GUÍA DE ESTUDIO CROMATOGRAFÍA

1. En el siguiente cromatograma identifique lo que señalan las flechas

2. En el siguiente diagrama identifique cada una de las partes del HPLC, construyendo un cuadro con sus funciones y
principales características.

3. Lea cada uno de los siguientes párrafos e identifique el tipo de cromatografía de partición que se empleó,
identificando la fase móvil y fase estacionaria empleada:
a) Una separación cromatografica se llevó a cabo con una columna Luna HILIC(R) de 10cmx4.6mm, 3µm de tamaño de
partícula. La fase móvil compuesta por formato de amonio 20mM en una mezcla de acetonitrilo-agua (80:20) a un
pH 7.3 se hizo pasar a un volumen de flujo de 1mL/min a una temperatura de 35°C.

b) En un análisis de antibióticos quinolonicos por HPLC, se emplea una columna C18 de 4.6 x 150mm con una fase
móvil compuesta por ácido acético 0.1M pH=2.8 y metanol (85:15) a un flujo de 1mL min-1, la temperatura de la
columna fue de 35°C.

c) Se separa una mezcla de carotenos y α-tocoferol con una columna Zorbax RX-SIL de 2.1 x 150mm a temperatura
ambiente y con una fase móvil compuesta por Hexano (solvente A) e isopropanol al 1% en acetato de etilo (90:10),
con un volumen de flujo de 0.5mL por minuto y un volumen de inyección de 5µL.

d) Para determinar una mezcla de derivados opiáceos en muestras biológicas se emplea cromatografía líquida con una
columna C18 de 4.6 x 250mm y con una fase móvil compuesta por un tampón de fosfato monobásico de sodio y
dodecil sulfato de sodio a pH=6.56 y acetonitrilo (55:45), con un volumen de flujo de 1mL por minuto.

e) Se analiza una muestra de orina para determinar cocaína y sus metabolitos, la fase móvil utilizada es una mezcla de
agua acidificada al 1% con ácido fórmico y acetonitrilo (80:20). La columna empleada fue una C18 de 4.6 X 10cm y el
flujo de la fase móvil fue de 0.2mL/min.
f) Para determinar varios compuestos naftalenos se empleó una columna de silica de 150 X 4.6mm con una fase móvil
compuesta por hexano y metil-terbutil éter (85:15) a un flujo de 2mL/min.

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4. Con el siguiente cromatograma encuentre el número de platos teóricos de ambos picos y la resolución
Compuesto tR Área W

A 3.15 10921731 1.09

5. Con el siguiente cromatograma encuentre el número de platos teóricos de ambos picos y la resolución
Compuesto tR Área W

A 2.95 10921731 0.29

6. Con el siguiente cromatograma encuentre el número de platos teóricos de ambos picos y la resolución
Compuesto tR Área W

A 6.95 10921731 0.49

7. Con el presente cromatograma y los datos que se colocan en la tabla, encuentre los platos teóricos, la resolución del
análisis y determine si hay una buena o mala resolución. Finalmente explique las diferencias de polaridad entre una
columna C18 y una columna ciano.
Compuesto tR Base (W)

Ac. Diatrizoico 2.71 0.152

Iohexol 2.85 0.202

8. Con el presente cromatograma y los datos que se colocan en la tabla, encuentre los platos teóricos, la resolución del
análisis y determine si hay una buena o mala resolución. Finalmente explique entre una columna C18 y una columna
“Fused-core” cual proporcionaría una mejor resolución en HPLC.
Compuesto tR Base (W)

Sulfametoxazol 2.71 0.112

Trimetoprim 2.85 0.183

9. Al analizar un lote de tabletas de acetaminofén y cafeína que contienen 500 y 65mg respectivamente, se sabe que el
peso promedio de las mismas es de 0.6137g. El método que se sigue es el que recomienda la USP, en el cual se
emplea ácido benzoico como estándar interno. Para la muestra se pesa 305.9mg y se disuelven en matraz
volumétrico de 100mL, del cual se toma 1mL y se coloca en una matraz de 25mL, al cual antes de aforar se le añaden
3mL de una solución del estándar interno, para finalmente inyectar en el cromatógrafo líquido. Los datos recogidos
en el análisis se muestran en la tabla siguiente:

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 Estándares Muestra

Concentración
Compuesto Área tR Compuesto Área tR
(ppm)

Acetaminofén 98.7 1123870 2.012 Acetaminofén 1156892 2.011

Cafeína 11.3 335781 2.876 Cafeína 329003 2.869

Ác. Benzoico 721 2269801 5.976 Ác. Benzoico 2254560 5.976

Determine el porcentaje de cada compuesto en las tabletas analizadas y si cumplen el criterio USP (90-110%).

10. Al analizar un lote de tabletas de acetaminofén, aspirina y cafeína que contienen 250mg, 250mg y 65mg
respectivamente, se sabe que el peso promedio de las mismas es de 0.7137g. El método que se sigue es el que
recomienda la USP, en el cual se emplea ácido benzoico como estándar interno. Para la muestra se pesa 305.9mg y
se disuelven en matraz volumétrico de 100mL, del cual se toma 1mL y se coloca en una matraz de 25mL, al cual
antes de aforar se le añaden 3mL de una solución del estándar interno, para finalmente inyectar en el cromatógrafo
líquido. Los datos recogidos en el análisis se muestran en la tabla siguiente:
Estándares Muestra

Concentración
Compuesto Área tR Compuesto Área tR
(ppm)

Acetaminofén 98.7 1123870 2.012 Acetaminofén 1056892 2.011

Aspirina 99.1 229951 5.007 Aspirina 228760 5.000

Cafeína 11.3 335781 3.876 Cafeína 319003 3.869

Ác. Benzoico 721 2269801 7.976 Ác. Benzoico 2224560 7.976

Determine el porcentaje de cada compuesto en las tabletas analizadas y si cumplen el criterio USP (90-110%).

11. Se analiza un lote de tabletas de Ibuprofeno de 600mg, con un peso total de las 20 tabletas de 14.2051g. Se pesa el
equivalente a 50mg de analito y se colocan en matraz volumétrico de 100mL, aforándose con la fase móvil. De esta
solución se toman 100µL y se colocan en matraz de 10mL, después de aforar la solución se inyecta en cromatógrafo.
Para el estándar se toman 25mg y se aforan en matraz de 25mL, se miden 200µL y se colocan en matraz de 10mL,
procediendo a inyectar esta solución. Los datos obtenidos se muestran en el cuadro siguiente:
Estándar Muestra

Compuesto Área tR Compuesto Área tR

Ibuprofeno 1119074.6 8.012 Ibuprofeno 1126402 8.000

12. Se analiza un lote de tabletas de aspirina de 500mg, con un peso total de las 20 tabletas de 12.2051g. Se pesa el
equivalente a 100mg de analito y se colocan en matraz volumétrico de 100mL, aforándose con la fase móvil. De esta
solución se toman 100µL y se colocan en matraz de 10mL, después de aforar la solución se inyecta en cromatógrafo.
Para el estándar se toman 25mg y se aforan en matraz de 25mL, se miden 100µL y se colocan en matraz de 10mL,
procediendo a inyectar esta solución. Los datos obtenidos se muestran en el cuadro siguiente:
3
 Estándar Muestra

Compuesto Área tR Compuesto Área tR

Aspirina 1119074.6 2.012 Aspirina 926402 2.011

13. Se analiza un lote de capsulas de amoxicilina de 500mg, con un peso total de las 20 capsulas de 12.2051g. Se pesa el
equivalente a 100mg de analito y se colocan en matraz volumétrico de 100mL, aforándose con la fase móvil. De esta
solución se toman 100µL y se colocan en matraz de 10mL, después de aforar la solución se inyecta en cromatógrafo.
Para el estándar se toman 25mg y se aforan en matraz de 25mL, se miden 100µL y se colocan en matraz de 10mL,
procediendo a inyectar esta solución. Los datos obtenidos se muestran en el cuadro siguiente:
Estándar Muestra

Compuesto Área tR Compuesto Área tR

Amoxicilina 1119074.6 2.012 Amoxicilina 1226402 2.011

14. Para la determinación de acetaminofén en jarabe se prepara una recta de calibración, pesando 24.6mg de
acetaminofén estándar, disolviendo en matraz de 25mL y de acá se toman volúmenes de 10µL, 25µL, 50µL, 100µL y
200µL todos aforados en matraz de 10mL. Se inyectan las soluciones y se encuentran los datos reflejados en el
cuadro siguiente:
Solución tR Concentración Área
10µL 4.967 429768
25µL 5.033 485209
50µL 5.000 557853
100µL 4.967 670867
200µL 5.033 976379

Para la muestra, un jarabe que reporta 120mg/5mL se toma el equivalente a 96mg y se colocan en matraz de 50mL,
de esta solución se toman 50µL y se aforan en matraz de 10mL. Al inyectar se obtuvo un tiempo de retención de
5.033min con una área de 663408. Encuentre los miligramos de analito por cucharadita y cucharada.

15. Para la determinación de acetaminofén en jarabe se prepara una recta de calibración, pesando 24.6mg de
acetaminofén estándar, disolviendo en matraz de 25mL y de acá se toman volúmenes de 10µL, 25µL, 50µL, 100µL y
200µL todos aforados en matraz de 10mL. Se inyectan las soluciones y se encuentran los datos reflejados en el
cuadro siguiente:
Solución tR Concentración Área
10µL 4.967 429768
25µL 5.033 485209
50µL 5.000 557853
100µL 4.967 670867
200µL 5.033 976379

Para la muestra, un jarabe que reporta 120mg/5mL se toman 2mL y se colocan en matraz de 25mL, de esta solución
se toman 50µL y se aforan en matraz de 10mL. Al inyectar se obtuvo un tiempo de retención de 5.033min con una
área de 673408. Prepare una curva de calibración en Excel, y su correspondiente grafica corregida, y finalmente
encuentre los miligramos de analito por cucharadita y cucharada.

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16. Para determinar una mezcla de derivados opiáceos en muestras biológicas se emplea cromatografía líquida con una
columna C18 de 4.6 x 250mm y con una fase móvil compuesta por un tampón de fosfato monobásico de sodio y
dodecil sulfato de sodio a pH=6.56 y acetonitrilo (55:45), con un volumen de flujo de 1mL por minuto. El coeficiente
de reparto octanol/agua es importante para definir si un compuesto es lipofílico o no, dependiendo si sus valores de
Log P son elevados. Por otra parte la ionización de los compuestos definirá su afinidad a una de las fases
cromatograficas, lo mismo que la presencia de grupo polares en su molécula. En la tabla siguiente encontramos las
estructuras y algunos datos relevantes de los cinco compuestos estudiados:

Compuesto Estructura Compuesto Estructura

Codeína Papaverina

pKa=8.2 pKa=6.4

Log P = 0.6 Log P =0.5

Morfina Tebaína

pKa=8.0 pKa=6.1

Log P = -0.1 Log P = 2.0

Noscapina

pKa=6.2

Log P = 2.0

Con la información anterior, coloque el orden de elución de los compuestos analizados justificando su
respuesta en cinco párrafos (no menos de 50 palabras).

17. Con la información dada, coloque el orden de elución de los compuestos analizados justificando su
respuesta en cinco párrafos (no menos de 50 palabras).
En un análisis de antibióticos quinolonicos por HPLC, se emplea una columna C8 de 4.6 x 150mm con una fase móvil
compuesta por ácido acético 0.1M pH=2.8 y metanol (85:15). Es sabido que en estos compuestos la presencia de
grupos amino y ácido disminuirán su solubilidad en solventes apolares. En la tabla siguiente encontramos las
estructuras de los cinco compuestos estudiados:

5
 Estructura

18. Algunos compuestos con elevada polaridad presentan inconveniencia para ser separados en RP, por lo tanto una
buena opción es la utilización de HILIC. La determinación de ácidos orgánicos en muestras de orina de ratas como
potenciales bio-marcadores de contaminación de arsénico, involucra la utilización de una columna HILIC 4.6 x
250mm a una temperatura de 45°C, con una fase móvil compuesta por acetonitrilo y acetato de amonio10mM
(80:20). En la tabla siguiente encontramos las estructuras de los cinco compuestos estudiados:
Estructura

Ácido pirúvico Ácido úrico

Ácido cítrico Ácido glutámico

Taurina

6
19.

7
8