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Informes de biotecnología 20 (2018) xxx–xxx

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Informes de biotecnología

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Osteogénesis mejorada de la proteína de fusión osteopontina-Fc recombinante

producida en plantas
Kaewta Rattanapisita , Suchada Srifab ,_ Pregúntale a Pavasantb, c ,

Waranyoo Foolcharoena,d, *
aUnidad de Investigación de Productos Farmacéuticos Producidos por Plantas, Universidad de Chulalongkorn, Bangkok,
Tailandia bUnidad de Investigación de Tejido Mineralizado, Facultad de Odontología, Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia
C
Departamento de Anatomía, Facultad de Odontología, Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia
d
Farmacognosia y Botánica Farmacéutica, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Historial del artículo: La osteopontina (OPN) juega un papel importante en el proceso de regeneración ósea. Investigaciones anteriores
Recibido el 27 de diciembre de 2018
mostraron que la OPN humana recombinante podía expresarse en hojas de Nicotiana benthamiana e inducir los
Recibido en forma revisada el 4 de febrero de 2019 genes osteogénicos relacionados. Sin embargo, la purificación de OPN a partir de proteínas vegetales con
Aceptado el 4 de febrero de 2019
cromatografía de afinidad de Ni todavía no fue lo suficientemente efectiva. Para mejorar la calidad de la expresión
y purificación de proteínas en las plantas, construimos una forma de OPN basada en Fc. La proteína OPN
Palabras clave:
completa se fusionó con el dominio Fc de IgG1 humana. Aquí, mostramos que la OPN-Fc producida en plantas
Osteopontina (OPN)
aumenta el nivel de expresión de la proteína y facilita la purificación de la proteína recombinante. Nuestro
Proteína de fusión OPN-Fc
Nicotiana benthamiana
resultado mostró que la OPN-Fc producida en plantas puede estimular la expresión de genes osteogénicos
Proteína recombinante producida en plantas
relacionados como DMP1, OSX y Wnt3a y también la deposición de calcio en las células hPDL. Estos hallazgos
Ingeniería de tejidos sugieren que la OPN-Fc producida en plantas tiene una aplicación potencial en la ingeniería de tejidos en el
futuro. © 2019 Los autores. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC
BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

1. Introducción es necesario mejorar la osteopontina producida en las plantas. Un nuevo

enfoque para mejorar es usar el dominio Fc de la inmunoglobulina.
La ingeniería de tejidos es la tecnología que tiene como objetivo restaurar Las proteínas de fusión Fc se han investigado por su eficacia con varios éxitos
los tejidos perdidos y los órganos dañados. Se compone de tres factores [9-11].
importantes, que son las células, los andamios y las moléculas de señalización [1–3]. En la proteína de fusión basada en Fc, el dominio Fc de la inmunoglobulina
Varias proteínas juegan un papel importante en la ingeniería de tejidos como se fusiona con una proteína de interés, lo que a menudo aumenta sus
moléculas de señalización, como proteínas estructurales, factores de crecimiento características biológicas y farmacológicas [12,13]. La fusión de la proteína al
y citocinas [1,4]. Sin embargo, existen algunas limitaciones que ralentizan la dominio Fc puede aumentar su vida media plasmática [14,15] debido a la lenta
aplicación de estas proteínas en la ingeniería de tejidos, como el costo, la eliminación debido al mayor peso molecular [16].
disponibilidad, la estabilidad y la variabilidad de lote a lote. Estas limitaciones Además, las proteínas de fusión Fc se pueden purificar fácilmente a través de
han sido superadas por el desarrollo de la tecnología de proteínas recombinantes. una cromatografía de afinidad de proteína A de un solo paso. Además, la
seguridad del uso de Fc en proteínas de fusión en humanos se ha establecido
Entre las diversas plataformas de producción de proteínas recombinantes, claramente a partir del desarrollo previo de fármacos basados en proteínas
las plantas tienen ventajas sobre otras, como el bajo costo, la velocidad de basadas en Fc y anticuerpos monoclonales terapéuticos [17-19].
producción, la modificación postraduccional y la ausencia de patógenos Por todas estas razones, creemos que la plataforma de fusión Fc es un
humanos. Las plantas se han utilizado previamente para producir vacunas y enfoque prometedor para mejorar la expresión, la purificación y la función de la
proteínas terapéuticas [5–7]. Para aplicaciones de ingeniería de tejidos, se proteína OPN producida en plantas. En este estudio, expresamos transitoriamente
demostró que la proteína osteopontina producida en plantas induce genes la OPN recombinante fusionada con el dominio Fc de la IgG1 humana en N.
relacionados con la osteogénesis [8]. Sin embargo, el rendimiento y la pureza de benthamiana. Encontramos que la fusión de Fc no afectó la función biológica
de la proteína OPN.
Sin embargo, el nivel de expresión y la pureza de la proteína de fusión OPN-Fc
* Autor correspondiente.
producida en plantas mejoraron, en comparación con la producción de OPN
Dirección de correo electrónico: [email protected] (W. Phoolcharoen). sola. Nuestro estudio sugirió que el OPN-Fc

https://doi.org/10.1016/j.btre.2019.e00312 2215-017X/©
2019 Los autores. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
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2 K. Rattanapisit et al. / Informes de Biotecnología 20 (2018) e00312

la proteína de fusión es un candidato potencial para aplicaciones de ingeniería de la proteína se eluyó con glicina 0,1 M pH 2,7 y se neutralizó con Tris-HCl 1,5 M pH
tejidos en el futuro. 8. La proteína purificada se analizó mediante SDS-PAGE y Western blot. La proteína
Fc se expresó y purificó usando el mismo protocolo que la fusión OPN-Fc.
2. Materiales y métodos

2.1. Construcción de OPN recombinante fusionada con IgG1 Fc humana 2.3. SDS-PAGE y Western blot

La secuencia del gen de fusión OPN-Fc se generó mediante PCR superpuesta. La electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE)
Primera amplificación de genes OPN [8] y Fc [20] utilizando cebadores específicos se realizó en geles de acrilamida al 10%. En general, los geles se corrieron durante
NcoI-SP-OPN cebador directo (5'-CCATGGAAC 1 h a 160 V. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con azul brillante de
TTGGACTTTCTTGGATTTTCCTCTTGGCTATCCTTAAGGGTG-3') y cebador Coomassie o se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa
inverso linker-OPN (5'-CCACCTCCAGAACCTCCACCTCCT (Biorad, EE. UU.). Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5 %
GAACCTCCACCTCCATTGACCTCA GAAGATGCAC-3') y cebador directo enlazador- (disuelta en tampón TBST que contenía Tris 25 mM, NaCl 250 mM, Tween-20 al 0,1
Fc (5'-GGAGGTGGAGGTTCAGG-3') y cebador inverso SacI-KD-Fc (5'- %, pH 7,4) durante 1 hora a temperatura ambiente. Para detectar OPN, la membrana
GAGCTCTTAAAGCTCATCCTTCAGACTTGC CAGG GGACAAAG-3'), se incubó con anticuerpo anti-OPN de ratón (Abcam, Reino Unido) diluido 1:5000 en
respectivamente. Los productos de PCR de OPN y Fc se mezclaron y amplificaron leche descremada al 1 % en TBST a 4 °C durante la noche y conjugado IgG-HRP
nuevamente utilizando el cebador directo NcoI-SP-OPN y el cebador inverso SacI- anti-ratón de cabra (Promega, EE. UU.) diluido 1 :20.000 en leche desnatada al 1%
KD-Fc. Para la construcción Fc como control negativo, el gen Fc [20] se amplificó en TBST durante 1 h a temperatura ambiente. Además, OPN-Fc se confirmó usando
utilizando el cebador directo específico XhoI-ATG-L (5'-CTCGAGATGGGAGGTGGAGGTTcadena gamma de IgG antihumana. La membrana se sondeó con gamma-HRP
CAGGAG-3') y el cebador inverso SacI-KD-Fc. El producto de PCR de los genes de antihumano de cabra conjugado (The Binding site, Reino Unido) diluido 1:5000 y se
fusión Fc y OPN-Fc se purificó y clonó en pGem-T Easy (Promega, EE. UU.) para la incubó con la membrana a 4 °C durante la noche. Las membranas se desarrollaron
secuenciación. La secuencia correcta se cortó y se insertó en el vector geminiviral por quimioluminiscencia utilizando reactivo de detección ECL plus (GE Healthcare,
pBY030.2R con el sitio NcoI y SacI. El pBY-Fc y el pBYOPN-Fc se transformaron en Reino Unido).
la cepa DH10B de E. coli mediante el método de choque térmico. El ADN del
plásmido se confirmó mediante PCR de colonias utilizando cebadores específicos
de genes y restricción enzimática. El plásmido se transformó en la tinción GV3101 2.4. Cultivo de células

de Agrobacterium tumefaciens para la expresión en la planta.

Se obtuvieron células de ligamento periodontal humano (hPDL) a partir de tejido
de ligamento periodontal sano de terceros molares recién extraídos, no cariados,
extraídos por razones de ortodoncia en la Facultad de Odontología de la Universidad
2.2. Expresión y purificación de la proteína de fusión OPN-Fc de Chulalongkorn. El protocolo fue aprobado por el Comité Ético de la Facultad de
Odontología de la Universidad de Chulalongkorn y se obtuvo el consentimiento
La proteína de fusión OPN-Fc se expresó usando pBIOPN-Fc co-infiltrado con informado de cada paciente. Brevemente, cada diente se enjuagó con PBS estéril,
el vector p19 (Fig. 1). Se infiltraron células de A. tumefaciens en plantas de Nicotiana pH 7,4 y se extrajo hPDL del tercio medio de la raíz. Los explantes se recolectaron
benthamiana de 6 a 8 semanas de edad. Las plantas se incubaron en una cámara en placas de cultivo de tejidos de 35 mm para permitir la migración celular en medio
de crecimiento durante 4 días después de la infiltración. de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al
Las hojas se recolectaron para la determinación de la expresión y purificación de 10 % (FBS), 2 nML de glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de
proteínas. Para la purificación de la proteína de fusión OPN-Fc, las hojas de tabaco estreptomicina y 5 mg/ml de anfotericina B. Los medios y suplementos fueron
infiltradas se extrajeron con tampón Tris (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl). El suministrados por GibcoBRL (ThermoFisher Scientific, EE. UU.).
extracto crudo se centrifugó a 26 000 g a 4 °C durante 30 min. El sobrenadante se
filtró con un filtro de 0,45 micras y se cargó en una columna de proteína A sefarosa Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada de 37 Cina con 5% de CO2.
(GE Healthcare, Suecia). Después de lavar con tampón tris, el purificado Después de la confluencia de las células, se separaron con EDTA de tripsina al
0,25 % y se subcultivaron en una proporción de 1:3 en un cultivo de tejido de 60 mm.

Fig. 1. Diagrama del vector Geminiviral que se usa para expresar la proteína OPN-Fc (A) y el diagrama de la proteína OPN-Fc (B).
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platos, considerando como pasaje uno. Los experimentos se llevaron a cabo usando Tabla 1

células del pasaje 3–7. Las células de al menos tres donantes diferentes se utilizaron Secuencia de cebadores para análisis de expresión génica mediante RT-PCR.

en experimentos. Gene Secuencias de cebadores

GAPDH F: 5' CAC TGC CAA CGT GTC AGT GGT G 3'
2.5. ensayo MTT R: 5' GTA GCC CAG GAT GCC CTT GAG 3'
qALP F: 5' CGA GAT ACA AGC ACT CCC ACT TC 3'
R: 5' CTG TTC AGC TCG TAC TGC ATG TC 3'
El ensayo colorimétrico basado en tetrazolio (prueba MTT) (USB Corporation, EE.
qBMP2 F: 5' GCG TGA AAA GAG AGA CTG C 3'
UU.) es un compuesto de tetrazolio que se reducirá a un producto de formazán mediante
R: 5' CCA TTG AAA GAG CGT CCA C 3'
la deshidrogenasa mitocondrial y mide células vivas e in vitro. Además, se utilizó MTT qDMP1 F: 5' ATG CCT ATC ACA ACA AAC C 3'
para confirmar los ensayos de proliferación in vitro porque el producto de formazán R: 5'CTC CTT TAT GTG ACA ACT GC 3'
representa la actividad metabólica de las células viables en un momento determinado. qOPN F: 5' AGG AGG AGG CAG AGC ACA 3'
R: 5'CTG GTA TGG CAC AGG TGA TG 3'
qOSX F: 5' GCC GO AGC TGT GO ACC TC 3'
La proliferación celular puede determinarse indirectamente por los cambios en la R: 5' GCT GCA AGC TCT CCA TAA CC 3'
cantidad de formazán. Las células hPDL se sembraron en placas de microtitulación de F: 5' CTG TTG GGC CAC AGT ATT CC 3'
qWNT3a
24 pocillos recubiertas previamente con proteína G y OPN-Fc, respectivamente, a una R: 5'GGG CAT GAT CTC CAC GTA GT 3'

densidad de 5 x 104 células/cm2 /pocillo durante 24, 48 o 72 h. Las células se trataron

con 300 ml de solución de MTT de 0,5 mg/ml y se incubaron durante 20 min a 37 C en
una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Después de eso, se aspiró la solución de recubierto con 50, 100, 200 y 300 ng de proteína de fusión OPN-Fc producida en plantas
MTT. Los pocillos se lavaron con PBS y se añadieron a cada pocillo 500 ml de e incubado 2 h a temperatura ambiente. Las células hPDL se sembraron en una placa
Glicina:DMSO (1:9). Una vez disueltos los cristales de formazán, se midió la densidad de microtitulación de 24 pocillos a una densidad de 8 x 104 células por pocillo. Después
óptica de las soluciones de formazán espectrofotométricamente a 570 nm usando una de 24 h de tratamiento, se extrajo el ARN para el análisis de la reacción en cadena de
longitud de onda de referencia de 630 nm en un lector de microplacas universal la polimerasa en tiempo real (RT-PCR).
ELX800UV (Bio-Tek Instruments Inc., EE. UU.). Los experimentos se realizaron por
triplicado. 2.8. Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
(RT-qPCR)

2.6. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) El ARN total se extrajo de cada experimento con el reactivo TRIsol-RNA Lysis
(5Prime, Gaithersburg, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se
La concentración de proteína de la proteína de fusión OPN-Fc producida en plantas cuantificó utilizando un espectromonómetro nano drop2000 (Thermo Fisher Scientific,
se determinó usando un ensayo ELISA de acuerdo con los manuales del kit ELISA de EE. UU.).
osteopontina humana (OPN) (Sigma-Aldrich, EE. UU.). Se evaluó la absorbancia del Las muestras de ARN se convirtieron en ADNc usando un kit de transcriptasa inversa
producto final a 450 nm utilizando un lector de microplacas (BioTek, ELx800, EE. UU.). (Promega, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La expresión génica se detectó mediante RT-PCR usando una máquina de reacción

2.7. Preparación de la placa recubierta de OPN en cadena de la polimerasa en tiempo real Light Cycler Nano (Roche Applied Science,
EE. UU.) y Fast Start Essential DNA Green Master (Roche Applied Science). El protocolo
La placa de microtitulación de 24 pocillos se revistió previamente en la superficie de PCR se estableció como; desnaturalización a 94 C durante 10 segundos, recocido a
usando 50 mg/ml de Proteína G (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) 250 ml 60 C durante 10 segundos y extensión a 72 C durante 10 s durante 45 ciclos. El
por pocillo y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La placa se bloqueó producto de reacción de GAPDH se utilizó como gen de referencia para el control
con 10 mg/ml de BSA durante 2 ha temperatura ambiente antes de lavarla con PBS 3 interno. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 1.
veces. el plato estaba

Fig. 2. La expresión de la proteína de fusión OPN-Fc en Nicotiana benthamiana aumentó en comparación con la proteína OPN (A) y la proteína purificada contenía porciones tanto de OPN (B) como de Fc humano (C).
Western blot para comparar el nivel de expresión de las proteínas de fusión OPN y OPN-Fc en extractos crudos (A). Los extractos crudos de hojas de N. benthamiana 4 días después de la agroinfiltración con p19 y
pBIOPN [8] (carril 1) o pBIOPN-Fc (carril 2) se cargaron en el gel SDS-PAGE en condiciones reductoras. La transferencia Western se sondeó con antisuero de OPN antihumano de ratón y se detectó con antisuero IgG
de cabra antiratón. Western blot para detectar porciones de OPN (B) y Fc (C) en la proteína de fusión OPN-Fc. El extracto crudo de la hoja de N. benthamiana 4 días después de la agroinfiltración con p19 y pBIOPN-Fc
se cargó en el gel SDS-PAGE en condiciones reductoras. La transferencia Western se sondeó con antisuero de OPN antihumano de ratón (B) o antisuero de Fc antihumano (C) para detectar la porción de OPN y Fc en
la proteína de fusión OPN-Fc, respectivamente. Carril 1: planta de tipo salvaje, Carril 2: plantas infiltradas con pBYOPN-Fc y p19.
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Fig. 3. La proteína de fusión OPN-Fc no mostró ningún efecto sobre la proliferación de células del ligamento periodontal humano (PDL). Tres líneas celulares de PDL establecidas a partir de tres donantes diferentes se
cultivaron en placas recubiertas con 300 ng de OPN-Fc o proteínas Fc. Los experimentos se realizaron por triplicado. La supervivencia celular se evaluó mediante ensayo MTT los días 1, 2 y 3. Los datos representaron
la absorbancia a 540 nm. Los datos son medias de 3 muestras replicadas independientes +/SD. El control en este experimento son las células no tratadas. (* p 0,05).

2.9. Tinción con rojo de alizarina S

Las células hPDL se cultivaron en medios generales (GM: 10 % DMEM suplementado

con 10 % FBS, 1 % suplemento Glutamax I, 1 % antibiótico-antimicótico) o medios
osteogénicos (OM: 10 % DMEM suplementado con 50 mg/ml de ácido ascórbico, fosfato
de B-glicero 10 mM, dexamtasona 100 nM) durante 21 días. Posteriormente, las células
se fijaron con metanol frío durante 20 min. Después de lavarlas con agua desionizada,
las células se incubaron con solución de tinción de rojo de alizarina S al 2 % (p/v) (Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Cada uno de los
especímenes de tinción se lavó con agua desionizada y se secó al aire.

3. Resultados

3.1. Expresión y purificación de la proteína de fusión OPN-Fc recombinante

La expresión transitoria de la proteína de fusión OPN-Fc se logró con el vector

Geminiviral [21] diseñado para contener la OPN en el extremo N terminal. Agrobacterium
tumefaciens contenía el vector pBYOPN-Fc y A. tumefaciens co-infiltrado contenía el
vector p19 (Fig. 1A) en hojas de N. benthamiana. Se generó la construcción OPN-Fc,
proteína OPN humana con el dominio Fc de IgG1 humana en su extremo C. Estos dos
dominios se separaron mediante un conector (Gly4Ser)3 para garantizar el plegamiento y
la función correctos de la proteína (Fig. 1B).

Las hojas infiltradas se recolectaron 4 días después de la infiltración. La expresión de

la proteína de fusión OPN-Fc se detectó mediante transferencia de Western utilizando un
anticuerpo anti-OPN. Comparamos los niveles de expresión de proteínas de la proteína
de fusión OPN y OPN-Fc. El resultado de la transferencia Western usando anticuerpo anti-
OPN confirmó que el nivel de expresión de la proteína OPN aumentó cuando la proteína
se fusionó con Fc (Fig. 2A).
Para confirmar la expresión de las partes OPN y Fc en la proteína de fusión, se realizó
una transferencia Western usando antisuero anti-OPN y anti-IgG humana. La proteína de
fusión OPN-Fc purificada por afinidad de proteína A se evaluó mediante gel SDS-PAGE
teñido con Coomassie (datos no mostrados) y mediante inmunotransferencia con antisuero
anti-OPN (Fig. 2B) y antisuero IgG1 antihumano (Fig. 2C).

Fig. 4. Efecto de la proteína de fusión OPN-Fc sobre la inducción de genes osteogénicos relacionados
3.2. El efecto de la proteína de fusión OPN-Fc producida en plantas sobre la proliferación en células del ligamento periodontal humano (PDL). Las células hPDL de tres donantes diferentes se

de células hPDL cultivaron en placas recubiertas con 50 ng, 100 ng, 200 ng y 300 ng de proteína de fusión hOPN OPN-
Fc producida en plantas durante 24 h. Se extrajo el ARN total y se realizó una PCR en tiempo real
utilizando conjuntos de cebadores para los genes OSX, DMP1 y Wnt3a humanos.
Se estudió el efecto de la proteína de fusión OPN-Fc sobre la proliferación de células Los valores de expresión de ARNm relativos se calcularon normalizados para las células cultivadas en
hPDL, en comparación con la proteína OPN. En este estudio, las células hPDL se 300 ng de placa recubierta con Fc producida en plantas. Los valores obtenidos para las células de
establecieron a partir de 3 donantes diferentes. Las celdas estaban control cultivadas en placas no recubiertas se establecieron en 1 para el cálculo posterior del cambio de pliegue.
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cultivadas en la placa recubierta con OPN-Fc recubierta. El número de células se vida útil de las proteínas [10,22] y permiten una expresión más fácil con la purificación
determinó por ensayo MTT después de cultivar durante 1, 2 y 3 días. Los resultados por afinidad de la proteína A [23]. Las proteínas de fusión basadas en Fc están
mostraron que la proteína de fusión OPN-Fc no afecta la proliferación de la célula hPDL, compuestas por la porción Fc del anticuerpo unida a la proteína de interés a través de un
similar a la proteína OPN y el control negativo Fc producido en plantas (Fig. 3). péptido conector. Además, el dominio Fc puede mejorar la solubilidad y la estabilidad de
la proteína recombinante mediante el plegamiento independiente de la proteína [24,25].

3.3. El efecto de la proteína de fusión OPN-Fc producida en plantas sobre la En este estudio, se utilizó un sistema de expresión transitoria basado en geminivirales
activación de genes relacionados con la osteogénesis [26] para expresar la proteína de fusión OPN-Fc recombinante en hojas de N.
benthamiana infiltradas con Agrobacterium. La fusión del fragmento Fc del anticuerpo
Las células hPDL se cultivaron en placas recubiertas con 50, 100, 200 y 300 ng de IgG1 humano [20] y la señal de retención de ER KDEL al extremo C-terminal de Fc
proteína de fusión OPN-Fc durante 72 h. Se extrajo el ARNm y se analizó la expresión facilitó la expresión y purificación de la proteína OPN. Cuando se comparó la proteína de
de los genes OSX, DMP1 y Wnt3a mediante qRT-PCR. Los valores de expresión de fusión Fc con la proteína OPN en un Western blot (Fig. 2A), el nivel de expresión de la
ARNm relativos se calcularon normalizados para las células cultivadas en placas proteína de fusión OPN-Fc fue mayor que el de OPN sola. Además, la presencia de la
recubiertas con Fc producidas en plantas. Nuestros resultados mostraron que 300 ng de porción tanto de OPN como de Fc se confirmó con transferencia Western usando
proteína OPN-Fc pueden inducir la expresión de los genes OSX, DMP1 y Wnt3a (Fig. 4). antisuero anti-OPN (Fig. 2B) y anti-IgG humana (Fig. 2C).
La OPN-Fc induce estos tres genes de forma dependiente de la dosis.

La proteína OPN se expresó en plantas y mostró la capacidad de inducir los genes

3.4. El efecto de la proteína de fusión OPN-Fc producida en plantas sobre la osteogénicos relacionados en las células madre periodontales humanas [8]. Sin embargo,
activación de la calcificación la purificación de proteína recombinante en plantas usando cromatografía de afinidad de
Ni no fue eficiente. Había proteína contaminada con plantas en la proteína OPN
Las células hPDL se cultivaron en medio general y medio osteogénico durante 21 purificada. En este estudio, se usó un cromatógrafo de afinidad de proteína A para
días. Las células hPDL se tiñeron con rojo de alizarina al final del experimento. La Fig. 5 purificar la proteína de fusión OPN-Fc.
mostró que las células hPDL cultivadas en medio general (GM) no eran rojas, pero las
células eran de color rojo claro cuando se cultivaron en medio osteogénico (OM). Cuando Estudios previos demostraron que la fusión del antígeno proteico con la Fc aumenta
las células se cultivaron en OM y se trataron con la proteína Fc producida en la planta la inmunogenicidad de los antígenos [27–29]. Este es el primer estudio que muestra que
como control negativo (Fc), las células eran de color rojo claro, similar a OM. Las células este enfoque puede utilizarse para mejorar la expresión de la proteína terapéutica. La
cultivadas en OM y tratadas con proteína OPN-Fc producida en plantas mostraron un proteína de fusión OPN-Fc purificada se probó en las células del ligamento periodontal
color rojo brillante, lo que indica el depósito de calcio en estas células. La proteína OPN- humano y no mostró diferencias significativas en la proliferación en comparación con la
Fc modula la calcificación de las células hPDL de forma dependiente de la dosis (Fig. 5). proteína OPN comercial y la proteína no tratada (Fig. 3).

Sin embargo, la proteína OPN-Fc podría inducir los genes relacionados con la
osteogénesis como DMP1, OSX y Wnt3a (Fig. 4) y estimular la deposición de calcio en
4. Discusión las células hPDL (Fig. 5). La deposición de calcio fue inducida por la proteína OPN-Fc
producida en plantas de manera dependiente de la dosis. Esto sugirió que OPN-Fc podría
La plataforma de fusión Fc es la tecnología atractiva para el desarrollo de fármacos. inducir la diferenciación de osteoblastos en células hPDL. En este estudio,
Las ventajas de la fusión Fc es aumentar la mitad

Fig. 5. Efecto de la proteína de fusión OPN-Fc sobre la inducción del depósito de calcio en células hPDL. Se detectó calcificación en las células hPDL que sembraron 50.000 células/pocillo
y se cultivaron en medio osteogénico durante 21 días. Las colonias de hPDL se tiñeron con solución de rojo de alizarina S al final del experimento. GM: Células de control que crecen en
medio general, OM: Células de control que crecen en medio osteogénico, Fc: Células tratadas con la proteína Fc producida en plantas en medio osteogénico, OPN-Fc 100 ng: Células
tratadas con 100 ng de OPN- producida en plantas Proteína Fc en medio osteogénico, OPN-Fc 200 ng: Células tratadas con 200 ng de proteína OPN-Fc de origen vegetal en medio
osteogénico, OPN-Fc 300 ng: Células tratadas con 300 ng de proteína OPN-Fc de origen vegetal en medio osteogénico .
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6 K. Rattanapisit et al. / Informes de Biotecnología 20 (2018) e00312

Las células madre del ligamento periodontal se utilizaron como modelo. Las células en Nicotiana benthamiana estimula genes relacionados con la osteogénesis en células
del ligamento periodontal humano, Sci. Rep. 7 (1) (2017) 17358.
madre del ligamento periodontal poseen las características de las células madre
[9] G. Young, J. Mahlangu, R. Kulkarni, B. Nolan, R. Liesner, J. Pasi, C. Barnes, S.
mesenquimales con el potencial de diferenciarse en células similares a los Neelakantan, G. Gambino, LM Cristiano, GF Pierce, G. Allen, Proteína de fusión Fc del
osteoblastos y se ha propuesto que son los principales tipos de células involucradas factor VIII recombinante para la prevención y el tratamiento del sangrado en niños con
en la regeneración periodontal [30]. hemofilia A grave, J. Thromb. Hemost. 13 (6) (2015) 967–977.
[10] JT Sockolosky, S. Kivimae, FC Szoka, La fusión de un péptido corto que une la
Nuestro estudio mostró que la plataforma de fusión Fc se puede aplicar para inmunoglobulina G a una proteína recombinante aumenta sustancialmente su vida media
usar con la proteína recombinante en la ingeniería de tejidos. La plataforma de plasmática en ratones, PLoS One 9 (7) (2014) e102566.
fusión Fc puede aumentar el nivel de expresión de proteínas y también mejorar el [11] Z. Lu, KJ Lee, Y. Shao, JH Lee, Y. So, YK Choo, DB Oh, KA Hwang, SH Oh, YS
Han, K. Ko, Expresión de la proteína de fusión GA733-Fc como candidata a vacuna para
proceso de purificación. Además, no afecta la función de la proteína interesada.
el cáncer colorrectal en plantas transgénicas, J. Biomed. Biotecnología. 2012 (2012)
Este enfoque se puede aplicar a otras proteínas recombinantes que tienen 364240 (364240).
dificultades en el nivel de expresión y el proceso de purificación. [12] JA Dumont, T. Liu, SC Low, X. Zhang, G. Kamphaus, P. Sakorafas, C. Fraley, D.
Drager, T. Reidy, J. McCue, HW Franck, EP Merricks, TC Nichols, AJ Bitonti, G.
F. Pierce, H. Jiang, Actividad prolongada de una proteína de fusión del factor VIII-Fc
En resumen, informamos una estrategia para la producción de proteína OPN recombinante en ratones y perros con hemofilia A, Blood 119 (13) (2012) 3024–3030.
efectiva y económica a partir de plantas. En este estudio, la proteína de fusión OPN- [13] Y. Gan, N. Dang, Z. Qu, R. Shi, L. Ding, L. Wang, S. Pang, proteína de fusión GLP-1-
Exendin-4/IgG4 (Fc) como nuevo fármaco para tratamiento de la diabetes, exp. clin.
Fc se expresó en hojas de N. benthamiana usando vectores Geminiviral. La
Endocrinol. Diabetes 123 (6) (2015) 371–375.
proteína de fusión OPN-Fc facilitó el proceso de purificación y también aumentó el [14] HK Yu, HJ Lee, JH Ahn, IH Lim, JH Moon, Y. Yoon, LS Yi, SJ Kim, JS Kim, la fusión del
nivel de expresión. Nuestros hallazgos mostraron que la proteína OPN-Fc producida dominio Fc de inmunoglobulina con la apolipoproteína (a) kringle V prolonga
significativamente la vida media plasmática sin afectar su actividad antiangiogénica,
en plantas indujo los genes osteogénicos relacionados y la deposición de calcio en
Protein Eng. Des. sel. 26 (6) (2013) 425–432.
las células hPDL. Estos hallazgos sugieren que la OPN-Fc producida en plantas [15] H. Wang, JS Davis, X. Wu, la fusión del dominio Fc de inmunoglobulina con TRAIL prolonga
tiene una aplicación potencial en la ingeniería de tejidos en el futuro. Sin embargo, significativamente su semivida plasmática y mejora su actividad antitumoral, Mol. Cáncer
se requieren más estudios para aclarar el mecanismo subyacente. Ther. 13 (3) (2014) 643–650.
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Conflicto de intereses 15070.
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recombinante (rFIXFc) demuestra seguridad y actividad prolongada en un estudio de fase
Los autores declaran no tener conflictos y consentimiento informado. 1/ 2a en pacientes con hemofilia B, Blood 119 (3) (2012) 666–672.
[18] J. Tuettenberg, M. Seiz, KM Debatin, W. Hollburg, et al., Farmacocinética, farmacodinámica,
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Agradecimientos
sanos y dos pacientes con glioma, Int.
inmunofarmaco. 13 (1) (2012) 93–100.
Este trabajo fue apoyado por la subvención del Fondo de Investigación de [19] LW Moreland, SW Baumgartner, MH Schiff, EA Tindall, et al., Tratamiento de la artritis
reumatoide con una proteína de fusión del receptor del factor de necrosis tumoral humano
Tailandia No MRG5980087 e IRN59W0001. KR recibió el apoyo del Fondo
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