T.P.

Nº 1 - Extracción de ARN - 2023

TRABAJO PRÁCTICO N° 1:

EXTRACCIÓN DE ARN

Los cultivos celulares eucariotas pueden emplearse en diferentes campos como,

por ejemplo, industria farmacéutica, medicina, investigación etc. A partir de ellos, es
posible obtener material biológico para el estudio de la expresión génica. Para este análisis
se emplea ARNm, que contiene la información genética necesaria para la expresión de
proteínas. De esta forma, es posible estudiar el efecto de diferentes moléculas de interés
(factores de crecimiento, inhibidores de mitosis, hormonas etc.) sobre la expresión de
ciertos genes en las células cultivadas in vitro. Es decir, que no solo podrá valorarse el efecto
a nivel microscópico como por ejemplo división celular, morfología, efecto tóxico etc., sino
también a nivel molecular.
A continuación, estudiaremos una de las técnicas empleadas en laboratorios de
biología molecular para obtener ARN, que será empleado en el Trabajo Práctico de RT-
PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa acoplada a Transcripción Reversa) para el estudio
de la expresión de genes de interés.

INTRODUCCIÓN
La posibilidad de aislar ARN lo más intacto posible es esencial para el análisis dela
expresión génica. El éxito de cualquier extracción de ARN es totalmente dependiente de la
eliminación de toda posible contaminación de ribonucleasas (RNasas) que degradan el
ARN durante y después de la extracción, provocando un bajo rendimiento.
Las RNasas son enzimas muy resistentes y de gran actividad catalítica:
a) Son marcadamente resistentes al calor, manteniendo incluso una considerable
actividad tras un ligero calentamiento;
b) Son activas dentro de un amplio rango de pH;
c) Usualmente no requieren cofactores para su actividad;
d) Algunas, como las RNasas pancreáticas, se renaturalizan fácilmente después de
un tratamiento con agentes desnaturalizantes (p. ej., urea).
El contenido de RNasas endógenas varía con el tejido que se estudia: páncreas y bazo
son tejidos con muy altos contenidos de RNasas, mientras que riñón, hígado e intestino
tienen niveles menores, aunque no despreciables. Un problema adicional es que el
contenido de ARN en cualquier tejido es muy bajo: una célula típica de mamífero contiene
aproximadamente 10-5 µg de ARN total, del que tan sólo 1-5% corresponde a ARNm. Por
esta razón, una pequeña contaminación de RNasas, tanto endógena (del propio tejido)
como exógena (del material utilizado, soluciones, manos, polvo, etc.), puede suponer un
problema serio, por lo cual se deben tomar algunas precauciones.

Precauciones:
A diferencia del ADN, el ARN es muy inestable una vez obtenido, por la presencia
de las RNasas celulares. Por ello resulta crítica la congelación del tejido o su rápida
homogeneización en la solución desnaturalizante. Una fuente potencialmente grande de
contaminación con RNasas son las manos del investigador por las células epidérmicas que
se liberan continuamente. Es por ello

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obligado el uso de guantes tanto al realizar la extracción como al preparar las soluciones.
Una vez colocados los guantes, se debe evitar abrir heladeras, tocar picaportes o cualquier
otra superficie potencialmente contaminada con ribonucleasas, y luego de cada extracción
deben desecharse inmediatamente. Por lo general, este procedimiento se realiza en una
cabina de flujo laminar para minimizar la contaminación y empleando pipetas únicamente
destinadas a tal fin. Otro aspecto importante para una extracción de ARN intacto con éxito
es la ejecución de todas las fases tan rápidamente como sea posible, ya que esto elimina
riesgos de contaminación. Se recomienda trabajar en frío, manteniendo las muestras y
reactivos en hielo y empleando preferentemente centrífuga refrigerada. Se debe utilizar
material de plástico, estéril y libre de RNasas, y si se quiere trabajar con recipientes de
cristal es necesario calentarlos a 250ºC durante 24 horas o más, ya que ni siquiera el
autoclavado nos garantiza la inactivación de las mismas. Todas las soluciones deben ser
libres de RNasas contaminantes, y esto se consigue tratándolas previamente con DEPC.
El DEPC (dietilpirocarbonato) es un agente alquilante que reacciona covalentemente
y de modo inespecífico con las proteínas, pero es muy reactivo con los sitios activos de las
ARNsas, inactivándolas muy eficaz, aunque no absolutamente. El DEPC sobrante puede
reaccionar con el ARN y es preciso eliminarlo autoclavando las soluciones antes de
utilizarlas; así, el DEPC se descompone en etanol y CO2 que son volátiles.

FUNDAMENTO Y PASOS PARA LA EXTRACCIÓN DEL ARN

Es importante destacar que la metodología detallada permite obtener ARN total es decir,
ARN ribosómico (mayoritario en la célula), ARN de transferencia y ARN mensajero. Existen
en el mercado kits comerciales que permiten purificar ARNm basados partículas
magnéticas conjugadas con oligodT (secuencias cortas de desoxitimidina) que retienen los
ARNm eucariotas por complementariedad de bases conla cola poli-A.

1) Lisis celular
Cuando se realiza la extracción de ARN a partir de un tejido específico, el primer
paso es la disgregación del tejido a estudiar a través de medios mecánicos con el uso del
Ultraturrax, en presencia de una solución o buffer de lisis, llamada Solución D, que puede
prepararse en el laboratorio, o una solución comercial, por ejemplo, TRI- REAGENT. Cuando
se trabaja con cultivos celulares, simplemente se colocan las células cultivadas in vitro en el
buffer de lisis, se agita y centrifuga enérgicamente.
Aunque no se conocen exactamente los componentes de la solución comercial, ambas
deben tener los siguientes componentes básicos:
a) Detergentes: Disuelven membranas celulares y liberan el contenido celular al
medio, como el laurilsarcocinato de sodio.
b) Agentes reductores: Contribuyen a la desnaturalización proteica mediante la
ruptura de puentes disulfuro (típicos de las RNasas), como el 2-mercaptoetanol.
c) Agentes caotrópicos: Sales con efecto desnaturalizante sobre las proteínas celulares,
incluyendo las RNasas, como el tiocianato de guanidina.

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d) Compuestos buffers: La solución D contiene citrato de sodio a pH 7.

Durante la extracción es importante que la solución tenga a un pH ácido de 4 que asegura
la mayor estabilidad de las moléculas de ARN y permite que el ADN sea selectivamente
retenido en la fase orgánica y la interfase, dejando el ARN en la fase acuosa. El acetato de
sodio (pH ácido) contribuye también a la precipitación proteica. Si se trabaja con solución
D, debe agregarse el acetato de sodio para acidificar el lisado mientras que en los buffers
comerciales no es necesario.

2) Separación de proteínas y lípidos

Tras el homogeneizado del tejido y la desnaturalización de las proteínas, se debe
aislar físicamente el ARN del resto de componentes celulares. Una delas maneras para
realizar esta separación, consiste en la Extracción Fenólica (también llamada extracción
en fenol ácido o con fenol saturado en agua) basada en la propiedad de los ácidos nucleícos
de ser más solubles en soluciones acuosas que en solventes orgánicos. Por lo general, el
fenol forma parte de la solución comercial. El principio básico de la extracción fenólica es la
desproteinización del homogeneizado celular y la eliminación de los componentes no
hidrosolubles mediante una separación de fases con distinta solubilidad. Se consigue así,
la separación de dos fases: una fase inferior orgánica (fenólica) que contiene lípidos,
proteínas, fragmentos subcelulares varios y ADN, y una fase superior acuosa (menos densa)
que contiene ARN, debido al pH ácido. Entre ellas, existe una interfase en la que se
encuentran mayormente ADN y proteínas, debido a su contenido en aminoácidos
hidrofóbicos e hidrofílicos. La ventaja de emplear TRI- REAGENT o cualquier buffer de lisis
comercial es que contiene fenol, por lo que se evita así el agregado del mismo al lisado.
Además, contiene un colorante que ayuda a valorar y observar la correcta separación de
fases. En esta separación, el fenol suele usarse en combinación con cloroformo para
aumentar la eficiencia de la extracción: la alta densidad del cloroformo y su capacidad
para disolver lípidos y proteínas proporciona fases acuosas menos contaminadas. El
cloroformo ayuda a eliminar el fenol y estabiliza la fase orgánica.

3) Precipitación del ARN

La fase acuosa se debe transferir a un nuevo tubo con sumo cuidado para evitar
la contaminación y este constituye el paso crítico de la extracción, ya que debe evitarse
transferir fase orgánica al nuevo tubo. Las etapas siguientes están destinadas a purificar
cada vez más el ARN mediante precipitaciones a baja temperatura con alcoholes, como
isopropanol y etanol y centrifugaciones secuenciales, produciendo un
«pellet» cada vez más libre de contaminantes. El agregado de isopropanol permite
precipitar el ARN junto con sales presentes en el medio. Luego, el agregado de etanol 75%
favorece por un lado la precipitación del ARN y por otro, la eliminación de las sales, ya
que al contener agua se solubilizan quedando en el sobrenadante luego de la centrifugación.

4) Redisolución del ARN

La resuspensión de dicho «pellet» debe realizarse, lógicamente, en
agua estéril libre de RNasas.

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5) Almacenamiento:
Existen diferentes formas de almacenar el ARN. En general, la solución acuosa de
ARN es estable a -80ºC por más de un año sin degradarse. El Mg +2 y otros metales pueden
catalizar clivajes no específicos en el ARN por lo que se deberían utilizar agentes
quelantes para asegurar su almacenamiento intacto, por ejemplo, EDTA libre de RNasas.

MÉTODOS DE ANÁLISIS

- Cuantificación del ARN

La cantidad de ARN extraído puede estimarse mediante espectrofotometría,
determinando la DO de las soluciones que contiene ARN a
260 nm. Se debe tener en cuenta que una DO de ARN igual a 1,00 corresponde a 40
μg/ml.
Para estimar la pureza del ARN se considera la proporción de la absorbancia a
260 nm y 280 nm. Una proporción de 1,8 es aceptada como ARN puro, proporciones
menores a este valor indican la presencia de proteínas, como contaminantes de la muestra.

- Comprobación de la integridad del ARN por electroforesis

La presencia de RNasas contaminantes en el estudio de expresión de genes en un
tejido determinado puede resultar en la falla completa del experimento o en una errónea
conclusión del resultado obtenido, ya que el ARN aparecería degradado en la corrida
electroforética haciendo dificultosa su visualización.
El ADN también puede contaminar una muestra de ARN extraído; en este caso,
podría visualizarse como una banda de PM mayor que suele encontrarse cerca del lugar de
siembra.

Figura 1 y 2: Electroforesis en gel de agarosa de ARN total

Figura 1: Figura 2:
1- Marcador de peso molecular 1- Marcador de peso molecular
2- ARN degradado 2 y 3- ARN contaminado con ADN
3- ARN intacto y puro 4 y 5- ARN intacto y puro.

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PROTOCOLO EXTRACCIÓN DE ARN

Material Necesario Soluciones necesarias
- Muestras de Tejidos - Buffer de Lisis: Quick-Zol (Se puede emplear
- Tubos de 1,5 ml Solución D: Tiocianato deguanidina 4 M,
- Micropipetas de 20, 200 y Citrato de sodio 25 mM pH7, N-
1000 ul laurilsarcosinato de sodio, 0,5%, â-
- Tips estériles mercaptoetanol 0,1 M), Fenol saturado en
- Centrífuga agua y Acetato de sodio 2M, pH 4.
- Descartador - Cloroformo
- Vortex - Isopropanol
- Etanol 70%
- Agua estéril libre de RNAsas
- Buffer TAE: Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1mM,
pH 8,2) para electroforesis.
1) Se emplearán muestras de diferentes tipos de tejidos: oviducto e hígado bovino
recolectados durante la faena en frigoríficos locales.
2) Una porción de cada órgano se colocará en un tubo previamente tarado y se
determinará el peso por diferencia.
3) A la muestra de tejido, agregar solución Quick-Zol en la siguiente proporción: 1 ml
por cada 0,100 g de tejido. Este paso debe realizarse con mucho cuidado ya que el reactivo
contiene Fenol.
4) Lisar en ultraturrax.
5) Separar en alícuotas de 500 µl del tejido lisado.
6) Añadir 200 µl de cloroformo.
7) Agitar vigorosamente 15 segundos.
8) Mantener a 4º C durante 5 minutos.
9) Centrifugar a 10.000 x g durante 15 minutos a 4 ºC.
10) Transferir la fase acuosa superior (aproximadamente 300 µl, anotar el volumen
recuperado) a un tubo limpio teniendo la precaución de medir el volumen transferido.La
fase fenólica se puede reservar para realizar la extracción de ADN o proteínas.
11) Añadir 300 µl (el mismo volumen de la fase acuosa recuperada) de isopropanol para
precipitar el ARN.
12) Incubar 5 minutos a 4º C.
13) Centrifugar a 10.000 x g 10 minutos a 4ºC.
14) Extraer el sobrenadante y descartarlo.
15) Añadir 1 ml de etanol 75% y mantener a temperatura ambiente 5 minutos.
16) Centrifugar a 10.000 x g 10 minutos.
17) Extraer el sobrenadante y descartarlo (descartar el etanol tratando de dejar el tubo
lo más seco posible; es probable que se requiera de una nueva centrifugación durante unos
segundos).
18) Resuspender en 10 µl de agua estéril libre de ARNasas.
19) Determinar la concentración del ARN obtenido mediante lectura en
espectrofotómetro a 260 nm de longitud de onda, considerando que se realizará una
dilución (1 µl de muestra en un volumen de 1000 µl):
Concentración de ARN µg/ml: 1000/1 * 40 * DO260
20) Evaluar la relación 260/280 para determinar la pureza de la muestra de ARN.

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Evaluación de la integridad del ARN obtenido, mediante electroforesis en gel de

agarosa
La calidad de ARN total puede estimarse mediante una electroforesis en geles
de agarosa. Tener en cuenta que, en una extracción de ARN total, las moléculas más
abundantes corresponden a los ARN ribosómicos y éstos son los que se observan.

1. Preparar 20 ml de un gel de agarosa al 1,5%. Pesar la cantidad adecuada de

agarosa, llevar a volumen con buffer TAE 1X. Calentar hasta ebullición para
fundirla agarosa. Dejar reposar unos minutos y agregar 1,2 ml del colorante
Sybrsafe. Volcar en el soporte y dejar enfriar. Una vez listo el gel, sacar el peine
y colocarlo en la cuba de electroforesis submarina.
2. Separar una alícuota de 10 µl de las muestras de ADN o ARN y agregar 2 µl
de buffer de siembra (Buffer TAE 1 X 50%, glicerol 50% y azul de bromo fenol
0,1%, como marcador del frente de corrida).
3. Sembrar las muestras en los pocillos. Correr el gel a 90 V durante
aproximadamente 20 min.
4. Observar en transiluminador con luz visible. Anotar los resultados obtenidos
y discutirlos en clase.

Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa de RNA total extraído de células eucariotas

teñidocon bromuro de etidio.

Se observan los RNA ribosómicos (RNAr) 28s (4,7 kb), 18s (1,9 kb) y 4-5s (0,10-0,15
kb) conteniendo tRNA y rRNA 5s.