Soluciones Especializadas para La Agricultura: Obtención de Cepas Endémicas de Hongos y Bacterias en Diferentes Cultivos

Soluciones Especializadas para la Agricultura
Obtención de cepas endémicas de hongos y bacterias

en diferentes cultivos
Biol. Anael Guadalupe Ruiz Guzman

Colecta de muestras
Materiales Equipos
Bolsas de politileno GPS
Plumón de aceite Agitador
Pala Balanza
Tubos 16x150 Campana de Flujo laminar
Matraces de 250 ml Mecheros
Papel aluminio Autoclave
Agua destilada Incubadora
Gradilla
Varilla para plaquear
Cajas Petri
Micropipeta de 1 ml
Parafilm
Trampas
Aislamiento
Materiales Equipos
Cajas Petri Autoclave
Asa bacteriologica Campana de flujo laminar
Micropipeta de 1 ml Mecheros
Micropipeta de 10 µl Incubadora
Varilla para plaquear Ultracongelador
Tubo eppendorf de 2 ml
Agua destilada
4
Bisturí
Cultivos monosporicos de Trichoderma spp y Materiales Equipos
Cajas Petri Autoclave
aislamiento de Bacillus spp y Pseudomonas spp.
Asa bacteriologica Campana de flujo laminar
Micropipeta de 1 ml Mecheros
Micropipeta de 10 µl Incubadora
C Varilla para plaquear
Tubo eppendorf de 2 ml
Agua destilada
Bisturí
10 µ
10- 10- 10- 10-

2 3 4
1
1ml 990µ 990µ 990µ
A oscuridad a 27 ± 2°C durante 24 horas 5

100µ 100µ 100µ
Trichoderma spp
Observado crecimiento con ayuda de un bisturí estéril se cortará

una hifa .
Se incubará hasta observar su crecimiento en todo el medio a 25°C

Se sembrará en medio PDA 6
Materiales Equipos
Bacillus spp y Pseudomonas spp. Cajas Petri Campana de flujo laminar
Portaobjetos Mecheros
Aguja de disección Microscopio
Asa bacteriológica Incubadora
Cubreobjetos
Papel secante
Parafilm
Observado crecimiento con ayuda de una asa bacteriológica se

sembrara por estría cruzada .
Se incubará hasta observar su crecimiento en todo el medio a 37°C

Aislados obtenidos de los nódulos Etanol al 95% por un minuto
Hipoclorito de sodio al 3% (v/v)
Desinfección durante 3 minutos
Enjuagar los nódulos con agua destilada
Silica gel y algodón
estéril hasta que no se percibió el olor a
para resguardarlas,
lejía
se refrigeraron a
4°C Medio ELMARC
(10.0 g de manitol, 0.5 g de K2HPO4, 0.2 g
de MgSO4, 0.1 g de NaCl, 0.5 g de extracto
de levadura y 15 g de agar bacteriológico
para un litro de agua destilada), se ajustó
el pH a 6.8 y agregó 10 ml de rojo Congo a
una concentración de 25 ppm.
28°C, en un periodo de 2 a 10
días, se requiere observar el
crecimiento diario de las
colonias bacterianas
Microorganismos de vida libre (Azotobacter, Cianobacterias y Pseudomonas) y simbióticos (Bradyrhizobium,

Rhizobium, Mesorhizobium y Sinorhizobium)
Identificación de especies del género de Trichoderma spp
Se duplicarán los aislamientos obtenidos de los cultivos monosporicos.

Técnica de Ridell
9
Se dejará en
crecimiento el hongo a
temperatura ambiente
(siete días
aproximadamente)
10
Azul de Metileno a 1%
Materiales Equipos
Cajas Petri Campana de flujo laminar
Varilla de vidrio en forma de V Mecheros
Portaobjetos Microscopio
Sacabocados Computadora
Aguja de disección Internet
Asa bacteriológica
Cubreobjetos
Papel secante
Parafilm
11
Identificación de especies del género de Bacillus spp y Pseudomonas spp.
Materiales Equipos
Portaobjetos Mecheros
Aguja de disección Microscopio
Cubreobjetos
Papel secante
Parafilm
Para determinar la caracterización de los

aislados se realizará a través de la técnica de
coloración de gram, pruebas bioquímicas como
agar tripe azúcar, citrato de Simmons y
oxidación- fermentación de Hugh y Leifson las
cuales se incubaran a a 37 °C por 48 horas
Bacterias fijadoras de Nitrógeno.
1. R. hainanense,
2. R. leguminosarum,
3. R. galegae,
4. R. etli,
5. R. lusitanum,
6. R. loessense,
7. R. giardinii,
8. R. mongolense,
9. R. indigoferae,
10. R. tropici,
11. R. yanglingense,
12. R. huautlense,
13. R. gallicum,
1. Rhizobium phaseoli, 14. R. cellulosilyticum
2. Sinorhizobium meliloti
3. Mesorhizobium loti, Tipos de cepas representativas del género Rhizobium
4. Bradyrhizobium elkanii
5. Rhizobium trifolii,
6. Azorhizobium caulinodans,
7. D. neptuniae.
Robledo et al., (2012)
Pruebas de hemólisis como criterio para la selección de cepas con mayor potencial antagonista.
Materiales Equipos
sacabocados Mecheros
Micropipeta Microscopio
Cubreobjetos
Regla
Parafilm
Patrón de hemolisis
Materiales Equipos
Preparación de inoculo de hongos
Cajas Petri Agitador
Portaobjetos Camara de Neubauer
Conteo de conidias en cámara de
Matraz Erlenmeyer Microscopio
Neubauer
Micropipeta de 10µl Incubadora
Agua destilada
Probeta de 100 ml
Papel secante
Parafilm
Concentración de inoculo para hongos
1.0 x 105 x 1ml Concentración de 100 esporas

(100 esporas x 100 ml)/(100000
esporas)= 0.10 ml
Para obtener la concentración inicial de esporas, se utilizará la siguiente

fórmula:
C1V1 = C2V2
Donde:
C1= Concentración de la solución inicial.
C2 = Concentración final de la nueva solución.
V1= Volumen de la solución inicial necesitado para preparar la nueva
solución.
V2 = Volumen final de la nueva solución.
Materiales Equipos
Evaluación de la viabilidad y periodo de sobrevivencia.
Portaobjetos Camara de Neubauer
Para la evaluación de la viabilidad y periodo de sobrevivencia Matraz Erlenmeyer Microscopio
del hongo se utilizará la siguiente formula:
Probeta de 100 ml
𝑵𝒐.𝑬𝑽𝑭 𝟏𝟎𝟎%
Agua destilada
%VE = Papel secante
𝑵𝒐. 𝑬𝑽𝑰
Parafilm
Donde:
VE= Viabilidad de esporas
EVF= número de esporas viables final
100% = Constante
EVI= número de esporas viables inicial
Preparación de inoculo de Bacillus spp. y Pseudomonas spp.
Para determinar la concentración celular se utilizara la ecuación

siguiente:
UFC = (UFC en placa)/(volumen adiconado)×factor de dilución
Diluciones
Materiales Equipos
Portaobjetos Incubadora
Matraz Erlenmeyer Microscopio
500ml
Probeta de 100 ml
Papel secante
Parafilm
Biofabricas

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Obtención de cepas endémicas de hongos y bacterias

Biol. Anael Guadalupe Ruiz Guzman

10- 10- 10- 10-

1ml 990µ 990µ 990µ

A oscuridad a 27 ± 2°C durante 24 horas 5

Observado crecimiento con ayuda de un bisturí estéril se cortará

Se incubará hasta observar su crecimiento en todo el medio a 25°C

Observado crecimiento con ayuda de una asa bacteriológica se

Se incubará hasta observar su crecimiento en todo el medio a 37°C

Microorganismos de vida libre (Azotobacter, Cianobacterias y Pseudomonas) y simbióticos (Bradyrhizobium,

Se duplicarán los aislamientos obtenidos de los cultivos monosporicos.

Para determinar la caracterización de los

1.0 x 105 x 1ml Concentración de 100 esporas

Para obtener la concentración inicial de esporas, se utilizará la siguiente

Para determinar la concentración celular se utilizara la ecuación

UFC = (UFC en placa)/(volumen adiconado)×factor de dilución

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