Guia Metabolismo Bacteriano 2023

Metabolismo Bacteriano
1. INTRODUCCIÓN:
La identificación bacteriana se resume principalmente en la identificación de

las características morfológicas (microscópicas), las características
macroscópicas (aquellas que se pueden observar a partir de las características
de las colonias obtenidas en los cultivos en medios de cultivo) y las pruebas
bioquímicas o metabólicas.
Las pruebas bioquímicas hacen parte de las metodologías que permiten

diferenciar e identificar géneros y/o especies de familias de bacterias que
comparten ciertas características metabólicas y enzimáticas las cuales se
pueden diferenciar gracias a los siguientes criterios:
• Tipo de metabolismo del sustrato (contenido en el medio de cultivo)
• Tipo de enzima o vía metabólica utilizada o secretada por el
microorganismo.
• Tipo de metabolito producido a partir de la degradación de los compuestos
presentes en las pruebas.
La mayoría de pruebas bioquímicas se interpretan gracias a los cambios en la
coloración de las pruebas debido a que la mayoría contienen los indicadores de
pH.
En el mercado existe una variedad de pruebas (galerías) para ser utilizadas en

la identificación de diferentes tipos de microorganismos. Aunque todos estos
sistemas tienen el mismo fundamento, difieren en el número y tipo de pruebas
que permiten realizar, ya que su selección está directamente relacionada con
la actividad metabólica del género al que pertenece el microorganismo a
identificar.
2. OBJETIVOS:
El objetivo de esta práctica es que los estudiantes:
• Reconozcan la utilidad de los perfiles bioquímicos como herramienta para

la identificación de bacterias.
• Apliquen una metodología para la identificación de bacterias basada en la
tipificación de sus características macroscópicas, microscópicas y
metabólicas.
• Identifiquen las diferentes pruebas bioquímicas empleadas en la
caracterización de bacterias.
• Interpreten los resultados de las diferentes pruebas bioquímicas empleadas
en la caracterización de bacterias.
3. PREGUNTAS DE COMPLEMENTACIÓN TEÓRICA
• Defina metabolismo.
• ¿Qué es y que evalúa una prueba bioquímica?
• Cuáles son las principales pruebas bioquímicas, ¿qué evalúa cada una?
• ¿Cómo se pueden clasificar las pruebas bioquímicas?
• ¿Cómo por medio de las pruebas bioquímicas se pueden identificar
bacterias?
• ¿Cuáles son las principales características de la familia de las
Enterobacterias?
• Defina sistema de identificación rápido (basado en pruebas bioquímicas.
• Cuáles son los más conocidos, cuáles son sus beneficios o ventajas.
• Qué permite identificar el Kit API 20E, por qué.
4. MATERIALES Y REACTIVOS POR GRUPO DE DOS PERSONAS:
Equipos Cantidad
Microscopio 1 unidad
Incubadora 35 °C 1 unidad por salón de clase
Reactivos Cantidad
Cristal Violeta para Gram 3 baterías por salón de clase
Lugol para Gram 3 baterías por salón de clase
Alcohol Acetona para Gram 3 baterías por salón de clase
Safranina/ Fucsina para Gram 3 baterías por salón de clase
Plantillas del sistema BBL Crystal 1 unidad
E/NF o API 20E
Aceite de inmersión 3 baterías por salón de clase
Hipoclorito al 2,5 % (spray) 3 frascos por salón de clase
Insumos Cantidad
Portaobjetos 1unidad
Asa Bacteriológica (Metálica) 1 unidad
Mechero de alcohol 2 unidades
Papel de arroz (libreta) 2 unidades por salón de clase
Cubeta para tinción 3 unidades por salón de clase
Parrilla para tinción 3 unidades por salón de clase
Cronometro 1 unidad
Pinzas de madera 6 unidades por salón de clase
Frasco lavador 3 unidades por salón de clase
Bandeja rectangular para Descartar 1 unidad
Material Contaminado
Cultivos frescos (18-24 horas) de 7 unidades por salón de clases
bacterias Gram Negativas, oxidasa
Negativas (Cepas congeladas)
suspenciones de 2 ml de solución
salina de los siguientes
microorganismos: E. coli,
Salmonella, Enterebacter, Proteus,
Pseudomonas y otros bacilos gran
negativos según disponibilidad
Reactivo para medir actividad 1 unidad
oxidasa
Micropipetas de 100 µl 1 unidad
Puntas Amarillas para Micropipeta de 1 caja
100 µl. Estériles
Tubos de 15 ml Estériles con 10 ml 1 unidades
de agua destilada esteril
Batería de reactivos para revelar 3 unidades
pruebas bioquímicas de API TDA,
VP1, VP2, NIT A, NIT B, JAMES.
Mechero de alcohol 2 unidades
5. METODOLOGIA:
5.1 Revisión de Cultivo y Coloración de Gram
• Realice la coloración de gran a partir del cultivo que encuentra en su puesto

siguiendo los pasos para la coloración descritos en la primera guia.
5.2 Caracterización bioquímica de microorganismos por medio del

Sistema de identificación rápida API 20E.
1. Realizar primero la prueba de oxidasa: Tomar una colonia y con la ayuda de

un asa de plástico o palillo estéril esparcirla sobre la tira que encuentra en su
puesto. Esperar de 10-15 segundos y observar si hay algún cambio de color.
La prueba se informa de la siguiente manera: Negativa: no hay presencia de
color. Positiva: aparición de un color que puede variar del violeta al púrpura.
2. Preparación de la suspensión bacteriana: con la ayuda de un asa

bacteriología estéril, tomar 1 colonia bien aislada del microorganismo a
analizar y depositarla en el Medio de suspensión. Disolver hasta que no se
observen grumos. (ver fig. 1 paso a)
3. Tomar 5 ml de agua destilada estéril y ponerlos en las celdas del empaque
de incubación corrugado de la prueba, para así obtener un ambiente saturado
de humedad y evitar la deshidratación durante la incubación.
4. Inocular la galería (tira de pruebas), que consta de tubo (parte inferior) y

cúpula (parte superior), de la siguiente manera: con la ayuda de una
micropipeta con punta estéril, inocular los tubos con la suspensión
bacteriana, incline la prueba perpendicular a la mesa, suelte el líquido
tocando con la punta de la pipeta la pared del dispositivo para no formar
burbujas. Para los compartimentos CIT, VP y GEL llene tanto el tubo como la
cúpula, situando la punta de la pipeta contra la pared de la cúpula y
depositando cuidadosamente la suspensión bacteriana sin introducir
burbujas. (ver fig. 1 paso b)
5. Después de la inoculación de los tubos llenar completamente la cúpula de los

compartimentos ADH, LDC, ODC, H2S y URE con aceite mineral (estas
pruebas se encuentran subrayadas). (ver fig. 1 paso c)
6. Colocar la cubierta plástica sobre la galería de pruebas, rotular y llevar a

incubar a 35±2°C por 24 horas. Si la prueba no puede ser leída una vez
cumplido el tiempo de incubación, retirar la prueba de la incubadora y
refrigerarla. (ver fig. 1 paso d)
Una vez cumplido el tiempo de incubación:
7. Interpretar (ver tabla 2.) y registrar (ver tabla 1.) todas las reacciones. Leer
primero todos los otros compartimentos antes de hacerlo con las pruebas
TDA, IND y VP, los cuales se hacen de la siguiente manera:
-TDA: adicionar una gota de cloruro férrico al 10%. La prueba se considera

positiva si hay la aparición de un color marrón-rojizo. Los organismos indol
positivos pueden producir un color naranja, lo que es considerado como un
resultado negativo para la prueba TDA.
-VP: adicionar una gota del reactivo VP A (KOH), y después una gota del
reactivo VP B (alfa naftol). Se considera una reacción positiva si se produce
un color rojo (no rosa tenue) dentro de los 10 minutos siguientes.
-IND: adicionar una gota del reactivo de Kovacs. La prueba se lee como
positiva si hay la formación de un anillo rojo dentro de los 2 minutos
siguientes.
-Lectura de la prueba de reducción de nitratos: antes de adicionar cualquier

reactivo, observe la presencia de burbujas en el tubo de la prueba GLU. La
presencia de burbujas en este compartimiento indica la reducción de nitratos
a N2. Adicionar 2 gotas del reactivo Nitrato 2 (Dimetil- alfa-naftilamina) y 2
gotas del reactivo Nitrato 1 (Ácido Sulfanilico). La prueba se lee como positiva
si hay aparición de un color rojo dentro de los 3 minutos siguientes. Un
resultado negativo debe ser confirmado con la adición de polvo de Zinc.
8. Registrar cada prueba positiva con un (+) en la casilla correspondiente en su
tabla de resultados (ver tabla 1.). Coloque los puntos correspondientes para
cada reacción positiva en la sección indicada.
9. Una vez interpretados y consignados los resultados, disponer todas las

piezas que hacen parte de la prueba en una bolsa roja.
Sistema API 20E – Esquema de siembra
Figura 1.
Reacciones Bioquímicas API 20E
Prueba Descripción Resultado

Positivo Negativo
O-nitrofenil-B-D-galactosido es
ONPG hidrolizado por la enzima que Amarillo Incoloro
hidroliza lactosa.
ADH Argnina deshidrolasa transforma Rojo Amarillo
la arginina en ornitina.
LDC Liberación de cadaverina por Rojo Amarillo
descarboxilacion de la lisina.
ODC Producción de putrescina por Rojo Amarillo
descarboxilacion de la ornitina.
CIT Utilización de citrato como única Azul oscuro Verde claro
fuente de carbono.
No formación
H2S Reducción de tiosulfato a H2S. Precipitado de del
color negro precipitado de
color negro
Hidrólisis de la urea por la acción
URE de la enzima ureasa, formación de Rojo Amarillo
NH3 y CO2
TDA Formación de indol y ácido Café Amarillo
piruvico por desaminacion del
triptófano
IND Detección de indol por adición del Anillo rojo Anillo amarillo
reactivo de Kovacs
VP Detección de acetoina por la Rojo Incoloro
adición de los reactivos KOH y
Alfa-naftol.
GEL Hidrólisis de la gelatina. Difusión del No difusión
pigmento del pigmento
GLU Fermentación de glucosa.
MAN Fermentación de manitol.
INO Fermentación de inositol. Amarillo o
SOR Fermentación de sorbitol. amarillo- Azul o verde
RHA Fermentación de ramnosa. verdoso
SAC Fermentación de sacarosa.
MEL Fermentación de melodiosa.
AMY Fermentación de Amigdalina.
ARA Fermentación de arabinosa
Amarillo,
NO2 Rojo, burbujas, ausencia de
N2 gas Reducción de nitratos amarillo burbujas,
N2O después de la naranja
adición de Zinc después de la
adición de
Zinc
Cambios de color y Reacciones Bioquímicas API 20E
6. REFERENCIAS:
● Johnson TR, Case CL. Laboratory Experiments in Microbiology. Eighth

Edition. Pearson, 2007.
● Morello J, Mizer H, Granato P. Laboratory Manual and workbook in
Microbiology. 7th Edition. 2002.
● Valencia HA. Manual de Prácticas de Microbiología Básica. Facultad de
Ciencias, Universidad Nacional de Colombia. 1ª Edición, 2004.
● Manual de Laboratorio de Microbiología Ambiental. Escuela de los Recursos
Naturales y del Ambiente – EIDENAR, Universidad del Valle 2003.
● Manual del usuario Sistema BBL Crystal E/NF ID

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4. Inocular la galería (tira de pruebas), que consta de tubo (parte inferior) y

5. Después de la inoculación de los tubos llenar completamente la cúpula de los

6. Colocar la cubierta plástica sobre la galería de pruebas, rotular y llevar a

Una vez cumplido el tiempo de incubación:

-TDA: adicionar una gota de cloruro férrico al 10%. La prueba se considera

-Lectura de la prueba de reducción de nitratos: antes de adicionar cualquier

9. Una vez interpretados y consignados los resultados, disponer todas las

Sistema API 20E – Esquema de siembra

Prueba Descripción Resultado

● Johnson TR, Case CL. Laboratory Experiments in Microbiology. Eighth

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