Tema 9
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Tema 9
• Extracción orgánica: cuando hay pocas células. Se utiliza una disolución llamada
solución de lisis para romper las células.
El medio hipotónico hace que el agua entre en la célula por presión osmótica y
que explote. Los detergentes o el jabón disuelven las membranas.
4. Purificación del DNA: precipitación por EtOH. El DNA en etanol tiene una
solubilidad menor y en presencia de altas concentraciones de sales, precipita.
Método utilizado para concentrar ADN.
El cloruro de litio también puede ser interesante para la extracción de RNA pero,
por otra parte, inhibe la transcriptasa inversa, enzima purificada que puede ser
muy útil en el laboratorio, ya que permite la síntesis de DNA a partir de RNA. Es
más difícil trabajar con RNA porque se degrada fácilmente por la presencia de
RNAsas en el medio, en cambio, el EDTA inhibe las DNAsas haciendo el DNA
más estable.
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HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
Una vez obtenidos los ácidos nucleicos, una de las formas más sencillas para su análisis es
la hibridación con otro ácido nucleico. La finalidad es saber si el DNA extraído tiene una
secuencia determinada (mutación que corresponde a una enfermedad, secuencia que
corresponde a una proteína determinada, …). Para eso, se sintetiza en el laboratorio un
ácido nucleico que tenga la secuencia complementaria, se mezclan ambos, y se ve si se
juntan. Si hay una secuencia complementaria se hibridan. Para su detección, se utiliza un
sonda que tiene un marcaje.
Para hibridar las dos hebras, primero hay que desnaturalizar el DNA. El DNA está
formando una doble hélice, es decir, dos hebras emparejadas, y para hibridar ese DNA con
otra hebra de ácido nucleico distinta, lo primero que hay que hacer es separar las dos
hebras del DNA inicial.
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Las moléculas de urea pueden colocarse alrededor de los ácidos nucleicos de forma que
empiezan a formar esos puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas de una cadena
y la urea separando las hebras. Al desnaturalizar los ácidos nucleicos se pasa de dsDNA o
ssDNA o de RNA estructurado a RNA lineal.
Cada curva es de un ácido nucleico distinto y cada tiene una tm que depende, en gran
medida, del porcentaje de pares G-C (%G-C) presentes en una secuencia de ácidos
nucleicos. La representación de la temperatura de fusión frente al porcentaje de pares G-C,
muestra que, según aumenta el porcentaje de pares G-C, la temperatura de fusión
aumenta. Esto es debido a que al haber más pares G-C, esas dos hebras están unidas con
mayor afinidad porque los pares G-C están unidos mediante tres puentes de hidrógeno
mientras que los pares A-T solo están unidos por 2. Por lo tanto, se necesita más energía
para separar las dos hebras.
En este caso, los dos moléculas posiblemente no tengan la misma longitud ya que las
curvas son diferentes, pero dos hebras con la misma longitud que variasen solamente en la
secuencia, tendrían una forma comparable y se vería que en la curva de la molécula con
más pares G-C, la temperatura de fusión estaría más a la derecha, es decir que sería
mayor. Si se tratara de dos moléculas de ácidos nucleicos comparables, la curva roja
tendría más pares G-C ya que su temperatura de fusión sería mayor.
Para detectar esa secuencia, después de la desnaturalización, hay que mezclar ese ácido
nucleico con otro de secuencia conocida que es el que se utiliza como sonda.
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En este caso, se tienen dos muestras de ácidos
nucleicos, donde la muestra 2 es la sonda. Se
desnaturalizan las dos muestras por separado
aplicándoles calor, se mezclan y se dejan enfriar. Al
enfriarse se obtiene una mezcla de distintas especies:
duplex de la muestra 1 (dobles hebras de la muestra
1), duplex de la muestra 2 (dobles hebras de la
muestra 2) y duplex híbrido (dobles hebras, una de la
muestra 1 y otra de la muestra 2). Los factores que
facilitan el emparejamiento del DNA son:
• Temperatura ↓
• Tiempo ↑
Emparejamiento ↑
• Longitud de cadena ↑
• Complementariedad ↑ (homología)
Cuanto más complementarias sean ambas hebras más fácilmente se emparejarán,
pero el hecho de que no sean complementarias al 100% no implica que no se puedan
hibridar. En ese caso, es posible que haya que variar otros parámetros, por ejemplo la
temperatura. Una temperatura menor puede favorecer que dos ácidos nucleicos con
menor complementariedad se hibriden. A su vez, cuanto más larga sea la cadena,
mayor probabilidad habrá de encontrar secuencias complementarias.
El emparejamiento no tiene por qué ser perfecto. Las secuencias no siempre se encuentran
a la misma distancia, pueden estar desplazadas y las secuencias no complementarias se
pueden distorsionar para que la hibridación surja. Para hibridar los ácidos nucleicos y
obtener la especificidad que se quiera, hay que trabajar con esos parámetros. Cuando un
ácido nucleico determinado se detecta usando una secuencia como sonda, con el fin de
que la sonda se una a la muestra solamente por esa secuencia en caso de que la tenga y
por el contrario, que no se una en caso de no haber una complementariedad mínima.
Por una parte está la muestra con la secuencia que se quiere detectar, por ejemplo una
mutación que puede causar una enfermedad, y por otra parte está la sonda de DNA que
tiene un marcaje. Se desnaturalizan los ácidos nucleicos, tanto del DNA marcado como de
la secuencia diana, se mezclan
ambas muestras, y se dejan para que
se renaturalicen y se hibriden.
Entonces, las hebras de ácido
nucleico marcado con la secuencia
diana se unen en caso de estar
presente en el medio y a continuación
se detecta la señal que se obtiene de
ese marcaje del ácido nucleico. El
DNA utilizado como sonda está
modificado químicamente para que
luego se pueda detectar una señal
cuando se obtenga el híbrido.
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MARCAJE DE SONDAS:
Para poder detectar el híbrido, y por lo tanto poder establecer la presencia de la secuencia
diana en el medio, es necesario que el DNA que se utiliza como sonda esté marcado. Hay
diferentes tipos de marcadores:
• Enzimas
El DNA que se utiliza como sonda está modificado químicamente de forma que puede
tener marcadores unidos covalentemente.
En cambio, los fluorocromos, son unas moléculas generalmente más grandes que
están unidas al ácido nucleico. Pueden tener otras repercusiones cuando se trabaje
con estos ácidos nucleicos. Al contrario que los isótopos radioactivos, el fluorocromo
puede añadir cierto impedimento estérico al híbrido formado por el DNA diana y la
sonda. Por ejemplo si se trabaja con alguna reacción enzimática.
TAMAÑO MANIPULACIÓN
Radiactivos<fluorocromos<enzima Radiactivos≈fluorocromos>enzima
Al tratarse de marcajes directos, los isótopos radiactivos y los fluorocromos tienen una
manipulación parecida. En cambio, las enzimas necesitan un procedimiento más laborioso.
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En cuanto al riesgo, los isótopos son muy peligrosos porque son radiactivos y pueden ser
mutagénicos.
MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN:
• Usar una nucleasa comercial, como la nucleasa S1 que cataliza la degradación de las
hebras sencillas.
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Soporte sólido:
• Dot-Blot y Slot-Blot: la diferencia entre los dos es que la forma en que se aplica la
muestra. El procedimiento de ambas técnicas consiste en:
3. en caso de que el DNA siga dentro de las células lisarlas y desnaturalizar el DNA
y si el DNA ya se ha extraído simplemente añadir la muestra.
4. añadir la sonda marcada( los isótopos radiactivos fueron los primeros, pero cada
vez se utilizan más los fluorocromos). Esta sonda solo se hibrida con las
muestras que contengan el DNA o RNA diana.
6. secar
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Por otra parte, también se puede analizar la misma muestra con diferentes sondas, de
forma que se puede detectar si una muestra determinada tiene una secuencia diana u
otra. Esto puede ser interesante en caso de analizar un genotipo determinado de una
muestra, por ejemplo, si una persona presenta un genotipo que puede causar una
enfermedad. Para ello hay que tener en cuenta que el humano es diploide, que tiene
dos alelos y como máximo dos secuencias diferentes en cada locus de un gen. Lo que
se puede hacer en este caso, es hibridar una muestra con las dos secuencias que se
pueden encontrar en ese locus y así, se puede ver si la persona es homocigótica para
un alelo sano, homocigótica para un alelo mutado o heterocigótica.
• Paciente 1: NS
• Paciente 2: NS
• Paciente 3: SS
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• Paciente 4: NN
• Paciente 5: NS
• Southern Blot
• Northern Blot
Electroforesis:
Antes de hacer tanto el Southern-Blot como el Northern- Blot, es necesario hacer una
electroforesis. La electroforesis es una
técnica analítica en la que un potencial
eléctrico hace que las moléculas
cargadas, se muevan. Hay dos tipos:
• Electroforesis horizontal: el
soporte del gel está en posición
horizontal. La muestra se añade en
los pocillos del gel de agarosa por
el lado del cátodo (electrodo
negativo) y se va moviendo hacia el
ánodo (electrodo positivo), ya que
los ácidos nucleicos están cargados
negativamente.
Para formar el gel hay que calentar la agarosa disuelta y dejar que se enfríe (maduración).
La maduración implica la formación de interacciones no covalentes entre las moléculas de
agarosa y la posterior formación de la estructura de gel. Este estructura es un material
sólido entre el que se encuentran partes de líquido, también llamado coloide, es decir, es
macroscópicamente homogéneo pero microscópicamente heterogéneo.
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La estructura de gel forma una especie de red a través de
la cual se mueven las moléculas de ácidos nucleicos. Los
espacios entre esta red son mayores o menores
dependiendo del porcentaje de agarosa que se utilice para
hacer el gel, si se aumenta la masa de agarosa,
los espacios se reducen, dificultando así la
movilidad de los ácidos nucleicos. El gel de
agarosa es más frecuente en ácidos nucleicos.
TEMED (N,N,N’,N’-Tetrametiletano-1,2-diamina).
La acrilamida y la N,N’-metilenbisacrilamida
polimerizan, es decir, forman enlaces
covalentes. Si solo se utilizara la acrilamida el
polímero sería lineal, la N,N’-
metilenbisacrilamida hace que se formen las
ramificaciones que componen la red del gel.
Entre las ramificaciones hay espacios por los que pasan los ácidos nucleicos. La función
del persulfato de amonio es proporcionar radicales libres para la polimerización de la
acrilamida y la N,N’- metilenbisacrilamida. El TEMED facilita la formación de esos radicales
del persulfato de amonio. Los espacios entre esta red varían según el porcentaje de
poliacrilamida. El gel de poliacrilamida es más frecuente en proteínas.
AGAROSA POLIACRILAMIDA
Southern-Blot:
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DNA que presenta la secuencia complementaria, se realiza una técnica llamada Southern-
Blot que utiliza una sonda formada por un oligonucleótido. El procedimiento consiste en:
4. desnaturalizar el DNA en este caso de forma química (por ejemplo aumentando el pH) y
no mediante calor ya que si se calienta la agarosa, se acaba fundiendo.
5. neutralizar el pH para que la sonda se hibride con la secuencia diana colocar papel de
filtro mojado y quitarle las burbujas para la difusión de las bandas tanto encima de la
membrana como debajo del gel.
6. colocar membrana sobre gel de agarosa, mojarla con buffer de transferencia y quitarle
las burbujas, para hacer la transferencia ssDNA a la membrana. Poner film transparente
para disminuir la evaporación del buffer durante la noche.
7. poner encima unas toallas para que absorban el buffer, después una lámina de cristal y
algo de peso y dejarlo durante toda la noche. Al día siguiente quitarlo todo y coger la
membrana.
8. se puede meter a membrana en una máquina de rayos UV para que se formen enlaces
covalentes entre el ácido nucleico y la propia membrana.
10. añadir la sonda a la membrana con la muestra, de forma que la sonda marcada
solamente se quede sobre la membrana en los sitios donde esté la secuencia que se
quiere determinar. Se deja
durante toda la noche
para que se hibriden.
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Northern-Blot:
La hibridación tanto en fase líquida como en sólida se extrae el DNA o RNA para después
analizarlo. Pero también es posible hibridar esos ácidos nucleicos directamente en el tejido
que se va a analizar.
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de DNA marcadas con un fluoróforo para detectar o
confirmar anomalías génicas o cromosómicas que
generalmente están más allá de la capacidad de
resolución de la citogenética de rutina.
Además, esta técnica se puede usar para hacer cariogramas utilizando las sondas
para poder estudiar todos los cromosomas de una célula. Se emplea una secuencia
específica para cada cromosoma y unida a la sonda se encuentra un fluoróforo
distinto con un color diferente, de forma que se tiene cariograma con cada
cromosoma de distinto color.
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DNA MICROARRAYS (DNA CHIPS):
Marcadores de enfermedades:
Los DNA microarrays se utilizan para estudiar la expresión de genes, pero también para
examinar las moléculas que se forman debido a una enfermedad, ya que los microarrays
analizan biomarcadores de enfermedades.
Las moléculas formadas por las enfermedades y que se detectan en líquidos corporales
son: proteínas, hormonas, antígenos, enzimas,… Pero, además, se utilizan los ácidos
nucleicos. Se puede detectar la expresión de genes en forma de RNA, se consigue el DNA
correspondiente a el mRNA. Se trata de realizar un estudio de dos líneas celulares cuya
expresión de genes se quiere comparar.
En este caso las células son células de la línea tumoral A y B, pero podrían ser células
sanas y células enfermas. Se va a estudiar qué genes se expresan en una situación frente a
la otra.
4. Se mezclan los dos cDNA y se aplican en el chip (tamaño 2x2 cm). El chip está
compuesto por múltiples pocillos y en cada uno hay un oligonucleótido fijado que tiene
la secuencia de uno de los genes de estas células, es decir, cada pocillo representa la
secuencia de un gen, pero también es posible tener más de una secuencia por gen
para poder corroborar la presencia o ausencia de señal de ese gen.
5. Teniendo secuencias complementarias a los genes en cada pocillo, tras coger la mezcla
de ambos cDNAs marcados con fluoróforos diferentes y añadirla al chip, se realiza la
hibridación.
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6. Se visualiza las señales de esos fluoróforos, obteniéndose un patrón. En cada pocillos
se consigue un color verde, rojo, amarillo o ningún color.
Mediante esta técnica es posible comparar dos situaciones y ver que genes se expresan
más en una situación que en la otra.
Éste es un ejemplo real de un microarray para analizar los 6,200 genes de S. cerevisiae. Un
punto=Un gen
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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN:
Las endonucleasas son enzimas capaces de catalizar la hidrólisis de ácidos nucleicos
dentro de la secuencia, a diferencia de las exonucleasas. Son de restricción porque
catalizan la hidrólisis en una secuencia determinada. Estas enzimas forman parte del
llamado sistema de restricción-modificación, el cual aparece en bacterias.
SISTEMA DE RESTRICCIÓN-MODIFICACIÓN:
En este caso está la metilasa de EcoR1 que cataliza la metilación de una adenina
determinada en ambas hebras. Las dos actividades reconocen la misma secuencia y cada
una va a catalizar su reacción, la metilasa cataliza la metilación de esa secuencia y la
endonucleasa va a catalizar el corte de esa secuencia. Sin embargo, si la secuencia está
metilada, la actividad endonucleasa no funciona sobre esa secuencia ya que la metilación
protege al ácido nucleico frente a degradación por la acción endonucleasa. La actividad de
la endonucleasa de restricción va a catalizar la hidrólisis de la secuencia que reconoce
siempre que no esté metilada.
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que la endonucleasa va a poder catalizar la hidrólisis del DNA del fago inactivándolo. Este
es el funcionamiento que tienen las endonucleasas de restricción en la naturaleza.
Hay tres tipos de endonucleasas de restricción pero los que se utilizan generalmente son
los del tipo II. La característica de las endonucleasas de restricción de tipo II es que la
actividad endonucleasa y la actividad metilasa están en dos proteínas diferentes, mientras
que en los de tipo I y tipo III ambas actividades se encuentran como dos subunidades de la
misma proteína.
Análisis de polimorfismos:
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• Polimorfismo génico: secuencias codificantes
Según el número de nucleótidos:
• Múltiples nucleótidos
Según la frecuencia:
• Frecuencia<1%: Mutación
• Frecuencia>1%: Polimorfismo
Es más apropiado utilizar variabilidad porque cuando se habla de variablilidad se abarcan
tanto la mutación como el polimorfismo, pero cuando se habla de polimorfismo se impone
la condición de que la variabilidad ocurre en la población con una frecuencia mayor del 1%.
Se tiene una secuencia nativa que es reconocida por una enzima de restricción (ER1),
pero ocurre una mutación que hace que esa enzima de restricción no reconozca esa
secuencia.
Es posible tener alteraciones entre las secuencias reconocidas. Si hay una inserción en
medio de dos sitios de restricción, la longitud de este fragmento que se va a producir
va a aumentar.
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Si la diferencia entre una situación y la otra son los tamaños de los ácidos nucleicos, se
puede analizar mediante una electroforesis, ya que se trata de la separación de los
ácidos nucleicos por su tamaño.
Este es un ejemplo directo en el que va a haber una mutación que va a cambiar el sitio de
restricción. Se tiene una secuencia de ácido nucleico en la que hay 4 puntos que son
reconocidos por una endonucleasa de restricción y por lo tanto se producen 5 fragmentos.
Si el gen que se va a analizar para el diagnóstico está entre dos sitios de restricción, se
puede hibridar una sonda marcada para la detección. Se utiliza una sonda que se va a
hibridar con un punto de uno de los fragmentos, ya que la secuencia de la sonda es
complementaria a la de ese punto.
• Se tiene un alelo sano (A) donde se encuentra una secuencia reconocida por la enzima
de restricción.
• Hay una mutación puntual en el alelo (B) que hace que ese sitio de restricción se
pierda.
Aún así, si se utiliza la misma sonda se va a seguir marcando una molécula, pero ahora el
tamaño del fragmento en el que está situada la sonda es diferente en una cada situación,
ya que en el segundo caso, al no haber sitio de restricción, ese fragmento no se ha
cortado.
• Si los dos alelos de una persona son AA, es decir que tiene el sitio de restricción en
ambos alelos, tiene dos fragmentos cortos.
• Si es una persona con unos alelos AB, tiene una molécula larga y una corta.
• Si una persona es homocigótica para el alelo B, ambos alelos son largos.
Si se cogen estas muestras y se cargan en un gel y se hace la electroforesis, se pueden
observar los diferentes patrones.
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• El genotipo homocigótico BB se observará en la electroforesis como una única línea
con un recorrido más corto, ya que al no reconocer el punto corte, el tamaño del
fragmento es más largo.
1. Se aísla el DNA
3. Se hace la electroforesis
3. Se utiliza una sonda que vaya a reconocer a algunos de esos fragmentos de forma que
todas las bandas que aparecen están coloreadas en gris. Se tienen distintos
marcadores de tamaño que permiten identificar los tamaños de las bandas.
4. Se desnaturaliza el DNA.
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Biologia Molecular
6. Se incuba junto con la sonda de DNA marcada y después se lava.
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