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    Práctica No 8A 2022B...

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    Alejaandra Roodriguez
    El documento describe varios métodos para la cuantificación de proteínas, incluyendo los métodos de Biuret, Bradford, BCA y Lowry. Explica los principios fundamentales de cada método y sus ventajas e inconvenientes. La práctica experimental involucra la construcción de una curva de calibración usando el método de Lowry y la determinación de la concentración de proteínas en una muestra problema.

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    Alejaandra Roodriguez
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    El documento describe varios métodos para la cuantificación de proteínas, incluyendo los métodos de Biuret, Bradford, BCA y Lowry. Explica los principios fundamentales de cada método y sus ventajas e inconvenientes. La práctica experimental involucra la construcción de una curva de calibración usando el método de Lowry y la determinación de la concentración de proteínas en una muestra problema.

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    Alejaandra Roodriguez
    El documento describe varios métodos para la cuantificación de proteínas, incluyendo los métodos de Biuret, Bradford, BCA y Lowry. Explica los principios fundamentales de cada método y sus ventajas e inconvenientes. La práctica experimental involucra la construcción de una curva de calibración usando el método de Lowry y la determinación de la concentración de proteínas en una muestra problema.

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    de 8

    Práctica No.

    8
    Métodos para la cuantificación de
    proteínas

    FUNDAMENTO TEÓRICO:

    La Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina


    básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere
    conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de
    enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

    Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan
    en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de
    derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. En la Tabla
    I se recogen los métodos más usados así como sus respectivas sensibilidades.

    Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas e inconvenientes, las principales se recogen en la
    Tabla II.
    Método de Biuret
    Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
    peptíd icos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es
    directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante
    específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y
    sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por
    ejemplo en suero).

    Método de Bradford
    Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El
    colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a
    la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor
    que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido, barato y pocas sustancias
    interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las
    soluciones básicas.

    Método de BCA
    El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso
    con inones Cu1+en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de
    monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino
    (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la
    cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia
    a compuestos que afectan a otros métodos.

    Método Lowry
    El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas.
    A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la
    intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de
    Lambert-Beer A= ε.l.c

    Este método consta de dos etapas:

    1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas forman do complejos con los átomos
    de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro.
    Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose
    los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción.
    El Cu2+se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

    2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin Ciocalteau, por los grupos fenólicos
    de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como
    catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido
    fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un
    complejo de color azul intenso.
    PRÁCTICA No. 8

    Objetivo:

    El alumno realizará una curva de calibración practicando el método de Lowry, empleando la


    proteína comercial seroalbúmina bovina además de determinar el contenido proteínico de una
    muestra problema.

    Material y Reactivos:

    Material:

    Vortex

    Gradillas

    Tubos de ensayo

    Micropipetas regulables de 20-200l y de 200-1000l


    Espectrofotómetro

    Celdas para espectro de 1ml

    Reactivos y Soluciones:

    Solución estándar de seroalbumina bovina (100mg/ml) Cambio de concentración a 1mg/ml)


    Muestra problema de proteína de concentración desconocida

    Reactivo de Lowry, compuesto por tres soluciones que se mezclan en el momento de su utilización,
    y que son las siguientes:

    A: Carbonato sódico al 2% en NaOH 0.1M

    B: Sulfato cúprico al 1%

    C: Tartrato sódico-potásico al 2%

    En el momento de su uso, se mezclan 10ml de A con 0.1 ml de B y 0.1 ml de C.

    Reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteau. Este reactivo viene preparado comercialmente y se debe


    mantener en refrigeración. Para su uso, se diluye inmediatamente antes de la reacción, en la
    relación de 1 parte de reactivo por 2 de agua destilada.

    Tubo 0 1 2 3 4 5 6
    Albumina (l) 0 40 60 80 120 160 200
    Agua (l) 200 160 140 120 80 40 0
    Reactivo de Lowry (l) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
    Agitar vigorosamente y dejar reposar 15 min.
    Agregar:

    Reactivo de Folin (l) 100 100 100 100 100 100 100
    Agitar vigorosamente y dejar reposar 30 min.

    Leer absorbancia a 750nm y anotar los valores en la siguiente tabla:

    Proteína (mg/ml) 0 20 50 40 60 80 100


    Absorbancia 0.087 0.349 0.420 0.543 0.766 0.889 1.105

    ACTIVIDADES

    1.- Graficar los valores de la absorbancia en función de la concentración de proteínas.

    Proteína
    0 20 50 40 60 80 100
    (mg/ml)
    Absorbanci
    0.087 0.349 0.42 0.543 0.766 0.889 1.105
    a

    Concentraci Proteína Absorbanci


    on (mg/ml) a Título del gráfico
    18.7777778 0 0.087 1.2
    45.2424242 20 0.349 y = 0.0099x + 0.0989
    64.8383838 40 0.543 1 R² = 0.9436

    52.4141414 50 0.42
    0.8
    87.3636364 60 0.766
    99.7878788 80 0.889
    0.6
    121.606061 100 1.105
    0.4

    0.2
    y = 0.0099x + 0.0989
    0
    x=(0.0989+y )/(0.0099) 0 20 40 60 80 100 120
    0.0989 0.0099

    2.- Calcular los valores de la pendiente y de la ordenada al origen de la recta.

    <

    R² = 0.9436

    CUANTIFICACION DE PROTEINAS DE LA MUESTRA

    Llevar a cabo las siguientes diluciones de la muestra problema: 1:10, 1:100.

    Tubo Muestras sin diluir Dilución 1:10 Dilución 1:100


    Muestra Problema (l) 200 200 200
    Reactivo de Lowry (l) 1000 1000 1000
    Agitar vigorosamente y dejar reposar 15 min.

    Agregar:

    Reactivo de Folin (l) 100 100 100 100 100 100 100

    Agitar vigorosamente y dejar reposar 30 min.

    Leer absorbancia a 750nm y anotar los valores en la siguiente tabla:

    Tubo Muestras sin diluir Dilución 1:10 Dilución 1:100


    Absorbancia 0.348 0.113 0.110
    Concentración en 142mg/mL 64.4mg/mL 63.4mg/mL
    proteína (mg/ml)

    ACTIVIDADES

    1.- Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras

    Proteína
    Absorbancia
    Concentracion (mg/ml)
    18.7777778 0 0.087
    45.2424242 20 0.349
    64.8383838 40 0.543
    52.4141414 50 0.42
    87.3636364 60 0.766
    99.7878788 80 0.889
    121.606061 100 1.105
    DIAGRAMA DE FLUJO DE LA PARTE EXPERIMENTAL

    CUESTIONARIO

    1.- ¿Qué es una curva patrón de proteínas? ¿Cómo se construye? ¿Cuál es su aplicación para la
    determinación de la concentración de proteínas?
    2.- Considera que la cuantificación de proteínas mediante interpolación proporciona un valor
    confiable de la concentración de proteínas en solución? ¿Por qué?
    3.- Por que la absorbancia directa a 280 nm no es confiable para cuantificar proteína?
    BIBLIOGRAFÍA
    TEXTO AUTOR PÁGINAS EDITORIAL

    DATOS DEL ESTUDIANTE


    NOMBRE EQUIPO GRUPO CALIFICACIÓN
    Y
    CÓDIGO

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