Grupos de Laboratorio de Alimentos 2 de 2017
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LABORATORIO ALIMENTOS
1. Determinación de Microorganismos Carne picada, Helado a base de leche, jugos
Aerobios mesófilos pasterizados, carne cruda de Bovinos,
porcinos, caprinos refrigeradas o congeladas)
huevos con cascara, frutas y hortalizas frescas
(lavadas, desinfectadas, peladas cortadas o
precocidas) carmelos, chicles, confites,
cereales, comida preparada con tratamiento
térmico
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fecales en alimentos
Método del NMP
9. Determinación de microorganismos en Manipuladores, ambiente y superficie.
manipuladores, ambiente y superficies.
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1 OBJETIVO: Determinar la presencia de microorganismos aerobios y facultativos mesófilos en
diferentes muestras de alimentos.
2 ALCANCE: Abarca a todos los microorganismos que tiene la propiedad de crecer en presencia de
oxigeno a una temperatura de 2O- 45 ºC.
4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA:
4.1. HOLGUIN, M. et, al Manual de técnicas de análisis para el control de calidad microbiológico
para consumo humano. División de laboratorios de alimentos y bebidas alcohólicas INVIMA
1998,2002, 2006.
4.2. LUNA, G. Manual Operativo de análisis microbiológico para alimentos universidad de Pamplona
1998.
5. CONTENIDO:
5.2. DEFINICIONES:
5.2.1. Agar plate count: (agar peptona de caseína glucosa extracto de levadura) medio simple que
permite el crecimiento de muchos microorganismos el cual contiene peptona de caseína extracto de
levaduras, D glucosa y agar agar
5.2.2. microorganismo viables: son aquellos microorganismos que tienen la propiedad de poder
reproducirse, en el caso de las bacteria de formar colonias.
5.2.3. UFC: Unidades formadoras de colonias.
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5.4.7. Instrumentos para prepara las muestras: Cuchillos, Tenedores, Pinzas, Tijeras,
Cucharas, espátulas, Sacabocados, Morteros con sus respectivos pistilos etc.
previamente esterilizados.
5.5. EQUIPOS:
5.5.1. Refrigerador
5.5.2. Contador de colonias
5.5.3. Incubadora a 35ºC +/- 2ºC.
5.5.4. Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de los alimentos.
5.6. PROCEDIMIENTO:
5.6.1. Método de Recuento en Placa:
5.6.1.1. Mezclar muy bien la muestra ( liquida) para asegurar su homogenización.
5.6.1.2. Desinfectar con alcohol al 75% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra.
5.6.1.3. Abrir asépticamente ( con el mechero en medio) y adecuadamente la muestra.
5.6.1.4. Si es sólida tomar porciones de diferentes sitios de la muestra.
5.6.1.5. Pesar 11 gramos de la muestra en balanza analítica si es sólida, sobre un papel
graff estéril o medir 11 mililitros si es liquida en recipiente estéril.
5.6.1.6. Macerar, picar o triturar.
5.6.1.7. Añadir al recipiente de dilución que contiene 99 ml de agua peptonada para
obtener la dilución de 10 1.
5.6.1.8. Mezclar al agitar vigorosamente el recipiente para homogenizar.
5.6.1.9. Preparar la dilución 102 trasfiriendo 1 ml de la dilución 10 1 a un tubo de
ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada, agitar cuidadosamente.
5.6.1.10. Preparar la dilución 103 trasfiriendo 1 ml de la dilución 10 2 a un tubo de
ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada, agitar cuidadosamente.
5.6.1.11. Transferir por duplicado alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones
consecutivas en cajas de petri estériles.
5.6.1.12. Verter en las cajas de petri, 15 ml de agar plate count fundido y mantenido a
45ºC
5.6.1.13. Mezclar el inoculo con el medio de cultivo fundido . No debe transcurrir mas de
20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. La
manera mas indicada de mezclar el inoculo con el medio es la siguiente:
Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces
Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj
Mover la caja 5 veces haciendo Angulo recto sobre el movimiento
Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj.
5.6.1.14. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que
contenga Agar plate count.
5.6.1.15. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1 % incubando una caja
que contenga 1 ml de agua peptonada y agar plate count.
5.6.1.16. Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 35ºC
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+/- 2ºC durante 48 horas.
5.6.1.17. Calculo e interpretación de los resultados.
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4.1. HOLGUIN, M. et, al Manual de técnicas de análisis para el control de calidad microbiológico
para consumo humano. División de laboratorios de alimentos y bebidas alcohólicas INVIMA 2001.
4.2. LUNA, G. Manual Operativo de análisis microbiológico para alimentos universidad de Pamplona
1998.
5. CONTENIDO:
5.2. DEFINICIONES:
5.2.1 Agar OGY(Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura) medio que permite el crecimiento
de mohos y levaduras y no de bacterias por la presencia de un antibiótico como la oxitetraciclina.
5.2.2. Agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol: medio que esta constituido de un azúcar,
levaduras y un antibiótico el cual inhibe el crecimiento de bacterias y permite el crecimiento de
hongos y levaduras.
5.2.3. UFC: Unidades formadoras de colonias.
5.3. CONDICIONES GENERALES: Los hongos son organismos eucarióticos los cuales pueden
ser unicelulares o pluricelulares. Las levaduras son unicelulares y crecen de forma sencilla en la
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naturaleza con algunas excepciones, los mohos son pluricelulares que forman hifas y que se pueden
observar macroscópicamente de aspecto algodonoso y velloso sobre la superficie que contaminan.
Los mohos y las levaduras tienen características similares a las bacterias cuando contaminan los
alimentos, tales como la capacidad de alteración y la producción de metabolitos tóxicos.
5.5. EQUIPOS:
5.5.1. Incubadoras
5.5.2. Contador de colonias
5.5.3. Incubadora a 35ºC +/- 2ºC.
5.5.4. Estufa
5.6. PROCEDIMIENTO:
5.6.1. RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS
5.6.1.1. Mezclar muy bien la muestra ( liquida) para asegurar su homogenización.
5.6.1.2. Desinfectar con alcohol al 75% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra.
5.6.1.3. Abrir asépticamente ( con el mechero en medio) y adecuadamente la muestra.
5.6.1.4. Si es sólida tomar porciones de diferentes sitios de la muestra.
5.6.1.5. Pesar 11 gramos de la muestra en balanza analítica si es sólida, sobre un papel
graff estéril o medir 11 mililitros si es liquida en recipiente estéril.
5.6.1.6. Macerar, picar o triturar.
5.6.1.7. Añadir al recipiente de dilución que contiene 99 ml de agua peptonada para
obtener la dilución de 10 -1.
5.6.1.8. Mezclar al agitar vigorosamente el recipiente para homogenizar.
5.6.1.9. Preparar la dilución 10-2 trasfiriendo 1 ml de la dilución 10 -1 a un tubo de
ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada, agitar cuidadosamente.
5.6.1.10. Preparar la dilución 10-3 trasfiriendo 1 ml de la dilución 10 -2 a un tubo de
ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada, agitar cuidadosamente.
5.6.1.11. Transferir por duplicado alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones
consecutivas en cajas de petri estériles.
5.6.1.12. Verter en las cajas de petri, 15 ml de agar OGY fundido y mantenido a
45ºC
5.6.1.13. Mezclar el inoculo con el medio de cultivo fundido . No debe transcurrir mas de
20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. La
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manera mas indicada de mezclar el inoculo con el medio es la siguiente:
Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces
Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj
Mover la caja 5 veces haciendo Angulo recto sobre el movimiento
Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj.
5.6.1.14. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que
contenga Agar OGY.
5.6.1.15. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1 % incubando una caja
que contenga 1 ml de agua peptonada y agar OGY .
5.6.1.16. Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 22ºC
+/- 2ºC ( temperatura ambiente) durante 5 -7 horas.
2 ALCANCE: Abarca a todos los bacilos gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no
formadores de esporas que fermentan la lactosa a una temperatura de 35ºC ( Coliformes totales) o a
una temperatura de 44.5 ºC , con producción de gas (Coliformes fecales).
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4.1. HOLGUIN, M. et, al Manual de técnicas de análisis para el control de calidad microbiológico
para consumo humano. División de laboratorios de alimentos y bebidas alcohólicas INVIMA 2001.
4.2. LUNA, G. Manual Operativo de análisis microbiológico para alimentos universidad de Pamplona
1998.
5. CONTENIDO:
5.2. DEFINICIONES:
5.2.1.Agar EMB: (agar eosina azul de metileno ) Medio selectivo y diferencial que permite el
Aislamiento y detección de Enteróbacterias o bacilos coliformes. Este medio contiene peptona,
lactosa, fosfato dipotasico agar, eosina azul de metileno.
5.2.2. Microorganismo viables: Son aquellos microorganismos que tienen la propiedad de poder
reproducirse, en el caso de las bacteria de formar colonias.
5.2.3. UFC: Unidades formadoras de colonias.
5.2.4. Coliformes fecales: Son todos los bacilos gram negativos, aerobios y anaerobios
facultativos, no formadores de esporas que fermentan la lactosa a una temperatura de 44.5 ºC , con
producción de gas.
5.2.5. Coliformes totales: : Son todos los bacilos gram negativos, aerobios y anaerobios
facultativos, no formadores de esporas que fermentan la lactosa a una temperatura de 35ºC.
5.3. CONDICIONES GENERALES: los coliformes son los indicadores mas reconocidos de
contaminación debido a son indicadores útiles de procesos de saneamientos inadecuados, su
presencia en un numero alto en un alimento procesado indica que la probabilidad de crecimiento de
bacterias patógenas es alta. en el caso de los coliformes fecales indica una contaminación probable
de fuente fecal
5.5. EQUIPOS:
5.5.1. Unidad de filtración estéril
5.5.2. Contador de colonias
5.5.3. Incubadora a 35ºC +/- 2ºC.
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5.5.4. Estufa
5.6. PROCEDIMIENTO:
5.6.1 TECNICA DE FILTRACIÓNPOR MEMBRANA
5.6.1.1. Preparar la unidad de filtración
5.6.1.2. verter 100 ml de la muestra en el embudo colector Y Aplique vació
para realizar la filtración
5.6.1.3. Al finalizar la filtración apague la bomba de vació, desenrosque el
El embudo colector del recipiente base.
5.6.1.4. Retire la membrana con ayuda de las pinzas estériles y colóquelas sobre las
Cajas de petri que contienen el medio EMB.
5.6.1.5. Incube las cajas de petri a una temperatura de 35 a 35ºC por un tiempo de 22-
24 para determinar coliformes totales
5.6.1.6 Incube las cajas petri a una temperatura de 44.5ºC por un tiempo de 22 -24
horas para determinar coliformes fecales
5.6.1.7. Para coliformes totales realice el conteo y escoja las cajas que presenten entre
20 y 80 colonias, Las colonias de interés son violeta oscuro o púrpura con o sin
brillo metálico.
5.6.1.8. Para coliformes fecales: Realice el conteo y escoja las cajas que presenten
entre 20 y 60 colonias. Las colonias de interés son violeta oscuro, verde o
negras con superficie brillante metálica.
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3 RESPONSABILIDAD: El encargado de hacer cumplir el procedimiento de análisis es el docente
del área de microbiología de alimentos, el cual debe tener una formación de microbiólogo o
bacteriólogo con una experiencia de 2 años como mínimo.
4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA:
4.1. HOLGUIN, M. et, al Manual de técnicas de análisis para el control de calidad microbiológico
para consumo humano. División de laboratorios de alimentos y bebidas alcohólicas INVIMA 1998
4.2. LUNA, G. Manual Operativo de análisis microbiológico para alimentos universidad de Pamplona
1998.
5. CONTENIDO:
5.5. EQUIPOS:
5.5.1. Incubadorasl
5.5.2. Contador de colonias
5.5.3. Incubadora a 35ºC +/- 2ºC.
5.5.4. Estufa
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5.6. PROCEDIMIENTO:
5.6.1 DETERMINACIÓN DE Pseudomona aeruginosa EN AGUA TRATADA Y
EMBOTELLADA
5.6.1.1. Verter 100ml de agua embotellada en un erlenmeyer que contiene 100ml de
caldo lactosado con magnesio
5.6.1.2. Incubar a 37ºc por 24- 48 horas.
5.6.1.3 Pasado este tiempo adicionar 0.1 ml de la preparación anterior a cajas de petri
que contiene agar cetrimide.
5.6.1.4. Expandir la muestra por toda la superficie de la caja con ayuda de una varilla
de hockey o asa redonda
5.6.1.5. Incube las cajas de petri a una temperatura de 42ºC por un tiempo de 24 -48
horas, la aparición de cualquier crecimiento indica la presencia de Pseudomona
sp, la presencia de pigmentación azul verdosa o fluorescencia ( piocianinas) es
prueba presuntiva de P. aeruginosa.
5.6.1.6 Adicionar colonias presuntivas a 10 ml de agua peptonada e incube a 42ºc por
un tiempo de 24- 48 horas, hasta la aparición de color azul verdoso.
5.6.1.7. Añadir 2 ml de cloroformo a la preparación anterior, la capa cloroformica
subyacente a la capa acuosa se tiñe de azul. La producción de piocianinas
confirma la aparición de Pseudomona aeruginosa.
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4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA:
4.1. HOLGUIN, M. et, al Manual de técnicas de análisis para el control de calidad microbiológico
para consumo humano. División de laboratorios de alimentos y bebidas alcohólicas INVIMA 2001.
4.2. LUNA, G. Manual Operativo de análisis microbiológico para alimentos universidad de Pamplona
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5. CONTENIDO:
5.1. FUNDAMENTO: Este método consiste en determinar y hacer el recuento del numero de
colonias de Staphylococcus coagulasa positiva en alimentos el cual se ponen en evidencia cuando
las condiciones de manipulación son deficientes, los materiales y equipos estan sucios y materias
primas de origen animal están contaminados.
5.2. DEFINICIONES:
5.2.1 Agar Baird parker: medio de cultivo que contiene cloruro de litio y telurito para la inhibición de
la flora acompañante, en tanto que el piruvato y la glicocola actúa favoreciendo selectivamente el
crecimiento de estafilococos. Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo,
las colonias de Staphylococcus muestran dos características diagnosticas de proteolisis y lipólisis y
se producen halos y anillos característicos y debido a la reducción del telurito a teluro se desarrolla
una colonia negra.
5.2.2.Caldo infusión cerebro corazon: caldo de cultivo que contiene trozos de corazon adecudo para
el crecimiento de muchas bacterias exigentes. El caldo cerebro corazon es especialmente adecuado
para el cultivo de estafilococos destinados al ensayo de plasmocoagulasa y para la realización de
hemocultivos.
5.3. CONDICIONES GENERALES: El Staphylococous aureus es una bacteria que tiene forma
de coco pero su agrupación es de manera irregular por tanto en la coloración de gram se observan
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como racimos de uvas, Esta bacteria es de gran importancia a nivel alimentario ya que produce una
toxina termoestable la cual puede producir intoxicación alimentaría, además por estar en la piel y en
las mucosas de los seres humanos es indicador de una manipulación inadecuada por parte de los
manipuladores de alimentos.
5.5. EQUIPOS:
5.5.1. Incubadoras
5.5.2. Contador de colonias
5.5.3. Incubadora a 35ºC +/- 2ºC.
5.5.4. Estufa
5.6. PROCEDIMIENTO:
5.6.1. Recuento de ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVA.
5.6.1.1. Mezclar muy bien la muestra (liquida) para asegurar su homogenización.
5.6.1.2. Desinfectar con alcohol al 75% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra.
5.6.1.3. Abrir asépticamente (con el mechero en medio) y adecuadamente la muestra.
5.6.1.4. Si es sólida tomar porciones de diferentes sitios de la muestra.
5.6.1.5. Pesar 11 gramos de la muestra en balanza analítica si es sólida, sobre un papel
graff estéril o medir 11 mililitros si es liquida en recipiente estéril.
5.6.1.6. Macerar, picar o triturar.
5.6.1.7. Añadir al recipiente de dilución que contiene 99 ml de agua peptonada para
obtener la dilución de 10 -1.
5.6.1.8. Mezclar al agitar vigorosamente el recipiente para homogenizar.
5.6.1.9. Preparar la dilución 10-2 trasfiriendo 1 ml de la dilución 10 -1 a un tubo de
ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada, agitar cuidadosamente.
5.6.1.10. Preparar la dilución 10-3 trasfiriendo 1 ml de la dilución 10 -2 a un tubo de
ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada, agitar cuidadosamente.
5.6.1.11. Transferir por duplicado alícuotas de 0.1 ml de cada una de las diluciones
consecutivas en cajas de agar Baird parker previamente temperadas.
5.6.1.12. Extender el inoculo sobre la superficie del agar, con la ayuda de la varilla de HOCKEY,
hasta que La superficie quede seca.
5.6.1.13. Invertir las placas e incubarlas a 35ºC + / - 2ºC durante 48 horas.
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5.6.1.14. Seleccionar las cajas que presenten entre 20 y 200 colonias aisladas y contar las colonias
negras
y brillantes, con bordes reducidos blancos, rodeados de zonas claras que contrastan con
el medio
opaco, zona de precipitado. Anotar el número de colonias con las características
anteriormente
señaladas y multiplicar por el factor de diluciòn y luego por 10.
colonias positivas
Colonias examinadas.
EJEMPLO:
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35000 * 4 = 28000 ufc/ gr o ml.
5
No crecimiento de colonias en las cajas de Petri en la dilución de 10 -1 expresar los resultados como:
Se confirma la intoxicación alimentaria por Staphylococcus aureus cuando hay Recuento mayor o
igual a 105 UFC S. aureus/g de alimento implicado.
DETERMINACIÓN DE SALMONELLA.
4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA:
4.1. HOLGUIN, M. et, al Manual de técnicas de análisis para el control de calidad microbiológico
para consumo humano. División de laboratorios de alimentos y bebidas alcohólicas INVIMA 2006.
4.2. LUNA, G. Manual Operativo de análisis microbiológico para alimentos universidad de Pamplona
1998.
5. CONTENIDO:
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5.4.2. Beaker estéril
5.4.3. Erlenmeyer estéril
5.4.4. Agar XLD, Bismuto Sulfito, Hektoen
5.4.5. Caldo selenito cistina, tetrationato
5.4.6 conjunto de baterias bioquímicas completa
5.4.7 Reactivo de griess
5.4.8. Polvo de zinc.
5.5. EQUIPOS:
5.5.1. Incubadoras
5.5.2. Contador de colonias
5.5.3. Incubadora a 35ºC +/- 2ºC.
5.5.4. Estufa
5.6. PROCEDIMIENTO:
5.6.1.1. Mezclar muy bien la muestra (si es liquida) para asegurar su homogenización.
5.6.1.2. Desinfectar con alcohol al 75% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra.
5.6.1.3. Abrir asépticamente ( con el mechero en medio) y adecuadamente la muestra.
5.6.1.4. Si es sólida tomar porciones de diferentes sitios de la muestra.
5.6.1.5. Pesar 25 gramos de la muestra en balanza analítica si es sólida, sobre un papel
graff estéril o medir 25 mililitros si es liquida en recipiente estéril.
5.6.1.6. Macerar, picar o triturar.
5.6.1.7. Añadir al recipiente de dilución que contiene 225 ml de agua peptonada
5.6.1.8. Cuando se analiza leche en polvo, utilizar agua destilada adicionada de 5 ml de solución
verde brillante al 0.1%
5.6.1.9. Incubar a 35º + / - 2ºC por 18 – 24 horas
5.6.1.10. Realizar controles positivos y negativos con cepas conocidas
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Se debe utilizar como minimo dos medio selectivos por cada caldo de enriquecimiento no
selectivo y selectivo para el aislamiento del microorganismo, se recomienda el agar bismuto sulfito,
al agar verde verde brillante lactosa sacarosa con novobiocina y el agar XLD.
5.6.3.1. A partir de cada uno de los cultivos obtenidos del enriquecimiento no selectivo y selectivo,
sembrar en superficie con asa por agotamiento placas con agar verde brillante lactosa sacarosa,
agar bismuto sulfito o agar XLD.
5.6.3.2. Incubar las placas a 35ºC + / - 2ºC durante 24 – 48 horas
5.6.5 serotipificación
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2 ALCANCE: Abarca el aislamiento e identificación de Vibrio cholerae en muestras de alimentos
4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA:
4.1. HOLGUIN, M. et, al Manual de técnicas de análisis para el control de calidad microbiológico
para consumo humano. División de laboratorios de alimentos y bebidas alcohólicas INVIMA 1998.
4.2. LUNA, G. Manual Operativo de análisis microbiológico para alimentos universidad de Pamplona
1998.
5. CONTENIDO:
5.1. FUNDAMENTO: Este método consiste en aislar e identificar la presencia de Vibrio cholerae
en alimento. El Vibrio cholerae 01 es el agente causal del colera, enfermedad diarreica producida por
una toxina segregada por el microorganismo en el intestino.
5.5. EQUIPOS:
5.5.1. Incubadoras
5.5.2. Contador de colonias
5.5.3. Incubadora a 35ºC +/- 2ºC.
5.5.4. Estufa
5.6. PROCEDIMIENTO:
5.6.1. Mezclar muy bien la muestra (si es liquida) para asegurar su homogenización.
5.6.2. Desinfectar con alcohol al 75% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra.
5.6.3. Abrir asépticamente ( con el mechero en medio) y adecuadamente la muestra.
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5.6.4. Si es sólida tomar porciones de diferentes sitios de la muestra.
5.6.5. Pesar 25 gramos de la muestra en balanza analítica si es sólida, sobre un papel
graff estéril
5.6.6. Macerar, picar o triturar.
5.6.7. Añadir al recipiente de dilución que contiene 225 ml de agua peptonada Alcalina
5.6.9. Incubar a 35º + / - 2ºC por 18 – 24 horas
5.6.10. Pasado el tiempo de incubación, sin mezclar el frasco o erlenmeyer, realizar un barrido de
la superficie del cultivo con el asa y siembra en superficie por agotamiento en agar tiosulfato
citrato sales biliares sacarosa (TCBS).
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