GVM-Guía de Validación de Plaguicidas
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DIRECTORIO
CONTENIDO
1. PROPOSITO 4
2. ALCANCE 4
3. REFERENCIAS 4
4. DESARROLLO 4
4.1 VALIDACION DE METODOS 4
4.2 CONFIRMACION DE IDENTIDAD 6
4.3 REPETITIVIDAD 10
4.4 REPRODUCIBILIDAD 12
4.5 EXACTITUD, PRECISION Y RECUPERACION 16
4.6 LINEALIDAD DEL METODO E INTERVALO DE TRABAJO 24
4.7 LIMITE DE DETECCION 26
4.8 LIMITE DE CUANTIFICACION 26
4.9 ROBUSTEZ 26
4.10 ESTIMACION DE INCERTIDUMBRE 29
4.11 CRITERIOS DE ACEPTACION DE LOS
PARAMETROS DE VALIDACION 35
5 ANEXOS
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CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS
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1. PROPOSITO
La presente guía describe el proceso y criterios para la validación de métodos analíticos,
dirigido hacia laboratorios que coadyuvan con el SENASICA.
2. ALCANCE
Esta guía establece los lineamientos para la validación de métodos cromatográficos aplicables
a metodologías para la detección, confirmación y cuantificación de residuos de plaguicidas en
productos agrícolas.
3. REFERENCIAS
[1] Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food
and Feed, Document No. SANCO/10684/2009.
[2] Anteproyecto de Directrices sobre Criterios de rendimiento para métodos de análisis para
determinación de residuos de plaguicidas, Comisión de CODEX Alimentarius, CX/PR 14/46/10,
Marzo de 2014.
[3] NMX-CH-140-IMNC-2002, Guía para la expresión de incertidumbre en las mediciones.
4. DESARROLLO
4.1. VALIDACION DE METODOS
La validación de métodos analíticos se realiza de acuerdo a las necesidades del laboratorio, que
directamente está relacionada con los requisitos de sus clientes.
Se debe validar una metodología cuando:
a) Antes de introducirlos como métodos de rutina.
b) Un método establecido es usado en un laboratorio diferente o con diferentes
analistas o instrumentos.
c) Cuando cambia alguna de sus condiciones, por ejemplo: cambio en la técnica de
extracción.
d) Se desarrolla un nuevo método para un problema particular.
e) Se revisa un método establecido para incorporar mejoras o ampliarlo hacia un nuevo
problema, por ejemplo, cambio de matriz.
f) Se debe demostrar la equivalencia entre dos métodos.
Para la validación de cada metodología analítica en específico, se debe considerar los puntos del
diagrama 1.
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Realizar un estudio de metodologias oficiales y seleccionar la que esté al alcance del laboratorio.
Considerando reactivos, material de laboratorio, equipos e instrumentos, instalaciones, etc.
NO ¿Resultados
satisfactorios en
pruebas
preliminares?
SI
Calculo de resultados.
NO
¿Se cumplen los
criterios de aceptación?
SI
Conclusión
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Los parámetros de Validación que se deben incluir el desarrollo del estudio del laboratorio para
una validación son las siguientes:
a) Confirmación de identidad.
b) Repetitividad.
c) Reproducibilidad.
d) Exactitud, Precisión y Recuperación (%R).
e) Linealidad del método, intervalo de trabajo e intervalo de confianza (sesgo).
f) Límite de detección (LD).
g) Límite de cuantificación (LC).
h) Robustez.
i) Incertidumbre.
4.2. CONFIRMACION DE IDENTIDAD
4.2.1 SELECTIVIDAD
4.2.2 ESPECIFICIDAD
Ejemplo:
Para el compuesto THPI, se buscan las transiciones 79>77, 79>51, 151>80 y 151>79 a una
concentración de aproximadamente 5 ng/g en solución, obteniendo el grafico 1.
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En solución es posible determinar el compuesto, por lo que se realiza una extracción en la matriz
de aguacate con una fortificación a una concentración aproximada de 5 ng/g. Por lo que tenemos
de resultado el grafico 2. En el cual, se observa que existe un efecto de la matriz, la cual nos causa
interferencia y no podemos identificar el analito en matriz (Especificidad).
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Como se puede observar en el grafico 2, es necesario buscar otras transiciones que no causen
interferencia a la concentración requerida. Por lo que nuevamente experimentalmente se obtienen
nuevas transiciones 151>80, 151>122.1 y 151>105.8. Estas transiciones son evaluadas en la
matriz de aguacate a una concentración aproximada de 5 ng/g, ver gráfico 3.
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Grafico 3, THPI en matriz de aguacate a una concentración aproximada de 5 ng/g con otras
transiciones.
Una vez, que se tienen las condiciones adecuadas del método cromatografico con el analito de
interés (Especificidad), se realiza el análisis de distintos blancos de matriz para poder ver posibles
interferencias debidas a la variedad de matriz o la madurez de la misma (Selectividad).
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4.3. REPETITIVIDAD
Cuando se realiza una medición de una magnitud intervienen factores como pueden ser el método
y forma de ejecutar la medición, los técnicos que realizan la medición, las condiciones
ambientales, defectos instrumentales o el paso del tiempo; entre otros. Todos estos factores
provocan un cierto grado de desviación en la estimación del valor de la magnitud debido al
desconocimiento o falta de control de la influencia de estos en el proceso de medida. La repetición
es esencial para obtener estimaciones confiables del método, tomando en cuenta las variaciones
en las condiciones de operación que se esperan durante la rutina diaria en la que se lleva a cabo
el método.
La repetitividad es la evaluación de la proximidad entre los resultados obtenidos (precisión) en el
método analítico bajo las mismas condiciones de trabajo; es decir, mismo analista, mismo
instrumento en una escala de tiempo corta.
La repetitividad se evalúa con una prueba estadística llamada Xi cuadrada que sirve para evaluar
la distribución de los resultados de porcentaje obtenidos en el método de análisis bajo las mismas
condiciones de trabajo. El criterio de aceptación para esta prueba es:
X2calculada< X2tablas (1)
[ ]
(2)
Dónde:
X2= ji cuadrada
n= número de mediciones de la muestra
S2 = varianza de la muestra
= varianza poblacional y representa la variabilidad del método
∑ [ ] (3)
∑ ( ̿)
(4)
Dónde:
N = número total de mediciones
k= número de pruebas
̿ = Gran media
= Varianza por prueba
( )( ) (5)
Ejemplo:
Se obtienen los datos de porcentaje de recobro de la prueba de repetitividad con Siete niveles por
septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate
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gl=(7-1)(7-1)=36
Se resta el valor individual menos la gran media y se eleva al cuadrado, enseguida se suma las
diferencias, teniendo los siguientes resultados
Intervalo de trabajo
Repeticiones Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Nivel 6 Nivel 7
a 233,65 86,64 13,86 181,74 24,65 66,78 67,28
b 44,97 0,06 0,09 21,24 1,22 54,06 0,93
c 344,48 29,33 107,57 2,83 52,36 5,09 40,61
d 129,77 86,07 2,73 38,58 90,49 65,73 10,12
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Se realiza la división
Se calcula
Buscando el valor de X2 con un nivel de significancia del 95% con 36 grados de libertad en tablas:
X2calculada< X2tablas
4.4. REPRODUCIBILIDAD
Cuando se evalúa la precisión bajo condiciones de trabajo diferentes a las de repetitividad, se
obtiene la reproducibilidad; con la cual se determina si existe algún efecto en los resultados de
porcentaje de recobro por algún factor mediante un análisis de la varianza para un factor con
efectos aleatorios. El criterio de aceptación para decir que el método es reproducible es la prueba
estadística F de Fisher es que debe cumplirse que:
(7)
( ) (8)
∑ (̿ ̅) (9)
∑ ∑ ( ̅) (10)
( )
(11)
k= número de pruebas
n= número de mediciones por prueba
̿ = Gran media
̅ = promedio por prueba
Fcal= F de Fisher calculada
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Ejemplo:
Se obtienen los datos de porcentaje de recobro de tres pruebas de reproducibilidad con siete
niveles por septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate:
Se calcula
Se resta el valor individual menos el promedio por cada prueba y se eleva al cuadrado, enseguida
se suma las diferencias, teniendo los siguientes resultados
Se calcula
( )
Sustituyendo
n= 49
k= 3
( )
Se obtiene lo siguiente
Por lo tanto al cumplirse el criterio de aceptación se concluye no existe influencia alguna y por lo
tanto el método es reproducible.
̅ ∑ (13)
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( ) √ ∑ ( ̅) (14)
( )
̅
(15)
( ) ̅ (16)
√
̅
(17)
⁄
√
Ejemplo:
Se obtienen los datos de concentración de tres pruebas de reproducibilidad con siete niveles por
septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate.
n= 147
Gran media = 98.80422
Desv . Estándar total = 9.642414
Hipotesis (µo) = 98
t (calculada) = 1.011222
La exactitud del método es del 98%
4.5.2. PRECISION
La precisión en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad estimada sirve para conocer la
dispersión de los resultados del método analítico como una desviación típica a diferentes
magnitudes dentro del intervalo de trabajo; donde se obtiene el coeficiente de variación del
método; que se puede expresar como un intervalo de aceptación de %R mínimo - %R máximo.
Las fórmulas para calcular la varianza para el método de repetitividad (Sr 2) es:
∑
(12)
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̅ (13)
n=número de pruebas
̅ = Desviación de las medias
(14)
(15)
√ (16)
√ (17)
= varianza de reproducibilidad
(18)
(19)
Ejemplo: Se obtienen los datos de concentración de tres pruebas de reproducibilidad con siete
niveles por septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate.
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Conc. De Nivel (ug/mL) 0,0051 0,0071 0,0087 0,0103 0,0258 0,0515 0,1030
0,0043 0,0077 0,0083 0,0116 0,0268 0,0468 0,1105
0,0054 0,0070 0,0086 0,0107 0,0258 0,0472 0,1030
0,0041 0,0074 0,0077 0,0100 0,0274 0,0522 0,1086
Primera prueba 0,0045 0,0077 0,0084 0,0096 0,0280 0,0468 0,0988
0,0044 0,0064 0,0094 0,0104 0,0280 0,0526 0,1045
0,0049 0,0068 0,0089 0,0099 0,0295 0,0481 0,0982
0,0049 0,0062 0,0091 0,0099 0,0294 0,0528 0,1006
0,0050 0,0068 0,0077 0,0100 0,0255 0,0483 0,1004
0,0039 0,0069 0,0086 0,0100 0,0247 0,0506 0,1024
0,0034 0,0073 0,0086 0,0089 0,0279 0,0512 0,1117
Se calcula el promedio y desviación estándar por prueba para cada nivel de concentración
Se calcula la gran media, desviación estándar, varianza de repetibilidad, desviación de las medias,
varianza entre analistas, varianza de reproducibilidad, precisión en condiciones de repetibilidad y
precisión en condiciones de reproducibilidad, límite de repetibilidad y límite de reproducibilidad
para cada nivel.
Se grafica la precisión en condiciones de repetibilidad (Sr) vs. Concentración y por regresión lineal
se obtiene la ecuación que describe el comportamiento de la precisión en el intervalo de trabajo.
Conc (ug/mL) Sr
0,00514697 0,0004939
0,00711571 0,00041094
0,0086591 0,00072046
0,01029981 0,00045377
0,02577409 0,00098002
0,05147836 0,00210643
0,10298088 0,00368434
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Pendiente 0,03365284
Ordenada 0,00024768
R^2 0,98892281
Conc (ug/mL) SR
0,00514697 0,00040327
0,00711571 0,00033553
0,0086591 0,00058825
0,01029981 0,0003705
0,02577409 0,00080018
0,05147836 0,0017199
0,10298088 0,00300828
Pendiente 0,02747773
Ordenada 0,00020223
R^2 0,98892311
es decir, permite ver el rendimiento del método en cuanto al proceso de extracción y la cantidad de
analito existente en la muestra original. Se obtiene a partir de las pruebas de repetitividad y
reproducibilidad, y se utiliza la siguiente fórmula para su cálculo:
(20)
Ejemplo:
Se obtienen los datos de concentración de prueba de repetitividad con siete niveles por
septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate.
∑ ∑
(24)
(25)
[ ∑ ∑ ( ̅) ]
∑ ̅
(26)
∑ ∑ ∑
⁄ √ (26)
√∑ (∑ )
(27)
( ̅)
√ (∑ )
(28)
∑
̅
(29)
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Donde:
Ejemplo:
Se obtienen los datos de concentración de prueba de Linealidad, con siete niveles por
septuplicado del plaguicida de Acephate en una matriz de Aguacate.
(30)
( ) (31)
4.9. ROBUSTEZ
Medida de la capacidad de un procedimiento analítico para no ser afectado por variaciones
pequeñas pero deliberadas en los parámetros del método y que provee una indicación de su
fiabilidad durante su uso habitual.
La robustez de un método analítico permite identificar aquellas variables que provocarán
cambios significativos y que deberían ser controladas más estrictamente.
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En la siguiente tabla (3A) los valores nominales marcados por el método se designan con
mayúscula y las variaciones correspondientes con minúsculas. En la combinación No. 1 está
compuesta con todas las variables y con los valores máximos, mientras los demás están
variados.
Factores Combinación
1 2 3 4 5 6 7 8
A/a A A A A a a a a
B/b B B b b B B b b
C/c C c C c C c C c
D/d D D d d d d D D
E/e E e E e e E E E
F/f F f f F F f f F
G/g G g g G g G G g
Resultados s t u v w x y z
Resultados: (%) s t u v w x y z
Valores ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
Sustitución 4 menos 4 combinaciones de s a la z
SA= 1/4 (s+t+u+v) - 1/4 (w+x+y+z) = (A-a) (32)
SB= 1/4 (s+t+w+x) - 1/4 (u+v+y+z) = (B-b) (33)
SC= 1/4 (s+u+w+y) - 1/4 (t+v+x+z) = (C-c) (34)
SD= 1/4 (s+t+y+z) - 1/4 (u+v+w+x) = (D-d) (35)
SE= 1/4 (s+u+x+z) - 1/4 (t+v+w+y) = (E-e) (36)
SF= 1/4 (s+v+w+z) - 1/4 (t+u+x+y) = (F-f) (37)
SG= 1/4 (s+v+x+y) - 1/4 (t+u+w+z) = (G-g) (38)
Srob = √ ∑ (39)
Donde
d = (valor nominal – variación)
PASOS
Escribir los factores del análisis
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Escribir en forma de columna los factores del análisis (valores nominales), las variaciones y
el factor.
Calcular la desviación estándar de los valores nominales le llamaremos s met.
Sustituir 4 menos 4 combinaciones de s a la z. Ejemplo: (ecuaciones 1 a la 7)
o VA= 1/4 (s+t+u+v) - 1/4 (w+x+y+z) = (A-a)
Calcular la desviación estándar de los (Srob), usando la ecuación No. 39.
Criterio de aceptación: Srob < Smet
Ejemplo:
Combinaciones
Factores
1 2 3 4 5 6 7 8
Agitación
vortex (seg) 60 60 60 60 +10 +10 +10 +10
Muestra (gr)
10 10 +0.10 +0.10 10 10 +.010 +.010
Agitación
manual (seg) 60 +10 60 +10 60 +10 60 +10
Sonicar
(seg) 300 300 +60 +60 +60 +60 300 300
Resultados
s t u v w x y z
Resultados: (%) s t u v w x y z
Valores 95 99 96 107 94 92 96 101
Srob =√
Srob =7.59
Sustitución:
Srob= 7.59
Criterio de aceptación:
Srob < Smet
7.59 > 6.8
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Sustitución:
Srob= 5.71
Criterio de aceptación:
Srob < Smet
5.71 < 6.8
Puede quedar como un método estándar, bajo las condiciones propuestas, sin considerar la
variación en el pesado de la muestra (+0.1g). Es decir, con un incremento del peso de muestra el
método no es robusto.
a) DEFINIR EL MENSURANDO Y
En la cuantificación de residuos de plaguicidas el mensurando es la concentración del
analito de interés (CA).
( )
( ) ( ) (40)
( ) (44)
Ejemplo:
( )
Ejemplo:
Se tiene una pipeta volumétrica de 5 mL, se desea conocer el volumen verificado y
su incertidumbre. Para ello se realiza una prueba de pesado en una balanza bajo
condiciones de temperatura constante. El resultado del volumen total de agua de la
pipeta es depositado dentro de un vaso de precipitado de 50 mL, obteniendo los
siguientes resultados:
( ) √ ∑( )
individual y esta para cada fuente de entrada está determinada principalmente por la
siguiente ecuación:
( ) ( ) ( ) ( ) (48)
Es decir, las fuentes de incertidumbre principales son debidas principalmente para cada
fuente de entrada por la incertidumbre de calibración, la incertidumbre de operación y la
incertidumbre de resolución.
Factor de probabilidad
cobertura
k=1 68.2%
k=2 95.4%
k=3 99%
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5. ANEXOS