Capítulo 1: Introducción A La Histotecnología Parte Ii: Técnicas Histológicas E Histoquímicas
Capítulo 1: Introducción A La Histotecnología Parte Ii: Técnicas Histológicas E Histoquímicas
Capítulo 1: Introducción A La Histotecnología Parte Ii: Técnicas Histológicas E Histoquímicas
MAYOR (2021)
Conceptos clave
Histoarquitectura: corresponde a la disposición y ordenamiento estructural de los
diferentes componentes de un tejido, principalmente células y macromoléculas. En
condiciones normales, un tejido está compuesto por un segmento funcional, altamente
celular y encargado de ejercer todas sus funciones fisiológicas inherentes; dicha porción es
conocida como parénquima, mientras que el área compuesta esencialmente por matriz
extracelular rica en fibras y mucopolisacáridos, con escasa presencia celular, se le conoce
como estroma y constituye lo que denominamos como tejido de sostén o conectivo. El
hito tisular que separa ambos compartimientos es conocido como membrana o lámina
basal. Ciertas patologías, como las neoplasias, trastornos inflamatorios, enfermedades
inmunomediadas y presencia de agentes biológicos (microorganismos) ocasionan diversos
efectos deletéreos sobre los tejidos, hecho que conocemos como disrupción
histoarquitectónica.
Topografía tisular: término derivado del griego: Topos- (lugar o territorio) y
-grafia (descripción o trazado), hace alusión al posicionamiento, disposición o
localización de un determinado componente tisular, en el contexto de un tejido, siendo
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Detención
Evitar la
de la putrefacción
autólisis
Preservación de
Conservación de grupos
histoarquitectura funcionales
bioquímicos
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Color
Aspecto al Patrón de
corte crecimiento
Dimensiones Textura
Distribución
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H B C D
E
A
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6) Aspecto al corte: una vez descritas las características esenciales del fragmento
recibido, se deberá proceder con su seccionamiento macroscópico, el cual
consiste en la obtención de fragmentos tisulares discretos, los cuales deberán
tener el tamaño adecuado para ser insertos en la cápsula histológica,
respetando las dimensiones descritas a priori. Sin embargo, la selección del
fragmento a procesar no es aleatoria, sino que deberá considerar un estricto
criterio por parte del anátomo patólogo, así como también por el
histotecnólogo, en el sentido que deberá incorporar el segmento lesionado del
tejido, así como también -si el fragmento captado por el médico cirujano lo
permite- un área de tejido sano o no lesionado, con el fin de efectuar una
comparación microscópica de eventuales disrupciones histoarquitectónicas,
respecto de su parte indemne. De momento -para este nivel- únicamente es
necesario comprender el fundamento general de la macroscopía y de cómo
proceder a efectuar un corte macroscópico de un fragmento de tejido, que
será destinado a histoprocesamiento; en cursos superiores, se enseñará el
protocolo correcto para la obtención de fragmentos macroscópicos,
dependiendo si el protocolo de obtención quirúrgica ha sido incisional o
excisional, para lo cual -en este último caso- se deberá realizar el estudio de
bordes correspondiente. Dado lo anterior, el siguiente diagrama tridimensional
ilustra -en términos generales- la forma de seleccionar adecuadamente un
segmento de tejido para el posterior análisis histopatológico.
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Dícese de un agente o fluido desprovisto de agua. En este caso, únicamente se aplica al etanol absoluto y al
xileno.
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A B
CANTO PARA Nº
Es importante saber que, para realizar la inclusión, todos los fragmentos de tejidos
que estaban en el interior de la cápsula deberán ser retirados, removiendo
previamente la tapa (la que se descartará como residuo domiciliario) para
orientarlos en el molde de acero. Las siguientes imágenes muestran una secuencia
de pasos sobre cómo proceder para realizar una adecuada inclusión tisular,
ejemplificando con un fragmento de colon de equino.
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A B
C D E
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A B
C D
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Por ello, es primordial que un equipo que permita detectar organismos y/o estructuras de
estas dimensiones tan minúsculas cuente con un sistema de amplificación basado en
superposición de lentes, con el acoplamiento de un sistema o fuente lumínica, a modo de
facilitar la formación de imágenes al observador. Derivado de ello, la principal
componente del fundamento de la microscopía se basa en la fotodinámica de la luz,
consistente en el estudio de las variadas modificaciones, tanto direccionales, como
conformacionales, que experimenta un haz de luz (reflexión, refracción y difracción). A
continuación, se especifican las cuatro principales variantes de la microscopía, cuya
selección y empleo dependerá de los propósitos del observador y del tipo de espécimen
en estudio.
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Fig. 11. A. Esquematización del fundamento óptico del microscopio convencional, con a
proyección de imágenes y trazado de rayos paraxiales (en amarillo). Creación personal,
Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
De acuerdo a las imágenes del microscopio óptico de campo claro, las partes más
relevantes a considerar de un microscopio óptico son las siguientes:
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2
6
1
4
3 5
8
6
9 7
Fig. 12. Microscopio óptico de campo claro, con cabezal acoplado sobre sistema de captación de
microfotografías (cámara), con sus respectivos hitos más importantes, numerados a continuación.
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Fig. 16. Corte histológico de riñón teñido con Isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las
áreas color verde brillante corresponden a reacción positiva, mientras que las zonas
color verde opaco corresponden a ruido de fondo, siendo uno de los principales
inconvenientes de la microscopía de epifluorescencia.
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Fig. 17. Comparación visual de resultados entre un extendido citológico teñido con
fluorocromos, bajo un microscopio de epifluorescencia (A) y bajo microscopía confocal
(B), en los que se observan claras diferencias entre el grado de definición de estructuras
y contornos celulares.
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Fig. 19. Esquematización del efecto que producen los colimadores en el direccionamiento
de los haces de luz. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
Coloración cito-histológica
Teniendo en consideración que, tanto los extendidos citológicos, como los cortes
histológicos, deben ser analizados, estudiados y diagnosticados mediante microscopía,
dichos preparados deben ser tratados por una serie de colorantes, sucesivos lavados y
reactivos, con el objeto de realizar una demarcación topográfica diferencial de las
diferentes estructuras tisulares.
Con el objeto de comprender más a cabalidad el fenómeno de la coloración tisular, es
necesario recordar algunos conceptos básicos acerca de la naturaleza física ondulatoria de
la luz. Como es sabido, la luz corresponde a un exiguo segmento situado en el centro del
espectro electromagnético, comprendido entre los 400 y los 750 nm de longitud de onda,
valores representados por la letra griega “lambda” (λ). Recordemos que 1 nm = 1x10-9 m).
En valores menores a 400 nm, continúa hacia la radiación ultravioleta (UV), mientras que
en valores mayores a 750 nm tenemos a la radiación infrarroja. Por su parte, los
colorantes son complejos moleculares capaces de proporcionar un determinado tinte o
color, en cuya estructura podemos distinguir dos porciones relevantes:
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Cada molécula colorante, cuando es estimulada por un haz de luz blanca (haz incidente),
absorbe una determinada cantidad de longitudes de onda y, dependiendo de su
configuración molecular, refleja un haz de luz perteneciente a un valor específico de
longitud de onda del espectro visible (haz de luz reflejado), el cual es traducido –por el
observador- en un color característico.
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Producto químico que tiene la propiedad de asociarse a cationes divalentes (como el ion cuproso o Cu++ y
el calcio, Ca++) y trivalentes, formando complejos órgano-metálicos u órgano-minerales estables e insolubles,
que pueden ser visualizados en un color o tonalidad específica.
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Coloración corriente
Cuando nos referimos a coloración corriente, también llamada tinción de rutina, hacemos
alusión a aquella técnica de coloración que debe ser aplicada a todo preparado
histopatológico, como un gold standard, para efectuar la primera evaluación microscópica
del mismo, con el fin de obtener un diagnóstico. En histotecnología, la coloración más
común es -por antonomasia- la Hematoxilina & Eosina; las razones que subyacen a su
empleo son variadas y abarcan conceptos tanto prácticos, como teóricos. En primera
instancia, se trata de una coloración topográfica núcleo-citoplasmática, de tonalidades
contrastantes, que demarca diferencialmente núcleos por la Hematoxilina (en púrpura) de
citoplasmas y otros constituyentes tisulares y celulares, por medio de la eosina (en
diferentes gamas de rosado); por otro lado, se trata de un protocolo sencillo, de fácil
implementación y alta reproducibilidad entre usuarios. En esencia, la propiedad que
tienen todas las estructuras tisulares o celulares que tengan afinidad por la Hematoxilina,
recibe el nombre de basofilia, mientras la cualidad de aquellas porciones de tejido o
células que presenten predilección por la eosina, recibe el nombre de eosinofilia o
acidofilia.
Todo preparado histopatológico debe ser analizado, en primera instancia, mediante esta
técnica. En caso de un eventual hallazgo o ante la pesquisa de un componente tisular o
celular específico, no detectable de forma directa y/o diferencial con la coloración
corriente, se procederá a la realización de un algoritmo diagnóstico complementario, el
cual consiste en el diseño de protocolo ordenado, sistemático y secuencial, a través del
cual se busca hallar –de forma certera- el diagnóstico cito o histopatológico.
A B
Fig. 22. Campos de cortes histológicos teñidos con Hematoxilina & Eosina. A. Retina de
erizo de tierra (Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020). B. Metástasis de carcinoma
espinocelular en pulmón de erizo de tierra. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021. 28
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Identificación de biopolímeros
Un biopolímero es un complejo macromolecular de origen biológico, compuesto –a su
vez- por una serie de subunidades reiterativas, conocidas como monómeros. En el
contexto de la química orgánica, podemos clasificar a los biopolímeros en cuatro grandes
familias: carbohidratos (azúcares), lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Dentro de cada
grupo, es posible encontrar una gran variedad de ejemplos, cada uno de los cuales cumple
funciones cruciales en las células y tejidos, tanto en condiciones fisiológicas o patológicas.
En el contexto de la histoquímica, la primera clasificación mencionada a priori abarca a los
glicosaminoglicanos (neutros y ácidos) y a polisacáridos animales, como el glicógeno. Por
su parte, los lípidos –en este contexto- podemos subdividirlos en lípidos neutros (entre los
cuales encontramos a los triglicéridos, como ésteres alcohólicos de ácidos grasos) y a los
lípidos complejos, como es el caso de la esfingomielina (constituyente esencial de la vaina
de mielina).
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Por otro lado, las proteínas –uno de los grupos bioquímicos más trascendentes para el
estudio de patologías animales- en la actualidad, los métodos histoquímicos que existen
para su detección son escasos y poco empleados. Entre los principales constituyentes de
la matriz tisular que, hasta nuestros días, siguen siendo objeto de estudio e identificación
con estos protocolos, podemos citar a productos hormonales del sistema APUD (Amine
Precursor Uptake Decarboxylase, consistente en un sistema enzimático encargado de la
síntesis de mediadores neuroendocrinos polipeptídicos, tales como hormonas y
neurotransmisores derivados de aminoácidos), Regiones Organizadoras Nucleolares o
NORs (correspondientes a proteínas codificadas a partir de copias teloméricas de ARN
ribelosómico, participantes directas de la síntesis y ensamblaje de subunidades
ribosomales) y el amiloide (proteína patológica resultante de un plegamiento erróneo,
durante el ensamblaje de su estructura secundaria. Los métodos histoquímicos para
detectar los constituyentes fibrilares de la matriz extracelular (no carbohidratos) son
quizás los más difundidos y de amplio uso hasta nuestros días; en este caso, podemos
incluir el colágeno (en cuyo grupo agruparemos a las fibras reticulares de colágeno tipo
III), elastina y actina. Gran parte de las proteínas presentes en los tejidos, ya sea, en el
contexto de una sobreexpresión o regulación a la baja, en determinados procesos
patológicos, son identificadas con elevada especificidad y sensibilidad gracias a los nuevos
métodos inmunodiagnósticos, gracias a la reacción antígeno (detección de epítopes) y
anticuerpo (mediante un determinado CDR del paratopo), tópico que será tratado
inextenso en la tercera parte del presente capítulo.
• APUD
•GAGs • NORs
neutros • Amiloide
•GAGs ácidos • Componentes
fibrilares de la MEC
•Glicógeno
Azúcares Proteínas
Ácidos
Lípidos
nucleicos
•Neutros • ADN
•Mielina • ARN
En última instancia, tenemos a los ácidos nucleicos, clasificados –desde el punto de vista
bioquímico- en función de su azúcar constituyente, enlazada a su respectiva base
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Identificación de carbohidratos
Los hidratos de carbono son macromoléculas compuestas por subunidades monoméricas
repetitivas de monosacáridos, cada uno de los cuales –a su vez- está enlazado a su
eslabón antecesor o sucesor, mediante enlaces α-1,2 y β-1,4 glucosídicos. También
podemos encontrar carbohidratos del tipo heteropolisacáridos, constituidos por
eslabones sucesivos de disacáridos, donde uno de los azúcares simples está provisto de un
grupo amino (-NH2) en su estructura; de esta forma, están siguiendo el patrón formular
[Monosacárido-Aminomonosacárido]n. Esta última modalidad es habitual en un tipo
especial de hidrato de carbono conocido como mucopolisacárido.
En los tejidos, por una parte, forman una porción esencial de la matriz extracelular o
intersticial, que es definida como aquel compartimiento de elevada complejidad
bioquímica y consistencia gelificada, en el cual están inmersas las células que componen
un tejido (parénquima y estroma). Esta matriz está constituida, en primer lugar, por una
sustancia amorfa fundamental rica en proteoglicanos y glicosaminoglicanos o GAGs
(también referidos como mucopolisacáridos), responsables de la hidratación y turgencia
de la MEC, mediante la atracción de moléculas de agua. Por otro lado, tenemos una matriz
fibrilar, abundante en complejos proteicos de elevada masa molecular y responsables de
oponer resistencia a las fuerzas externas de tracción, compresión, flexión y torsión. Así
mismo, los GAGs también forman parte de diversos productos glandulares exocrinos, por
lo tanto, están presentes en la secreción salival, lacrimal y diversas secreciones
sintetizadas y liberadas por las células que constituyen el tubo digestivo, con gran ahínco
en los epitelios gástricos, duodenal y colónico.
En virtud del grado de acidez de los mucopolisacáridos, dada la presencia o ausencia de
radicales bioquímicos o grupos funcionales determinados en su molécula, podemos
clasificarlos en ácidos y neutros, respectivamente.
Por otro lado, dentro de los carbohidratos que podemos demarcar con técnicas
histoquímicas, tenemos el glucógeno, polisacárido de reserva energética, presente en
forma más abundante en el interior del citoplasma de los hepatocitos y los miocitos
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A B
C D
Fig. 23. Aplicaciones de la Reacción de PAS. A. Secreción glandular (glándula lacrimal de erizo de
tierra). B. Membranas basales (túbulos seminíferos, equino). C. Acúmulo de glicógeno
intraneuronal en ternero. D. Neumonía granulomatosa por hongos en canino. Laboratorio de
Patología Veterinaria, 2021. 32
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A B
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A B
V
Fig. 25. Aplicaciones generales del método de coloración con Alcian Blue. A. Detección de
glicosaminoglicanos en núcleo pulposo intervertebral. B. Identificación de productos de
secreción glandular, en el colon de un gato. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
d) Método combinado de PAS/Alcian Blue: este método se utiliza para realizar una
marcación simultánea de glicosaminoglicanos neutros y ácidos en un mismo corte
histológico. A su vez, es muy empleado para el estudio de ciertos cuadros
patológicos conocidos como degeneraciones mixomatosas, en las que al menos
uno de estos tipos de mucopolisacáridos prolifera en un contexto tisular
determinado, en detrimento de otros constituyentes de la matriz extracelular,
tales como, colágeno, elastina o estructuras celulares especializadas, como
miocitos lisos o estriados.
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Identificación de proteínas
Como bien se mencionó en los párrafos introductores, la identificación histoquímica de
proteínas ha caído progresivamente en el desuso, por dos principales motivos:
- Las proteínas son estructuras tan complejas, como variadas, por lo que resulta muy
complejo es poder identificar una estructura proteica completa en un fragmento
tisular.
- Las proteínas son macromoléculas extremadamente ubicuas y de morfología muy
variada, es decir, pueden estar formando complejos con azúcares, lípidos y ácidos
nucleicos, al mismo tiempo que pueden ser, tanto pequeños homodímeros de
transmembrana, como grandes polímeros fibrilares helicoidales, que ocupan parte
sustancial de la matriz extracelular.
- El advenimiento de nuevos métodos de detección de elevada sensibilidad y
especificidad, tales como las técnicas inmunodiagnósticas, ha relegado a las
vetustas técnicas histoquímicas específicas para proteínas a la obsolescencia, ello
considerando que los métodos inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes
detectan fracciones específicas y puntuales de una estructura proteica, suficientes
para confirmar la presencia y grado de expresión de una determinada molécula, en
un contexto tisular.
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Fig. 27. Esquematización de las fuerzas biomecánicas que imprimen efectos en los
constituyentes fibrilares de la Matriz Extracelular, implicados en el mantenimiento de la
morfología tisular. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
Entre las fuerzas biomecánicas que se producen en los tejidos, podemos encontrar:
- Tracción: fuerza ejercida por ambos extremos de un fascículo fibrilar, en
direcciones opuestas, con tendencia al estiramiento.
- Compresión: fuerza impresa desde ambos extremos de un fascículo fibrilar, en
dirección centrípeta, con tendencia a la contracción.
- Flexión: fuerza proporcionada perpendicularmente al eje central del elemento,
con tendencia a generar un doblez. Lo anterior produce una compresión en su
parte cóncava y una tracción en la zona convexa (opuesta).
- Torsión: las fuerzas aplicadas, en diferentes puntos, actúan sobre el fascículo
generando un efecto de giro en dos direcciones contrarias.
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C
B
A
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Colágeno tipo Componente de la LED de la membrana basal, Entrelazado con colágeno tipo III a modo de
VII conocido también como fibras de anclaje o red, constituye la denominada reticulina.
refuerzo reticular.
Identificable sólo por IHQ.
Colágeno tipo No está presente en la MEC, sino que son Proteína fibrilar de transmembrana,
XVII pequeñas fibras de conexión ubicadas entre componente esencial de la lámina Electrón-
el hemidesmosoma y el colágeno IV. lúcida (LEL).
Fig. 29. Tabla que sintetiza los principales tipos de colágeno presentes en la matriz extracelular de los
tejidos animales, haciendo mención a su localización y función en su contexto determinado. Creación
personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
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A B
C D
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Fig. 30. Técnicas de coloración específicas para colágeno. A. Hígado de bovino con
distomatosis por Fasciola hepática, Hematoxilina & Eosina. B. Confirmación del patrón
cirrótico con técnica Tricrómica de Masson. C. Estudio de birrefringencia con microscopía
de luz polarizada, en un caso de carcinoma espinocelular cutáneo bien diferenciado
(Picrosirius Red, con birrefrinencia en rojo-anaranjado. D. Carcinoma espinocelular cutáneo
pobremente diferenciado, con birrefringencia en amarillo-verdoso. Laboratorio de
Patología Veterinaria, 2021.
A B
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Identificación de amiloide
El amiloide es una proteína, cuya síntesis deriva de procesos netamente patológicos, por
lo tanto, no puede ser encontrada en tejidos indemnes. Morfológicamente y bajo tinción
corriente, se ha caracterizado como un depósito amorfo, hialino, eosinofílico, de
localización topográfica intersticial o extracelular, el cual puede confundirse fácilmente
con colágeno o sustancia amorfa fundamental, con la diferencia que el amiloide –a
diferencia del primero- no se dispone en fascículos continuos y consistentes, sino que –
debido a que su estructura consiste en un β-plegamiento aleatorio- se visualiza con un
aspecto más irregular; por otra parte, se distingue de los glicosaminoglicanos, en que
éstos –a la coloración de rutina- adquieren una afinidad tintorial muy débil por la eosina,
por lo que se observan de un color rosa pálido, mientras que el amiloide se aprecia en un
tono rosa fuerte. El daño principal que induce el amiloide en los tejidos es una atrofia
local en el sitio del depósito, comprimiendo las estructuras del parénquima y parte del
estroma.
Con respecto a su estructura orgánica, cada cadena de amiloide está compuesta por
polipéptidos con composición aminoacídica aleatoria y variada; el componente principal
se denomina fibrilla amiloídea y está formada por filamentos helicoidales de 7 a 10 nm de
diámetro, cada una de las cuales cuenta con una fracción glicoproteica, llamada
componente P y una matriz químicamente heterogénea, llamada componente C. Al
mismo tiempo, cada fibrilla se compone de filamentos, los cuales corresponden a sus
subunidades (proteínas β-plegadas), formando una estructura serpenteante y en dirección
ascendente. La figura A muestra un modelo tridimensional de un filamento de amiloide,
donde los aminoácidos se disponen –a modo de cuentas de collar- formando pliegues
sucesivos y cuyo eje (axis) muestra una trayectoria de crecimiento vertical, hasta formar
una fibrilla, la cual se asociará –mediante enlaces peptídicos- a otro filamento contiguo.
En este caso, cada segmento que está compuesto por cuentas de un color determinado,
corresponde a un pliegue beta. La figura B, la cual despliega un plano cenital del filamento
de amiloide, muestra en pleno la estructura β-plegada de esta proteína, en donde cada
surco corresponde al sitio de unión peptídica con otro filamento; de esta forma, las
uniones sucesivas de filamentos constituirán una fibrilla de amiloide. Al mismo tiempo,
este surco de β-plegamiento es el área donde se depositarán las moléculas de colorante
específico para detectar –de manera selectiva- esta estructura.
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Si bien, su origen es tan complejo, como diverso, se ha establecido que existen dos
potenciales mecanismos principales, para comprender cómo se efectúa su síntesis y
depósito en el espacio tisular intersticial. De este modo, podemos aducir a dos tipos de
amiloidosis: primaria o autoinmune y secundaria o adquirida.
A B
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A B C
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entablan los enlaces peptídicos entre los aminoácidos del polipéptido en construcción,
actuando como ribozimas (ácidos nucleicos con capacidad de generar actividad
enzimática). En las células eucariotas, un 80% está localizado en el citoplasma y un 20% en
el núcleo, específicamente en el nucléolo, sitio en el que se produce la síntesis del ARN
ribosomal.
ARN pol I
B23
C23
UBF
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Los resultados obtenidos a partir de este método deben expresare por medio de un
recuento de sumatoria de NORs en 10 campos de gran aumento (40X). En general, los
procesos neoproliferativos malignos, tales como carcinomas, sarcomas, mastocitomas de
alto grado, melanomas, entre otros, presentan un recuento elevado de NORs, puesto que,
considerando que las células neoplásicas se caracterizan por evadir los puntos de control
de restricción del ciclo celular –donde el objetivo es detener el ingreso a una determinada
fase del mismo y evitar así la continuación de su crecimiento- éstas comienzan un ciclo de
proliferación reiterativa y sostenida en el tiempo, evadiendo los mecanismos de inducción
de senescencia (tales como autofagia y apoptosis); en esta etapa de crecimiento, se
requiere de la síntesis de un sinnúmero de proteínas que participan en la fase expansiva
de una neoplasia, en la que se requiere de la presencia de ribosomas, para permitir la
traducción del ARNm y formación de polipéptidos. Entre estas proteínas encontramos a
factores de crecimiento, péptidos proangiogénicos, factores de motilidad, integrinas de
anclaje a la MEC y al endotelio, metaloproteinasas, entre otros; en consecuencia, las NORs
nos otorgan información sobre la actividad transcripcional de una célula, que es elevada
per se en una neoplasia, con más ahínco si es maligna.
A B
De esta forma, para el estudio del potencial proliferativo de una neoplasia –en conjunto
con marcadores inmunohistoquímicos de pronóstico- es necesario estimar el promedio de
NORs tingibles3 y establecer lo que se conoce como Tiempo de Generación, concepto que
hace alusión al lapso que demora una célula en completar su ciclo de crecimiento,
incluyendo desde síntesis de ARNm y proteínas (G1), replicación del ADN (fase S),
monitoreo de la maduración celular (G2), hasta la mitosis. Un elevado recuento de NORs
3
Dícese de una estructura que resulta identificable a la microscopía, dada su afinidad por un determinado
colorante o reactivo empleado en una técnica.
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supone un bajo tiempo de generación, vale decir, la célula crece a una rápida velocidad,
evadiendo incluso la fase G2, en la que participan los factores promotores de la
maduración, consistentes en el conjugado proteico Ciclina B1/CDK1, antes del ingreso a la
instancia de división. Estudios en mastocitomas caninos como el de Sledge et al. (2016)
fijan un umbral de distinción entre bajo grado (mejor pronóstico) y alto grado (mal
pronóstico), mediante el Score AgNOR, en un promedio de 54 NORs por 10 campos de
gran aumento; de esta forma, un score ≥54 NORs, corresponde a un mastocitoma de bajo
grado, mientras que un score <54 NORs, equivale al diagnóstico de un mastocitoma de
alto grado.
Fig. 36. Esquematización tridimensional de las Regiones Organizadoras Nucleolares, las cuales se
posicionan en el telómero del brazo corto de los cromosomas acrocéntricos. La esfera irregular
situada más al fondo corresponde al nucléolo, sitio en el que se produce la codificación del ADN
a ARN ribosómico, el que se ensamblará junto a sus cuatro proteínas (en colores verde, rojo,
amarillo y marrón). Creación personal con Tinkercad, Laboratorio de Patología Veterinaria,
2021.
Identificación de componentes hormonales del sistema APUD
Hoy en día, se afirma que el sistema endocrino no está remitido únicamente a un grupo de
órganos o tejidos, sino que los tejidos de todos los sistemas orgánicos son capaces de
sintetizar y liberar mediadores químicos, capaces de controlar -regulando al alza, feedback
positivo, o a la baja, feedback negativo- los más diversos procesos biológicos que tienen
lugar en el organismo.
Hasta hace unas décadas, desprendiéndose de la premisa mencionada a priori, se pensaba
que existía una variante del sistema endocrino, la cual consiste en grupos celulares
específicos, asociados a tejidos epiteliales glandulares, tanto endocrinos, como exocrinos,
las cuales se encuentran ampliamente distribuidas en los diferentes sistemas, razón por la
cual se le acuñó el término de Sistema Endocrino Difuso. Precisamente, los avances en la
endocrinología abrogaron el empleo de esta denominación y se ha decidido adoptar una
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nueva clasificación a estas células con funciones reguladores específicas y que no forman
parte de la trama tisular de un órgano endocrino, la cual conocemos hoy como sistema
APUD, del inglés, Amine Precursor Uptake Decarboxylase (sistema de captación y
descarboxilación de los mediadores amino precursores). Pese a que gran parte de estos
productos poseen una función endocrina, también están implicados en la regulación de la
actividad nerviosa, pues -en este grupo- encontramos así mismo a variados
neurotransmisores. Por este motivo, en caso que estas células desarrollen una
transformación de carácter neoplásico, estos procesos reciben el nombre de neoplasias
neuroendocrinas, entre cuyas particularidades se encuentra su elevado potencial invasivo
y metastásico, vinculados a un pobre pronóstico de sobrevida.
Por lo tanto, sus funciones -aunque variadas- suelen asociarse a regulación de la motilidad
de las capas musculares del tubo digestivo, estimulación de secreción pancreática (de
acuerdo a requerimientos sistémicos), activación del centro emético, regulación de la
contractibilidad vascular sanguínea, medición de respuestas de hipersensibilidad tipo I
(inmediata o alérgica), entre otras funciones.
La siguiente tabla sintetiza las funciones de las principales secreciones neuroendocrinas.
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Fig. 38. Tabla resumen de los principales mediadores neuroendocrinos del sistema APUD, en la
que se incorporan hormonas y neurotransmisores, con sus respectivas funciones efectoras y
células encargadas de su síntesis y liberación. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
A B
A A
Fig. 38. A. Trastorno neoproliferativo pulmonar, de apariencia neuroendocrina, en un canino. Hematoxilina & Eosina.
B. Reacción de Grimelius positiva en células neoplásicas (flecha roja). Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
Identificación de lípidos
Los lípidos son biomoléculas apolares e hidrofóbicas, los cuales se encuentran
ampliamente distribuidos en los tejidos animales. Dado que están compuestos, en gran
parte, por segmentos apolares, normalmente provistos de cadenas metílicas, son
disueltos en los fluidos deshidratantes empleados durante el histoprocesamiento, tales
como el Ottix Plus®, benceno, cloroformo y xileno. Por ello, los adipocitos (células del
tejido conectivo que están provistas de grandes inclusiones grasas intracitoplasmáticas)
son visualizados a como estructuras circulares dispuestas en empalizada, en las que
únicamente se denotan sus límites citoplasmáticos y su núcleo constreñido hacia la
periferia, no así su citoplasma, el cual se observa en blanco y de aspecto vacuo, cada vez
que el tejido es procesado con protocolos convencionales.
No obstante, como se hubo mencionado, existen protocolos de histoprocesamiento
expreso, los cuales no emplean agentes apolares, sino que los tejidos son inmersos de
forma directa en un medio hidrofílico (por ende, no presenta afinidad molecular por los
lípidos), denominado OCT®, además de un equipo especializado para el seccionamiento de
los tejidos a espesor micrométrico, conocido como crióstato. En éste, el fragmento tisular
es tratado a temperatura de congelación (-20°C), con el objeto de facilitar la formación de
un bloque sólido, resistente al corte histológico. Como resultado de este proceso, las
fracciones lipídicas de la matriz tisular no sufren modificaciones químicas, manteniendo
indemnes sus estructuras y permitiendo su coloración con determinados colorantes,
específicos para la detección de lípidos. Desde el punto de vista histoquímico, los lípidos
se pueden clasificar según su capacidad de unión a ciertas moléculas colorantes, en virtud
de su configuración molecular:
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Fig. 39. Corte histológico, obtenido mediante congelación, de un hígado de bovino con
esteatosis severa, teñido con técnica de Oil Red. Laboratorio de Patología Veterinaria,
2021.
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
Fig. 39. Campos de un corte histológico de cerebelo de equino. A. Tinción con Hematoxilina &
Eosina. B. Tinción con Luxol Fast Blue, en el que la sustancia blanca se aprecia en un color azul
cobalto. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
Reacción metacromática
Cuando el sustrato tisular, al ser tratado con una gama de colorantes específicos –
denominados, así mismo, como metacromáticos- emite una longitud de onda –traducida
en un determinado color- diferente a la tonalidad original del colorante empleado,
hablamos de metacromasia (del griego, Meta- , más allá de y -khroµos, -khromos,
color).
Ciertas matrices tisulares tienen características químicas únicas y particulares,
consistiendo en biopolímeros polianiónicos, es decir, provistos de una secuencia de
aniones (carga negativa) situados en tándem (uno tras otro) y espaciados el uno del otro
por una distancia de 0,5 nm. Este tipo de matrices de tejido recibe un nombre específico,
desde el punto de vista histoquímico, siendo conocidas como cromótropos; ejemplos de
éstos tenemos a la matriz cartilaginosa (que circunda los condrocitos de forma territorial e
interterritorial), correspondiente al sulfato de condroitina y al medio intracitoplasmático
de los mastocitos, en este caso, sulfato de heparina. Ambos medios moleculares tienen
en común el hecho que están compuestos por macromoléculas –clasificadas como
carbohidratos- provistas de una elevada concentración electrolítica aniónica, es decir,
polianiones. Ahora bien, si son carbohidratos ¿por qué simplemente no se identifican con
los métodos tratados en el párrafo destinado a esta clasificación? Debido a que, los
colorantes empleados para aquellas técnicas se ven imposibilitados de teñir de forma
directa estas estructuras, por un efecto volumétrico o estérico; de este modo, tanto el
colorante empleado en la Reacción de PAS (pararrosanilina), como el Alcian Blue, son
moléculas tan grandes que –al interaccionar con una secuencia de aniones separados por
un espacio tan exiguo- no logran entablar los enlaces químicos adecuados para lograr una
coloración estable. Es por este motivo, que estas estructuras –preferentemente- resultan
mejor demarcadas con colorantes de geometría molecular planar, como es el caso del
Azul de toluidina.
Si bien, el Azul de toluidina emite un color situado en la gama de los azules (480-530 nm),
cuando interacciona con otras estructuras tisulares, en el caso de estar en contacto con un
cromótropo –como los recientemente mencionados- se produce un cambio en su
espectro de absorción y reflexión, percibiéndose una coloración, dependiendo del largo de
la secuencia polianiónica, en una mayor λ (color rojo, hacia los 650-750 nm) o menor λ
(color violeta, hacia los 400-475 nm).
Fig. 40. Estructura molecular del colorante Azul de toluidina, en la que se aprecia su geometría
planar (180º), lo que es crucial para la comprensión del fundamento de la metacromasia.
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
Fig. 41. Tabla resumen de los tipos de metacromasia y su color. Creación personal, Laboratorio
de Patología Veterinaria, 2021.
A B
A A
Fig. 42. Campos de cortes histológicos de mastocitomas cutáneos caninos, teñidos con Azul de
toluidina. A. Mastocitoma de bajo grado con metacromasia positiva (o g-metacromasia). B.
Mastocitoma de alto grado, con metacromasia negativa (o a-metacromasia). Laboratorio de
Patología Veterinaria, 2019.
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A B
A A
Fig. 43. Campos de cortes histológicos de un pulmón de canino, con un cuadro de neumopatía
urémica. A. Tinción con Hematoxilina & Eosina. B. Reacción de Von Kossa, en la que los
depósitos de sales calcáreas se distinguen en negro, en torno a la lámina propia alveolar.
Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
A B
A B
Fig. 44. Campos de cortes histológicos de un hígado de canino, con un cuadro de intoxicación
por cobre. A. Tinción con Hematoxilina & Eosina, en la que se observan depósitos globulares
café-anaranjados. B. Reacción con Ácido rubeánico, donde se visualizan los depósitos de cobre
en negro. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
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Hemoglobina
Hematógenos Hemosiderina
Pigmento
Pigmentos biliar
Lipídicos Lipofuscina
No
hematógenos
Proteicos Melanina
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En la mayoría de los casos, condiciones fisiológicas inclusive, estas estructuras son proclive
a depositarse formando acúmulos en determinadas localizaciones de la topografía tisular,
siendo detectables a la microscopía de luz incluso sin requerir de la técnica de coloración
corriente, para visualizarlos en una tonalidad particular y se presentan como acúmulos
globulares discretos, tanto intracitoplasmáticos, como extracitoplasmáticos, según sea el
caso. No obstante, la gran mayoría de los pigmentos presentes en tejidos animales se
caracterizan por presentar, en su totalidad, una condición de monocromía, es decir,
aquellos biocromos que serán objeto de estudio en diversas patologías presentan una
gama de coloración muy similar, oscilando entre en marrón anaranjado y el pardo. De esta
afirmación se escinde la importancia de recurrir a métodos histoquímicos especializados,
para permitir la detección selectiva de estas macromoléculas, las cuales poseen orígenes
metabólicos muy disímiles entre sí.
Desde el punto de vista biológico, podemos clasificar a los biocromos según su origen
metabólico en hematógenos y no hematógenos. Los primeros derivan, esencialmente, a
partir de la hemoglobina, pigmento bermellón presente en el interior de los citoplasmas
de los eritrocitos, la cual –mediante le paso de una serie de vías metabólicas- van
adquiriendo una tonalidad y localización tisular determinada. En esta clasificación,
podemos mencionar a la hemosiderina, hematoidina y bilirrubina (también denominada
como pigmento biliar). Por su parte, los pigmentos no hematógenos tienen su génesis a
partir de procesos en los que no se ven involucrados complejos del tejido sanguíneo; en
este caso, podemos clasificarlos en pigmentos proteicos y lipídicos. Mientras que los
proteicos provienen a partir de una serie de reacciones de oxidorreducción a partir de
ciertos aminoácidos, como la tirosina, que dará origen al pigmento melánico (melanina)
los lipídicos se originan tras reacciones de lipoperoxidación fosfolipídica, dando paso a la
formación de un grupo conocido como lipopigmentos, entre los cuales podemos
enumerar a la lipofuscina y al pigmento ceroide.
Pigmentos hematógenos
Su origen está ligado a la hemocatéresis o eriptosis, fenómeno de remoción fisiológica o
patológica de los hematíes, siendo el primer caso al cumplir su vida útil de 120 días en
circulación. Tras este evento, el cual tiene lugar –mayoritariamente- tanto en los
parénquimas esplénico como hepático (y, en menor medida, en la médula ósea), se
produce la liberación de la hemoglobina al espacio extracelular, induciendo la activación
del sistema fagocítico mononuclear (según el contexto tisular local: células de Küpfer en el
hígado y células retículo-endoteliales en el bazo). De este modo, los macrófagos tisulares
engloban y endocitan a la estructura cuaternaria integral de la hemoglobina. En el interior
del macrófago, se produce la activación de la enzima hemooxidasa, la cual actúa
directamente sobre el grupo prostético de la hemoglobina, produciéndose –en este
punto- la escisión de sus componentes originales en el grupo prostético (denominado
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Hemoglobina • Hemooxidasa
• Biliverdina
Biliverdina reductasa
• Transporte
Bilirrubina por albúmina
Pigmento biliar
(conjugación
hepática)
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A B
A
Fig. 46. Campos de cortes histológicos de un hígado de canino, con un cuadro de intoxicación
por cobre y una consecuente obstrucción de los canalículos biliares, por una fibrosis secundaria,
generando un éstasis y acumulación de pigmento biliar en el parénquima hepático A. Tinción
con Hematoxilina & Eosina (ver pigmento café anaranjado). B. Reacción de Fouchet positiva.
Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
HEMOGLOBINA
Para cumplir con este propósito, la bilirrubina debe ser trasladada vía hemática
hacia el hígado, gracias a la albúmina, proteína transportadora por excelencia, la
cual –tras ingresar al parénquima hepático a través de la circulación sinusoidal-
será endocitada por los hepatocitos, para dar paso a las reacciones de conjugación
con los ácidos biliares (tales como, ácidos taurocólicos, desoxicólico,
quenosedoxicólico, ursodesoxicólico, glicocólico e hiodesoxicólico) y así constituir
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
las sales biliares. En su conjunto, estas sales serán encauzadas fuera del
parénquima hepático en la secreción biliar, mediante los colangíolos, los que se
anastomosarán en el conducto hepático, para ser almacenados en la vesícula biliar
y actuar en la emulsión grasa, de acuerdo a los requerimientos orgánicos. El 50%
de la bilirrubina que es absorbida en el epitelio intestinal es traspasada a la
circulación sanguínea, arribando a la circulación renal, para luego ser excretada en
forma de urobilinógeno, mientras que aquella bilirrubina que es absorbida, es
dirigida hacia el punto final de la digestión, produciéndose un pigmento
amarronado, conocido como estercobilina, que otorga la tonalidad característica a
las heces.
Fig. 48. Reacción de reducción de la biliverdina a bilirrubina (no conjugada), gracias a la acción
de la enzima Biliverdina reductasa. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria,
2021.
Ion ferroso
Ion férrico
Alto Bajo
requerimiento de requerimiento de
hierro hierro
Eritropoyesis Hemosiderina
Fig. 49. Esquematización de los eventos metabólicos alternativos, que se producen dependiendo
de los requerimientos sistémicos de hierro. Se muestra la secuencia general para la síntesis de
hemosiderina. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
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A B
A A
Pigmentos no hematógenos
Pigmento melánico
La melanina es un pigmento marrón oscuro, la cual es sintetizada en los melanocitos,
células de origen neuroectodérmico derivadas de la cresta neural, correspondiente a un
grupo de células localizadas dorsalmente al tubo neural. Estas células suelen localizarse
aledañas a las células que constituyen el estrato proliferativo, tanto de la epidermis, como
del epitelio folicular piloso. En condiciones normales, son capaces de sintetizar y
almacenar este pigmento, el cual es responsable de dotar de una determinada tonalidad
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
al tegumento y –en casos puntuales- a las mucosas. La melanina se sintetiza a partir del
aminoácido L-DOPA (Dihidroxifenilalanina), a partir del cual se van sucediendo una serie
de reacciones oxidantes, hasta dar paso a la formación de un polímero de eumelanina. En
ciertos cuadros patológicos, en los que la melanina se distribuye con un patrón anómalo
ectópico, ya sea, en el interior de los melanocitos o melanófagos (como en los melanomas
pigmentados) o fuera de éstos (como ocurre en patologías inmunomediadas asociadas a
un daño en la membrana basal, como es el caso del complejo pénfigo, produciendo una
banda de pigmentación dermoepidérmica).
Para detectar la melanina, existe un método histoquímico específico, el cual aprovecha la
cualidad de este pigmento para atraer electrostáticamente los cationes de plata
(argénticos o Ag++), propiedad conocida como argentafinidad, por medio de un método
denominado Fontana-Masson. De este modo, la melanina es demarcada diferencialmente
en negro y –para facilitar su ubicación topográfica- se realiza un contraste de fondo (de
citoplasmas y matriz extracelular) con verde luz.
A B
A A
Fig. 51. Campo de un corte histológico de melanoma dérmico equino (ubicado en la base de la
cola). A. Tinción con Hematoxilina & Eosina, donde la melanina se observa en marrón. B.
Reacción de Fontana-Masson, en la que la melanina se torna a negro. Laboratorio de Patología
Veterinaria, 2021.
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
Teniendo en cuenta que las membranas lipídicas están compuestas –esencialmente- por
fosfolípidos, éstos son especialmente susceptibles a la acción de radicales libres,
induciendo su degradación oxidativa, gracias a la presencia de insaturaciones (en este
caso, dobles enlaces entre carbonos presentes en la cadena de ésteres de ácidos grasos);
ejemplos de estas estructuras son la fosfatidilserina, fosfatidilcolina y
fosfatidiletanolamina. El proceso en el cual los radicales libres capturan electrones no
enlazados, presentes en la membrana lipídica, se puede subdividir en dos instancias:
a) Fase I o iniciación: en este punto, los radicales libres del sistema están en contacto
directo con los fosfolípidos de las membranas lipídicas, dotándolos de una carga
neta negativa y pasando a ser denominados como lípidos peroxil-radicales (R-OO).
b) Fase II o propagación: en consideración que el lípido peroxil-radical es una
molécula muy inestable, se adiciona a otra cadena lipídica, con el objeto de
permitir la formación de un lípido peroxidado (R-OOH), responsable de la
disrupción irreversible de las bicapas lipídicas.
De este modo, se produce una sucesión de reacciones en cadena en la que los radicales
lipídicos, asociados a dobles enlaces, continúan captando radicales libres presentes en el
sistema. La adición continua de estos lípidos peroxidados, en conjunto con diversas
glicoproteínas del glicocálix celular) permite la formación de un complejo pigmentado café
anaranjado, birrefringente y de múltiples glóbulos discretos, conocido como
lipopigmento, también llamado lipocromo. El método histoquímico que permite su
detección diferencial se denomina Reacción de Schmörl, la cual aprovecha la capacidad de
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A B
Identificación de microorganismos
Si bien, con el advenimiento de técnicas de biología molecular, las cuales han permitido el
desarrollo de métodos muy exactos, sensibles y específicos para el estudio y detección de
microorganismos (dos de los cuales serán tratados inextenso en la segunda parte de este
capítulo), existen algunos métodos histoquímicos diferenciales para la determinación de
bacterias y hongos. Se trata de metodologías de amplio uso en histopatología, gran parte
de ellas de alta reproducibilidad, bajo costo y fácil implementación, que se aplican, ya sea,
para una detección tipo tamiz y general, como también para determinaciones algo más
específicas, sin ánimos de efectuar una tipificación por género y especie. En este apartado,
trataremos los métodos generales para bacterias (según propiedad bioquímica de su
pared celular y algunas técnicas para cierto tipo de bacterias) y hongos (los cuales también
pueden ser determinados gracias a la Reacción de PAS, como se trató en el apartado de
técnicas específicas para identificación de carbohidratos).
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
Fig. 54. A-B. Campo de un corte histológico de piel de canino, con un cuadro de reacción de Splendore-Hoeppli, por presencia de
bacterias Gram positivas, en morado. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020. C-D. Microabsceso en tejido nervioso de un caprino
con signología nerviosa, sugerente de listeriosis. Hematoxilina & Eosina, 40X. D. Confirmación de presencia de bacterias Gram
positivas en el mismo campo anterior. Tinción de Gram, 100X. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
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Fig. 55. Campo de un corte histológico de válvula ileocecal de bovino, en la que se observa
un acúmulo de Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes (BAAR) en lámina propia, en color fucsia,
con el método de Ziehl-Neelsen. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2018.
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Fig. 56. Campo de un corte histológico de sección tubular del parénquima renal de un bovino,
en el que se observa la presencia de espiroquetas (en negro) en el luen tubular, aledañas al
epitelio tubular de ribete en cepillo. Reacción de Warthin-Starry, Laboratorio de Patología
Veterinaria, 2021.
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A B
A A
Fig. 57. Campo de un corte histológico la piel de un canino, en la que se aprecia una reacción de Splendore-
Hoeppli, producto de agentes del complejo YACS. A. Tinción con Hematoxilina & Eosina. En rosado intenso, se
visualiza la presencia de depósitos de inmunoglobulinas B. Reacción de Grocott, en la cual se distinguen
acúmulos de bacterias filamentosas en negro. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
también en los epítopes antigénicos, razón por la cual se recomienda utilizar para
métodos inmunohistoquímicos.
Es primordial saber que el procedimiento para tratar las muestras óseas o calcificadas
difiere del procesamiento de los otros tipos de tejidos, por lo que la descalcificación es un
paso intermedio que debe añadirse antes de realizar el dictado macroscópico. De este
modo, el diagrama de flujo es el siguiente:
Protocolo de seccionamiento
A diferencia de las otras clases de tejido, un fragmento óseo debe seccionarse conforme
se produzca su curso progresivo de ablandamiento, durante el tratamiento con su
respectivo agente descalcificante. Sin embargo, a diferencia de lo que se puede suponer,
este seccionamiento no debe realizarse de manera aleatoria en cualquier parte del
fragmento, sino que debe efectuarse habiendo diseñado un concienzudo protocolo de
corte macroscópico, tomando como referencia las observaciones macroscópicas y los
antecedentes que figuren en la anamnesis. Para abordar más a fondo estos aspectos,
debemos considerar que gran parte de las ablaciones óseas que se llevan a cabo en
pabellones quirúrgicos del tipo falangectomía (amputación quirúrgica de las falanges
distales y garras) se basan en confirmar o detectar el compromiso del hueso por un
determinado proceso neoplásico, sobre todo maligno. En histotecnología, aquello es
conocido con el nombre de estudio de profundidad, pues consiste en la determinación
microscópica del grado de profundidad que alcanza una lesión en un fragmento óseo,
tomando como referencia el extremo, borde superficial o margen visible de la misma.
Fig. 58. Esquematización tridimensional de una vértebra, en la cual se aprecian dos opciones para proceder a la
realización de cortes anátomo-histológicos, para posterior estudio histopatológico. A. Realización de corte
longitudinal, a partir de una lesión observada (en rojo) desde el canal medular hacia el cuerpo de la vértebra. B.
Corte transverso o axial, que permite el estudio del cuerpo completo de la vértebra. Laboratorio de Patología
Veterinaria, 2021.
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A B
A ©
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
Fig. 59. Descalcificación de cabeza de erizo, para estudio de patrón de crecimiento e invasión de neoplasia oral.
A. Vista cenital de cabeza de erizo de tierra afircano, Atelerix albiventris, en la que se observa el trazado previo
de los cortes anatómicos que se efectuarán en el tejido durante la descalcificación; en rojo, es posible apreciar
los cortes sagitales, mientras que en verde los cortes coronales. B. Corte sagital de cabeza de erizo de tierra
africano, en la que se visualiza una lesión exofítica blanquecino-amarillenta, que protruye desde el epitelio
palatino hacia la cavidad oral (recuadro rojo). En este caso, el análisis histopatológico permitió establecer el
patrón invasivo de la neoplasia, el cual alcanzó el área medular de las celdillas etmoidales y el metencéfalo
(pons). Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
Fig. 60. Fragmento de tejido óseo durante el dictado macroscópico, en pleno proceso de descalcificación. A. La flecha azul
indica la dirección en la que se estima que podría estar invadiendo el componente neoplásico, hacia el borde profundo (en
verde). B. Corte macroscópico de tejido descalcificado con navaja. C. Seccionamiento del fragmento destinado a estudio.
Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
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Estereotaxia: vocablo proveniente del griego stereós- (espacio, volumen) y -taxis (localización). Dícese de
todo procedimiento, ya sea, quirúrgico o exploratorio, el cual utiliza -como base- la proyección de imágenes
en un sistema de monitoreo guiado por ordenadores y que permite la orientación y localización exacta de
una lesión en un órgano o tejido interno determinado.
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
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A B
A A
Fig. 61. Protocolos para inclusión y corte de fragmentos óseos, destinados a estudio histopatológico. A. Tacos
parafinados, en los que se aprecia la orientación del borde superficial o externo de la lesión hacia el canto
numerado de la cápsula (línea segmentada roja) y el borde profundo hacia el extremo contrario (línea
segmentada verde). B. Láminas histopatológicas teñidas con Hematoxilina & Eosina, respetando la orientación
del fragmento tisular especificado en el taco parafinado, con el borde superficial (S) dirigido hacia el rótulo y el
profundo (P) hacia abajo. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
De este modo, como se aprecia en la figura, el borde superior (en rojo) representa el
extremo de la lesión visible a la macroscopía, mientras que el borde inferior (en verde)
corresponde al límite profundo definido de antemano por el equipo del laboratorio de
patología, con el fin de constatar si existe invasión o compromiso en un plano profundo.
Por otro lado, para la obtención del corte histológico a partir del taco parafinado, se
recomienda recoger las cintas en portaobjetos con carga positiva (los mismos que se
emplean para inmunohistoquímica), o bien, en portaobjetos tratados con cualquier medio
adhesivo, como cola fría al 2%, para evitar que los cortes se escindan del portaobjetos en
los lavados en la etapa de coloración. De todas maneras, como se puede apreciar en la
imagen de la derecha, en la que se visualizan los cortes histológicos ya teñidos con
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
Hematoxilina & Eosina, los límites superficial y profundo han sido demarcados con lápiz de
tinta negra como S y P, respectivamente. Se sugiere también incrementar el tiempo de
tinción con el colorante nuclear (Hematoxilina), pues -como se ha mencionado- el
tratamiento prolongado de un fragmento tisular con un medio ácido provee de una
elevada carga de protones disociados (H+) a la matriz tisular, lo que fomenta la unión de
radicales aniónicos de colorantes ácidos, como la eosina, incluso a sitios del tejido a los
que suelen asociarse colorantes catiónicos, como los núcleos; esto corresponde al
fenómeno de incremento de eosinofilia previamente referido y que puede subsanarse, o
bien, mitigarse efectuando una coloración nuclear más prolongada y -con precaución- un
lavado copioso con agua corriente, para facilitar el viraje de tinción nuclear a un azul
intenso; de este modo, se ofrece un excelente resultado en lo que respecta a contraste
núcleo-citoplasmático.
Si bien, son muy variadas las técnicas que se emplean para el estudio de tejido óseo,
dependiendo de los requerimientos del patólogo y del proceso patológico que esté
afectando al tejido, existe una técnica histoquímica la cual -pese a no ser empleada
rutinariamente para el diagnóstico histopatológico de fragmentos óseos- otorga
información crucial para discernir -microscópicamente- ante la presencia de matriz ósea
madura (mineralizada y provista de fascículos de tejido conectivo colágeno denso) y
matriz inmadura u osteoide; en este caso, hablamos del método tricrómico de Goldner.
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LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
A B
A A
C D
A A
Fig. 62. Microfotografías de fragmentos óseos destinados a estudio histopatológico. A. En esta imagen,
correspondiente a un campo de un corte de vértebra de felino con espesor completo, se demuestra que, pese
al protocolo de descalcificación practicado en este fragmento tisular, la médula ha mantenido de forma intacta
su histoarquitectura. B. El recuadro de línea segmentada azul muestra un área del fragmento que aún presenta
sales de calcio en abundante cantidad, los que pueden observarse como acúmulos basófilos, mientras que las
laminillas que han sido descalcificadas con éxito muestran únicamente el colágeno subyacente a las sales de
calcio, en color rosado. C. Corte de hueso esponjoso vertebral, en el que se aprecia el límite entre tejido óseo y
cartilaginoso (línea segmentada azul). D. Campo equivalente al de la microimagen C, el cual demuestra, con la
técnica Tricrómica de Goldner, la presencia de matriz osteoide en rojo y la matriz cartilaginosa y ósea madura,
provista de abundante colágeno, en verde cian. A, B, C. Hematoxilina & Eosina. D. Tricrómica de Goldner.
Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
En este contexto, es necesario recordar que los osteoblastos son aquellas células
inmaduras del tejido óseo (análogas a los fibroblastos de la matriz extracelular fibrilar y a
los condroblastos del tejido cartilaginoso) los cuales, inducidos por proteínas
osteomorfogénicas como BMP-2 y BMP-4 y la expresión de genes como KLF-4, inician la
síntesis y producción de matriz osteoide, la cual es rica en fosfatasa alcalina y escasa en
sales minerales. Si bien, el osteoide forma parte de alrededor del 40% del total de la masa
ósea madura, su proporción se ve notoriamente incrementada, incluso en campos que
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trascienden los límites del tejido óseo de un fragmento tisular determinado, en procesos
neoplásicos malignos, por lo que el uso de esta técnica es imperativo para coadyuvar a la
determinación morfológica e histoquímica de estos trastornos neoproliferativos, sobre
todo en caso de no contar con el método inmunohistoquímico. De este modo, en caso de
acaecer mutaciones en las células osteoprogenitoras (ya sea, en mecanismos de
osificación intramembranosa, donde las células afectadas son las mesenquimales
primitivas o endocondral, en la que la afección se centra en las células
condroprogenitoras) puede derivar en el desarrollo de osteosarcomas.
MC
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MO
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Fig. 63. Microfotografías de cortes de tejido óseo descalcificado, para un caso de neoplasia mesenquimal en
estudio, localizada en 4º y 5º falange de un canino. A. Presencia de células fusadas y osteoblastos con
disposición aleatoria, rodeadas de una abundante matriz rosado intensa. Hematoxilina & Eosina, 10X. B.
Confirmación de la presencia de matriz osteoide, en rojo anaranjado, aledaña a la matriz madura, en verde, en
un caso de osteosarcoma canino. Tricrómica de Goldner, 10X. C. Presencia de metaplasia condro-ósea en un
caso de tumor mamario mixto benigno canino, en el cual es común encontrar áreas de hematopoyesis
extramedular. MC. Metaplasia cartilaginosa. MO. Metaplasia ósea. Hematoxilina & Eosina, 10X. D. Campo
equivalente al de la imagen C, en el que se demuestra la abundancia de matriz osteoide, en rojo, abarcando
gran parte de la laminilla ósea en formación y que permite constatar un tejido óseo inmaduro o en curso de
formación. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
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Así, desde un punto de vista más holístico, en diversas osteopatologías o trastornos en los
que se esté produciendo degeneración, neoformación o génesis ectópicas de tejido óseo,
tales como, osteomalacias, osteosarcomas y hematopoyesis extramedular,
respectivamente (esta última muy común en tumores mamarios mixtos benignos), aquella
matriz inmadura se produce en cantidades tan considerables que dificulta y ralentiza el
proceso de mineralización, como ocurre normalmente en las etapas tardías de la
maduración ósea.
Los resultados de una coloración con la técnica Tricrómica de Goldner se basan,
nuevamente, en la afinidad que presentan los colorantes utilizados en el proceso por
determinados componentes de la matriz tisular. Por ejemplo, para la demarcación de la
matriz ósea madura (mineralizada y provista de fascículos de colágeno denso) se utiliza un
colorante denominado Fast Green, el cual se asocia al colágeno tipo I presente en el
hueso, confiriéndole una tonalidad verde cian, mientras que el colorante Ponceau de
Xilidina tiñe todos los sitios del tejido en los que no hay colágeno, entre ellos, la matriz
osteoide, en un color rojo escarlata. Por su parte, los núcleos pueden ser teñidos con
Hematoxilina, observándose de un color púrpura, mientras que los eritrocitos adquieren
una tonalidad anaranjada oscura.
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