Taller Técnicas de laboratorio en bioquímica 1:

ESPECTROFOTOMETRÍA

MATERIA: Bioquímica

GRUPO : 4

INTEGRANTES:

- Alejo Campos, Silvia Rocio

- García Alpiste, Nayeli Norit
- Monge Aviles, Angye
- Muñoz Sovero, Eliane Anat
- Nakagawa Meza, Hiromi Fiorella
- Solier Lopez, Katherin
- Tirado Bistolfi, Ariadna

Coordinador:

- Zimic, Mirko

I. OBJETIVOS

- Obtener y analizar espectros de absorción de biomoléculas.

- Aplicar las técnicas espectrofotométricas para el estudio funcional de las
biomoléculas
 - Aplicar la ley de Lambert–Beer para la cuantificación de biomoléculas

II. INTRODUCCIÓN

El presente informe de laboratorio, referente a la práctica N°1 “Taller de Técnica de

laboratorio: Espectrofotometría”, exhibe un análisis de la comparación de valores de
absorción espectrofotométricos de la hemoglobina y derivados, usando un
espectrofotómetro UV-visible. Además, se muestran los resultados obtenidos del uso de los
métodos Bradford y Biuret para la cuantificación de proteínas.

El espectrofotómetro UV-visible se basa en la capacidad de las biomoléculas de absorber

radiaciones dentro del espectro de UV-visible. Las longitudes de onda que la molécula
absorbe y la eficiencia con la que se absorbe la luz dependen de la estructura atómica y de
las condiciones del medio (Díaz et al., s. f.). La absorción ocurre cuando la luz que incide
sobre una molécula coincide con la diferencia de energía entre el estado fundamental de
energía y el estado excitado (de mayor energía). Si la energía no coincide entonces el fotón
no es absorbido, por el contrario el fotón es emitido.

Un espectro de absorción también se usa para identificar a ciertas moléculas; puesto que, la
longitud de onda es dependiente del grupo funcional o el arreglo atómico de cada molécula,
teniendo cada uno por su cuenta su propia “huella digital”. Las medidas en
espectrofotometría nacen de la ley de Lambert-Beer, este se usa para explicar la relación
directa entre la absorbancia de luz de una longitud de onda fija y la concentración de la
solución (“c”, en mol/L), la fórmula expresada es: “OD=A= a*l*c”; donde “OD” es densidad
óptica, “l” es la longitud de la cubeta en cm (en el experimento se considerará con el valor
de 1) y “a” es el coeficiente de extinción (o de absorción) molar de la molécula en análisis.

En detalle, con respecto a la primera parte, se trabajó principalmente con la hemoglobina

oxigenada (extraída de los glóbulos rojos), en consecuencia, se observó la variación de sus
distintos espectros de absorción desde la forma base hasta la modificada. Es decir, se
estudió su alteración de frecuencia cuando reacciona con el reactivo de Drabkin,
convirtiéndola en una cianometahemoglobina (el cual presenta un espectro de absorción
propio); asimismo, se comparó con el espectro de absorción del grupo hemo (que fue
representado por la “solución hemina” en el experimento).

Por otro lado, en el proceso de cuantificación de proteínas, lo que se conoce como “Método
de Bradford” se basa en la unión del colorante azul de Coomassie con los grupos R básicos
y aromáticos de las proteínas para observar la variación del espectro de absorción. Cuya
coloración puede ser detectada a una longitud de onda de 595 nm.

III. DESARROLLO

Experimento 1: Espectro de absorción de la hemoglobina

 1. Comparación de los espectros de absorción de las soluciones A, B y C e
identificación de longitudes de onda de máxima absorbancia.

Se emplearon los datos de la absorbancia de cada solución a diferentes longitudes de onda

que se nos facilitaron en la guía de práctica. Las longitudes de onda que se evaluaron
variaron entre 390 nm hasta los 630 nm, con un intervalo de 5 nm. Con estos registros
elaboramos una gráfica para representar la variación del espectro de absorción de las tres
soluciones y poder elaborar una correcta interpretación al comparar sus valores.

Gráfica 1. Absorbancia vs. longitud de onda de las tres soluciones.

Longitudes máximas de onda:
a. A(Hemina): 390 nm (1.292 de absorbancia)
b. B(Hb): 415 nm (1.744 de absorbancia)
c. C(Drabkin + Hb): 420 nm (1.889 de absorbancia)

2. Actividad Hb2 del simulador “Espectrofotómetro UV-VIS virtual”

Se registró el espectro de absorbancia de diferentes formas de hemoglobina, esta vez con

un simulador de “Biomodel”, al usar un espectrofotómetro UV-VIS virtual. Se añadieron 3 ml
de cada muestra en una cubeta y se procedió a realizar un barrido entre 500 nm y 700 nm.

- Desoxihemoglobina, presentó la máxima absorbancia a longitud de onda de 560

nm.
 - Oxihemoglobina, presentó dos picos de máxima absorbancia a 540 nm y a 570 nm.

- Metahemoglobina, no se observan picos pronunciados,

se aprecia la mayor absorbancia a longitud de onda de 500 nm.

- Carboxihemoglobina, presentó dos picos de máxima absorbancia a 530 nm y a

560 nm.

- Cianometahemoglobina, la máxima absorción ocurre entre 540 nm y 555 nm de

longitud de onda.

Experimento 2: Cuantificacion de proteinas

Se aplicó la técnica espectrofotométrica para cuantificar proteínas de una solución y medir

las absorbancias correspondientes, con el uso de las técnicas de Bradford y Biuret,
construyendo una curva de calibración que contiene datos previos de sustancias conocidas,
donde medimos la absorbancia a determinada longitud de onda, obteniendo una serie de
puntos que nos darán una relación lineal. La recta de calibrado obedece a la ley de
Lambert-Beer siendo notable la relación directamente proporcional entre la concentración y
la absorbancia.

a) Cuantificación de proteínas por el método de Bradford

Se mezcla 1 mℓ de una muestra problema con reactivo de Bradford, para un volumen total
de 3 mℓ. Calcula la concentración de proteínas en la muestra de partida si el ensayo ha
proporcionado un valor A595 = 0.445

y=0.0007 x 0.445=0.0007 x x=0.445 /0.0007=635.71

en 3 mL = > Ci.Vi = Cf.Vf

Ci.1mL=X.3mL Ci=(635.71∗3)/1 = 1907.13 mg/L

b) Cuantificación por el método de Biuret

Se preparó el siguiente experimento descrito a continuación:

Curva
Reactivo Blanc estándar M M
o 1 2 3 4 5 6 1 2
Agua (μL) 1 9 8 5 4 2 0 5 5
0 0 0 0 0 0 0 0
0
BSA 28mg/mL (μL) 0 1 2 5 6 8 1 0 0
0 0 0 0 0 0
0
Muestra (μL) 0 0 0 0 0 0 0 5 5
0 0

Para el estándar de proteínas se utilizó seroalbúmina bovina (BSA) y las muestras problemas M1
y M2, corresponden a muestras de albúmina. A todos los tubos se les adicionó 900uL de reactivo
de biuret y se incubó 10 minutos a 37oC. Luego se leyó en espectrofotómetro a 540 nm.
Calcule las concentraciones de proteínas en las muestras M1 y M2

Tub BSA(mg/ A
o mL) 540nm
1 2.8 0.076
2 5.6 0.145
3 14 0.37
4 16.8 0.433
5 22.4 0.569
6 28 0.738
M1 ¿? 0.231
M2 ¿? 0.143
Se calculó las concentraciones de proteínas en las muestras M1 y M2:
M1: y=0.026 x 0.231=0.026 x x=0.231/ 0.026=8.88 mg/mL
M2: y=0.026 x 0.143=0.026 x x=0.143 /0.026=5.5 mg /mL
De acuerdo a la curva estándar de las proteínas, la concentración de la M1 es 8.88 mg/mL
y de la proteína M2 es 5.5 mg/mL.

IV. DISCUSIÓN

En la primera parte del experimento 1 se encontró que la absorbancia en las tres muestras
se daba a diferentes longitudes de onda. La hemina es el nombre farmacológico para el
grupo hemo, compuestos de protoporfirina con un átomo de hierro (III), actúa como grupo
prostético en diversas hemoproteínas.

El reactivo de Drabkin, es una solución que contiene ferricianuro de potasio (K 3Fe(CN)6), y

cianuro de potasio (KCN) y al juntarse con sangre diluida se obtiene
cianometahemoglobina, una forma estable que se recomienda internacionalmente para la
determinación total de la concentración de hemoglobina (Briones et al., 2009). El reactivo de
Drabkin puede reaccionar con los diferentes derivados de la hemoglobina, menos con la
sulfohemoglobina. En la parte 1 del experimento la máxima absorbancia de Drabkin+Hb fue
a 420 nm; sin embargo, al revisar la literatura encontramos que la máxima absorbancia
ocurre a los 540 nm valor que concuerda con los resultados de la parte 2 del experimento
(Van Kampen & Zijlstra, 1983). Esto es debido a que el primer pico (420 nm) es conocido
como la banda de Soret, este aparece dentro de la región azul-violeta del espectro de luz
visible encontrado especialmente en las porfirinas. No obstante, en la gráfica 1 de igual
forma se aprecian ligeros picos a 540 nm en la absorbancia de Drabkin+Hb.

En la parte 2 del experimento 1, al realizar el espectro de absorbancia (a partir de 500 nm)

de las diferentes derivados de hemoglobinas se observan cambios en la absorbancia. Las
variaciones se deben principalmente a la presencia de los diferentes ligandos que
acompañan a la Hb (O2, CO, CN y Hi). La desoxihemoglobina no presenta uniones con el
oxígeno. La literatura nos indica que en la oxihemoglobina es posible encontrar picos a 270,
337, 417, 547 y 575 nm (Nonoyama, 2004). En efecto, esto es lo que indican los resultados
del simulador, picos a 540 y 570 nm aproximadamente.

La metahemoglobina es la forma de hemoglobina que existe con el hierro oxidado (Fe +3),
perdiendo la capacidad de unirse al oxígeno molecular. Cuando la oxihemoglobina se
convierte a metahemoglobina, el color cambia de rojo brillante a marrón oscuro y tiene la
máxima absorbancia a 410 nm (correspondiente a la Banda de Soret) y 500-600 nm; ya no
se aprecian dobletes, en contraste con la oxihemoglobina (Nonoyama, 2004).

La carboxihemoglobina absorbe a 530 nm y 570 nm, se origina tras la unión del monóxido
de carbono (CO) al centro del grupo hemo y tiene una afinidad 200 veces mayor que la del
oxígeno. Debido a esto, una baja concentración de 0.1% de CO podría convertir la mitad de
las hemoglobinas en carboxihemoglobina, resultando mortal para un organismo (Nonoyama,
2004).
La cianometahemoglobina, como fue mencionado anteriormente, se obtiene a partir de la
oxidación de la hemoglobina (Fe+2 a Fe+3), formando una metahemoglobina y la posterior
unión del cianuro de potasio, formando un compuesto muy estable y que absorbe a 540 nm
(Van Kampen & Zijlstra, 1983).

En la segunda parte del laboratorio se utilizan dos diferentes métodos para el

reconocimiento de las proteínas propuestas en la primera parte.

En el método de Bradford, se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G250. Se basa en

la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una de color intensamente
azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan con los grupos amino de las
proteínas.

La interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por

lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de
detergente y líquidos orgánicos como el metanol.
El reactivo llamado Bradford, al entrar en contacto con proteínas se reduce y su color
amarillento torna a un azul intenso, la cuantificación se hace midiendo la absorbancia en un
espectrofotómetro, a 595 nm y también existe una relación lineal dentro de determinadas
concentraciones de proteínas (Bradford, M).

Para determinar la concentración de proteína total presente en una muestra se requiere la

preparación de una curva de calibrado empleando una proteína patrón, esto se realiza a
partir de los datos obtenidos en la cuantificación.
Utilizamos una mezcla de proteína y un reactivo de Bradford que contiene un colorante
coomassie blue, se forma un complejo proteína colorante que absorbe abs 595 nm. Este
método indirecto es para determinar la concentración de proteínas de los homogenatos.

El método de Biuret es una formación de un compuesto coloreado o cromóforo, de color

azul-púrpura, debido a la formación de un complejo entre el ión cobre y los enlaces
peptídicos a pH alcalino, que se mide a 540 nm.

El reactivo de Biuret es el sulfato cúprico diluido en solución alcalina. Los compuestos que
contienen dos o más enlaces peptídicos tales como el Biuret (NH2CONHCONH2) y
proteínas, forman complejos organometálicos con los iones cúpricos para dar un color
púrpura característico del método de Biuret (Puerto, 2013).

Esta reacción , es muy general, ya que todos los compuestos con dos grupos carbonilos o
enlaces peptídicos unidos directamente o por medio de un átomo de carbono o nitrógeno
dan reacción positiva. Los dipéptidos y los aminoácidos con excepción de la histidina, serina
y treonina, dan reacción negativa. A pH bajos los iones cobre se combinan también con los
grupos carboxilos y a pH altos reaccionan con los grupos amino de las proteínas. La
reacción no debe efectuarse en presencia de iones amonio, debido a que forma
compuestos coloreados con los iones de cobre. (Fernández Reyes & Galván, 2009)

El método de Biuret tiene pocos agentes interferentes (uno de ellos es el sulfato de amonio).

V. CONCLUSIONES

- La espectrofotometría Uv-Visible es una técnica que se basa en la capacidad de las

biomoleculas de absorber luz dentro del espectro electromagnético, de acuerdo a la
naturaleza de los átomos, la concentración de las soluciones, el espesor de la
muestra y el coeficiente de extinción, se puede calcular la absorbancia de cada
biomolécula a una longitud de onda conocida.
- La hemoglobina presenta un grupo hemo, este puede unirse a diferentes ligandos
como O2, CO, CN y Hi y así cambiar la longitud de onda donde ocurren sus máximos
de absorbancia.
- Este método de Bradford, mide la absorbancia y en base a eso se obtiene la
concentración de proteínas del homogenato.Se basa en la unión del colorante
coomassie blue a la proteína produce un corrimiento de absorbancia de 595 nm.
Además, este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente
arginina) y aromáticos.
- El método de Bradford resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos, ya
que se puede trabajar en un rango de 1 a 25 microgramos para un volumen de 1 ml
alternativo. Mientras que el método de Biuret, no es muy sensible para la
determinación de proteínas, ya que se requiere grandes cantidades de proteínas el
rango adecuado usando 1 ml final es de 0,1 a 1 mg de proteínas.
- Los dos métodos tienen en común que la disolución de proteína se mezcla con un
reactivo que determina que aparezca o se intensifique un color (azul) que se
cuantifica midiendo la absorbancia a una determinada longitud de onda frente a un
blanco de reactivo.

VI. CUESTIONARIO

- Experimento 1: Espectro de absorción de la hemoglobina

1. ¿Qué diferencias encuentra entre los máximos de absorbancia de la hemina y las

muestras de hemoglobina?- Explique el origen de esas diferencias.

Se puede observar que la máxima absorbancia de la hemina se encuentra a 390 nm,

mientras que la máxima absorbancia de la hemoglobina es a 415 nm. Se puede identificar
una diferencia en la estructura de la hemina con la estructura de la hemoglobina. La
hemina, es el grupo prostético de diversas hemoproteínas y enzimas, posee en el centro
Fe❑+3. [1] Mientras que la hemoglobina posee en el centro el Fe❑+2. Debido a esta
diferencia, la hemina es incapaz de poder captar el oxígeno.
En el caso de la hemoglobina, el hierro II tiene la capacidad de poder interaccionar con el
oxígeno y ese estado va a hacer que la molécula tenga una forma plana. En el caso de la
hemina que posee Fe❑+3, su estructura será triangular y va a hacer que la absorbancia
sea mayor, pero a menor longitud de onda. En cambio la absorbancia del hierro en estado
+2
Fe❑ , va a hacer que la absorbancia sea a mayor longitud de onda cercano al color rojo
(aproximadamente 700 nm). [2,3,13]

2. ¿Qué longitud de onda utilizará para identificar hemoglobina en una solución?

Explique el porqué.

Se utilizará 415 nm, que es la longitud de onda en el nivel máximo de absorbancia y dará la
mayor sensibilidad posible. La Hemoglobina presenta un grupo hemo que está conformado
por un conjunto de porfirinas y tiene como base a una protoporfirina. Las porfirinas
presentan una intensa banda de absorción de aproximadamente 400 nm y por esta razón,
415 nm será la longitud de onda se utilizará en el análisis espectrofotométrico. [1, 2, 4]

3. ¿Existe alguna razón estructural que origine el espectro de absorción de la

hemoglobina? Explique.

La hemoglobina tiene una característica de unión reversible y esto es debido a que la

hemoglobina depende de la unión de una proteína al grupo hemo y por lo tanto, puede
aceptar y soltar al oxígeno de manera reversible. [4,6] Cuando la hemoglobina se encuentra
y unida con el oxígeno, se llama oxihemoglobina (HbO2) y es la forma oxidada de la
molécula. Asimismo, también existe una forma reducida que es la desoxihemoglobina (Hb).
Ambas absorben y transmiten determinadas longitudes de ondas y estos estados de
oxidación y reducción son los que influyen en el espectro de absorción. [6,8]

Figura 1. Hemoglobina oxigenada y desoxigenada. (Benites, 2014)

4. ¿Cuáles son los cambios que Ud observa en el espectro de absorción de la Hb

cuando se utiliza el reactivo de Drabkin, a qué se debe?

A partir del gráfico se puede observar que la hemoglobina con el reactivo de Drabkin tiene
420 nm de absorbancia.

El reactivo de Drabkin está preparado a base de cianuro y potasio. La hemoglobina, que

posee Fe❑2, se oxida a Fe❑+3 cuando entra en contacto con el ferricianuro potásico y
esto forma la metahemoglobina. Todas las formas de hemoglobina pueden ser oxidadas
por este reactivo, excepto la sulfohemoglobina. Cuando la metahemoglobina entra en
contacto con cianuro potásico (KCN), se transforma en cianometahemoglobina. Este
compuesto es muy estable y tiene una longitud de onda de 540 nm. [9,10]

5. ¿Puede Ud. identificar cuáles son los picos de absorción que distinguen la
hemoglobina oxigenada y desoxigenada? Justifique su respuesta (revise la
bibliografía y cite referencia).

De acuerdo a lo anteriormente mencionado en la pregunta cuatro, la molécula de

hemoglobina puede estar unida al oxígeno y se llama oxihemoglobina (HbO2). En el caso
de que la hemoglobina no esté unida al oxígeno, entonces se le llama
desoxihemoglobina(Hb). [4,6] Debido a esto, el espectro de absorción es diferente según
la hemoglobina oxigenada y desoxigenada. En el caso de la desoxihemoglobina, posee
longitudes de onda más largas que la oxihemoglobina. Asimismo, existe una disminución
en el nivel de la absorbancia máxima. [11,12]

Figura 2. Espectro de absorción de Hemoglobina Oxigenada, deoxigenada en regiones

ultravioletas y en regiones visibles.

Experimento 2: Cuantificación de proteínas

1. Si Ud hubiese utilizado una muestra de suero como muestra problema del

experimento 3. ¿Los valores de concentración obtenidos para las muestras de
suero representan a la concentración de albúmina o a la concentración total de
proteínas?

La reacción de Biuret es un método, el cual se utiliza universalmente para medir la

concentración de proteínas total en suero porque la reacción es específica, ya que
detecta la presencia de compuestos de tres o más enlaces peptídicos. El reactivo
de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de
NaOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta,
 debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu+2 y los
pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces
peptídicos, esto si la reacción da positiva. La cantidad de producto formado
depende de la concentración de proteína.

2. ¿Con los ensayos realizados en la presente práctica, podría usted diferenciar la

concentración de una muestra de Hemoglobina en sangre o de Albúmina en suero?
Describa el ensayo a utilizar para la cuantificación de proteínas en cada caso,
indicando las longitudes de onda que utilizaría.

Con los ensayos realizados se puede diferenciar la concentració (Azul de verde

bromo cresol), ya que en el caso de la albúmina en suero está determinada con la
medición de la absorbancia de esta a una longitud que tiene como máxima
absorción (204 nm). Además, tomemos en cuenta que de acuerdo a Lambert Beer
se facilita la concentración. La longitud de onda que resulta es de 620 nm.

VII. BIBLIOGRAFÍA

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