CROMATOGRAFIA

Concepto

La cromatografía comprende un conjunto de técnicas que tienen como finalidad la separación

de mezclas basándose en la diferente capacidad de interacción de cada componente en otra
sustancia. De forma general, consiste en pasar una fase móvil (una muestra constituida por
una mezcla que contiene el compuesto deseado en el disolvente) a través de una fase
estacionaria fija sólida. La fase estacionaria retrasa el paso de los componentes de la muestra,
de forma que los componentes la atraviesan a diferentes velocidades y se separan en el
tiempo. Cada uno de los componentes de la mezcla presenta un tiempo característico de paso
por el sistema, denominado tiempo de retención. Cuando el tiempo de retención del
compuesto deseado difiere del de los otros componentes de la mezcla, éste se puede separar
mediante la separación cromatográfica.

Fundamento teórico

La separación de los diferentes componentes de una mezcla que se encuentran en un líquido o

gas es el resultado de las diferentes interacciones de los solutos a medida que se desplazan
alrededor o sobre una sustancia líquida o sólida (la fase estacionaria). Las diversas técnicas
para la separación de mezclas complejas se fundamentan en la diversidad de afinidades de las
substancias por un medio móvil gas o líquido y un medio absorbente estacionario (papel,
gelatina, alúmina o sílice) a través del cual circulan.

Cromatografía en capa fina (CCF)

En la cromatografía en capa fina (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa delgada de un
adsorbente (como por ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa) depositada sobre un soporte
plano como una placa de vidrio, o una lámina de aluminio o de plástico.

La CCF es una técnica analítica y tiene como objetivo el análisis de una mezcla de
componentes. 

El proceso es similar a la cromatografía de papel con la ventaja de que se desarrolla más

rápidamente, proporciona mejores separaciones y se puede elegir entre diferentes
adsorbentes. La CCF es una técnica estándar en el laboratorio de química orgánica. Debido a su
simplicidad y velocidad, la CCF se utiliza a menudo para monitorizar las reacciones químicas y
también para el análisis cualitativo de los productos de una reacción, puesto que permite
conocer de manera rápida y sencilla cuántos componentes hay en una mezcla.

Procedimiento

Una placa de CCF es una lámina de vidrio, metal o plástico recubierta con una capa delgada de
un sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina). Se deposita una pequeña cantidad de la muestra
problema en disolución en un punto en la parte inferior de la placa. Entonces la placa se
introduce en una cubeta cromatográfica, de forma que sólo la parte inferior de la placa queda
sumergida en el líquido. Este líquido o eluyente es la fase móvil y asciende por la placa de CCF
por capilaridad.            

A medida que el eluyente pasa por el lugar donde está la mancha de la mezcla problema se
establece un equilibrio entre las moléculas de cada uno de los componentes en la mezcla que
son adsorbidas y las que se encuentran en disolución.

En principio, los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la fuerza de su adsorción, de

forma que unos componentes se desplazarán más que otros. Cuando el eluyente llega a la
parte superior de la placa, esta se saca de la cubeta, se seca, y los componentes separados de
la mezcla se visualizan.

Visualización de las manchas

Si los compuestos son coloreados se pueden observar las manchas a simple vista. Si no es así,
hay varios métodos para visualizar las manchas correspondientes a cada componente de la
mezcla.

Utilizar luz ultravioleta (UV254) para observar la placa. Normalmente se adiciona un colorante
fluorescente al adsorbente, de forma que la placa sea fluorescente en todas partes excepto
donde haya una mancha correspondiente a un compuesto orgánico.

Utilizar reveladores, por ejemplo, vapores de yodo que es un reactivo inespecífico.

Emplear reactivos específicos para desarrollar coloración en las manchas. Esto se puede hacer
sumergiendo la placa de CCF en una disolución que los contenga o en forma de spray.

Cálculo del factor de retención Rf

Cuando son visibles, se puede determinar para cada una de las manchas el valor de Rf (factor
de retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en la placa. Cada compuesto
tiene un Rf característico que depende del disolvente empleado y del tipo de placa de CCF
utilizada, pero es independiente del recorrido del disolvente. De esta manera se puede ayudar
a identificar un compuesto en una mezcla al comparar su Rf con el de un compuesto conocido
(preferiblemente cuando se hacen eluir en la misma placa de CCF).

Cromatografia en columna

Es una técnica de purificación, puesto que permite aislar los compuestos deseados de una
mezcla.

Procedimiento

La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte
sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice (SiO2) y alúmina
(Al2O3)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El
resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por
efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un
equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye
por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá
interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes
velocidades y se conseguirá su separación. Así, de manera similar a otros tipos de
cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del medio sólido
se corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la columna
para cada uno de los componentes de la muestra original, que se recogerán en fracciones
diferentes.

La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes
componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten más
eficientemente con las moléculas polares de una mezcla por los lugares polares del
adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazará las moléculas, incluyendo las más
polares, rápidamente a través de la columna. Si el disolvente es muy polar la elución será muy
rápida y generalmente habrá poca separación de los componentes de la mezcla. Si por el
contrario el disolvente es muy apolar, no eluirán los compuestos de la columna. Por lo tanto, la
elección del eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. A menudo se
utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para determinar y
elegir el sistema solvente adecuado para cada separación.

En 1978 se introdujo una versión modificada denominada cromatografía en columna rápida. La

diferencia con la cromatografía en columna tradicional es que en la técnica rápida el disolvente
se hace atravesar la fase estacionaria aplicando una presión positiva. Esto hace que las
separaciones mejoren en resolución y se pueda disminuir el tiempo de elución, por lo cual
constituye un método de elección.

Análisis de los eluatos de la columna

Si los compuestos separados en una cromatografía en columna son coloreados, el progreso de

la separación se puede monitorizar visualmente. No obstante, a menudo los compuestos que
deben ser aislados suelen ser incoloros. En este caso, se recogen secuencialmente pequeñas
fracciones de eluatos en tubos rotulados y la composición de cada fracción se analiza por
cromatografía en capa fina. Una vez identificadas las diferentes fracciones que contienen el
mismo producto, se reúnen, se elimina el disolvente y se analiza la identidad de los
componentes por métodos espectroscópicos.

-La cromatografía analítica se utiliza para separar mezclas, y tiene como principal objetivo
determinar la identidad y concentración de los componentes de una mezcla.

-La cromatografía preparativa se emplea para purificar grandes cantidades de una especie
molecular.

 
 Cromatografía en papel

En la cromatografía sobre papel, las interacciones del soluto con el papel hacen que los
compuestos se desplacen a velocidades diferentes.

Una pequeña mancha de disolución que contiene la muestra se aplica sobre una tira de papel
cromatográfico a una distancia aproximada de un centímetro de la base. La muestra es
adsorbida en el papel. Esto significa que la muestra entra en contacto con el papel y puede
establecer interacciones. El papel es sumergido en un disolvente adecuado (etanol o agua) e
introducido en un contenedor cerrado. A medida que el disolvente asciende por el papel,
encuentra la muestra que empieza a viajar por el papel con el disolvente. Los diferentes
compuestos de la muestra recorren distancias diferentes dependiendo de la fuerza de sus
interacciones químicas con el papel. La cromatografía en papel requiere algún tiempo,
habitualmente se necesitan varias horas para completarse.

El cromatograma final puede ser comparado con otros de mezclas conocidas a fin de
identificar los componentes de la muestra. La cromatografía en papel de dos dimensiones
consiste en desarrollar el cromatograma en un disolvente, girar el papel 90º y desarrollar el
cromatograma en un disolvente diferente. Es útil para separar mezclas complejas de
compuestos similares.

Actualmente, la cromatografía en papel se utiliza poco y ha sido ampliamente reemplazada por

la cromatografía en capa fina. No obstante, todavía se utiliza como una poderosa herramienta
pedagógica.

Cromatografía de intercambio iónico

Se trata de una cromatografía en columna que utiliza una fase estacionaria con sustancias con
componentes con carga eléctrica. Se utiliza para separar compuestos cargados, incluyendo
aminoácidos, péptidos y proteínas. La fase estacionaria es normalmente una resina de
intercambio iónico que contiene grupos funcionales cargados que interaccionan con grupos
cargados de signo opuesto del compuesto que se quiere retener. Puede ser:

Intercambiador de iones cargado positivamente (intercambiador de aniones), que interacciona

con aniones

Intercambiador  de iones cargado negativamente (intercambiador  de cationes), que

interacciona con cationes

Los compuestos retenidos se pueden eluir de la columna por gradiente de elución o por
elución isocrática con un cambio de la concentración salina o del pH. La cromatografía de
intercambio iónico es muy utilizada para purificar proteínas.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

Se suele denominar HPLC, y es una forma de cromatografía en columna que se utiliza a

menudo en bioquímica y química analítica. La muestra problema es forzada a pasar a través de
una columna (fase estacionaria) por un líquido (fase móvil) a elevada presión, lo que disminuye
el tiempo que los componentes separados permanecen en la fase estacionaria, y por lo tanto,
el tiempo de difusión dentro la columna. En la salida de la comuna existe un detector que
indica la cantidad de soluto que está saliendo. Este proceso de difusión dentro la columna
comporta la aparición de picos anchos y pérdida de resolución. El hecho de estar menos
tiempo en la columna se traduce en picos más estrechos en el cromatograma resultante así
como una mayor resolución y sensibilidad.

Otra manera de disminuir el tiempo que la muestra está dentro de la columna es utilizar un
gradiente de disolventes, que consiste en cambiar la composición de la fase móvil a fin de
acelerar la salida de la muestra del interior de la columna. Se pueden considerar dos tipos:

Fase normal

Se utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se usa principalmente cuando la
muestra a analizar es de naturaleza apolar. Fue el primer tipo de HPLC, pero hoy en día ha sido
muy desplazado por la fase reversa.

Fase reversa

Se desarrolló debido al elevado número de biomoléculas polares. La fase estacionaria es apolar

y la fase móvil polar. Una de las fases estacionarias más empleadas es sílice tratada con
RMe2SiCl, donde R es una cadena alquílica como CnH2n+1 . En este caso, para una
determinada sustancia, el tiempo de retención aumenta con la polaridad de la fase móvil.

Cromatografía de permeación en gel (GPC)

La cromatografía de permeación en gel se conoce también como cromatografía de exclusión

por tamaño, porque separa las moléculas según su dimensión. Las moléculas pequeñas entran
en un medio poroso y por tanto les cuesta más salir de la columna, dejando las partículas más
grandes eluir primero. La GPC es una técnica muy empleada para determinar la distribución
del peso molecular en polímeros, aunque suele proporcionar baja resolución.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad se basa en interacciones no covalentes selectivas entre la

muestra y moléculas específicas. Es muy específica, pero no muy consistente. Se utiliza mucho
en bioquímica para la purificación de proteínas.

Cromatografía gas-líquido

La cromatografía gas-líquido se fundamenta en el reparto del equilibrio de la muestra a

analizar entre una fase estacionaria líquida y una fase móvil gaseosa. Es una técnica útil para
una gran variedad de mezclas no polares, pero es poco eficiente para moléculas termolábiles.