Biologia Molecular

Tema 9: Técnicas de detección de ácidos nucleicos

Polimorfismo de secuencia: diferencias de secuencia (a veces cambios de un único nucleótido)
entre DNAs individuales.

EXTRACCIÓN DEL DNA:

Para analizar los ácidos nucleicos, lo primero es extraerlos.
Hay varias formas:

• Disrupción mecánica de células: agresivo, se utiliza

cuando hay muchas células o cuando se quiere extraer
material de las plantas. Consiste en coger el tejido,
meterlo en un instrumento similar al mortero y aplastar
las células rompiéndolas físicamente.

• Extracción orgánica: cuando hay pocas células. Se utiliza una disolución llamada
solución de lisis para romper las células.

1. Solubilización de componentes celulares: medio hipotónico + detergentes

(SDS).

El medio hipotónico hace que el agua entre en la célula por presión osmótica y
que explote. Los detergentes o el jabón disuelven las membranas.

2. Desnaturalización e hidrólisis de proteínas que puedan interferir en el

análisis: detergentes, agentes caotrópicos (DTT para romper los puentes
disulfuro), proteasas (proteinasa K para hidrolizar las proteínas del medio)

3. Eliminación de proteínas desnaturalizadas: fenol/cloroformo. A veces en una

disolución y otras en dos pasos distintos.

4. Purificación del DNA: precipitación por EtOH. El DNA en etanol tiene una
solubilidad menor y en presencia de altas concentraciones de sales, precipita.
Método utilizado para concentrar ADN.

Se puede utilizar acetato de sodio (NaOAc), acetato de amonio (NH4OAc),

cloruro de litio (LiCl) o cloruro de sodio (NaCl), pero no es lo mismo utilizar
una que otra, cada sal tiene un uso particular. Por ejemplo, si se utiliza una
enzima que vaya a fosforilar el DNA, no es conveniente utilizar el acetato de
amonio porque ese amonio puede inhibir la enzima.

El cloruro de litio también puede ser interesante para la extracción de RNA pero,
por otra parte, inhibe la transcriptasa inversa, enzima purificada que puede ser
muy útil en el laboratorio, ya que permite la síntesis de DNA a partir de RNA. Es
más difícil trabajar con RNA porque se degrada fácilmente por la presencia de
RNAsas en el medio, en cambio, el EDTA inhibe las DNAsas haciendo el DNA
más estable.

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HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
Una vez obtenidos los ácidos nucleicos, una de las formas más sencillas para su análisis es
la hibridación con otro ácido nucleico. La finalidad es saber si el DNA extraído tiene una
secuencia determinada (mutación que corresponde a una enfermedad, secuencia que
corresponde a una proteína determinada, …). Para eso, se sintetiza en el laboratorio un
ácido nucleico que tenga la secuencia complementaria, se mezclan ambos, y se ve si se
juntan. Si hay una secuencia complementaria se hibridan. Para su detección, se utiliza un
sonda que tiene un marcaje.

La hibridación de los ácidos nucleicos se trata del emparejamiento de ácidos nucleicos

procedentes de distintas fuentes. Requiere dos hebras complementarias y antiparalelas
de ácidos nucleicos, pero no es necesario que ambas sean del mismo tipo de ácido
nucleico (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA).

Para hibridar las dos hebras, primero hay que desnaturalizar el DNA. El DNA está
formando una doble hélice, es decir, dos hebras emparejadas, y para hibridar ese DNA con
otra hebra de ácido nucleico distinta, lo primero que hay que hacer es separar las dos
hebras del DNA inicial.

DESNATURALIZACIÓN DEL DNA:

La desnaturalización del DNA consiste en la separación de ambas hebras de una

molécula de dsDNA. La desnaturalización del RNA se basa en la disrupción de la
estructura secundaria del RNA. Pero esas moléculas no se degradan. Cuando se habla de
la degradación del DNA o RNA, se refiere a la hidrólisis, pérdida de bases u otras
modificaciones químicas pero no a la desanturalización.

En el caso del DNA, el proceso de desnaturalización hace

que la doble hebra de DNA se separe en dos hebras,
primero parcialmente, ya que una molécula de DNA
genómico es considerablemente larga, y al final se separan
completamente consiguiendo dos hebras individuales de
DNA en una conformación aleatoria.

Este proceso se puede obtener mediante agentes

químicos: urea, formamida, formaldehído, aumentando el
pH, y el más común, aplicando calor. Todos los agentes
químicos tienen el efecto de romper los puentes de
hidrógeno entre las dos hebras de ácidos nucleicos.
Dependiendo de como estén las muestras y de donde
estén los ácidos nucleicos se utilizará un agente u otro.

Este es el mecanismo principal por el que se

desnaturalizan los ácidos nucleicos, ya que lo que
mantiene unidas ambas hebras son los puentes de
hidrógeno, por lo tanto, si se quiere desnaturalizar el
dsDNA, es necesario romperlos.

En el caso del RNA, la desnaturalización hace que la

estructura secundaria del RNA pase a RNA lineal.

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Las moléculas de urea pueden colocarse alrededor de los ácidos nucleicos de forma que
empiezan a formar esos puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas de una cadena
y la urea separando las hebras. Al desnaturalizar los ácidos nucleicos se pasa de dsDNA o
ssDNA o de RNA estructurado a RNA lineal.

La representación de porcentaje de desnaturalización del ácido nucleico (eje y) frente a la

temperatura a la que tenemos la muestra (eje x) muestra que el porcentaje de
desnaturalización sigue una curva sigmoidea. El parámetro característico de estas curvas
es la temperatura de desnaturalización (tm) o temperatura de fusión. Es posible detectar
el porcentaje de desnaturalización ya que se puede medir la absorbancia de los ácidos
nucleicos a 260 nm (longitud de onda de absorbancia máxima de los ácidos nucleicos). La
absorbancia aumenta debido a que las bases nitrogenadas ya no están emparejadas y no
impiden absorber la radiación las unas a las otras. La viscosidad disminuye a medida que
la temperatura aumenta.

Cada curva es de un ácido nucleico distinto y cada tiene una tm que depende, en gran
medida, del porcentaje de pares G-C (%G-C) presentes en una secuencia de ácidos
nucleicos. La representación de la temperatura de fusión frente al porcentaje de pares G-C,
muestra que, según aumenta el porcentaje de pares G-C, la temperatura de fusión
aumenta. Esto es debido a que al haber más pares G-C, esas dos hebras están unidas con
mayor afinidad porque los pares G-C están unidos mediante tres puentes de hidrógeno
mientras que los pares A-T solo están unidos por 2. Por lo tanto, se necesita más energía
para separar las dos hebras.

En este caso, los dos moléculas posiblemente no tengan la misma longitud ya que las
curvas son diferentes, pero dos hebras con la misma longitud que variasen solamente en la
secuencia, tendrían una forma comparable y se vería que en la curva de la molécula con
más pares G-C, la temperatura de fusión estaría más a la derecha, es decir que sería
mayor. Si se tratara de dos moléculas de ácidos nucleicos comparables, la curva roja
tendría más pares G-C ya que su temperatura de fusión sería mayor.

EMPAREJAMIENTO DEL DNA:

Para detectar esa secuencia, después de la desnaturalización, hay que mezclar ese ácido
nucleico con otro de secuencia conocida que es el que se utiliza como sonda.

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En este caso, se tienen dos muestras de ácidos
nucleicos, donde la muestra 2 es la sonda. Se
desnaturalizan las dos muestras por separado
aplicándoles calor, se mezclan y se dejan enfriar. Al
enfriarse se obtiene una mezcla de distintas especies:
duplex de la muestra 1 (dobles hebras de la muestra
1), duplex de la muestra 2 (dobles hebras de la
muestra 2) y duplex híbrido (dobles hebras, una de la
muestra 1 y otra de la muestra 2). Los factores que
facilitan el emparejamiento del DNA son:

• Temperatura ↓
• Tiempo ↑
Emparejamiento ↑
• Longitud de cadena ↑
• Complementariedad ↑ (homología)
Cuanto más complementarias sean ambas hebras más fácilmente se emparejarán,
pero el hecho de que no sean complementarias al 100% no implica que no se puedan
hibridar. En ese caso, es posible que haya que variar otros parámetros, por ejemplo la
temperatura. Una temperatura menor puede favorecer que dos ácidos nucleicos con
menor complementariedad se hibriden. A su vez, cuanto más larga sea la cadena,
mayor probabilidad habrá de encontrar secuencias complementarias.

El emparejamiento no tiene por qué ser perfecto. Las secuencias no siempre se encuentran
a la misma distancia, pueden estar desplazadas y las secuencias no complementarias se
pueden distorsionar para que la hibridación surja. Para hibridar los ácidos nucleicos y
obtener la especificidad que se quiera, hay que trabajar con esos parámetros. Cuando un
ácido nucleico determinado se detecta usando una secuencia como sonda, con el fin de
que la sonda se una a la muestra solamente por esa secuencia en caso de que la tenga y
por el contrario, que no se una en caso de no haber una complementariedad mínima.

Por una parte está la muestra con la secuencia que se quiere detectar, por ejemplo una
mutación que puede causar una enfermedad, y por otra parte está la sonda de DNA que
tiene un marcaje. Se desnaturalizan los ácidos nucleicos, tanto del DNA marcado como de
la secuencia diana, se mezclan
ambas muestras, y se dejan para que
se renaturalicen y se hibriden.
Entonces, las hebras de ácido
nucleico marcado con la secuencia
diana se unen en caso de estar
presente en el medio y a continuación
se detecta la señal que se obtiene de
ese marcaje del ácido nucleico. El
DNA utilizado como sonda está
modificado químicamente para que
luego se pueda detectar una señal
cuando se obtenga el híbrido.

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MARCAJE DE SONDAS:

Para poder detectar el híbrido, y por lo tanto poder establecer la presencia de la secuencia
diana en el medio, es necesario que el DNA que se utiliza como sonda esté marcado. Hay
diferentes tipos de marcadores:

• Isótopos radioactivos: emite radiactividad

• Fluorocromos: emite fluorescencia

• Enzimas

El DNA que se utiliza como sonda está modificado químicamente de forma que puede
tener marcadores unidos covalentemente.

Hay dos tipos de marcaje:

• Marcaje directo: cuando el marcador está unido

directamente a la sonda y se puede visualizar de forma
directa (isótopos radioactivos y fluorocromos).

En el caso de un isótopo radioactivo, el ácido nucleico marcado no se distingue

químicamente del ácido nucleico no marcado, es decir que la modificación no altera el
tamaño de la molécula. Es un átomo que tiene un isótopo de forma que una vez hecha
la hibridación, se utiliza una técnica para detectar esa radiactividad de forma directa.

En cambio, los fluorocromos, son unas moléculas generalmente más grandes que
están unidas al ácido nucleico. Pueden tener otras repercusiones cuando se trabaje
con estos ácidos nucleicos. Al contrario que los isótopos radioactivos, el fluorocromo
puede añadir cierto impedimento estérico al híbrido formado por el DNA diana y la
sonda. Por ejemplo si se trabaja con alguna reacción enzimática.

En ambos casos, para detectar la señal, se coge el híbrido, se mete en un instrumento

y se mide la señal. En el marcaje radiactivo se mide la radiactividad y en el caso del
fluorocromo, se irradia la muestra con la longitud de onda correspondiente al
fluorocromo y se detecta la fluorescencia.

• Marcaje indirecto: el marcador no se puede visualizar

directamente (enzimas).

Para detectar la señal hay que manipular más la

muestra. Se añade un sustrato cuya reacción da un producto. La enzima cataliza la
reacción de un sustrato determinado para después visualizar la señal del producto.
Muchas veces, este producto también se detecta mediante absorbancia ultravioleta o
por fluorescencia.

TAMAÑO MANIPULACIÓN

Radiactivos<fluorocromos<enzima Radiactivos≈fluorocromos>enzima

Al tratarse de marcajes directos, los isótopos radiactivos y los fluorocromos tienen una
manipulación parecida. En cambio, las enzimas necesitan un procedimiento más laborioso.

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En cuanto al riesgo, los isótopos son muy peligrosos porque son radiactivos y pueden ser
mutagénicos.

MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN:

Hibridación en fase líquida:

Dependiendo de las muestras y del análisis a reali9zar, la hibridación se localiza en fase

líquida o sólida. Procedimiento de la hibridación en fase líquida:

1. Lisis célular y purificación de los ácidos nucleicos de la muestra que se quiere

analizar

2. Extracción del DNA

3. Desnaturalización mediante calor, utilizando una disolución básica,…

4. Se añade la sonda y ocurre la hibridación, tras la cual se obtiene el híbrido

En la disolución se encuentra el híbrido formado por la sonda y el DNA diana, pero también
hay moléculas de sonda por su cuenta, de forma que si se realiza el análisis directamente
en esa disolución, se va a obtener mucha señal que se corresponderá con la sonda que no
está necesariamente unida a la DNA diana que se quiere detectar. Por ello, hay que separar
el DNA hibridado del resto para obtener una mejor señal. Se puede hacer mediante dos
métodos:

• Usar una nucleasa comercial, como la nucleasa S1 que cataliza la degradación de las
hebras sencillas.

1. El DNA no hibridado se hidroliza.

2. El DNA hibridado se precipita con ácido tricloroacético (TCA). Es un ácido muy

fuerte que se utiliza para conseguir la precipitación de polímeros y moléculas
grandes.

3. Separar el DNA hibridado del resto y obtener su señal.

• Cromatografía de adsorción sobre hidroxiapatito. El hidroxiapatito tiene calcio, PO4-3 y

grupos -OH unidos a una columna, de forma que los fosfatos de los ácidos nucleicos
se coordinan con ese calcio, reteniendo así los ácidos nucleicos. Cuantos más
fosfatos tenga un ácido nucleico, más tarda en pasar la columna, por lo que las hebras
sencillas, al tener menos fosfatos que las hebras dobles, salen antes de la columna.
Posteriormente, cambiando la disolución que se utiliza en la columna, se puede
conseguir la fracción de DNA hibridado y detectar su señal.

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Soporte sólido:

Se prepara una sonda de DNA marcada con la secuencia

complementaria al gen de interés. La sonda se revela
después del apareamiento. Hay varios métodos para
realizar una hibridación de ácidos nucleicos en un soporte
sólido:

• Hibridación de colonias: colonias de

microorganismos o células creciendo en placas Petri.
Todas las células que están multiplicándose en cada
colonia tienen el mismo contenido genético.

1. Presionar un papel de nitrocelulosa sobre las

colonias de la placa para que algunas de las
células se peguen al papel.

2. Romper las células con disolventes químicos

como una disolución básica, para que el DNA
quede expuesto.

3. Hibridar el DNA utilizando una sonda de DNA

marcada, por ejemplo un isótopo radiactivo.

4. Visualizar la sonda reactiva en soportes sólidos.

Se pone el soporte sólido frente a una lámina fotográfica, y de esta forma se
obtienen marcas que corresponden a la sonda radiactiva utilizada. Esto indica
qué células originales tienen la secuencia de interés.

La pequeña marca que se encuentra tanto en la placa de petri como en el papel

de nitrocelulosa, permite orientar el papel de tal modo que en la placa original se
puedan identificar las colonias que tienen la secuencia diana correspondiente.

• Dot-Blot y Slot-Blot: la diferencia entre los dos es que la forma en que se aplica la
muestra. El procedimiento de ambas técnicas consiste en:

1. aplicar una gota (Dot-Blot) o raya (Slot-Blot) de la muestra a analizar,

directamente sobre un papel de nitrocelulosa o nailon.

2. bloquear la capacidad de adsorción del resto del soporte con albúmina, de

forma que al añadir la sonda, no se una por todas partes.

3. en caso de que el DNA siga dentro de las células lisarlas y desnaturalizar el DNA
y si el DNA ya se ha extraído simplemente añadir la muestra.

4. añadir la sonda marcada( los isótopos radiactivos fueron los primeros, pero cada
vez se utilizan más los fluorocromos). Esta sonda solo se hibrida con las
muestras que contengan el DNA o RNA diana.

5. lavar para eliminar la mayor parte de la sonda que no se ha hibridado.

6. secar

7. detectar mediante una autorradiografía por ejemplo.

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Dependiendo de la cantidad de secuencia diana presente en la muestra, la intensidad

de la señal obtenida difiere, es decir, cuanta más secuencia diana haya mayor
intensidad tendrá señal. A partir de la autorradiografía, es posible extraer
conclusiones. Si se utiliza la misma sonda en distintas muestras y se obtienen
diferentes intensidades de señal, se puede deducir si hay mayor o menor cantidad de
secuencia diana.

Por otra parte, también se puede analizar la misma muestra con diferentes sondas, de
forma que se puede detectar si una muestra determinada tiene una secuencia diana u
otra. Esto puede ser interesante en caso de analizar un genotipo determinado de una
muestra, por ejemplo, si una persona presenta un genotipo que puede causar una
enfermedad. Para ello hay que tener en cuenta que el humano es diploide, que tiene
dos alelos y como máximo dos secuencias diferentes en cada locus de un gen. Lo que
se puede hacer en este caso, es hibridar una muestra con las dos secuencias que se
pueden encontrar en ese locus y así, se puede ver si la persona es homocigótica para
un alelo sano, homocigótica para un alelo mutado o heterocigótica.

En este caso, se ha realizado un análisis de hibridación Dot-Blot con oligonucleotido

específicos (ASO) para analizar las muestras de varios pacientes que se sospecha que
pueden tener fibrosis quística, enfermedad que afecta a varios órganos: pulmones y
tracto digestivo entre otros, y se presenta con relativa frecuencia en la población. La
mutación más común de los pacientes que padece esta enfermedad es la deleción del
aminoácido en la posición 508 de una proteína denominada CFTR. Se han usado dos
sondas, una hibrida con la secuencia nativa (sana) del gen de esta proteína. La otra
hibrida con la secuencia mutada. Entonces arriba las muestras están tratadas con el
oligonucleotido utilizado para detectar la secuencia normal y abajo, la misma muestra
pero tratada con el oligonucleotido que se hibridaría con la secuencia que se tendría
en caso de que hubiera ocurrido la deleción. Se denomina N al alelo normal y S al
mutado, por lo que el genotipo de cada muestra puede ser NN (homocigótico sano),
NS (heterocigótico) o SS (homocigótico mutado).

Tras realizar el análisis estos son los resultados:

• Paciente 1: NS
• Paciente 2: NS
• Paciente 3: SS

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• Paciente 4: NN
• Paciente 5: NS
• Southern Blot
• Northern Blot
Electroforesis:

Antes de hacer tanto el Southern-Blot como el Northern- Blot, es necesario hacer una
electroforesis. La electroforesis es una
técnica analítica en la que un potencial
eléctrico hace que las moléculas
cargadas, se muevan. Hay dos tipos:

• Electroforesis horizontal: el
soporte del gel está en posición
horizontal. La muestra se añade en
los pocillos del gel de agarosa por
el lado del cátodo (electrodo
negativo) y se va moviendo hacia el
ánodo (electrodo positivo), ya que
los ácidos nucleicos están cargados
negativamente.

• Electoforesis vertical: el soporte

del gel está en posición vertical.
Ocurre más frecuentemente con
geles de poliacrilamida. El cátodo
se encuentra arriba, cerca de los
pocillos donde se aplican las
muestras, y el ánodo está abajo. Los
ácidos nucleicos de la muestra se van moviendo hacia abajo.

El soporte polimérico, el gel, opone una resistencia al movimiento de las moléculas.

La preparación del gel de agarosa consiste

en la gelificación de la agarosa, cuyo estado
es uno llamado sol o incluso puede estar sin
disolver en disolución de forma
desordenada. La agarosa es un polisacárido
formado por galactosas alfa y beta que se
extrae de las algas de los géneros Gellidium
y Gracillaria.

Para formar el gel hay que calentar la agarosa disuelta y dejar que se enfríe (maduración).
La maduración implica la formación de interacciones no covalentes entre las moléculas de
agarosa y la posterior formación de la estructura de gel. Este estructura es un material
sólido entre el que se encuentran partes de líquido, también llamado coloide, es decir, es
macroscópicamente homogéneo pero microscópicamente heterogéneo.

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Biologia Molecular
La estructura de gel forma una especie de red a través de
la cual se mueven las moléculas de ácidos nucleicos. Los
espacios entre esta red son mayores o menores
dependiendo del porcentaje de agarosa que se utilice para
hacer el gel, si se aumenta la masa de agarosa,
los espacios se reducen, dificultando así la
movilidad de los ácidos nucleicos. El gel de
agarosa es más frecuente en ácidos nucleicos.

La poliacrilamida es un polímero que se forma

mezclando acrilamida, N,N’-
metilenbisacrilamida, persulfato de amonio
(APS) y

TEMED (N,N,N’,N’-Tetrametiletano-1,2-diamina).
La acrilamida y la N,N’-metilenbisacrilamida
polimerizan, es decir, forman enlaces
covalentes. Si solo se utilizara la acrilamida el
polímero sería lineal, la N,N’-
metilenbisacrilamida hace que se formen las
ramificaciones que componen la red del gel.

Entre las ramificaciones hay espacios por los que pasan los ácidos nucleicos. La función
del persulfato de amonio es proporcionar radicales libres para la polimerización de la
acrilamida y la N,N’- metilenbisacrilamida. El TEMED facilita la formación de esos radicales
del persulfato de amonio. Los espacios entre esta red varían según el porcentaje de
poliacrilamida. El gel de poliacrilamida es más frecuente en proteínas.

AGAROSA POLIACRILAMIDA

% agarosa/poliacril. 0,5-4 0,5-30

Resolución (capacidad %↑=

de diferenciar 2 resolución↑
50 kb-50b 1kb-1b
muestras de tamaño
distinto) (bp)
Es posible diferenciar 2 ácidos
Permite trabajar con
Ventajas nucleicos que difieran en 1
muestras más grandes
nucleotido
Monómero muy tóxico
Riesgos Ninguno (neurotóxica, cancerígena y
teratogénica)

Southern-Blot:

Tras realizar la electroforesis, la posición de los ácidos nucleicos no se aprecia a simple

vista, por lo que es necesario hacer algo para que se vean, como teñir todos los ácidos
nucleicos de la muestra. En cambio, en caso de querer detectar de forma específica del

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Biologia Molecular
DNA que presenta la secuencia complementaria, se realiza una técnica llamada Southern-
Blot que utiliza una sonda formada por un oligonucleótido. El procedimiento consiste en:

1. coger una muestra de DNA y prepararla para la electroforesis.

2. en este caso, se ha digerido con endonucleasas de restricción, que son enzimas

capaces de catalizar la hidrólisis de un ácido nucleico en una secuencia concreta. Se
consigue una DNA genómico fragmentado en tamaños determinados que dependen de
la secuencia del DNA.

3. realizar la electroforesis en gel de agarosa.

4. desnaturalizar el DNA en este caso de forma química (por ejemplo aumentando el pH) y
no mediante calor ya que si se calienta la agarosa, se acaba fundiendo.

5. neutralizar el pH para que la sonda se hibride con la secuencia diana colocar papel de
filtro mojado y quitarle las burbujas para la difusión de las bandas tanto encima de la
membrana como debajo del gel.

6. colocar membrana sobre gel de agarosa, mojarla con buffer de transferencia y quitarle
las burbujas, para hacer la transferencia ssDNA a la membrana. Poner film transparente
para disminuir la evaporación del buffer durante la noche.

7. poner encima unas toallas para que absorban el buffer, después una lámina de cristal y
algo de peso y dejarlo durante toda la noche. Al día siguiente quitarlo todo y coger la
membrana.

8. se puede meter a membrana en una máquina de rayos UV para que se formen enlaces
covalentes entre el ácido nucleico y la propia membrana.

9. marcar la sonda del oligonucleótido (por ejemplo con isótopos radiactivos) y

desnaturalizar la sonda marcada.

10. añadir la sonda a la membrana con la muestra, de forma que la sonda marcada
solamente se quede sobre la membrana en los sitios donde esté la secuencia que se
quiere determinar. Se deja
durante toda la noche
para que se hibriden.

11. lavar el exceso de sonda

con otro buffer,
incubándolo a 52 ºC
durante 30 minutos y
repetir 3 veces.

12. poner el film sobre la

membrana.

13. revelar el film y obtener

la señal solamente
donde esté la secuencia
complementaria a la
sonda.

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Biologia Molecular
Northern-Blot:

El Northern-Blot es una técnica muy parecida al Southern-Blot, pero en vez de detectar

DNA, detecta RNA. El procedimiento es prácticamente igual al del Southern-Blot con la
diferencia de que en este caso no se utilizan enzimas de restricción. La única diferencia en
cuanto al procedimiento entre ambos es que en el Northern-Blot no se realiza la digestión
del RNA con endonucleasas de restricción.

El Southern-Blot y el Northern-Blot se utilizan muy frecuentemente en análisis de biología

molecular ya que permiten la detección de secuencias determinadas después de haberlas
separado mediante la electroforesis.

HIBRIDACIÓN “IN SITU”:

La hibridación tanto en fase líquida como en sólida se extrae el DNA o RNA para después
analizarlo. Pero también es posible hibridar esos ácidos nucleicos directamente en el tejido
que se va a analizar.

• Hibridación en el tejido para detectar:

• Infecciones virales: es posible buscar si un ácido nucleico está presente en una
secuencia específica de un virus, si las secuencias de un virus se encuentran en
un tejido en caso de infección, ...

• Cáncer (por mutaciones): es posible ver si hay secuencias mutadas que

producen cáncer.

• RNA (para estudiar la expresión génica)

• Hibridación de cromosomas, o partes de
cromosomas, para localización de genes,
aberraciones cromosómicas, compatibilidad
de trasplantes:

• FISH (Fluorescent “in situ” hybridization)

La FISH es una tecnología que utiliza sondas

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Biologia Molecular
de DNA marcadas con un fluoróforo para detectar o
confirmar anomalías génicas o cromosómicas que
generalmente están más allá de la capacidad de
resolución de la citogenética de rutina.

Para la desnaturalización del ácido nucleico

generalmente no se va a usar el calor, sino agentes
químicos. Este técnica llamada FISH tiene muchas
aplicaciones.

En este ejemplo de hibridación de cromosomas, se han

utilizado dos tipos de sondas, una que emite
fluorescencia en rojo y otra en verde. La sonda con
secuencia complementaria al centrómero del
cromosoma 13 está marcada con un fluoróforo verde y
la sonda del cromosoma 21 está marcada con un
fluoróforo rojo. El DNA se tiñe con DAPI, un fluoróforo
azul que se une al surco menor.

Este caso es un ejemplo de expresión de RNA con una

sonda radiactiva sobre el tejido de rata. Se observa la expresión de distintos genes
porque lo que se está usando son sondas específicas para un mRNA de secuencia
determinada. Se utiliza cuando se quiere ver si un gen se está expresando en una
parte de un tejido.

Además, esta técnica se puede usar para hacer cariogramas utilizando las sondas
para poder estudiar todos los cromosomas de una célula. Se emplea una secuencia
específica para cada cromosoma y unida a la sonda se encuentra un fluoróforo
distinto con un color diferente, de forma que se tiene cariograma con cada
cromosoma de distinto color.

Otro uso del FISH es la detección de aberraciones en los cromosomas. En este

caso, hay una sonda marcada en rojo que se une a la región 18p, es decir al brazo p
del cromosoma 18 y una sonda marcada en verde que se une a la región 18q, que
es el brazo q del cromosoma 18. Se observa que la sonda roja se marca en ambos
cromosomas 18 pero la sonda verde solamente en uno de los cromosomas 18. Esto
significa que a uno de los homólogos del cromosoma 18 le falta el brazo q (brazo
corto), lo que tiene consecuencias considerables.

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Biologia Molecular
DNA MICROARRAYS (DNA CHIPS):

Marcadores de enfermedades:

Los DNA microarrays se utilizan para estudiar la expresión de genes, pero también para
examinar las moléculas que se forman debido a una enfermedad, ya que los microarrays
analizan biomarcadores de enfermedades.

Las moléculas formadas por las enfermedades y que se detectan en líquidos corporales
son: proteínas, hormonas, antígenos, enzimas,… Pero, además, se utilizan los ácidos
nucleicos. Se puede detectar la expresión de genes en forma de RNA, se consigue el DNA
correspondiente a el mRNA. Se trata de realizar un estudio de dos líneas celulares cuya
expresión de genes se quiere comparar.

En este caso las células son células de la línea tumoral A y B, pero podrían ser células
sanas y células enfermas. Se va a estudiar qué genes se expresan en una situación frente a
la otra.

1. Se cogen las células, se extrae el RNA mensajero

2. A partir del mRNA, en el laboratiorio, es posible sintetizar un DNA llamado DNA

complemetario (cDNA) mediante la transcriptasa inversa. La transcriptasa inversa es la
enzima que tienen los retrovirus (virus que tienen el genoma en forma de RNA) y es
capaz de catalizar la síntesis de DNA utilizando RNA como molde. Estas enzimas están
purificadas y se pueden comprar. La diferencia entre el cDNA y el mRNA es que habrá
timinas en el cDNA donde había uracilos en el mRNA y que el DNA es de doble hebra
mientras que el mRNA es de hebra sencilla.

3. Se marcan las moléculas con fluorocromos. Se puede hacer de varias formas:

• Marcar las moléculas de cDNA después de haberlas utilizado

• Utilizar un fluoróforo mientras se sintetiza el cDNA. Pueden ser nucleótidos
modificados, de forma que cuando la transcriptasa inversa incorpora esos
nucleótidos en el DNA, ya están modificados y se puede obtener el marcaje
directamente en la síntesis del cDNA.

Se utiliza un marcaje para el cDNA procedente de las células tumorales A y otro

marcaje diferente para las células tumorales B. Ahora se tiene DNA que corresponde al
mRNA de las células A con un marcaje de color verde y DNA procedente del mRNA de
las células B con un marcaje de color rojo. El DNA representa los genes que se están
expresando, porque son los que están en forma de mRNA.

4. Se mezclan los dos cDNA y se aplican en el chip (tamaño 2x2 cm). El chip está
compuesto por múltiples pocillos y en cada uno hay un oligonucleótido fijado que tiene
la secuencia de uno de los genes de estas células, es decir, cada pocillo representa la
secuencia de un gen, pero también es posible tener más de una secuencia por gen
para poder corroborar la presencia o ausencia de señal de ese gen.

5. Teniendo secuencias complementarias a los genes en cada pocillo, tras coger la mezcla
de ambos cDNAs marcados con fluoróforos diferentes y añadirla al chip, se realiza la
hibridación.

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6. Se visualiza las señales de esos fluoróforos, obteniéndose un patrón. En cada pocillos
se consigue un color verde, rojo, amarillo o ningún color.

• Si se obtiene VERDE, significa que lo que se ha hibridado con el oligonucleótido

fijado al pocillo es el DNA procedente de la línea tumoral A. El DNA de las células
B no se ha hibridado o se ha hibridado menos. La secuencia o el gen que
representa ese pocillo se expresa en la línea celular A.

• Si se obtiene ROJO, indica que lo que se ha hibridado con el oligonucleótido

fijado al pocillo es el DNA de la línea tumoral B. El DNA de las células A no se ha
hibridado o se ha hibridado menos. La secuencia o el gen que representa ese
pocillo se expresa en la línea celular B.

• Si el pocillo es de color AMARILLO, ambos DNAs se expresan de forma similar,

es decir que se obtiene señal de ambas líneas celulares.

• Si el pocillo es de color NEGRO, no se ha expresado ninguna de las dos líneas

celulares.

Mediante esta técnica es posible comparar dos situaciones y ver que genes se expresan
más en una situación que en la otra.

Éste es un ejemplo real de un microarray para analizar los 6,200 genes de S. cerevisiae. Un
punto=Un gen

• Puntos verdes: genes expresados+en el crecimiento

normal.

• Puntos rojos: genes expresados+en la exporulación.

• Puntos amarillos: genes expresados igual en ambos.
Los resultados de los DNA microarrays se analizan usando un
software especializado.

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Biologia Molecular
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN:
Las endonucleasas son enzimas capaces de catalizar la hidrólisis de ácidos nucleicos
dentro de la secuencia, a diferencia de las exonucleasas. Son de restricción porque
catalizan la hidrólisis en una secuencia determinada. Estas enzimas forman parte del
llamado sistema de restricción-modificación, el cual aparece en bacterias.

SISTEMA DE RESTRICCIÓN-MODIFICACIÓN:

Las endonucleasas de restricción reconocen una secuencia, generalmente corta (6-8

nucleótidos) y en muchos casos estas secuencias son palindrómicas. Los sistemas de
restricción-modificación están constituidos por dos actividades enzimáticas, una es una
endonucleasa y la otra es una metilasa (enzima capaz de catalizar la metilación de un
nucleótido).

En este caso está la metilasa de EcoR1 que cataliza la metilación de una adenina
determinada en ambas hebras. Las dos actividades reconocen la misma secuencia y cada
una va a catalizar su reacción, la metilasa cataliza la metilación de esa secuencia y la
endonucleasa va a catalizar el corte de esa secuencia. Sin embargo, si la secuencia está
metilada, la actividad endonucleasa no funciona sobre esa secuencia ya que la metilación
protege al ácido nucleico frente a degradación por la acción endonucleasa. La actividad de
la endonucleasa de restricción va a catalizar la hidrólisis de la secuencia que reconoce
siempre que no esté metilada.

Este sistema procede de las bacterias, cuyo DNA está

metilado y por lo tanto no hay hidrólisis, y funciona
como sistema de protección frente a virus que infectan
a las propias bacterias llamados fagos. Los fagos
pueden insertar su DNA dentro de la bacteria,
secuestrar toda la maquinaria de replicación de la
bacteria y hacer que se produzcan más virus. Sin
embargo, si la bacteria tiene el sistema de restricción-
modificación, el DNA que entra a la bacteria procedente
del fago no está metilado o tiene un patrón de
metilación distinto al que reconoce el sistema, con lo

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Biologia Molecular
que la endonucleasa va a poder catalizar la hidrólisis del DNA del fago inactivándolo. Este
es el funcionamiento que tienen las endonucleasas de restricción en la naturaleza.

Hay tres tipos de endonucleasas de restricción pero los que se utilizan generalmente son
los del tipo II. La característica de las endonucleasas de restricción de tipo II es que la
actividad endonucleasa y la actividad metilasa están en dos proteínas diferentes, mientras
que en los de tipo I y tipo III ambas actividades se encuentran como dos subunidades de la
misma proteína.

Las primeras tres letras de las secuencias de reconocimiento se corresponden con la

especie de la bacteria de la que procenden (Eco = Escherichia coli), la siguiente letra y el
número indican la cepa. Las flechas señalan donde ocurre el corte y los asteriscos, la
metilación. Estas son las propiedades de las secuencias de reconocimiento de las
endonucleasas de restricción de tipo II:

• Secuencias palindrómicas de 4-8

bp.

• Algunas se cortan en la mitad dando

extremos romos (B)

• Algunas se cortan dejando

extremos cohesivos (O) de 2-4
nucleótidos de forma que el 3’ o el
5’ sean uno más largo que el otro.

Los extremos cohesivos se pueden

volver a hibridar pero los extremos romos
no.

Análisis de polimorfismos:

Las endonucleasas de restricción se utilizan para analizar polimorfismos:

• Polimorfismo de secuencia: cualquier secuencia

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Biologia Molecular
• Polimorfismo génico: secuencias codificantes
Según el número de nucleótidos:

• Variabilidad de nucleótido único (Single Nucleotide Variability (SNV) o

Polimorfismo de nucleótido único Single Nucleotide Polimorfism (SNP)

• Múltiples nucleótidos
Según la frecuencia:

• Frecuencia<1%: Mutación
• Frecuencia>1%: Polimorfismo
Es más apropiado utilizar variabilidad porque cuando se habla de variablilidad se abarcan
tanto la mutación como el polimorfismo, pero cuando se habla de polimorfismo se impone
la condición de que la variabilidad ocurre en la población con una frecuencia mayor del 1%.

Las endonucleasas de restricción se utilizan particularmente para analizar la variación de

secuencias en un único nucleótido y se puede ver mediante el fenómeno llamado RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorfism).

Las muestras de DNA se cortan con un enzima de restricción y producen fragmentos de

longitud determinada. La variación (polimorfismo) en la secuencia del DNA produce un
patrón de corte distinto. Las secuencias que son reconocidas por las enzimas de
restricción se llaman sitios de restricción.

1. Cambios en la propia secuencia reconocida por las enzimas de restricción:

Se tiene una secuencia nativa que es reconocida por una enzima de restricción (ER1),
pero ocurre una mutación que hace que esa enzima de restricción no reconozca esa
secuencia.

También puede ocurrir que una enzima de restricción no reconociera la secuencia

nativa, pero que tras ocurrir una mutación, aparezca un nuevo sitio de restricción que la
enzima reconozca.

Esto resultaría en dos fragmentos distintos dependiendo de la mutación y la secuencia

que se tiene. La diferencia en los fragmentos que se obtienen puede venir de
mutaciones que eliminan sitios de restricción o de mutaciones que los producen.

2. Cambios entre los sitios de reconocimiento (sitios de restricción) de las enzimas:

Es posible tener alteraciones entre las secuencias reconocidas. Si hay una inserción en
medio de dos sitios de restricción, la longitud de este fragmento que se va a producir
va a aumentar.

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Biologia Molecular
Si la diferencia entre una situación y la otra son los tamaños de los ácidos nucleicos, se
puede analizar mediante una electroforesis, ya que se trata de la separación de los
ácidos nucleicos por su tamaño.

RFLP PARA DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES:

Este es un ejemplo directo en el que va a haber una mutación que va a cambiar el sitio de
restricción. Se tiene una secuencia de ácido nucleico en la que hay 4 puntos que son
reconocidos por una endonucleasa de restricción y por lo tanto se producen 5 fragmentos.
Si el gen que se va a analizar para el diagnóstico está entre dos sitios de restricción, se
puede hibridar una sonda marcada para la detección. Se utiliza una sonda que se va a
hibridar con un punto de uno de los fragmentos, ya que la secuencia de la sonda es
complementaria a la de ese punto.

Pueden suceder dos cosas:

• Se tiene un alelo sano (A) donde se encuentra una secuencia reconocida por la enzima
de restricción.

• Hay una mutación puntual en el alelo (B) que hace que ese sitio de restricción se
pierda.

Aún así, si se utiliza la misma sonda se va a seguir marcando una molécula, pero ahora el
tamaño del fragmento en el que está situada la sonda es diferente en una cada situación,
ya que en el segundo caso, al no haber sitio de restricción, ese fragmento no se ha
cortado.

Dependiendo del genotipo de la persona cuya muestra se ha obtenido, se obtiene una

distribución de tamaño:

• Si los dos alelos de una persona son AA, es decir que tiene el sitio de restricción en
ambos alelos, tiene dos fragmentos cortos.

• Si es una persona con unos alelos AB, tiene una molécula larga y una corta.
• Si una persona es homocigótica para el alelo B, ambos alelos son largos.
Si se cogen estas muestras y se cargan en un gel y se hace la electroforesis, se pueden
observar los diferentes patrones.

• El genotipo homocigótico AA se observará en la electroforesis como una única línea

con un recorrido más largo, ya que al reconocer el punto corte, el tamaño del
fragmento es más corto.

• El genotipo heretocigótico AB, aparecerá como dos líneas a diferentes alturas en la

electroforesis, debido a que al tener un alelo de cada tipo el tamaño de cada uno será
diferente.

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Biologia Molecular
• El genotipo homocigótico BB se observará en la electroforesis como una única línea
con un recorrido más corto, ya que al no reconocer el punto corte, el tamaño del
fragmento es más largo.

Para realizar este análisis:

1. Se aísla el DNA

2. Se trata ese DNA con enzimas de restricción-modificación

3. Se hace la electroforesis

4. Se puede hacer una transferencia Southern-Blot.

RFLP EN ANÁLISIS FORENSE:

La técnica RFLP se puede utilizar para:

• Obtener la huella de DNA (identificación de individuos)

• Tests de paternidad
• Diagnóstico de enfermedades
La identificación de individuos y el test de paternidad al ser análisis forense, hoy en día se
utilizan más los SPRs pero los RFLPs también son una opción. Para el diagnóstico de
enfermedades es una elección porque se pueden detectar mutaciones puntuales que
ocurren en un sitio de restricción. Hay muchas enzimas y hoy en día es posible buscar en
bases de datos si hay una enzima que tiene una secuencia de reconocimiento que
corresponde a la mutación que se quiere analizar.

Obtención de la huella de DNA:

1. Se coge un cromosoma y se corta con una enzima de restricción.

2. Se consiguen los fragmentos y se ponen en una electroforesis.

3. Se utiliza una sonda que vaya a reconocer a algunos de esos fragmentos de forma que
todas las bandas que aparecen están coloreadas en gris. Se tienen distintos
marcadores de tamaño que permiten identificar los tamaños de las bandas.

4. Se desnaturaliza el DNA.

5. Se transfiere a una membrana de nailon.

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Biologia Molecular
6. Se incuba junto con la sonda de DNA marcada y después se lava.

7. Utilizando una sonda, se van a marcar algunas de esas bandas. Southern-Blot No es

necesario marcar todos los fragmentos sino que es suficiente con marcar un número
considerable para poder distinguir entre diferentes muestras.

8. Se transfiere de la membrana a un film y se expone.

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