Fluorometria y Fosforimetria
Fluorometria y Fosforimetria
Fluorometria y Fosforimetria
Luminiscencia: Se pierde una parte de exceso de energía como calor y emite la energía remanente como radiación
electromagnética de una longitud de onda mayor que la absorbida.
Cuando una molécula tiene un estado electrónico excitado más estable que el usual, el exceso de energía vibracional
será disipado por colisiones, mientras que la molécula permanece en el estado electrónico excitado; más tarde la
molécula sigue uno de los dos caminos siguientes:
PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS
Cuando la radiación UV/vis de la frecuencia apropiada es absorbida por una molécula, uno o más de los electrones
apareados (generalmente un electrón π) es elevado a un estado singulete excitado, en el cual el espín del electrón
promovido no cambia y el espín neto es todavía cero. Sin embargo, en determinadas condiciones (cruce de intersistema)
un grupo de espines electrónicos pueden ser desapareados y los dos electrones desapareados están en igual sentido y se
genera un estado triplete excitado.
Debe poseer una estructura molecular que absorba radiación ultravioleta o visible.
Entre más grande sea la absorbencia de una molécula más intensa es su luminiscencia. Las moléculas que
contienen dobles enlaces conjugados y alto grado de estabilidad de resonancia, son particularmente útiles para
estudio.
Los hidrocarburos aromáticos, particularmente rígidos, planos, con estructuras multicíclicas son ideales. Los
anillos aromáticos que contienen heteroátomos generalmente presentan mejor fosforescencia que
fluorescencia.
Reacción química y extinción (quenching) de oxígeno pueden competir con la luminiscencia. El oxígeno disminuye la
intensidad de la fluorescencia de un compuesto orgánico por oxidación; generalmente, el oxígeno extingue los estados
singuletes y tripletes excitados por la promoción del cruce de intersistema a través de colisiones con las especies
excitadas y forma un complejo de transferencia de carga transitoria.
Espectros de excitación: Se obtienen a partir del registro de la intensidad luminiscente a una longitud de onda
determinada.
Espectros fluorescentes y fosforescentes: implican excitación a una longitud de onda fija mientras se registra la
intensidad de emisión como función de la longitud de onda.
Relación entre el número de moléculas que fluorescen y el número de moléculas excitadas, o la relación de fotones
emitidos y fotones absorbidos. Crece en cuanto a la fluoresencia está presente
INSTRUMENTACIÓN
Fuente de radiación
• Más común en fluorómetros de filtro es la lámpara de arco de mercurio a baja presión equipada con una
ventana de sílice fundida.
• Para los espectrofluorómetros en donde se requiere una fuente de radiación continua, se utiliza una lámpara de
arco de xenón a elevada presión de 75 a 450 W
Monocromadores y detectores
Detectores: Los tubos fotomultiplicadores han sido ampliamente utilizados como detectores en instrumentos de
fluorescencia sensibles. Los detectores de diodos alineados también han sido propuestos para los espectrofluorómetros.
FLUORÓMETROS
El haz que proviene de la lámpara de mercurio se divide en un haz de referencia y en un haz de muestra. Ambos haces
pasan a través del filtro primario y el haz de referencia es entonces reflejado hacia el tubo fotomultiplicador de
referencia. Las salidas eléctricas de los dos detectores están conectadas a un comparador de estado sólido, el cual mide
la relación de intensidades entre la muestra y la referencia; esta relación sirve como parámetro analítico.
ESPECTROFLUORÓMETROS
Permiten obtener de manera simultánea el espectro de excitación y de emisión. Los espectrofluorómetros utilizan dos
monocromadores de red, la radiación del primer monocromador se desdobla en dos, una parte pasa a través del
fotomultiplicador de referencia y otra por el de la muestra. La radiación fluorescente resultante, después de ser
dispersada en el segundo monocromador, se detecta en un segundo fotomultiplicador.
FOSFORÍMETROS
Un dispositivo que alternativamente irradia la muestra y, después de un tiempo adecuado, mide la intensidad de
fosforescencia..
Normalmente las medidas de fosforescencia se llevan a cabo a la temperatura del nitrógeno líquido, con el
objeto de prevenir la degradación de la radiación de salida por des activación colisional. Normalmente forma
parte del fosforímetro un recipiente Dewar con ventanas de cuarzo. A esta temperatura, el analito está en un
cristal de disolvente sólido (el disolvente más usual es una mezcla de dietil eter, pentano y etanol)
La estandarización a menudo se lleva a cabo con una solución sulfato de quinina aproximadamente 10-5 M. Esta
disolución generalmente se excita con una radiación de 350 nm y emite radiación a 450 nm.