CBT 047

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA
CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA
Análisis de secuencias de genoma completo de Escherichia coli aisladas de

vegetales y comida callejera de Ecuador
Informe Final de Integración Curricular, Modalidad Proyecto de Investigación, previo

a la obtención de título de Ingeniera Biotecnóloga, otorgado por la Universidad
Técnica de Ambato, a través de la Facultad de Ciencias e Ingeniería en Alimentos y
Biotecnología.
AUTORA: Lissette Katherine Sánchez Gavilanes

TUTOR: PhD. William Ricardo Calero Cáceres
Ambato – Ecuador
Marzo - 2023
APROBACIÓN DEL TUTOR
PhD. William Ricardo Calero Cáceres.
CERTIFICA:
Que el presente Informe Final de Integración Curricular ha sido prolijamente revisado.

Por lo tanto, autorizo la presentación de este Informe Final de Integración Curricular
bajo la modalidad de Proyecto de Investigación, el mismo que responde a las normas
establecidas en el Reglamento de Titulación y Grados de la Facultad de Ciencia e
Ingeniería en Alimentos y Biotecnología.
Ambato, 10 de febrero del 2023
Firmado electrónicamente por:

WILLIAM RICARDO
CALERO CACERES
PhD. William Ricardo Calero Cáceres.

C.I. 171434885-9
TUTOR
ii
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Lissette Katherine Sánchez Gavilanes, manifiesto que los resultados obtenidos en
el presente Informe Final de Integración Curricular, modalidad Proyecto de
Investigación, previo a la obtención del título de Ingeniera Biotecnóloga, son
absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas
bibliográficas.
Lissette Katherine Sánchez Gavilanes

C.I. 180438450-9
AUTORA
iii
APROBACIÓN DE LOS MIEMBROS DEL TRIBUNAL DE GRADO
Los suscritos Profesores Calificadores, aprueban el presente Informe Final de

Integración Curricular, modalidad Proyecto de Investigación, el mismo que ha sido
elaborado de conformidad con las disposiciones emitidas por la Facultad de Ciencia e
Ingeniería en Alimentos y Biotecnología de la Universidad Técnica de Ambato.
Por constancia firman:

LILIANA PAULINA
LALALEO CORDOVA
Presidente del Tribunal

IRVIN RICARDO TUBON
USCA
B.F. Irvin Ricardo Tubón Usca, PhD.
C.I. 060425035-7

HELENA MARITZA DE
LA TORRE OLVERA
Blga. Helena Maritza De la Torre Olvera, PhD
C.I. 130965199-8
Ambato, 08 de marzo del 2023
iv
DERECHOS DE AUTOR
Autorizo a la Universidad Técnica de Ambato, para que haga de este presente Informe
Final de la Integración Curricular o parte de él un documento disponible para su
lectura, consulta y procesos de investigación, según las normas de la institución.
Cedo los derechos en línea patrimoniales de mi Informa Final de la Integración

Curricular, con fines de difusión pública, además apruebo la reproducción de este,
dentro de las regulaciones de la Universidad, siempre y cuando esta reproducción no
suponga una ganancia económica y se realice respetando mis derechos de autor.
Lissette Katherine Sánchez Gavilanes

C.I. 180438450-9
AUTORA
v
DEDICATORIA
“Todo el mundo tiene estrellas, pero no significan lo mismo para todos. Para
algunos, que son viajeros, las estrellas sirven de guía. Para otros no son más que
lucecitas en el cielo. Para los sabios, son problemas. Pero todas esas están en silencio.
Tú, y solo tú tendrás estrellas como nadie más las tiene”
El Principito
A Dios y la Virgen María, por guiar

cada paso que he dado, por cuidarme y
nunca dejarme caer.
Lo más importante en mi mundo es mi Familia.

A mi Familia
Mis padres Elsa y Wilson por ser la luz

en mi camino y fortaleza y sabiduría en
momentos de fragilidad. Son el vivo
reflejo de amor incondicional, les
viviré eternamente agradecida.
Mis hermanitas Pao y Andre, el mejor
regalo que me han dado mis padres.
Por su ternura y complicidad, las amo
con todo mi corazón.
Mis abuelitos, tíos y primos por sus
enseñanzas y cariño. A mi ángel en el
cielo, porque guardo su sonrisa en mis
ojos, su fortaleza en mis huesos y su
alegría en mi alma.
Lissette Sánchez
vi
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios y a la Virgen María por su bendición, por la vida, la salud y la fuerza para
enfrentar cada obstáculo y disfrutar cada alegría.
A mis padres, por ser los autores principales en mi vida, por su amor y esfuerzo. A mis
hermanitas por los momentos de felicidad y llanto, por ser mi motivación y alegría. A mi
hermanito Moisés por siempre estar para mí.
A mi tutor, PhD. William Ricardo Calero Cáceres por ser mi mentor y guía en esta travesía,
por su enseñanzas, consejos y apoyo incondicional. Muchísimas gracias por todo.
A mis amigos por su cariño, amistad y apoyo. Por más momentos juntos.
A mis cómplices en esta travesía Katty, Jenny, Gaby J, Gabby L, Pauli, Chris, Joyce y Anabell.
Que la vida nos vuelva juntar.
A cada persona que ha ayudado en mi crecimiento profesional, mi más sincero

agradecimiento.
A la Universidad Técnica de Ambato y Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y

Biotecnología por la formación impartida y la experiencia que me han permitido vivir. A mis
docentes por brindarme sus conocimientos en mi formación profesional.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDO
APROBACIÓN DEL TUTOR ....................................................................................... ii
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD ...................................................................... iii
APROBACIÓN DE LOS MIEMBROS DEL TRIBUNAL DE GRADO ....................... iv
DERECHOS DE AUTOR ............................................................................................. v
DEDICATORIA ........................................................................................................... vi
AGRADECIMIENTO ................................................................................................. vii
RESUMEN.................................................................................................................. xii
ABSTRACT ................................................................................................................ xiii
CAPÍTULO 1 ............................................................................................................... 1
MARCO TEÓRICO..................................................................................................... 1
1.1. Antecedentes investigativos ......................................................................... 1
1.1.1. Emergencia de la resistencia antimicrobiana ........................................... 1
1.1.2. Patógenos alimentarios............................................................................. 3
1.1.3. E. coli: mecanismos de resistencia y producción de toxinas. .................. 6

1.1.3.1. E. coli: mecanismos de resistencia...................................................... 6
1.1.3.2. E. coli: productora de toxina Shiga (STEC)......................................... 9
1.1.4. Investigación epidemiológica de E. coli ................................................ 10

1.1.4.1. Técnicas de tipificación bacteriana .................................................... 10
1.1.4.2. Secuenciación de próxima generación (NGS) ................................... 11
1.1.4.3. Aplicación de la secuenciación de próxima generación: Secuenciación
de Genoma Completo (WGS) .................................................................................... 12
1.1.5. Análisis de secuencias de genoma completo. Herramientas

bioinformáticas empleadas en el análisis de secuencias de genoma completo .......... 13
1.2. Objetivos .................................................................................................... 19
1.2.1. Objetivo General .................................................................................... 19

1.2.2. Objetivos Específicos ............................................................................. 19
viii
CAPITULO 2 ............................................................................................................. 20
METODOLOGÍA ...................................................................................................... 20
2.1. Materiales ................................................................................................... 20
2.2. Métodos ...................................................................................................... 22
2.2.1. Análisis de la calidad del genoma de las secuencias ensambladas ........ 23
2.2.2. Caracterización de secuencias ................................................................ 24
2.2.3. Determinación de profagos y elaboración de gráficos circulares .......... 27
2.2.4. Comparación de secuencias de genoma completo de diversos orígenes

geográficos y elaboración de árboles filogenéticos ................................................... 28
CAPÍTULO 3 ............................................................................................................. 31
RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................................ 31
3.1. Análisis y discusión de los resultados ............................................................ 31

3.1.1. Análisis de secuencias a través de plataformas bioinformáticas ............ 31
3.1.1.1. Análisis de secuencias de genoma completo ..................................... 31
3.1.1.2. Caracterización de secuencias de genoma completo (WGS) de E. coli
portadores de la toxina Shiga. .................................................................................... 33
3.1.1.3. Caracterización genotípica de secuencias de genoma completo de E.
coli portadoras de betalactamasas de espectro extendido. ......................................... 41
3.1.2. Evaluación de la distancia filogenética entre aislamientos de E. coli de

origen ecuatoriano con aislamientos de diverso origen geográfico ........................... 51
3.1.2.1. Estructura de población basada en la estrategia cgMLST ..................... 51

3.1.2.2. Caracterización de secuencias de diverso origen geográfico y análisis
comparativo con secuencias de origen local .............................................................. 57
CAPÍTULO 4 ............................................................................................................. 62
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................ 62
4.1. Conclusiones ....................................................................................................... 62
4.2. Recomendaciones ................................................................................................ 64
MATERIALES DE REFERENCIA ......................................................................... 65
ix
Referencia Bibliográficas........................................................................................... 65
Anexos ........................................................................................................................ 86
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Toxinas bacterianas, fuentes asociadas y toxicidad que generan en células

eucariotas...................................................................................................................... 5
Tabla 2 Recursos informáticos ................................................................................. 20
Tabla 3 Equipos ......................................................................................................... 22
Tabla 4 Identificación de las secuenciaciones del genoma completo de 2 cepas de E.
coli aisladas de vegetales y comida callejera de Ecuador portadoras de genes toxina
Shiga y ARGs ............................................................................................................. 34
Tabla 5 Caracterización basada en la WGS de 2 cepas de E. coli aisladas de vegetales
y comida callejera de Ecuador portadoras de genes toxina Shiga y ARGs ............... 35
Tabla 6 Identificación de las secuenciaciones del genoma completo de 3 cepas de E.
coli aisladas de vegetales y comida callejera de Ecuador portadoras de ARGs y genes
de virulencia ............................................................................................................... 41
Tabla 7 Caracterización basada en la secuenciación del genoma completo de 3 cepas
de E. coli aisladas de vegetales y comida callejera de Ecuador portadoras de ARGs y
genes de virulencia ..................................................................................................... 43
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Línea de tiempo. Relación entre la introducción de nuevos antibióticos e

identificación de resistencia antimicrobiana ................................................................ 2
Figura 2 Transferencia genética horizontal entre bacterias ........................................ 8
Figura 3 Mecanismo de secuenciación de próxima generación ................................ 12
Figura 4 Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli C5b1
aislada de col blanca (B. oleracea) ............................................................................ 36
x
Figura 5 Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli T5bX
aislada de tomate (S. lycopersicum) ........................................................................... 37
Figura 6 Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli N1-
1 aislada de comida callejera (Ensalada). .................................................................. 44
Figura 7 Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli
J5_2C2 aislada de juego de caña. ............................................................................... 45
Figura 8 Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli L6by
aislada de lechuga (L. sativa). .................................................................................... 49
Figura 9 Árbol de expansión mínima (Minimum-spanning tree) para 50 aislados
basados en el cgMLST de E. coli ............................................................................... 52
Figura 10 Árbol de filogenia rectangular comparativo y predicción de genes de
virulencia para 50 aislados de E. coli de diverso origen geográfico .......................... 58
Figura 11 Árbol de filogenia rectangular comparativo y predicción de ARGs para 50
aislados de E. coli de diverso origen geográfico ........................................................ 59
Figura 12 Árbol de filogenia rectangular comparativo y predicción de plásmidos para
50 aislados de E. coli de diverso origen geográfico. .................................................. 60
ÍNDICE ANEXOS
Anexo 1 Tabla de identificación de las secuenciaciones del genoma completo de 13

cepas de E. coli aisladas de vegetales y comida callejera de Ecuador ...................... 86
Anexo 2 Tabla de información relacionada a la calidad del genoma para las 13
secuencias de genoma completo aisladas de vegetales y comida callejera de Ecuador
.................................................................................................................................... 88
Anexo 3 Tabla de información compilada de secuencias de genoma completo de
diverso origen geográfico y de origen local ............................................................... 89
Anexo 4 Códigos de identificación (CI) y tipo de complejo clonal (ST Complex) .. 94
xi
RESUMEN
La secuenciación de genoma completo (WGS) es una herramienta fundamental para

el análisis y detección de genes de resistencia antimicrobiana (ARGs), factores de
virulencia y elementos genéticos móviles (MGE) en genomas bacterianos. No
obstante, la aplicación de WGS en Ecuador se desarrolla a través de la academia, mas
no en la adopción de estas tecnologías como mecanismos de vigilancia y control
epidemiológico en los sistemas de salud. El presente estudio se enfocó en la
caracterización in silico de secuencias de genoma completo de Escherichia coli
aisladas de vegetales y comida callejera procedentes de mercados de las ciudades
Ambato y Riobamba, siguiendo como línea de investigación Microbiología y
Biotecnología. Se emplearon secuencias de longitudes de lectura de extremo
emparejado de 300 pb. La caracterización in silico se realizó a través de herramientas
bioinformáticas empleadas para la detección de ARGs, virulencia y MGE. Los
resultados de patogenicidad indicaron que 2 cepas portaban los genes stx2 y diversos
factores de virulencia. Adicionalmente, se identificó que 3 cepas portaban los genes
blaTEM y blaCMY y diferentes determinantes de RAM que confieren resistencia a
aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas y sulfametoxazol. Los análisis de filogenia
indicaron que las interacciones evolutivas de ARGs, factores de virulencia y tipos de
plásmidos no se correlacionaron con el origen geográfico y fuente de aislamiento,
mostrando una elevada diversidad. Estos hallazgos destacan la necesidad de emplear
WGS en la vigilancia y control de E. coli patogénica en matrices alimentarias, teniendo
en cuenta una perspectiva “One Health”.
Palabras clave: Secuenciación de genoma completo, Escherichia coli, resistencia,

virulencia, plásmidos, fagos, filogenia.
xii
ABSTRACT
Whole genome sequencing (WGS) is a fundamental tool for the analysis and detection
of antimicrobial resistance genes (ARGs), virulence factors, and mobile genetic
elements (MGEs) in bacterial genomes. Despite their advantages for epidemiological
analysis, applying WGS in Ecuador is scarce and limited to Academia. The present
study focused on in silico characterization of WGS of Escherichia coli isolated from
vegetables and street food from markets in Ambato and Riobamba. The research line
of this research is Microbiology and Biotechnology. For this study, paired-end read
length sequences of 300 bp were used. In silico characterization was carried out
through bioinformatics tools to detect ARGs, virulence, and MGE genes. Two isolates
harbor the stx2 genes and various virulence factors. It was also identified that three
strains carried the blaTEM and blaCMY genes, and different ADR determinants confer
resistance to aminoglycosides, quinolones, tetracyclines, and sulfamethoxazole.
Phylogenetic analysis indicated that the evolutionary interactions of resistance genes,
virulence factors, and plasmid types did not correlate with the geographic origin and
source of isolation, showing high diversity. These findings highlight the need to use
WGS as a surveillance tool to analyze pathogenic E. coli in food matrices, taking into
account a "One Health" perspective.
Keywords: Whole genome sequencing, resistance, virulence, plasmids, phages,

phylogeny.
xiii
CAPÍTULO 1
MARCO TEÓRICO
1.1.Antecedentes investigativos
1.1.1. Emergencia de la resistencia antimicrobiana
A lo largo de los últimos años, la resistencia a los antimicrobianos (RAM) ha sido

considerada una de las principales amenazas mundiales para la salud pública (World
Health Organization, 2015). Desde principios del siglo XX, cuando se descubrieron
los primeros antibióticos modernos, los antimicrobianos han salvado millones de vidas
en el mundo, siendo desde entonces una de las bases centrales en la medicina (The
World Bank & World Health Organization, 2022). Sin embargo, el uso persistente
de los antibióticos a nivel mundial ha originado que muchos antimicrobianos hayan
perdido su eficacia, dada la presión selectiva que estos agentes antagonistas ejercen
sobre las bacterias, derivando en una aceleración del ritmo evolutivo, generándose
episodios de mutaciones y el desarrollo de nuevos mecanismos de resistencia (Buelow
et al., 2021; Rodgers et al., 2018).
En este sentido, estadísticas presentadas en el año 2019, exhibieron que 4.95 millones
de muertes fueron provocadas por enfermedades asociadas a RAM bacteriana, y
estimaciones para el año 2050 prevé que esta cifra haya incrementado a 20 millones,
dejando pérdidas económicas superiores a los 2,9 billones de dólares (The World
Bank & World Health Organization, 2022; Uddin et al., 2021). Bajo este contexto,
RAM se considera una amenaza de alto impacto para la salud de los seres humanos,
animales, medioambiente y economía mundial (Pan American Health Organization
1
& World Health Organization, 2021). Alexander Fleming en su discurso de
aceptación del premio Nobel en 1945 mencionó “Existe el peligro de que un hombre
pueda aplicar una dosis insuficiente de antibiótico, y al exponer a este microorganismo
a una cantidad no letal del mismo, los haga resistentes” (Fleming, 1945).
Desafortunadamente, en la actualidad este vaticinio es una realidad. La presión
selectiva antimicrobiana, permite que las bacterias adquieran ARGs (del inglés,
antibiotic resistance genes) y elementos genéticos móviles (MGE, del inglés mobile
genetic elements) que pueden transferirse a otras bacterias por diferentes mecanismos
de transferencia genética horizontal (HGT, del inglés horizontal gene transfer). Cabe
recalcar que las bacterias al adquirir esta RAM también adquieren una mayor
capacidad de proliferar en animales, humanos y entorno natural (Velazquez-Meza et
al., 2022).
Figura 1
Línea de tiempo. Relación entre la introducción de nuevos antibióticos e
identificación de resistencia antimicrobiana
Adaptado de (CDC, 2019)
2
En retrospectiva, las primeras bacterias resistentes identificadas fueron de origen
clínico, tal es el caso de Staphylococcus aureus, una bacteria resistente a la penicilina
identificada como resistente pocos años después de la inserción del antimicrobiano en
hospitales de Londres en el año de 1940 (Levy & Bonnie, 2004). Años posteriores, la
introducción de nuevos medicamentos semisintéticos empleados para combatir
bacterias resistentes y el sobreuso de los mismos, acrecentó el número de bacterias
resistentes y multirresistentes, por ejemplo, las Enterobacterias a saber: E. coli,
Shigela y Salmonella fueron identificadas como resistentes a múltiples fármacos en la
década de 1950 y 1960 (Watanabe, 1963). RAM ha sido considerada una creciente
fuente de preocupación a través de los años, puesto que la implementación de un
antibiótico no tarda en establecer resistencia, y en adición, se ha identificado que más
del 70% de las bacterias presenta resistencia al menos a un antibiótico (Economou &
Gousia, 2015).
Ante una posible crisis, la Organización Mundial de la Salud (OMS), emitió una acción
global acerca de RAM en 2015, adoptando un enfoque “One Health”(World Health
Organization, 2015). One Health describe un enfoque multidisciplinario conjunto
para proporcionar soluciones direccionadas a una salud óptima en personas, animales
y medio ambiente (Velazquez-Meza et al., 2022). De esta forma, se han desarrollado
sistemas de vigilancia e investigaciones frente al uso y consumo de antimicrobianos
en la población humana, animal y sus interconexiones, personas, animales, plantas y
entorno compartido, a fin de abordar la problemática a nivel regional, nacional y
mundial (FAO et al., 2022).
1.1.2. Patógenos alimentarios
A lo largo de la historia, los seres humanos han empleado microorganismos y sus

subproductos para producir y conservar alimentos mediante la fermentación. No
obstante, algunos de estos microorganismos deterioran significativamente los
alimentos y provocan enfermedades transmitidas por lo alimentos (Gourama, 2020).
3
Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) son un gran desafío para los
sistemas de salud pública a nivel mundial puesto que estas provocan una morbilidad,
mortalidad y costos económicos considerables, en especial en países en vías de
desarrollo (FAO & WHO, 2021).
La frecuencia e importancia de las enfermedades transmitidas por los alimentos

depende directamente de la interacción entre la matriz alimentaria, el patógeno de
transmisión por los alimentos, el huésped y el medio ambiente (Mousavi Khaneghah
et al., 2020). Se estima que cada año 1 de cada 10 personas en el mundo padecen de
enfermedades después de consumir alimentos contaminados por diversos agentes
(bacterias, virus, parásitos, toxinas y productos químicos), de estas, 420,000 personas
mueren y causan una pérdida de 33 millones de DALYS (años de vida saludable) a
nivel global (World Health Organization, 2015). En Ecuador, de acuerdo a la Gaceta
Epidemiológica del Ministerio de Salud, se reporta un promedio de 12,203 casos de
enfermedades bacterianas transmitidas por alimentos y agua para el año 2019, y 6,728
casos en el año 2021 (Ministerio de Salud Pública, 2022).
Dado el mecanismo por el cual estos patógenos transmitidos por los alimentos causan
enfermedades, las enfermedades transmitidas por medio de matrices alimentarias se
pueden clasificar en tres tipos: infecciones, infecciones tóxicas e intoxicaciones
transmitidas por los alimentos (Gourama, 2020). Algunos de los patógenos
responsables de la mayoría de los brotes reportados de ETAs son Norovirus,
Campylobacter spp., Salmonella spp, Listeria monocytogenes y E. coli productora de
toxinas Shiga (Curtis et al., 2014). Las infecciones tóxicas son provocadas por toxinas
producidas por el patógeno ingerido dentro del huésped (CDC, 2017; Zuñiga & Caro,
2017). Los microorganismos producen dos tipos de toxinas, endotoxinas: son toxinas
de lipopolisacáridos que forman parte de la membrana externa o de la pared celular de
bacterias Gram negativas; y exotoxinas: son proteínas tóxicas sintetizadas dentro de
las células que se excretan por bacterias, hongos, algas y protozoos Gram positivos y
Gram negativos (Madigan et al., 2016).
4
Las enterotoxinas son exotoxinas liberadas por el patógeno en el intestino, que afecta
principalmente la permeabilidad de las células epiteliales de la pared intestinal
(Martin, 2012). Algunos ejemplos de estos microorganismos son E. coli, Clostridium
perfringens, Vibrio cholera y S. aureus, con frecuencia estos microorganismos
generan toxinas capaces de formar poros en las membranas celulares, induciendo la
muerte celular del hospedador (Madigan et al., 2016). En la Tabla 1 se identifican
toxinas bacterianas, sus fuentes asociadas y la toxicidad que estas generan en células
eucariotas.
Tabla 1
Toxinas bacterianas, fuentes asociadas y toxicidad que generan en células
eucariotas
Organismo Toxina Fuente Toxicidad
C. perfringens Alfa, Beta, Suelo, agua, e Intoxicación alimentaria,
Épsilon y Iota intestinos de enterocolitis, gangrena
Enterotoxina de mamíferos. gaseosa.
C. perfringens
(CPE).
C. botulinum Toxina C2. Suelo, agua, Intoxicación alimentaria,

productos cárnicos, botulismo infantil y
miel, intestinos de adulto.
mamíferos.
B. anthracis Antígeno Tierra, productos Edema y necrosis
protector, toxina animales cutánea, shock,
del edema, contaminados insuficiencia cardíaca,
toxina letal. (huesos o pieles). disfunción respiratoria
grave.
E. coli Toxina Shiga Alimentos, Diarrea leve sin sangre a

animales, agua, grave, síndrome
personas y medio hemolítico urémico,
ambiente insuficiencia renal.
contaminados.
Adaptado de (Cetin, 2020).
5
1.1.3. E. coli: mecanismos de resistencia y producción de toxinas.
E. coli es un bacilo anaerobio facultativo Gram negativo perteneciente a la familia

Enterobacteriaceae (Gonzalez-Escalona et al., 2019). En seres humanos, E. coli es
comensal del tracto intestinal; no obstante, es capaz de sobrevivir fuera del tracto
intestinal como en el suelo, agua y alimentos (Vila et al., 2016). Algunas cepas de E.
coli no suelen ser patógenas, mientras que otras pueden causar una variedad de
enfermedades en humanos y animales. En la actualidad la amenaza identificada sobre
dicho patógeno radica a la creciente prevalencia de E. coli RAM y a la capacidad que
tiene estos para producir toxinas.
1.1.3.1. E. coli: mecanismos de resistencia
En general, las bacterias resisten la acción inhibitoria de los antibióticos empleando

dos mecanismos: la resistencia intrínseca y la adquirida. La resistencia intrínseca es la
capacidad natural que tienen los microorganismos para resistir a un determinado
antimicrobiano empleando sus características estructurales y funcionales (Cox &
Wright, 2013). Los mecanismos de resistencia adquirida se desarrollan a partir de un
cambio en el ADN bacteriano que desemboca un nuevo rasgo fenotípico.
Los mecanismos intrínsecos normalmente se encuentran codificados por cromosomas,

e incluyen bombas de expulsión activa o de eflujo (mecanismo capaz de modular o
eliminar la actividad de varios tipos o familias de antibióticos), enzimas que inactivan
antibióticos o mecanismos que sirven como barreras de permeabilidad (Fajardo et al.,
2008; Nikaido & Takatsuka, 2009). Las bacterias Gram negativas, al poseer una
segunda membrana lipídica posterior a la capa de peptidoglicano, permite generar
mayor resistencia intrínseca, ocasionando reducir la permeabilidad al encontrarse
expuesta a moléculas hidrófobas (Andersson & Hughes, 2017).
6
Algunos ejemplos de los mecanismos intrínsecos son: la bomba de eflujo AcrAB-
TolC de E. coli capaz de expulsar diferentes antibióticos dada la amplia especificidad
de sustrato, entre ellos los b-lactámicos dianónicos (Chowdhury et al., 2019); la
barrera de permeabilidad impuesta por la membrana externa en E. coli resistente a la
vancomicina permite describir otro mecanismo de resistencia intrínseca
(Krishnamoorthy et al., 2016).
Los mecanismos de resistencia adquiridos pueden ser mediados por dos vías:
mutaciones o con mayor frecuencia por HGT (Saha & Sarkar, 2021). La resistencia
adquirida por mutaciones son procesos espontáneos que no necesariamente se generan
tras la exposición a antibióticos (Sekyere & Asante, 2018). Las mutaciones pueden
generar resistencia al emplear los siguientes mecanismos: 1) modificación o
eliminación de la proteína a la cual el agente antimicrobiano se adhiere; 2) regulación
en la producción de enzimas inactivantes del agente antimicrobiano; 3) regulación o
modificación de las proteínas de membrana externa necesarias para permitir el ingreso
de los antibióticos a las células; 4) regulación de las bombas de eflujo (Calero
Cáceres, 2017; Morrison & Zembower, 2020).
Por otro lado, la HGT es un fenómeno de intercambio genético ya sean entre bacterias
u otros linajes de organismos (Burmeister, 2015). Los mediadores de HGT son los
MGE. Los MGE son segmentos de ADN que codifican enzimas y proteínas capaces
de cambiar de lugar entre cromosomas bacterianos (Dobrindt et al., 2015). Existen
diferentes clases de HGT, describiéndose: transposones, plásmidos, bacteriófagos,
agentes de transferencia genética (GTAs, del inglés gene tranfer agents), integrones,
elementos de integración conjugativa (ICEs, del inglés integrative conjugative
elements), islas genómicas (Gis, del inglés genomic islands (Frost et al., 2005;
Partridge et al., 2018).
En la Figura 2, se identifican los mecanismos de intercambio genético; la transferencia

de genes determinantes en la resistencia a los antibióticos en E. coli se desarrolla
7
mediante mecanismos de intercambio genético que involucran la transformación con
ADN libre, transducción por bacteriófagos (virus que infectan bacterias) o conjugación
que involucra plásmidos (moléculas de ADN bacteriano que coexiste de manera
independiente al cromosoma de la célula, y son los principales transportadores de
genes entre bacterias) (Clark et al., 2019; Emamalipour et al., 2020; Partridge et
al., 2018).
Figura 2
Transferencia genética horizontal entre bacterias
Adaptado de ( Guo, 2020)
E. coli es considerada un indicador para la resistencia antimicrobiana de las bacterias

Gram negativas. Dentro de los mecanismos de resistencia de E. coli destaca la
resistencia a β-lactámicos, dada la codificación de enzimas como las β-lactamasas de
espectro extendido (ESBL, del inglés extended-spectrum beta-lactamase) encargadas
de degradar estos antimicrobianos (Krishnamoorthy et al., 2016). Algunos de los
ARGs localizados en E. coli de prevalencia que codifican la resistencia a b-lactámicos
son: blaCTX, blaTEM y blaSHV (Khalifa et al., 2021).
8
1.1.3.2. E. coli: productora de toxina Shiga (STEC)
STEC es un grupo de E. coli patógenas, antiguamente identificadas como E. coli

enterohemorrágicas (EHEC). El primer brote reportado por STEC ocurrió en 1982, en
el cual el serotipo E. coli 0157:H7 fue causante de dos brotes de colitis hemorrágica;
en la actualidad, este serotipo es el causante de la mayoría de los brotes asociados a
STEC. STEC es productora de toxinas reconocidas como verotoxinas o Stxs (Zhang
et al., 2021).
Las Stx son toxinas proteicas bacterianas codificadas por los genes stx. Se encuentran
formadas por dos subunidades principales: subunidad A, encargada de lesionar el
ribosoma eucariota y detener la síntesis de proteínas en células diana y; pentámero de
subunidad B, responsable de mediar la unión de toxinas al receptor presente en células
endoteliales Gb3 (globotriaosilceramida) (Fraser et al., 2004). Las Stx se clasifican
en Stx1 y Stx2. El mecanismo de acción de estas toxinas es el mismo, pero
genéticamente e inmunológicamente se diferencian entre sí, exteriorizando un 55-60%
de identidad genética y de aminoácidos (Lee et al., 2007; Zhang et al., 2021).
Las infecciones provocadas por STEC son reconocidas como un problema de salud
pública importante alrededor del mundo. Según datos recopilados en el año 2010, han
permitido identificar que STEC transmitida por los alimentos desencadenó más de 1
millón de enfermedades humanas, 128 muertes y una pérdida de 13 000 DALYS
(World Health Organization & Food and Agriculture Organization of the United
Nations, 2018).
9
1.1.4. Investigación epidemiológica de E. coli
Las investigaciones de brotes generalmente vinculan las etiologías a alimentos

específicos, entre ellos alimentos crudos de origen animal, derivados de animales sin
procesar, frutas, verduras, entre otros (CDC, 2022; Luna-Guevara et al., 2019); este
precedente ha permitido que los sistemas de salud pública, las agencias reguladoras y
la industria alimentaria investiguen y desarrollen programas epidemiológicos en
muchos países (Dewey-Mattia et al., 2019). Sin embargo, en Ecuador no se realizan
estudios epidemiológicos enfocados en la detección de reservorios de RAM o de vías
de diseminación de RAM en la cadena alimentaria, con excepción de ciertos estudios
realizados por la academia (Barragán-Fonseca et al., 2022; Tubón et al., 2022;
Zurita, Yánez, Sevillano, Ortega-Paredes, et al., 2020).
En 2015, la Organización Mundial de la Salud (OMS) lanzó el Sistema mundial de

vigilancia de la resistencia y el uso de antimicrobianos (GLASS) para estandarizar las
metodologías de vigilancia de RAM, incluidas las directrices para la recopilación, el
análisis, la interpretación y el intercambio de datos de AMR de patógenos prioritarios
por países a nivel clínico (World Health Organization, 2015). La iniciativa GLASS
sugiere utilizar enfoques de secuenciación del genoma completo (WGS) para
complementar la caracterización fenotípica de patógenos prioritarios, con la
expectativa de que esto conduzca a una mejor comprensión de la transmisión y la
interrelación de las poblaciones microbianas (World Health Organization, 2020).
1.1.4.1. Técnicas de tipificación bacteriana
La tipificación bacteriana es la capacidad de diferenciación de bacterias a nivel de

especies o subespecies. La tipificación bacteriana se puede dar empleando métodos
fenotípicos (caracterización basada en atributos expresados visualmente) y genotípicos
(caracterización de contenido genético) (Harris & Okoro, 2014). La caracterización
10
bacteriana a nivel genotípico provee una descripción de contenido genético presente
en la bacteria, principalmente la identificación de ADN plasmídico en el cual se
pueden localizar ARGs, virulencia o cualquier tipo de gen de interés (Espitia-Navarro
et al., 2019). Existen diferentes niveles de caracterización genética: caracterización de
todo el contenido genético bacteriano, caracterización del ambiente cromosómico,
tipificación de vectores plasmídicos o caracterización de una pequeña parte de ADN
bacteriano de interés (Ann-Luna, 2016). La tipificación emplea dos métodos de
genotipado: 1) método basado en bandas; 2) método basado en secuencias (Oyarzabal
& Kathariou, 2014).
Los métodos de genotipado basados en tecnologías de secuenciación han incrementado

la disponibilidad de datos de secuencias bacterianas, convirtiendo a la secuenciación
en una herramienta factible para la vigilancia de RAM y patógenos potenciales
(Boolchandani et al., 2019). Bajo esta línea, la secuenciación permite identificar la
secuencia concreta de nucleótidos que conforman el ADN o ARN (Wood et al., 2020).
Empleando la secuenciación se puede analizar los polimorfismos de un solo nucleótido
(SNPs, del inglés single nucleotide polymorphism) o analizar secuencias buscando
caracteres repetidos. La tipificación multilocus de secuencias (MLST, del inglés multi-
locus sequence typing), secuenciación de genes específicos, secuenciación del genoma
completo (WGS, del inglés whole genome sequencing), son algunos de los métodos de
secuenciación emergente (Satapathy et al., 2019).
1.1.4.2. Secuenciación de próxima generación (NGS)
La secuenciación de próxima generación (NGS, del inglés next generation sequencing)

engloba un conjunto de tecnologías destinadas a analizar la secuenciación masiva y
paralela de millones de secuencias de una sola cadena individual de ADN analizada
por separado, pero de forma simultánea (Fletcher, 2021). Esta secuenciación se
diferencia del resto (secuenciación primera, segunda y tercera generación) dado que
se amplifican los fragmentos de ADN antes de empezar a secuenciar. Algunas de los
11
equipamientos o plataformas empleadas en NGS son: Roche, 454 Life Sciences (GS
FLX titanium), Life Technologies (Ion Torrent & Ion Proton) e Illumina (HiSeq,
MiSeq, GenomeAnalyzer), Nanopore, PacBio (Pervez et al., 2022; Udaondo et al.,
2021; Y. Wang et al., 2021).
Figura 3
Mecanismo de secuenciación de próxima generación
1.1.4.3. Aplicación de la secuenciación de próxima generación:

Secuenciación de Genoma Completo (WGS)
WGS es un método integral de NGS utilizado para analizar genomas completos; es

decir, permite determinar el orden exacto de las bases nitrogenadas (A, T, C y G) en
el genoma de un organismo (CDC, 2022; Yin et al., 2019). WGS en la actualidad se
emplea como un mecanismo clínico de rutina para el control y estudio de infecciones,
así como para la caracterización de patógenos y ARGs (Oniciuc et al., 2018). Existe
una gran gama de herramientas bioinformáticas para predecir RAM a partir de datos
de WGS en tiempo real, dada la disponibilidad creciente de programas que permiten
12
ensamblar, tipificar e identificar genotipos específicos de interés. De este modo,
debido a las grandes mejoras tecnológicas de secuenciación, WGS se ha convertido en
una de las herramientas base para la ejecución de investigaciones epidemiológicas
(Köser et al., 2014).
1.1.5. Análisis de secuencias de genoma completo. Herramientas

bioinformáticas empleadas en el análisis de secuencias de genoma
completo
Las herramientas bioinformáticas permiten ensamblar o mapear la lectura, al genoma

de referencia (Nodehi et al., 2021). La gran cantidad de softwares o herramientas para
realizar ensamblajes o mapear las lecturas están en sistema operativo Unix o Linux de
forma que se emplean líneas de comandos; solo una pequeña proporción se encuentran
en Sistema Operativo de Disco (DOS, del inglés disk operating system) utilizable en
Windows con una interfaz menos compleja (Joppich & Zimmer, 2019). Pese a esto,
en la actualidad ya existen diferentes herramientas bioinformáticas basadas en la web
que permiten subir los datos de secuencias completas y analizar los mismos sin el
empleo de líneas de comandos.
Herramientas bioinformáticas dependientes de CGE
El centro de Epidemiológica Genómica (CGE, del inglés Center for Genomic

Epidemiology), proporciona una base de datos bioinformáticos diseñados con la
finalidad de analizar e interpretar datos de secuencias completas empleando diferentes
servicios (Larsen et al., 2017).Algunos de los servicios bioinformáticos webs
desarrollados por CGE, se describen a continuación:
13
• MLST 2.0
Representa uno de los métodos más utilizados para la tipificación de microorganismos

patógenos. Consiste en el análisis de las secuencias de fragmentos de
aproximadamente 450 pb de por lo menos 7 genes housekeeping, cuyas variaciones
permiten diferenciar las distintas cepas de la misma especie (Díaz et al., 2018). El
programa MLST versión 2.0 es una herramienta bioinformática que analiza los perfiles
de MLST para 66 especies bacterianas utilizando como datos de entrada WGS que
puede ser ingresado en formato FASTA y FASTQ (Larsen et al., 2012).
• ResFinder 4.1.
ResFinder es una de las herramientas bioinformáticas de la plataforma CGE de libre

acceso, que permite identificar ARGs completos, y/o mutaciones cromosómicas
específicas que median la resistencia a antimicrobianos en las secuencias parciales o
totales del ADN bacteriano (lecturas sin procesar y genomas ensamblados) (Florensa
et al., 2022). Esta herramienta bioinformática, emplea bases de datos seleccionadas,
bases de datos públicas y de artículos ResFinder puede aceptar datos en forma de
genomas ensamblados en formato FASTA y en forma de lecturas crudas, en formato
FASTQ (Carattoli et al., 2014).
Contiene cuatro bases de datos, la primera enfocada en identificar ARGs, la segunda

direccionada en identificar mutaciones cromosómicas puntuales, la tercera base de
datos se encuentra ligada a la traducción del genotipo a fenotipo y la última base de
datos, es un panel específico para simular pruebas de susceptibilidad (Bortolaia et al.,
2020). Esta última base de datos implementa antibióticos in silico que simulan pruebas
de susceptibilidad a antimicrobianos, semejante al mecanismo empleado en las
pruebas de susceptibilidad fenotípicas (Clausen et al., 2018).
14
• PlasmidFinder 2.1.
Según Carattoli et al., (2014), PlasmidFinder 2.1. es una herramienta web que
contiene una base de datos de consenso que integra replicones de 559 plásmidos
completamente secuenciados. Se construyó a partir de 126 secuencias diseñadas en
plásmidos completamente secuenciados disponibles en la base de datos de nucleótidos
del NCBI en 2014 y se ha actualizado continuamente para incluir nuevos replicones
de plásmidos secuenciados asociados con la familia Enterobacteriaceae.
PlasmidFinder se puede utilizar para el análisis de secuencias de replicones de datos
de secuenciación en bruto (fastq) y ensamblados (fasta) (Carattoli et al., 2014).
• VirulenceFinder 2.0.
VirulenceFinder 2.0 es un servidor que permite la identificación de genes de virulencia

conocidos en secuencias de nucleótidos (Besser et al., 2018). Por otra parte, esta
herramienta es empleada para examinar secuencias de genoma de fagos, profagos,
detección de ARGs y virulencia (Kleinheinz et al., 2014).
• CSI Phylogeny 1.4
Herramienta bioinformática empleada en la clasificación filogenética basada en la

detección de polimorfismos de nucleótido único (SNPs), infiriendo una filogenia
justificada en la alineación concatenada de SNP de alta calidad. Por otro lado, CSI
Phylogeny 1.4 facilita la generación de árboles filogenéticos desarrollados en base a
SNP localizados entre los aislados ingresados (Ahrenfeldt et al., 2017).
15
Herramientas bioinformáticas independientes de CGE
• Centro de Recursos de Bioinformática Bacteriana y Viral (BV-BRC)
Sistema de información diseñado con la finalidad de desarrollar investigaciones sobre

enfermedades infecciosas bacterianas y virales. Esta plataforma alberga datos sobre la
estructura y función de proteínas, estudios clínicos, resistencia a medicamentos,
epidemiologia, entre otros; por otra parte, proporciona herramientas de código abierto
para el análisis de datos y anotaciones genómicas (Olson et al., 2023).
• PHASTER
Servidor web desarrollado para la identificación y anotación de secuencias de profagos

dentro de genomas y plásmidos bacterianos (Arndt et al., 2016).
• Proksee
Herramienta bioinformática web empleada en el ensamblaje, generación de anotación

y visualización del genoma (Proksee, 2022).
• BacWGSTdb 2.0
BacWGSTdb 2.0 es una base de datos de libre acceso empleada en la tipificación de

secuencias de genoma completos bacterias. La gran diversidad de recursos para los
datos de secuenciación genoma bacterianos y metadatos recuperados de NCBI
GenBank y BioSample con los que cuenta esta base de datos, permiten la vigilancia
epidemiológica genómica de los patógenos bacterianos (Feng et al., 2021).
16
• Galaxy Sciensano
Es un servidor Galaxy que cuenta con herramientas bioinformáticas, flujos de trabajo

y bases de datos empleadas en WGS para la tipificación y caracterización de
patógenos. Algunas de las aplicaciones se destaca el ensamblaje, mapeo de lectura,
alineación de secuencias, entre otros. En sus actualizaciones recientes permite el
análisis de datos provenientes de Illumina, permitiendo tener una alta compatibilidad
con esta plataforma (Galaxy, 2023).
• PHYLOViZ
PHYLOViz es un software que permite el análisis de métodos de tipificación basados

en secuencias que incluyen el análisis de SNP y el genoma completo (WGS). Es una
herramienta Java independiente que permite la deducción filogenética y visualización
de conjuntos de datos con enfoques epidemiológicos moleculares (datos referentes a
SNP o cg/wgMLST) (Nascimento et al., 2017).
• iTOL
iTOL es una herramienta empleada en el diseño, visualización, y generación de

anotaciones de árboles filogenéticos (Letunic & Bork, 2021).
• Tipificación de secuencias multilocus del genoma central (cgMLST)
Los esquemas MLST de genoma central se basan en un conjunto fijo de genes que se
encuentran conservados en todo el genoma, los cuales suelen ser específicos de la
especie (Kimura, 2018). Esta clase de esquemas son herramientas que permiten el
genotipado, mismas en el área epidemiológica permiten potenciales investigaciones y
vigilancia, en adición la clasificación de cepas en las diferentes muestras (Ragupathy
17
et al., 2022). El cgMLST tiene como objetivo relacionar el poder discriminatorio del
MLST clásico con la amplia cantidad de datos genéticos derivados de WGS
(Neumann et al., 2019).
18
1.2. Objetivos
1.2.1. Objetivo General
Analizar secuencias de genoma completo de Escherichia coli aisladas de vegetales y

comida callejera de Ecuador.
1.2.2. Objetivos Específicos
- Caracterizar in silico secuencias de genoma completo de E. coli portadoras de la toxina

Shiga aisladas en vegetales de Ecuador.
- Caracterizar in silico secuencias de genoma completo de E. coli portadoras de

betalactamasas de espectro extendido aisladas en vegetales de Ecuador.
- Evaluar la distancia filogenética y las características genómicas entre las secuencias

de genoma completo de E. coli caracterizadas en este estudio con secuencias
representativas de diferente origen geográfico y tipo de muestra.
19
CAPITULO 2
METODOLOGÍA
2.
2.1.Materiales
Tabla 2
Recursos informáticos
Recursos Desarrollador
Base de datos
• NCBI • Biblioteca Nacional de Medicina, Departamento de

Salud y Servicios Humanos EE. UU, Gobierno Federal
de los EE.UU.
Herramientas
bioinformáticas:
• Plataforma CGE • Grupo de Investigación para la Epidemiología

Genómica del Instituto Nacional de Alimentos,
Universidad Técnica de Dinamarca (DTU).
• KBase • Departamento de Biología de Sistemas Energéticos de

Estados Unidos.
• iTOL • Ivica Letunic y Peer Bork (Letunic & Bork, 2007)
• BacWGSTdb 2.0 • Instituto de Medicina Traslacional, Universidad de

Zhejiang, China. Zhi Ruan y Ye Feng (Ruan & Feng,
2016)
• Galaxy Sciensano • Laboratorio de Nekrutenko en el Centro de Genómica

Comparada y Bioinformática de Penn State, Laboratorio
20
Recursos Desarrollador
Taylor de la Universidad Johns Hopkins y el Laboratorio

Goecks de la Universidad de Salud y Ciencias de
Oregón.
• Microreact • Centro de Vigilancia de Patógenos Genómicas (CGPS).
• Proksee • Genome Canadá y Genome Alberta.
• Pathogenwatch • Centro de Vigilancia de Patógenos Genómicas (CGPS).

Instituto de Grandes Datos, Universidad de Oxford.
• Phaster • Institutos Canadiense de Investigación en Salud (CIHR),

Genome Alberta, Universidad de Alberta. David Arndt,
Jason Grant, Ana Marcu, Tanvir Sajed, Allison Pon,
Yongjie Liang, David Wishart.
• BV-BRC • Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades

Infecciosas (NIAID).
• Phyloviz • Bruno Goncalves y Joao Andre Carrico
Secuencias de genoma
completo de E. coli
obtenidas de aislamientos
de vegetales y comida
callejera de Tungurahua y
Chimborazo en los años
2020 – 2021.
21
Tabla 3
Equipos
Recursos Cantidad
Computadora portátil 1
Router para internet 1
2.2.Métodos
La presente investigación planteó realizar un análisis in silico de secuencias de genoma

completo de E. coli. Se utilizaron secuencias de genoma completo de E. coli obtenidas
de aislamientos de vegetales frescos y comida callejera originarios de Ecuador,
portadoras de toxina Shiga (STEC) y resistencia antimicrobiana proveniente de
estudios preliminares que no incluyeron el análisis de genoma completo (Barragán-
Fonseca et al., 2022; Tubón et al., 2022).
Previamente, se identificaron 182 aislados como pertenecientes a la especie E. coli. Se

seleccionaron aislados que presentaron perfiles de resistencia antimicrobiana
fenotípica y genotípica y, portaban los genes de virulencia stx2, independientemente.
Los aislados fueron recuperados de vegetales frescos provenientes de mercados de la
ciudad de Riobamba y la comida preparada fue obtenida en calles de la ciudad de
Ambato. Las secuencias crudas de genoma completo fueron obtenidas en base a una
colaboración con el Departamento de Agricultura y Mercados del Estado de Nueva
York (Estados Unidos), la Universidad McGill de Montreal (Canadá) y la Universidad
Central del Ecuador. En resumen, los cultivos de E. coli se realizaron en caldo LB e
incubaron a 37°C durante 24 horas. La biomasa generada se empleó para extraer ADN
genómico utilizando el kit de purificación de ADN genómico Wizard (Promega,
22
Madison, WI, EE. UU) siguiendo el instructivo del fabricante; el ADN fue
cuantificado utilizando el fluorómetro Qubit 3.0 (Invitrogen, CA, EE.UU.).
Las bibliotecas genómicas fueron preparadas utilizando el kit de preparación de

bibliotecas Nextera XT (Illumina, CA, EE.UU.), y la secuenciación de todo el genoma
(WGS) se realizó empleando longitudes de lectura de extremo emparejado de 300 pb
en la plataforma MiSeq (Illumina). Las lecturas en bruto se ensamblaron de novo a
través de SKESA v2.2 haciendo uso del Pipeline de Anotación del Genoma Procariota
NCBI (Souvorov et al., 2018). Las secuencias de genoma completo ensambladas
fueron depositadas en la base de datos del Centro Nacional de Información
Biotecnológica (NCBI) bajo el BioProject PRJNA415804, los ensamblajes
(Assembly) y biomuestras (BioSample) individuales se enumeran en Anexo 1. Los
ensamblajes fueron descargados de la base de datos GenBank de NCBI en formato
FASTA.
2.2.1. Análisis de la calidad del genoma de las secuencias ensambladas
El análisis de la calidad de los datos de WGS son esenciales antes de realizar cualquier
análisis bioinformático, para evaluar si estos han alcanzado un estándar adecuado. A
partir de las secuencias de genoma completo previamente ensambladas y descargadas,
se desarrolló el análisis de la calidad del genoma empleando la herramienta
bioinformática BV-BRC (https://www.bv-brc.org). Una vez iniciado sesión en BV-
BRC, se procedió a subir cada una de las secuencias en la carpeta principal. Posterior
a ello, en el menú principal utilizando las opciones Herramientas y Servicios en la
categoría Genómica, se seleccionó la opción Análisis del genoma integral. Este
metaservicio de análisis integral del genoma permite realizar un análisis profundo de
las secuencias que incluyen ensamblajes, anotaciones, análisis comparativos básicos
que permiten distinguir el genoma de sus vecinos más cercanos.
23
Una vez abierto el formulario de entrada de Análisis del genoma integral, se seleccionó
los datos de entrada “Contigs ensamblados”; los archivos de entrada fueron
seleccionados uno por uno de manera independiente de la carpeta principal “Espacios
de trabajo”. El parámetro seleccionado de dominio del organismo objetivo fue
Bacterias o Arqueas; por otro parte, el nombre de la taxonomía insertada fue
“Escherichia coli”. La identificación de la taxonomía se rellenó automáticamente
después de introducir el nombre de la taxonomía (ID Escherichia coli: 562). Los
nombres de salida fueron insertados en base a la especie microbiana e identificación
del aislamiento (Ejm. Escherichia coli_JC5_2C2). Los datos de salida fueron
depositados en una carpeta denominada “Grupos de genoma”.
Los análisis efectuados se visualizaron en el espacio de trabajo privado en la categoría

“Mis genomas”. Cada secuencia analizada fue seleccionada una por una y visualizada
mediante la opción “Vista del Genoma”. Los resultados provenientes del análisis
desarrollado en esta sección son expuestos en el apartado de anexos, Anexo 1.
2.2.2. Caracterización de secuencias
La caracterización de las secuencias se desarrolló empleando herramientas disponibles

en el sitio web del Centro de Epidemiologia Genómica (CGE, del inglés Center for
Genomic Epidemiology) (http://www.genomicepidemiology.org/services/). La
caracterización in silico fue efectuada a partir de datos de WGS de E. coli. Los
resultados obtenidos fueron cribados en base a las combinaciones y coincidencias
perfectas para un gen determinado, evaluándose la longitud del mejor gen de
resistencia de coincidencia en la base de datos y la longitud de alineación entre el mejor
gen de interés (gen de resistencia, gen de virulencia, identificación del replicón de
plásmido encontrado, entre otros) y la secuencia correspondiente en el genoma.
24
• Tipificación de secuencias multilocus (MLST)
Una vez analizada la calidad de los ensamblajes, se procedió a tipificar los aislamientos
empleando la herramienta MLST 2.0. Para lo cual, se seleccionó el servicio de
herramientas bioinformáticas para tipificación con el nombre “MLST”. Seguidamente
se seleccionó el tipo de microorganismos al cual pertenecen las muestras “Escherichia
coli #1”. El parámetro subsiguiente de profundidad mínima fue deshabilitado dado
que las entradas de lecturas eran contigs ensamblados, siendo este parámetro relevante
en entradas de lectura en bruto. Se seleccionó el tipo de entrada de datos FASTA y se
cargaron los archivos uno a uno. Los resultados referentes al perfil MLST, organismo
al que pertenecen los aislados, tipo de secuencia del genoma de entrada (ST, del inglés
Sequence Type), se detallan en el apartado resultados (CGE, 2022).
• Identificación de ARGs y mutaciones puntuales
Empleando la herramienta ResFinder 4.1 se identificó ARGs completos y mutaciones

puntuales. De forma que, se seleccionó el servicio de herramientas bioinformáticas
para fenotipado con el nombre “ResFinder”. Los parámetros seleccionados fueron
“Mutaciones puntuales y/o genes adquiridos”, en este caso se evaluaron tanto las
mutaciones en puntos cromosómicos como los ARGs adquiridos; para cada ítem, se
seleccionaron las opciones predeterminadas. Posteriormente se escogió la especie a la
cual pertenecen las muestras “Escherichia coli” y el tipo de lectura seleccionado fue
“Genoma/Contigs ensamblados”. Los archivos se cargaron uno a uno y los resultados
obtenidos referente al antimicrobiano evaluado, clases del antibiótico o
antimicrobiano, fenotipo predicho de secuenciación de genoma completo (resistencia
o no resistencia), trasfondo genético, es decir, los genes o mutaciones puntuales
responsables de la resistencia genética (en el caso de haber resistencia), se presentan
en el capítulo “Resultados y Discusión” (CGE, 2022).
25
• Identificación de los genes de virulencia adquiridos
La identificación de los genes de virulencia adquiridos se realizó empleando el servicio

bioinformático VirulenceFinder 2.0. Inicialmente, se eligió el servicio de herramientas
bioinformáticas para fenotipado con el nombre “VirulenceFinder”. Posterior a ello, se
seleccionó la base de datos del microorganismo correspondiente al análisis
(Escherichia coli). Los parámetros referentes al umbral y longitud mínima fueron
seleccionados por defecto 90% y 60%, respectivamente. El umbral para %ID, permite
identificar el porcentaje mínimo de nucleótidos idénticos entre el gen de virulencia
adecuado en la base de datos y la secuencia muestra; por otro parte, la longitud mínima
hace referencia al número de nucleótidos que una secuencia debe superponerse al gen
de virulencia, representándolo en forma de porcentaje de longitud total del gen de
virulencia. El tipo de lecturas seleccionado fue “Genoma/ Contig ensamblado”; y los
archivos se cargaron uno a uno, de manera independiente.
Los resultados obtenidos concerniente al factor de virulencia, porcentaje de identidad,

longitud del mejor gen de virulencia coincidente en la base de datos y longitud de los
mejores segmentos de alta puntuación (HSP), fenotipo previsto, número de adhesión,
son presentados en el capítulo “Resultados y Discusión”.
26
• Identificación del potencial de patogenicidad
La predicción del potencial de patogenicidad de los aislamientos se llevó a cabo a

través del servicio bioinformático PathogenFinder 1.1. Se seleccionó el servicio de
herramientas bioinformáticas para fenotipado con el nombre “PathogenFinder”. El
parámetro referente al filo o clase del microorganismo interés fue seleccionado en base
al modelo automático; por otra parte, el tipo de entrada seleccionado fue “Genoma/
Contig ensamblado”. Los archivos fueron cargados uno por uno de manera
independiente y los resultados referentes a la probabilidad de que los aislamientos sean
un patógeno humano son expuestos en el apartado “Resultados y Discusión”.
• Identificación de plásmidos
Se empleó la herramienta PlasmidFinder 2.1 para identificar la presencia de plásmidos

en los aislados de secuencias completas de E. coli. Para ejecutar la predicción de
plásmidos utilizando el servidor web PlasmidFinder, se procedió a seleccionar la base
de datos “Enterobacteriaceae”. El umbral para el porcentaje mínimo de identidad
predeterminado fue 95%; por otro lado, el umbral de cobertura mínimo
predeterminado fue 60%. El tipo de lectura seleccionado fue “Genoma/ Contigs
ensamblado o borrador (fasta)”. Los archivos fueron cargados uno por uno de manera
independiente. Los resultados de identificación del replicón de plásmido encontrado
con mayor identidad se muestran en el apartado “Resultados y Discusión”.
2.2.3. Determinación de profagos y elaboración de gráficos circulares
El servidor web PHASTER (http://phaster.ca) se empleó para identificar regiones de

bacteriófagos y profagos (estado del genoma de bacteriófagos integrados en el genoma
huésped). Los archivos de secuencias de nucleótidos fueron cargados de manera
27
individual en la plataforma PHASTER. Se seleccionó el ítem “Mi entrada consiste en
varios contigs separados (solo formato FASTA)”; por otra parte, el ítem consecuente
se dejó como predeterminado. Los datos fueron enviados y una vez completada la
carga del archivo, se identificó las regiones de profagos intactas (puntuación >90, este
parámetro es calculado mediante 3 métodos para puntuar las regiones del fago como
intactas, cuestionables o incompletas). Las regiones de ADN de fagos intactas fueron
recopiladas en archivos de texto con extensión “. fasta” y el contenido de G+C se
presenta en la sección “Resultados y Discusión”.
Se desarrollaron gráficas circulares de las secuencias de genoma completo de forma

individual, empleando la herramienta bioinformática web Proksee (https://proksee.ca),
en el cual se insertó las regiones de profagos intactas e identificaron los ARGs y
virulencia previamente analizados. Las WGS previamente descargadas fueron
cargadas de manera independiente través del Browser. Una vez creado el mapa
circular, se procedió a insertar el archivo “. fasta” de las regiones de profagos intactas
para cada secuencia empleando la herramienta BLAST localizada en la categoría
“Comparación de Secuencias”. En la sección de Trabajo, se seleccionó el archivo que
contenía las regiones de profagos intactas cargado, y se añadió los resultados en el
mapa. Los ARGs localizados con anterioridad por ResFinder fueron insertados
empleando la herramienta “CARD Resistance Gene Identifier” localizada en la
categoría “Anotación del Genoma”; los genes de resistencia insertados sin previo
análisis fueron eliminados del gráfico circular.
2.2.4. Comparación de secuencias de genoma completo de diversos orígenes

geográficos y elaboración de árboles filogenéticos
Para la elaboración de los árboles filogenéticos, se tomaron 50 WGS de aislamientos

de E. coli procedentes de diferentes países del mundo; con la finalidad de: identificar
las diferencias existentes entre los genomas de E. coli disponibles en las bases de datos
y evaluar la relación existente con aislamientos de origen ecuatoriano. Las secuencias
28
empleadas fueron secuencias referenciadas en artículos y revistas científicas en
diferentes años y secuencias aisladas de diferentes matrices (Humana, Animal,
Alimentaria y Ambiental).
De igual forma, para la selección de los aislamientos de orígenes diversos, se empleó

el concepto de referencia expuesto en el estudio de (Nagy et al., 2020), el cual detalla
tres apartados:
i. Los aislamientos de un solo país se preferirán si provienen de una misma

publicación.
ii. Cada país estará representado por un máximo de 10 secuencias de diverso origen
(alimentario, ambiental o clínico).
iii. Se seleccionarán las secuencias provenientes de artículos publicados con una
preferencia de los 5 últimos años.
Las secuencias seleccionadas fueron descargadas empleando la base de datos NCBI,

de forma que, la descarga de las WGS ensambladas provenientes de diversos orígenes
fue desarrollada a través de la base de datos GenBank de NCBI en formato FASTA y
guardado con el número de acceso ID Strain_localización_año (Ejem:
RICC00000000.1_C1-067_USA_2006). La información referente al país de origen,
matriz, tipo de muestra, fecha de aislamiento, código de acceso, y referencia son
expuestos en el Anexo 3.
WGS descargadas de diversos orígenes fueron caracterizadas siguiendo el mismo

protocolo de análisis de WGS mencionado con anterioridad; de esta forma, se
utilizaron las herramientas de CGE para identificar los ARGs, genes de virulencia,
plásmidos, perfiles de MLST, subtipificación de las cepas, MGE y regiones de profago
(PHASTER). De igual forma, se empleó la plataforma BV-BRC para conocer la
calidad del genoma ensamblado, el tamaño total del genoma, número de contigs, N50
y contenido G+C.
29
Los árboles filogenéticos se realizaron empleando las secuencias de diferentes
ubicaciones geográficas previamente caracterizadas y las secuencias descritas en la
presente investigación. Se empleó la tipificación de la secuencia multilocus del
genoma central (cgMLST), la cual es una extensión del esquema MLST convencional
de siete locus que amplía el rango de genes diana al nivel del genoma completo y, a
menudo, se usa como una solución para proporcionar una relación filogenética muy
detallada (Feng et al., 2021).
Para realizar el análisis de tipificación cgMLST se empleó la herramienta

bioinformática Galaxy Sciensano. Se ingresaron los archivos FASTA previamente
extraídos de NCBI a la plataforma Galaxy Sciensano. Posterior a la construcción de
una lista de conjunto de datos, se empleó la herramienta “Multi Locus Sequence
Typing (MLST-BLAST) para analizar las cgMLST individualmente. Seguidamente se
utilizó la herramienta “MLST-Phylogeny” de la cual se extrajo la matriz alélica para
la generación de los árboles de filogenia basado en la tipificación cgMLST. La
construcción del árbol de filogenia (Árbol de Expansión Mínima) se realizó a partir de
los datos obtenidos en Galaxy Sciensano a través de la herramienta bioinformática
Phyloviz.
La elaboración de los árboles de filogenia rectangular se realizó empleando iTOL. Las

anotaciones referentes a las secuencias de genoma completo, origen de aislamiento,
ARGs, virulencia y tipo de plásmidos fueron insertadas a través del editor de iTOL.
Los análisis complementarios fueron realizados empleando las plataformas Microreact
y Pathogenwatch. Los resultados son presentados en el capítulo “Resultados y
Discusión”.
30
CAPÍTULO 3
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Análisis y discusión de los resultados
3.1.1. Análisis de secuencias a través de plataformas bioinformáticas
La información recopilada mediante las diversas bases de datos y plataformas

bioinformáticas NCBI, Enterobase, EMBL-EBI, KBase, BV-BRC, CGE,
BacWGSTdb, iTol, Microreact, Pathogenwatch y Phyloviz, empleados en la
caracterización de aislados de E. coli, se presentan a continuación.
3.1.1.1. Análisis de secuencias de genoma completo
En la presente investigación se analizaron 5 secuencias de genoma completo de E. coli

aisladas en estudios anteriores de vegetales y comida callejera de Ecuador, de las
cuales dos aislamientos son portadores de genes productores de la toxina Shiga, y tres
aislamientos codifican ARGs betalactámicos. Adicionalmente, se analizaron 8
aislamientos de E. coli los cuales no portan los mecanismos de resistencia y de
virulencia caracterizados en los objetivos de la presente investigación, sin embargo, se
añadió su análisis preliminar en la sección de anexos. La calidad del genoma se
encuentra predicha en base a datos estadísticos en el cual se incluye el número total de
lecturas, contenido de guanina-citosina (%GC), número de contigs, contigs N50 y L50,
puntuación de integridad y contaminación CheckM del genoma (Parks et al., 2015;
Parrello et al., 2019). En el Anexo 1 y 2, se detalla la información general
31
correspondiente a las secuencias de genoma completo analizadas en el presente
estudio.
En base a la información general para las secuencias de genoma completo, se identificó

que el número total de lecturas varió de 4.0 Mb a 5.3 Mb, expresando rendimientos
idóneos con referencia a las cantidades secuenciadas. El genoma de E. coli suele
bordear los 5.0 Mb, no obstante, los genomas de E. coli dependiendo la cepa aislada
pueden variar aproximadamente 1 Mb, oscilando entre 4.5 y 5.5 Mb (Hozzari et al.,
2020).
Por otra parte, el porcentaje total de contenido de GC es empleado como parámetro de

control de calidad. El contenido genómico de GC de las bacterias varia en relación a
las diferencias en el proceso mutacional o procesos neutrales y selectivos, estas
variaciones van desde menos del 25% hasta más del 75% (Hershberg, 2016;
Raghavan et al., 2012). Bajo literatura, el contenido de GC para la secuenciación del
genoma completo es alrededor del 49-51% (Guo et al., 2014); en este contexto el
porcentaje promedio para las secuencias analizadas fue de 50.7% G+C.
En referencia al número de contigs, estos oscilaron entre los 54 hasta 171; por lo
general el número total de contigs ensamblados <100 contigs representa un valor
realista en referencia a la calidad del genoma. La longitud media de todas las
longitudes de contigs N50 se encontraron en el rango de 74,583 pb a 276,038 pb; en
este sentido, medidas de N50 > 15,000 pb son indicadores de buena calidad, no obstante,
se prefiere un tamaño mínimo de 30,000 pb (Ellington et al., 2017).
Otras de las métricas que terminaron la integridad del genoma fueron las métricas de
integridad y contaminación del genoma, las cuales evidenciaron el 100% de integridad
CheckM y el porcentaje de contaminación CheckM el cual osciló entre 0.1% al 1.5%,
32
indicando que la calidad del genoma para las secuencias evaluadas es considerada
buena.
3.1.1.2. Caracterización de secuencias de genoma completo (WGS) de E. coli

portadores de la toxina Shiga.
El enfoque principal de esta sección se delimitó en el análisis de dos secuencias de

genoma completo de aislamientos de E. coli de origen vegetal portadores de la toxina
Shiga (aislamientos C5b1 y T5bX). Como parte de la caracterización in silico, se
determinó los tipos de plásmidos que poseen, ARGs, análisis de la presencia de
profagos, serovar, genes de virulencia complementarios, y tipo de secuencia MLST.
En ambos aislamientos, se observó la presencia de genes productores de enterotoxinas

como stx y astA. Los dos aislamientos fueron stx2 positivos, es decir portaban genes
de la toxina Shiga del subtipo A y B (stx2A y stx2B), la información general de la
caracterización in silico se describe en la Tabla 4. A la par se identificó el tipo de
secuencia MLST, tipo de plásmido y regiones de profagos intactas para estas dos cepas
de E. coli C5b1 y T5bX, esta información se detalla en la Tabla 5. El tipo de secuencia
(ST) identificada para estas dos cepas fue ST677, el tipo de plásmido detectado fue
IncFII y se encontraron 5 y 6 regiones de profagos intactas.
Las evaluaciones fenotípicas realizadas en etapas previas por Barragán & Calero,
(2022) para las cepas de E. coli C5b1 y T5bX, indicaron la presencia de patotipos
diarreogénicos, puesto que, posterior a la etapa de PCR se identificó la amplificación
del gen de virulencia stx2. Estos resultados fueron corroborados en base al análisis de
WGS realizado en el presente estudio.
33
Tabla 4
Identificación de las secuenciaciones del genoma completo de 2 cepas de E. coli
aisladas de vegetales y comida callejera de Ecuador portadoras de genes toxina
Shiga y ARGs
Aislamiento C5b1 T5bX

Año de aislamiento 2021 2021
Col Blanca (Brassica Tomate (Solanum
Tipo de muestra
oleracea) lycopersicum)
Ubicación geográfica Chimborazo Chimborazo
Número de lecturas
5,184,284 5,181,902
totales
Porcentaje de G+C (%) 50.71 50.71
N50(bp) 217,893 229,587
L50(bp) 8 7
No. de contigs 87 85
No. de CDSs 5,242 5,229
No. de tRNA 82 82
No. de rRNA 10 8
Completitud (CheckM) 100 100
Contaminación
0.1 0.1
(CheckM)
No. Acceso a BioSample SAMN28681467 SAMN28681464
No. Acceso a SRA SRS13189686 SRS13189707
No. Acceso a Assembly GCA_023561385.1 GCA_023561575.1
34
Tabla 5
Caracterización basada en la WGS de 2 cepas de E. coli aisladas de vegetales y comida
callejera de Ecuador portadoras de genes toxina Shiga y ARGs
Cepa MLST Tipo de Profagos Genes de Genes de

Plásmido (Regiones Virulencia Resistencia
Intactas)
C5b1 ST677 IncFII(pHN7A 5 astA; gad; hlyE; ampC1
8) hra; iss; lpfA; ampH
mcmA; mchB;
mchF; ompT;
stx2A; stx2B;
terC; traT
T5bX ST677 IncFII(pHN7A 6 astA; gad; hlyE; ampC1

8) hra; iss; lpfA; ampH
mcmA; mchB;
mchF; ompT;
stx2A; stx2B;
terC; traT
Los factores de virulencia como astA encargado de codificar la enterotoxina estable

térmica, gad (glutamato descarboxilasa), hra, gen que codifica la aglutinina resistente
al calor, lpfA (fimbriae polar larga) factor adhesivo de STEC , y ompT, factor asociado
a la patogenicidad extraintestinal pues codifica la proteasa de la membrana externa de
E. coli, se encontraron presentes en los aislamientos portadores de genes toxina Shiga,
como se observa en la Figura 4 y 5 (Bidet et al., 2022; da Silva et al., 2022; Hammad
et al., (2020)., Zhang et al., 2021).
35
Figura 4
Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli C5b1
aislada de col blanca (B. oleracea)
Nota: Los genes de resistencia, virulencia y presencia de regiones intactas de profagos están codificados por
colores de la siguiente forma: verde (regiones intactas de profagos), morado (ARGs), y anaranjado (genes de
virulencia)
36
Figura 5
Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli T5bX
aislada de tomate (S. lycopersicum)
virulencia)
Los aislados de E. coli positivos para stx2 curiosamente fueron de origen vegetal. En
este contexto, a lo largo de los años se ha identificado que el principal reservorio de
STEC son animales (European Centre for Disease Prevention and Control, 2022).
No obstante, estudios epidemiológicos actuales atribuyen el incremento de
hospitalizaciones al consumo de verduras frescas contaminadas con STEC, infiriendo
un mayor alcance en la diseminación de STEC al medio ambiente (Leonard et al.,
2016). En el caso de los aislamientos C5b1 y T5bX, ambos pertenecen al serovar
O174:H21, el cual no ha sido previamente reportado en Ecuador, pero ha sido
detectado en aislamientos STEC origen humano, animal y alimentario en Chile y
Argentina, en donde se observa una diseminación emergente de este serovar en los
últimos años (Galarce et al., 2021; Torres et al., 2018). El uso de estiércol animal sin
tratar en los campos de cultivo, así como el uso de agua de riego contaminada, favorece
37
la diseminación de microorganismos potencialmente patógenos hacia el suelo y los
alimentos (Pushpakanth et al., 2019; Ramos et al., 2021). La detección de STEC en
alimentos vegetales cuyo consumo no implica un tratamiento térmico representa una
alerta adicional, considerando que puede facilitarse su adquisición por los
consumidores y provocar brotes de infecciones transmitidas por los alimentos
(Waltenburg et al., 2022).
Las toxinas Shiga (Stx) en las STEC generalmente se codifican en el genoma de los
bacteriófagos lambdoides, que pasan la mayor parte del tiempo de su ciclo de vida
integrados como profagos en sitios específicos del cromosoma bacteriano (Rodríguez-
Rubio et al., 2021). En la Figura 4 y 5, se puede identificar que el gen stx2 subtipo A
y B se encontraban ubicados en regiones identificadas como intactas de profagos de
los aislamientos C5b1 y T5bX (Regiones de Profagos 8 y 7, respectivamente). Según
Koutsoumanis et al., (2020) los bacteriófagos convertidores de toxinas Shiga tienen
la capacidad de movilizar genes stx y lisogenizar cepas bacterianas no patógenas
convirtiéndolas en STEC. La inducción de los bacteriófagos Stx lisogénicos puede
darse a partir de cultivos de la célula hospedadora mediante diferentes agentes
inductores como factores abióticos (uso de antibióticos como mitomicina C, factores
de huésped, luz ultravioleta) (Grande et al., 2014; Rodríguez-Rubio & Muniesa,
2021). Por lo tanto, una continuación al presente estudio sería la inducción del ciclo
lítico de los profagos presentes en C5b1 y T5bX, y su posterior caracterización con la
finalidad de conocer si siguen una vía lisogénica o lítica, y si son capaces de transferir
los genes Stx a una célula receptora por medio de transconjugación.
IncFII (pHN7A8) es un tipo de plásmido identificado en la presente investigación en

las cepas positivas para stx2, evidenciándose este análisis in silico en la Tabla 5.
Aunque en el presente estudio no se ha identificado la presencia de ARGs y factores
de virulencia en plásmidos en los STEC evaluados, es importante recalcar que, los
plásmidos de tipo IncFII (pHN7A8) regularmente están involucrados en la difusión de
los genes blaCTX-M que codifican las cefotaximasas, las cuales son enzimas encargadas
de conferir la resistencia a cefalosporinas (Eskandari-Nasab et al., 2018; He et al.,
38
2013; Zhou et al., 2021). Lastimosamente, la secuenciación de fragmentos cortos de
Illumina no permite ensamblar diferencialmente a plásmidos y al cromosoma, motivo
por el cual una investigación complementaria a la presente podría enfocarse en WGS
por medio de fragmentos largos a través de la tecnología Nanopore o PacBio, y
posteriormente ejecutar un ensamblaje híbrido (lecturas cortas y largas) para obtener
una secuencia consenso de alta calidad que diferencie a plásmidos y cromosomas (De
Maio et al., 2019).
La tipificación MLST reveló que los dos aislamientos portadores de genes stx2
compartían un mismo ST (ST677). Estudios de vigilancia han identificado con
frecuencia que las cepas de E. coli ST677 como cepas STEC de serovar O174:H21 que
circulan en matrices alimentarias, animales, ambientales y humanas distribuidas con
frecuencia en América, Europa, Asia y África (EnteroBase, 2023; Galarce et al.,
2021). En el caso de aislamientos de origen alimentario, la diseminación de E. coli
ST677 se evidencia en productos alimenticios (sin especificar el tipo de alimento, ni
el origen) por parte de la vigilancia epidemiológica de la Agencia Canadiense de
Inspección de Alimentos (EnteroBase, 2023). Adicionalmente, estudios han revelado
que las cepas STEC de ST677 con frecuencia portan múltiples ARGs tal es el caso del
gen ampC (Mahindroo & Taneja, 2021). En este contexto las cepas de E. coli C5b1
y T5bX analizadas, presentaron también genes de resistencia a β-lactámicos, tal es el
caso de los genes ampC1 y ampH. Los genes ampC1 y ampH son encargados de
codificar β-lactamasas de clase C (cefalosporinasas AmpC) (Huang et al., 2021).
Estos reportes sugieren que E. coli ST677 se encuentra ampliamente diseminada a
nivel de matriz de aislamiento y distribución geográfica, motivo por el cual se justifica
la necesidad de realizar monitoreo y vigilancia genómica, lo cual permitiría prevenir
brotes de ETAs ligados a STEC resistentes a antimicrobianos.
En la caracterización in silico efectuada mediante ResFinder, se detectaron

“mutaciones no definidas” en los genes ampC, parC y pmrB de los aislamientos E. coli
C5b1 y T5bX. En estos dos aislamientos se identificaron dos mutaciones del gen
ampC, una mutación en el gen parC y dos mutaciones en el gen pmrB. En este
39
contexto, las mutaciones no definidas son mecanismos de defensa que algunas
bacterias han desarrollado ante la presión selectiva generada por los antimicrobianos
(Hager et al., 2017). Los mecanismos de resistencia mutacional incluyen,
modificaciones en los centros de unión bacteriano a antibióticos, sobreexpresión de
proteínas o enzimas que inhiben la actividad antimicrobiana, mutaciones que dan como
resultado la sobreexpresión de numerosas bombas de eflujo intrínsecas (Cho & Misra,
2021; Coolen et al., 2021; Khalifa et al., 2021). En este sentido, se ha mencionado
que las mutaciones significativas de aminoácidos en el gen parC (codifica la
topoisomerasa IV) desencadena mecanismos de resistencia a las fluoroquinolonas
(Johnning et al., 2015). Un estudio de 58 aislamientos clínicos de E. coli resistentes
a fluoroquinolonas realizado en hospitales de EE. UU, encontraron que el 85% de los
aislamientos presentaban sustituciones de aminoácidos en parC (Morgan-Linnell et
al., 2009). Por otra parte, se ha descrito que las mutaciones cromosómicas puntuales
en el gen pmrB (codifica la proteína cinasa sensora PmrB) desencadenan mecanismos
de resistencia a colistina y polimixina B en E. coli (Cannatelli et al., 2017; Phan et
al., 2017).
Con respecto a la resistencia fenotípica, en una caracterización preliminar se identificó

que los aislamientos E. coli C5b1 y T5bX poseen resistencia a gentamicina (CN),
ampicilina (AM), cefotaxima (CTX), cefalotina (KF) (Barragán-Fonseca et al.,
2022). La identificación fenotípica de la resistencia a aminoglucósidos, cefalosporinas
y penicilinas viene determinada por la presencia del gen cromosómico ampC
(Kohlmann & Gatermann, 2020; Singh et al., 2020). Según Tamma et al., (2019),
las enzimas AmpC son inducibles y pueden sobreexpresarse en altos niveles por
mutaciones; esta sobreexpresión confiere a la bacteria resistencia a cefalosporinas de
amplio espectro tales como cefotaxima, ceftazidima y ceftriaxona. Los análisis in
silico realizados a partir de la WGS representan un enfoque potencial para
proporcionar datos completos referentes a genes de resistencia o mutaciones
relacionadas, que podrían ser usados para comparar las evaluaciones fenotípicas
tradicionales con resistencias antimicrobianas inferidas genotípicamente.
40
3.1.1.3. Caracterización genotípica de secuencias de genoma completo de E.
coli portadoras de betalactamasas de espectro extendido.
Posterior al análisis de secuencias de genoma completo para la identificación de ARGs

en las secuencias evaluadas, se detectó que 3 secuencias portaban genes de resistencia
a b-lactámicos de espectro extendido (BLEE). Las cepas de E. coli portadores de
BLEEs fueron aisladas de comida callejera (ensalada y jugo de caña) y vegetales
(lechuga), como se presenta en la Tabla 6.
El análisis de WGS confirmó la presencia de los genes blaTEM-1B y blaCMY-132 en tres

cepas de E. coli (N1_1, Jc5_2C2 y L6by). Los genes que portan BLEEs comúnmente
detectados fue blaTEM-1B, dado que fue identificado en los tres aislamientos; por otra
parte, el gen blaCMY-132 fue detectado en el aislamiento de E. coli Jc5_2C2.
Adicionalmente, se detectaron otros 16 ARGs adquiridos relacionados a la resistencia
a diversas clases de antibióticos. Los 3 aislamientos presentaban al menos un gen de
resistencia adicional, y la mayoría presentó por lo mínimo 8 ARGs. En adición, todas
las cepas portaban las variantes de los genes tet (resistencia a tetraciclina y doxiciclina)
y sul (resistencia al sulfametoxazol).
Tabla 6
Identificación de las secuenciaciones del genoma completo de 3 cepas de E. coli
aisladas de vegetales y comida callejera de Ecuador portadoras de ARGs y genes de
virulencia
Cepa N1_1 Jc5_2C2 L6bY

Año de aislamiento 2020 2021 2021
Tipo de muestra Ensalada Jugo de caña Lechuga (Lactuca
sativa)
Ubicación Tungurahua Tungurahua Chimborazo
geográfica
41
Cepa N1_1 Jc5_2C2 L6bY
Número de lecturas 5,058,102 5,125,220 4,007,122
totales
Porcentaje de G+C 50.54 50.53 50.68
(%)
N50(bp) 119,031 276,038 210,300
L50(bp) 15 7 6
No. de contigs 115 61 56
No. de CDSs 5,024 5,020 4,607
No. de tRNA 80 82 78
No. de rRNA 7 5 6
Completitud 100 100 100
(CheckM)
Contaminación 1.5 0.1 0.1
(CheckM)
No. Acceso a SAMN28681473 SAMN28681469 SAMN28681465
BioSample
No. Acceso a SRA SRS13189681 SRS13189654 SRS13189668
No. Acceso a GCA_023561435.1 GCA_023561735.1 GCA_023561375.1
Assembly
Algunos de los ARGs que codifican enzimas modificadoras de aminoglucósidos

localizados en los aislamientos fueron aac (6')-Ib-cr , ant(3'')-IIa; aph(6)-Id; aph (3'')-
Ib, ant (3'')-Ib y aadA2 (Eftekhar & Seyedpour, 2015; Zhang et al., 2017). Dos de
los aislamientos portaban el gen dfrA14 (codifica una dihidrofolato reductasa resistente
a trimetoprima). Uno de los aislamientos portaba los genes mphA (confiere resistencia
a macrólidos) y qnrB19 (otorga resistencia a las quinolonas) (Alcock et al., 2023;
Moreno-Switt et al., 2019).
Adicional a la identificación de ARGs, se realizó el análisis de MLST, determinando

que las cepas portadoras de BLEEs (N1_1, Jc5_2C2 y L6by) pertenecían a una amplia
42
selección de tipo de secuencias, siendo estos ST101, ST12373 y ST1286,
respectivamente. Por otra parte, el buscador de plásmidos (PlasmidFinder) predijo
varios replicones de plásmidos en todas las cepas portadoras de BLEEs. Los tipos de
plásmidos localizados fueron IncI1-I (Alpha), IncFIC (FII); IncFIB (AP001918);
IncFIA, IncFII (pHN7A8) y Col (pHAD28). Adicional, se identificaron las regiones
de profagos intactas, determinando que las cepas de E. coli N1_1, Jc5_2C2 y L6by
presentaban una región de profago intacta en la cual no se localizaron ARGs y
virulencia; la información detallada se describe en la Tabla 7.
Tabla 7
Caracterización basada en la secuenciación del genoma completo de 3 cepas de E.
coli aisladas de vegetales y comida callejera de Ecuador portadoras de ARGs y
genes de virulencia
Cepa MLST Tipo de Profagos Genes de Genes de

Plásmido (Regiones Resistencia Virulencia
Intactas)
N1_1 ST101 IncI1-I(Alpha); 1 aac (6')-Ib-cr; etsC; fyuA; hlyE;
IncFIC(FII); ant(3'')-IIa; aph(6)- hlyF; iucC; iroN;
IncFIB(AP0019 Id; aph (3'')-Ib; irp2; iutA; lpfA;
18); IncFIA ampH; ampC1; mchF; terC; traT
blaTEM-1B; dfrA14;
sul2; tetA
Jc5_2c2 ST12373 IncFIA; 1 aph (6)-Id; aph astA; chuA; eilA;
IncFIB(AP0019 ((3'')-Ib; aadA2; gad; hlyE; kpsE;
18; IncFIC(FII); ampH; blaCMY-132; sitA; terC; traT
IncFII(pHN7A8) blaTEM-1B; sul2; tetB
L6by ST1286 Col(pHAD28) 1 aadA2; ant (3'')-Ib; terC

ampH; blaTEM-1B;
dfrA12; mph(A);
qnrB19; sul1; tetA
En las Figuras 6, 7 y 8 se presentan los mapas circulares de las secuencias de genoma

completo de las cepas de E. coli que portaban BLEEs. Se ha identificado que los
aislamientos de E. coli obtenidos a partir de comida callejera (ensalada y jugo de caña)
adicional a portar varios ARGs, portaban una gran variedad de genes de virulencia
43
como astA, chuA, eilA, etsC, fyuA, gad, hlyE, hlyF, iucC, iroN, irp2, iutA, kpsE, lpfA,
mchF, sitA, terC, traT. Por otra parte, el aislamiento de E. coli obtenido a partir de
lechuga únicamente portaba el gen de virulencia terC.
Figura 6
Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli N1-1 aislada
de comida callejera (Ensalada).
virulencia)
44
Figura 7
Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli J5_2C2
aislada de juego de caña.
virulencia)
Los alimentos callejeros listos para el consumo humano son potenciales vehículos de
transmisión de microorganismos patógenos, debido a que las limitadas prácticas de
seguridad alimentaria ejecutadas por los vendedores de alimentos callejeros
incrementan el número de enfermedades bacterianas transmitidas por los alimentos
(Tenea et al., 2023). Por su parte, la contaminación de los alimentos con
microorganismos resistentes a antimicrobianos representa un problema de salud en
45
aumento en todo el mundo. Bajo este contexto, E. coli resistente a antimicrobianos se
ha convertido en un patógeno peligroso implicado en epidemias de gastroenteritis en
América, Europa, Asia y África localizado con frecuencia en alimentos poco cocidos,
carne contaminada, jugos de frutas y leche sin pasteurizar, y verduras frescas (Giri et
al., 2021; Pilamala et al., 2023). En consecuencia, la OMS recomienda la vigilancia
de las bacterias entéricas productoras de BLEEs (WHO, 2014). Por consiguiente, el
control y vigilancia de la seguridad de los alimentos vendidos en la calle es un desafío
para muchos países. En Ecuador, a pesar de contar con un Reglamento para el Control
Sanitario de Alimentos que se expenden en vías públicas (Acuerdo No. 14381), se ha
identificado que la comida calleja lista para comer no está regularizada y es una tarea
compleja para los vendedores ambulantes el control de los puntos de riesgo de
contaminación (Reglamento de Control Sanitario de Alimentos, 1992; Zurita et
al., 2020). De esta forma, la detección de E. coli portadora de BLEEs es indispensable
para comprender la diversidad y las rutas de diseminación de la resistencia a los
antimicrobianos en matrices alimentarias, en especial alimentos de alto consumo local.
Los aislamientos de comida callejera empleados en el presente análisis de WGS se

derivaron de muestras que contenían integrados una serie de ingredientes, tal es el caso
del aislado de ensalada, este contenía ingredientes como mote, choclo, habas, ensalada
fresca y cerdo; por lo cual no se puede vincular la contaminación de dichos alimentos
a un solo ingrediente principal. Por su parte, se ha descrito que los productos
alimenticios derivados de frutas frescas son una fuente de preocupación constante,
puesto que estos productos frescos son con frecuencia más sensibles a la
contaminación, dados sus mecanismos de cultivo y recolección inadecuados,
suministros de agua de regadío contaminada, limitada limpieza antes de la
distribución, y almacenamiento inapropiado de frutas (Tenea et al., 2023). Según
Azanaw et al., (2022) las principales fuentes que aportan a la contaminación
microbiana en alimentos son temperaturas de mantenimiento inadecuadas,
manipulación excesiva de alimentos por parte de los vendedores, utensilios y equipos
sucios para cocinar y servir, materias primas contaminadas, almacenamiento de
materia prima inadecuado y falta de higiene personal de los vendedores.
46
Se ha identificado la presencia de los genes blaTEM-1B y blaCMY-132 en cepas de E. coli
aisladas de comida callejera, como se detalla en la Gráfica 6 y 7. El gen blaTEM-1B es
una de las variantes del gen blaTEM que se localiza con mayor frecuencia en bacterias
Gram negativas, por lo cual se encuentra mayormente distribuida a nivel mundial
(Delmani et al., 2017). Las enzimas que codifican estos genes son responsables de
conferir la resistencia a penicilina, ampicilina y cefalosporinas. En base a estudios
realizados en Ecuador por Calva et al., (2016) se ha identificado que el gen blaTEM
presente en E. coli es predominante en el país localizándose en aislamientos de E. coli
de la flora comensal de humanos y animales; lo que sugiere la posible incidencia de la
mala higiene personal de los manipuladores de los alimentos expendidos en las calles.
Por otra parte, aunque no existió la presencia del gen blaCTX-M en las secuencias
analizadas, se ha detectado la alta prevalencia del gen blaCTX-M en muestras aisladas de
alimentos principalmente de cevichochos y salsa de ají en Ecuador, elucidando el papel
de fuentes no humanas como reservorios para la resistencia a BLEEs (Zurita et al.,
2020). Por otra parte, la variante blaCMY-132 del gen blaCMY que codifica la resistencia a
las penicilinas, cefalosporinas y cefamicina (Seiffert et al., 2017); se encontró
únicamente en la cepa de E. coli J5_2c2 aislada de jugo de caña. Investigaciones
realizadas en Ecuador han identificado la incidencia del gen blaCMY en aislamientos de
origen humano y animal, por lo que se sugiere que la diseminación de estos genes a
matrices alimentarias puede darse debido a la materia prima contaminada, mala
higiene personal y pobres mecanismos de agua segura en el empleo de la preparación
de los alimentos (Álvarez & Vera, 2020; Garcés & Calero, 2020; Vinueza &
Dávila, 2018).
La diseminación de estos genes a diferentes especies microbianas puede atribuirse al

transporte de los genes blaCMY por plásmidos. Estudios asociados a las diferentes
variantes del gen blaCMY han indicado que existe una alta probabilidad que la
propagación de estas variantes sea mediada por la HGT de plásmidos de tipo IncI1
(Fang et al., 2018; Sidjabat et al., 2014). De igual forma, se ha descrito que el tipo
de plásmido IncFIA (localizado en los aislamientos N1_1 y J5_2c2) se encarga de
movilizar y diseminar los genes blaTEM-1B (Rodríguez, 2020). Por otra parte, el análisis
de WGS identificó la presencia de otros ARGs tales como los genes tet y sul. Un
47
estudio realizado en Reino Unido ha identificado que los genes portadores de BLEEs
se asocian con variantes genéticas tet y sul para una misma cepa de E. coli,
describiendo que la co-resistencia antimicrobiana es probablemente impulsada por la
ubicación de las variantes de genes sul y tet en plásmidos de tipo IncI1 (Duggett et
al., 2020). En el presente estudio, a pesar de que se identificó diferentes tipos de
plásmidos (IncFI1-1, IncFIA, IncFIB, IncFIC), se detectó que ningún gen de
resistencia se ubicó en los plásmidos localizados. En este contexto, un punto de
inflexión de WGS de lectura corta es la difícil reconstrucción de los plásmidos, por lo
cual el empleo de ensamblajes híbridos (lecturas cortas y largas) es un mecanismo
efectivo para reconstruir genomas contiguos precisos que podrían mejorar la
reconstrucción y caracterización de plásmidos que acarrean ARGs (Berbers et al.,
2020).
La tipificación MLST reveló que las cepas de E. coli N1_1 y Jc5_2C2 aisladas de
comida callejera presentaban los tipos de secuencias ST101 y ST12373,
respectivamente. E. coli ST101 ha sido ampliamente detectada en aislamientos de
diverso origen geográfico y diversas fuentes de aislamiento; no obstante, los
aislamientos derivados de fuentes alimentarias han sido identificadas con frecuencia
en países como Alemania, Bangladesh, Camboya, China, Canadá, EE. UU, México,
Países Bajos, Polonia, Reino Unido, Tailandia y Tanzania (EnteroBase, 2023). A
pesar de la baja incidencia de E. coli ST101 aislada de comida en países de América
del Sur, se ha detectado este tipo de secuencia en aislamientos de origen animal,
ambiental y humano en Brasil, Colombia, Chile y Perú, siendo la cepa de E. coli N1_1
la primera evidencia de ST101 en matrices alimentarias, lo que sugiere que este clon
juega un papel relevante en la diseminación en matrices humana, animal, medio
ambiente y en la actualidad en matrices alimentarias (Galarce et al., 2021). Por otra
parte, E. coli ST12373 solo ha sido descrito en aislamientos de matrices humanas en
Australia, siendo un linaje inusualmente detectado (EnteroBase, 2023).
Para las cepas de E. coli aisladas de comida callejera se identificó la patogenicidad

detectándose genes de virulencia (etsC, gad, hlyE hlyF, iroN, iss, ompT y traT)
48
relacionados con patotipos de origen extraintestinal de E. coli (Founou et al., 2022).
Adicionalmente, se identificaron genes de enterotoxinas tales como astA. La alta
detección de genes de virulencia localizados sugiere que las cepas aisladas de comida
callejera tenían el potencial de ser patógenas para los seres humanos y los animales.
De esta forma se ha identificado que las cepas portadoras de BLEEs, no solo albergan
ARGs sino también factores de virulencia, lo cuales pueden ser trasmitidos a través de
HGT a otras bacterias diseminándose con amplio espectro a diversas matrices; motivo
por el cual, se enfatiza en la necesidad de garantizar las medidas adecuadas de
seguridad alimentaria y medidas acertadas de prevención y control de infecciones en
los hospitales.
Figura 8
Mapa circular de la secuencia genómica completa de la cepa de E. coli L6by aislada
de lechuga (L. sativa).
virulencia)
49
En la Figura 8, se visualiza un mapa circular de la secuencia de genoma completo de
la cepa E. coli L6by aislada de lechuga (L. sativa). Se ha mencionado que los productos
de origen agrícola suelen estar contaminados por E. coli RAM proveniente de
fertilizantes elaborados a base de estiércol, agua de riego, suelo, animales salvajes e
insectos (Reid et al., 2020). En dicho aislamiento se han identificado gran variedad de
ARGs destacando los genes que confieren resistencia b-lactámicos (blaTEM-1, ampH),
tetraciclinas (tetA), quinolonas (qnrB19), macrólidos (mphA), aminoglucósidos
(aadA2, ant (3'')-Ib) y antagonista de la vía del folato (sul1, dfrA12). La presencia de
E. coli portadora de una amplia gama de ARGs representa un motivo de preocupación,
por lo tanto, es indispensable aportar hacia el desarrollo de estrategias que garanticen
la seguridad alimentaria de vegetales sin previo tratamiento térmico distribuidos
ampliamente en mercados agrícolas, de tal forma que se prevenga y reduzca la
propagación de infecciones resistentes a antibióticos entre la población.
Por otra parte, el tipo de secuencia identificado para la cepa E. coli L6by fue ST1286,
este tipo de secuencia pertenece al complejo clonal ST10 Cplx distribuido
ampliamente en América, África, Asia, Europa y Oceanía. En adición, se ha
identificado este tipo de secuencia en aislamientos de matrices ambientales, humanas
y animales en Ecuador, lo que insinúa que este tipo de secuencia se encuentra
ampliamente diseminado en diferentes matrices (EnteroBase, 2023). Por otra parte, el
plásmido identificado en la secuencia de la cepa E. coli L6by fue Col(pHAD28). En
el presente estudio se identificó que el gen qnrB19 y el plásmido Col(pHAD28) se
encontraban ubicados en un mismo contig (ABGJUB010000055.1). Según Jibril et
al., (2021), los plásmidos Col(pHAD28) habitualmente albergan genes qnrB;
adicionalmente, el plásmido Col(pHAD28) caracterizado en diversos estudios ha sido
identificado en cepas de Salmonella (Jibril et al., 2021); infiriendo la alta incidencia
de diseminación de ARGs a diversos géneros y especies microbianas mediante
mecanismos de HGT.
50
3.1.2. Evaluación de la distancia filogenética entre aislamientos de E. coli de
origen ecuatoriano con aislamientos de diverso origen geográfico
3.1.2.1. Estructura de población basada en la estrategia cgMLST
Se realizó una comparativa de los aislamientos de E. coli caracterizados en el presente

estudio con aislamientos de diverso origen geográfico a fin de identificar las relaciones
y diferencias existentes entre los genomas. Los análisis se realizaron empleando 50
secuencias de genoma completo de E. coli aisladas de diversos orígenes y países.
Dentro de las 50 secuencias de genoma completo se incluían las secuencias de genoma
completo de origen local caracterizadas en el presente estudio; se desarrolló una
comparación filogenómica cgMLST basado en las secuencias de genoma completo
(2485 alelos). Posteriormente, se obtuvo un árbol de expansión mínimo construido
mediante PHYLOViZ 2.0.
En la Figura 9, se identifica un esquema general de la filogenia de las 50 cepas de E.

coli pertenecientes a 20 países tales como Alemania, Argentina, Australia, Chile,
Ecuador, Egipto, España, Estados Unidos, Francia, India, Indonesia, Italia, Japón,
Malasia, México, Países Bajos, Sudáfrica, Suecia, Suiza y Tailandia. La fuente de
donde fueron obtenidas las cepas derivaba de muestras de origen animal, ambiental,
alimentario y humano.
51
Figura 9
Árbol de expansión mínima (Minimum-spanning tree) para 50 aislados basados en el cgMLST de E. coli
Nota: Las imágenes representan el origen de las muestras. Las etiquetas corresponden al:1) perfil alélico (ST, del inglés sequence type) y 2) codificación de identificación
(CI). Los aislamientos sombreados corresponden a STs asociados o relacionados (ST complex) y los aislamientos encerrados en círculos de color amarillo representan los
aislamientos analizados en el presente estudio
52
El análisis cgMLST mostró que los genomas se agrupaban según el serotipo y tipo de
secuencia, indicando que los aislados de E. coli pertenecían a diferentes linajes; de
forma que, de los 50 genomas, 24 se agruparon en 4 grupos (Complex “Cplx”),
mientras que los genomas restantes no se agruparon. El primer grupo de aislados
identificado perteneció al ST-10 Cplx (ST10, ST34, ST48, ST617, ST993, ST1286,
ST4204), el segundo grupo abarcó el ST-11 Cplx (ST11), el tercer grupo comprendió
el ST-23 Cplx (ST360, ST410) y el cuarto grupo incluyó el ST-155 Cplx (ST58).
En esta dirección, en el árbol de expansión mínima se exhibe que siete de las trece
cepas de E. coli de origen local analizadas en el presente estudio (cepas Ch5_1a1,
L6bY, M1_1, C2_1c1, E2_2b, CM3aX, R6c2), pertenecían a ST-10 Cplx. De igual
forma, se logra evidenciar la alta incidencia de este complejo clonal en diversas
matrices, detallándose aislamientos de origen alimentario, ambiental, animal y
humano en países como Alemania, Australia, Chile, Egipto, Italia, India y México.
Estudios han reportado que, E. coli ST-10 Cplx es uno de los complejos clonales
mayoritariamente distribuidos, puesto que E. coli del complejo clonal 10 es altamente
eficaz colonizando humanos, animales, productos frescos y nichos ambientales (Liu
et al., 2016; Manges et al., 2015). Adicionalmente se ha identificado que E. coli ST-
10 Cplx con frecuencia son resistentes a antimicrobianos y potenciales patógenos
extraintestinales para humanos y animales (Reid et al., 2019). En este punto se puede
inferir que es probable que los aislamientos designados a los mismos ST o complejos
clonales ST-Complex tengan un antepasado reciente común.
En la misma línea se logra identificar que el aislamiento de CI#24 de origen

ecuatoriano se encontraba en un punto central, detectándose que existían entre 326
hasta 667 diferencias alélicas entre los aislados CI #25, #37, #38, #39, #40 y #42 con
referencia al aislamiento #24. Estos resultados evidencian que los aislamientos de
ST10 se encuentran relativamente más cercanos a diferencia de los ST variables que
conforman el complejo clonal ST-10Cplx, lo que sugiere que existe una amplia
diversidad de STs dentro de dicho complejo clonal. Por otra parte, también se ha
descrito que, la cercanía o lejanía de los linajes depende de la serotipificación basada
53
en la presencia de antígenos O (diferenciación basada en la composición química) y H
(diferenciación basada en el contenido proteico de los flagelos) (CDC, 2022). Es de
esta forma que se detectó que las cepas NAEC1115 (CI#25) y 10270 (CI#26) portaban
el serovar O101:H9 y las cepas de origen ecuatoriano C2_1c1 (CI#39) y E2_2b
(CI#40) portaban el serovar O51:H4. En referencia a estudios realizados en China, se
describe que las cepas que pertenecen al serogrupo 0:51 de E. coli son clasificadas
como E. coli enteropatógena atípica (aEPEC), pues estos serotipos han sido
identificados y aislados con frecuencia en pacientes con gastroenteritis; sin embargo,
con poca incidencia han sido también aislados de matrices animales y carne cruda (Xu
et al., 2017). Para las cepas E. coli C2_1c1 (#39) y E2_2b (#40) no se encontraron
diferencias alélicas puesto que estos aislamientos presentaban variaciones nulas en las
secuencias elucidando la presencia de aislamientos homólogos que indican que
provienen de una ascendencia común.
Por otro lado, empleando SerotypeFinder 2.0 se identificó que las cepas SAKAI (Japón
CI#47), MC2 (Francia CI#48), STEC 343 (Países Bajos CI#49), C1-057 (Estados
Unidos CI#50) pertenecientes a E coli ST-11 Cplx presentaron un mismo serotipo,
O157:H7. Se ha descrito que el serotipo E. coli O157:H7 es uno de los serotipos
ampliamente distribuidos en patógenos que provocan ETAs, ha sido predominante en
países como Argentina, EE. UU, Gran Bretaña y Japón; sin embargo, dicho tipo de
secuencia y serotipo no fue localizado en aislamientos de origen ecuatoriano.
Curiosamente, las cepas de E. coli O157:H7 fueron aisladas de heces de animales
(ganado) y humanos. Según Mead & Griffin, (1998), E. coli O157:H7 regularmente
se encuentra en las heces de ganado sano y se disemina mediante alimentos y agua
contaminados. De igual forma, las diferencias alélicas localizadas en estos
aislamientos variaron de 174 hasta 256, especificando que las cepas STEC 343 (Países
Bajos CI#49) y C1-057 (Estados Unidos CI#50) se localizaban mucho más cerca dado
el reducido número de diferencias alélicas, detectándose 174 diferencias alélicas. La
amplia distribución geográfica de este tipo de secuencia ST11 es un indicativo de la
preservación de este linaje y diseminación con el paso de los años, puesto que la cepa
E. coli SAKAI fue identificada en 1996 en Japón (Hayashi et al., 2001). Por su parte,
este E. coli ST11 ha sido ampliamente detectado en América del Norte en EE. UU y
54
Canadá, y con muy baja prevalencia en países de América del Sur identificándose en
Argentina y Paraguay.
Por otra parte, el complejo clonal ST-23Cplx ha sido detectado en las cepas de E. coli
C2117, 53037, STEC 778g y STEC908e2 identificadas en Tailandia, Países Bajos y
Australia. Aunque se ha descrito la presencia de dichas cepas en Asia, Europa y
Oceanía, se ha identificado que este tipo de complejo clonal se encuentra también
ampliamente diseminado en América y África, identificándose en América del Sur en
países como Brasil, Ecuador y Perú; los aislamientos ecuatorianos han sido en su
mayoría detectados en muestras de origen humano en estudios de vigilancia
desarrollados por la Universidad de California-Berkley, el Instituto de Tecnología de
Georgia y la Unidad de Investigación de Enfermedades Transmitidas por Alimentos y
Resistencia a los Antimicrobianos (UNIETAR) (EnteroBase, 2023).
El último complejo clonal E. coli ST-155 Cplx identificado en matrices alimentarias y

animales, unifica el tipo de secuencia ST58 proveniente de Alemania (RE2 CI#4) y
Sudáfrica (CFG_335 CI#5). Se ha descrito que E. coli ST58 del complejo clonal ST-
155 Cplx es un grupo clonal ExPEC causante de infecciones del torrente sanguíneo;
los aislamientos de E. coli ST58 han sido identificados en animales productores de
alimentos, estiércol, aguas aledañas a granjas, cereales (cebada y avena) (Reid et al.,
2022). A pesar de la nula incidencia de este tipo de secuencia en las secuencias
analizadas en el presente estudio, en Ecuador se ha detectado la presencia en muestras
de origen ambiental, animal y humano; sin embargo, no se ha reportado la presencia
en muestras de origen alimentario, según datos de vigilancia realizados por la
Universidad de California-Berkley, el Instituto de Tecnología de Georgia y el Centro
de Medicina Veterinaria (CVM)-FDA (EnteroBase, 2023).
Por su parte, las cepas T5bX y C5b1 de ST677 identificadas como secuencias
portadoras de STEC, se encontraron filogenéticamente cercanas, pues que se
determinó que presentaban una diferencia alélica de 2, por lo cual se infiere que estos
55
aislamientos provenían de un mismo ancestro en común. Por otra parte, se logra
identificar que existen aislamientos de diverso origen geográfico relacionados
filogenéticamente a los aislamientos ecuatorianos mencionados tales como la cepa de
E. coli EK 5.12 (Alemania); no obstante, las diferencias alélicas identificadas para
dichos aislamientos con respecto a las secuencias de origen ecuatoriano eran
considerables, identificándose diferencias alélicas de 1590 con respecto a las cepas
T5bX y C5b1, respectivamente, lo que se infiere que estos aislamientos pueden no
compartir un ancestro en común. Por otra parte, los aislamientos de E. coli N1_1
(CI#8), Jc5_2c2 (CI#30) y L6by (CI#34) portadores de BLEEs presentaban diferencias
alélicas significativas por lo cual no se puede inferir que dichos aislamientos no
comparten un ancestro en común. En cuanto al serovar identificado para dichas cepas
fue H40, O12:H48 y O16:H40 para las cepas N1_1, Jc5_2c2 y L6by, respectivamente.
En el caso de la cepa de E. coli N1_1 se identifica gráficamente la relación filogenética

con las cepas 71CH (CI#7), MEZEC10 (CI#9), STEC1828-1 (CI#10), STEC816b
(CI#11) y EPEC919f (CI#12); sin embargo, se identifican grandes diferencias alélicas,
determinándose diferencias de 1584, 1647, 1494, 1598 y 1776, respectivamente para
cada aislamiento con referencia al aislamiento ecuatoriano. Los serovares detectados
en la presente eran variables determinándose los serotipos H28, O8:H49, O43:H2,
O100:H30 y O26:H11. Con respecto a la cepa Jc5_2c2 se encontró una diferencia
alélica de 2249 con referencia a su aislamiento más cercano siendo este la cepa E. coli
EC14 aislada en Malasia. De esta forma se infiere que el análisis MLST de genoma
central mostró una distribución aleatoria para las secuencias portadoras de ARGs, y no
se identificó una asociación con un linaje clonal especifico, salvo la cepa de E. coli
L6by de complejo clonal ST-10 Cplx.
De forma general, se logra evidenciar que los diferentes tipos de secuencias y serovares
se encuentran ampliamente diseminados en diversas matrices y origen geográfico
desde el punto de vista filogenético; por lo cual, se puede inferir que los aislamientos
que no pertenecen a un complejo clonal, no exhiben relaciones filogenéticas cercanas.
Por su parte se demuestra que los aislamientos filogenéticamente cercanos eran de
origen animal y humano, y por su parte los aislamientos provenientes de matrices
56
alimentarias eran filogenéticamente cercanas a aislamientos de origen ambiental y
animal.
3.1.2.2. Caracterización de secuencias de diverso origen geográfico y análisis

comparativo con secuencias de origen local
Se realizó la caracterización de los factores de virulencia, ARGs y presencia de tipos

de plásmidos para las secuencias de diverso origen geográfico empleando la
plataforma VirulenceFinder, ResFinder y PlasmidFinder del CGE; dichas
caracterizaciones fueron realizadas a fin de identificar la distribución de los factores
de virulencia, los ARGs y la presencia de plásmidos en aislamientos de diverso origen
geográfico y fuente de aislamiento. Se identificaron 40 factores de virulencia, diversos
genes para 9 familias de antibióticos y 18 tipos de plásmidos. Cada árbol de filogenia
rectangular cuenta con una leyenda que indica el continente del cual es proveniente el
aislamiento, el origen o matriz, y la representación de presencia de los genes y tipo de
plásmido; la presencia de los genes de virulencia, resistencia y tipos de plásmidos se
identifica con la figura pintada de negro o llena como se muestra en la Figura 10, 11
y 12. La información detallada de los aislamientos se presenta en el apartado de anexos
bajo la identificación de Anexo 3.
57
Figura 10
Árbol de filogenia rectangular comparativo y predicción de genes de virulencia para 50 aislados de E. coli de diverso origen geográfico
Nota: Cada columna identificada en la parte superior corresponde al factor de virulencia predicho en cada secuencia. La detección del factor de virulencia se identifica con
la figura llena
58
Figura 11
Árbol de filogenia rectangular comparativo y predicción de ARGs para 50 aislados de E. coli de diverso origen geográfico
Nota: Cada columna identificada en la parte superior corresponde al ARGs predichos en cada secuencia. La detección del gen que confiere la resistencia se identifica con
la figura llena
59
Figura 12
Árbol de filogenia rectangular comparativo y predicción de plásmidos para 50 aislados de E. coli de diverso origen geográfico.
Nota: Cada columna identificada en la parte superior corresponde a los tipos de plásmidos predichos en cada secuencia. La localización de los diferentes plásmidos se
identifica con la figura llena
60
De forma general, los aislamientos de origen alimentario de origen ecuatoriano
caracterizados en el presente estudio presentan un bajo porcentaje de ARGs,
destacando principalmente los genes de resistencia a aminoglicósidos como aadA1,
aph(3'')-Ib y aph(6)-Id, los cuales se encuentran rondando el 20% de las secuencias
analizadas y cuyos porcentajes son similares a los detectados en aislamientos del resto
de América, Europa, Asia y África, en donde han sido detectados en un rango entre el
14% y el 33%. Con respecto a los mecanismos de virulencia, aquellos que presentan
un porcentaje de presencia superior al 50% corresponden a los genes terC (confiere
resistencia al telurio), hlyE (codifica para una proteina formadora de poros), iss
(codifica para la proteina de supervivencia sérica), traT (resistencia serica de E. coli),
ompT (factor asociado a la patogenicidad extraintestinal) (Sarowska et al., 2019); los
cuales guardan concordancia con los porcentajes de presencia de tales genes en los
aislamientos de América, Europa, Asia y África evaluados en el presente estudio, así
como con respecto a su origen. Con respecto a los plásmidos, aquellos que han sido
detectados en mayor frecuencia son los de tipo IncFIB e InFII, los cuales están
presentes en más del 50% de los aislamientos de origen alimentario de Ecuador, y cuyo
porcentaje se asemeja a los detectados en aislamientos de origen humano y animal a
nivel global.
Los plásmidos representan uno de los principales MGE. Desafortunadamente, los

datos de las secuencias se basaron principalmente en la secuenciación de lectura corta
(Illumina), motivo por el cual, la identificación de la ubicación específica de los ARGs
y de virulencia no está claros, porque el ensamblaje de novo de las lecturas del ADN
genómico total no permite la separación de los ensamblajes según su ubicación original
(plásmidos o cromosoma) (Wang et al., 2021). Por otra parte, las comparaciones
topológicas del árbol filogenético rectangular indica que las relaciones evolutivas de
los ARGs, genes de virulencia y tipos de plásmidos que albergan E. coli no se
correlacionaron completamente con el origen de los aislamientos (animal, ambiental,
humano y alimentos) y su localización geográfica.
61
CAPÍTULO 4
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1. Conclusiones
• Se caracterizó in silico secuencias de genoma completo de E. coli portadoras

de la toxina Shiga mediante la plataforma VirulenceFinder 2.0 de CGE,
identificándose que las cepas de E. coli C5b1 y T5bX provenientes de
aislamientos de origen vegetal portaban genes stx2 que codifican hacia la
producción de toxina Shiga; empleando la herramienta PHASTER y Proksee
se detectó que los genes stx2 se localizaban en regiones de profagos.
Adicionalmente se encontraron genes de resistencia que codifican las b-
lactámasas de clase C y mutaciones no definidas que se ha descrito que
confieren la resistencia a las cefalosporinas de amplio espectro, polimixinas y
fluoroquinolonas. Simultáneamente, la tipificación MLST obtenida mediante
la plataforma MLST 2.0 de CGE reveló que el tipo de secuencia para estos 2
aislamientos fue ST677.
• Se caracterizó in silico secuencias de genoma completo de E. coli portadoras

de b-lactamasas de espectro extendido mediante la plataforma ResFinder 4.1
de CGE, detectándose que las 3 cepas de E. coli N1_1 (ST101), Jc5_2C2
(ST12373) aisladas a partir de comida callejera y la cepa L6by (ST1286)
aislada de vegetales portaban los genes blaTEM y blaCMY que codifica para
BLEEs; adicionalmente se identificaron 18 genes de resistencia adquiridos
destacando que todas las cepas portaban las variantes de los genes tet y sul que
confieren resistencia a la tetraciclina y al sulfametoxazol. Los tipos de
plásmidos identificados en dichos aislamientos fueron IncFI1-1, IncFIA,
IncFIB, IncFIC y Col; sin embargo, se identificó que únicamente el gen de
62
resistencia qnrB19 que confiere resistencia a quinolonas se ubicó en la misma
región del plásmido Col(pHAD28).
• La distancia filogenética entre aislamientos de origen local y de diverso origen

geográfico basados en la tipificación cgMLST, detectó que 6 aislamientos
locales pertenecían a un mismo complejo clonal (ST-10 Cplx) y las diferencias
alélicas identificadas entre aislamientos de India y Australia fueron de 326
hasta 667 con referencia a los aislamientos ecuatorianos, lo que se infiere que
estas cepas provenían de un antepasado común. Las cepas de origen
ecuatoriano T5bX y C5b1 identificadas como STEC, se localizaron
filogenéticamente cercanas, pues se determinó que presentaban 2 diferencias
alélicas. Los aislamientos que no fueron clasificados dentro de un mismo
complejo clonal y serovar no exhibieron relaciones filogenéticas cercanas. De
igual forma, se determinó que las comparaciones topológicas basadas en las
interacciones evolutivas de ARGs, factores de virulencia y tipos de plásmidos
de E. coli no se correlacionaron con el origen geográfico y tipo de fuente de
aislamiento.
• Se analizó secuencias de genoma completo de E. coli aisladas a partir de

vegetales y comida callejera en función de herramientas bioinformáticas
empleadas en la caracterización de la calidad del genoma de las secuencias
ensambladas, determinación de ARGs y factores virulencia, tipos de
plásmidos, regiones de profagos, tipos de secuencias MLST y cgMLST. En
general, las secuencias analizadas presentaron altos estándares de calidad dado
su bajo índice de contaminación el cual se encontró entre 0.1 % y 1.5 % y
porcentaje de completitud del 100%. De igual manera se detectó una mayor
frecuencia de detección de factores de virulencia, ARGs, tipos de plásmidos y
cantidades superiores de regiones de profagos en secuencias aisladas a partir
de comida callejera. Se logró detectar la presencia de STEC y E. coli portador
de BLEEs en matrices alimentarias en función de la tecnología de WGS. Los
hallazgos identificados en el presente estudio proporcionan una base para
generar una mayor evaluación del riesgo relacionado con la RAM y la
63
diseminación de microorganismos potencialmente patógenos; por lo cual, a
pesar que la aplicación de WGS en el país todavía se centra en situaciones
académicas se propone la adopción de estas tecnologías como mecanismos de
vigilancia y control epidemiológico para comprender los orígenes y
diseminación de RAM.
4.2. Recomendaciones
• El empleo de WGS de lectura corta no permite ensamblar diferencialmente

plásmidos y cromosoma, por lo cual el empleo de ensamblajes híbridos que
implementen la WGS mediante fragmentos largos y cortos facilitarían la
generación de secuencias consenso de alta calidad que diferencie plásmidos y
cromosomas.
• Evaluar los mecanismos de inducción a la expresión de bacteriófagos

portadores de genes stx2.
• Se plantea secuenciar genomas completos de E. coli aislados de diversas

fuentes a fin de comprender la diseminación y relaciones evolutivas entre
aislamientos de origen ecuatoriano.
• La importancia de la vigilancia y monitoreo epidemiológico considerando

WGS contribuirá a la implementación de estrategias que permitan comprender
la evolución y diseminación de RAM y patógenos potenciales en todo el
mundo.
64
MATERIALES DE REFERENCIA
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Yang, X. (2021). Genomic analysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli
O157:H7 from cattle and pork-production related environments. NPJ Science of
Food, 5(1). https://doi.org/10.1038/S41538-021-00097-0
Zhang, Y., Liao, Y., Salvador, A., & Wu, V. (2021). Genomic characterization of two
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84
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in Microbiology, 12, 3564.
Zuñiga, I., & Caro, J. (2017). Enfermedades transmitidas por los alimentos: Una
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Zurita, J., Yánez, F., Sevillano, G., Ortega-Paredes, D., & Paz y Miño, A. (2020).
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resistant Escherichia coli epidemic clones in Quito, Ecuador. Letters in Applied
Microbiology, 70(3), 203–209. https://doi.org/10.1111/LAM.13263
85
Anexos
Anexo 1
Tabla de identificación de las secuenciaciones del genoma completo de 13 cepas de E. coli aisladas de vegetales y comida callejera de
Ecuador
Cepa Año de Tipo de muestra Ubicación No. Acceso a No. Acceso a No. Acceso a
aislamiento geográfica BioSample SRA Assembly
M1_1 2020 Guiso Tungurahua SAMN28681462 SRS13189682 GCA_023561655.1
N1_1 2020 Ensalada (Mote, Tungurahua SAMN28681473 SRS13189681 GCA_023561435.1
choclo, hablas y fritada)
C2_1c1 2021 Huevos de cordorniz Tungurahua SAMN28681463 SRS13189695 GCA_023561635.1
cocidos
Jc5_2C2 2021 Jugo de caña Tungurahua SAMN28681469 SRS13189654 GCA_023561735.1
(Saccharum
officinarum)
Ch5_1a1 2021 Ensalada de chochos Tungurahua SAMN28681468 SRS13189704 GCA_023561535.1
(Lupinus mutabilis)
E2_2b 2021 Merengue dulce de Tungurahua SAMN28681472 SRS13189662 GCA_023562495.1
huevo (Espumilla)
86
Cepa Año de Tipo de muestra Ubicación No. Acceso a No. Acceso a No. Acceso a
aislamiento geográfica BioSample SRA Assembly
Hmm 2021 Habas, melloco, Tungurahua SAMN28681466 SRS13189663 GCA_023561715.1
mapahuira
L6bY 2021 Lechuga (Lactuca Chimborazo SAMN28681465 SRS13189668 GCA_023561375.1
sativa)
CM3aX 2021 Col Roja (Brassica Chimborazo SAMN28681470 SRS13189687 GCA_024740505.1
oleracea)
C5b1 2021 Col Blanca (Brassica Chimborazo SAMN28681467 SRS13189686 GCA_023561385.1
oleracea)
T5bX 2021 Tomate (Solanum Chimborazo SAMN28681464 SRS13189707 GCA_023561575.1
lycopersicum)
R6c2 2021 Rábano (Raphanus Chimborazo SAMN28681474 SRS13189649 GCA_023562295.1
raphanistrum subsp.
Sativus)
R3cX 2021 Rábano (Raphanus Chimborazo SAMN28681471 SRS13189648 GCA_023562535.1
raphanistrum subsp.
Sativus)
87
Anexo 2
Tabla de información relacionada a la calidad del genoma para las 13 secuencias de genoma completo aisladas de vegetales y comida
callejera de Ecuador
Cepa No. de Contenido N50(bp) L50 No. de No. de No. No. Completit Contamina
lecturas G+C (%) (bp) contigs CDSs de de ud ción
totales tRN rRN (CheckM) (CheckM)
A A
M1_1 4,720,963 50.67 209,096 7 54 4,634 78 8 100 -
N1_1 5,058,102 50.54 119,031 15 115 5,024 80 7 100 1.5
C2_1c1 4,687,622 50.77 221,921 8 66 4,601 82 6 100 -
Jc5_2C2 5,125,220 50.53 276,038 7 61 5,020 82 5 100 0.1
Ch5_1a1 4,751,717 50.81 234,975 7 68 4,675 78 7 100 -
E2_2b 4,651,603 50.78 221,316 8 65 4,566 81 5 100 -
Hmm 4,830,023 50.76 228,829 8 73 4,767 74 7 100 -
L6bY 4,007,122 50.68 210,300 6 56 4,607 78 6 100 0.1
CM3aX 4,940,394 50.90 74,583 20 171 4,968 77 8 100 0.1
C5b1 5,184,284 50.71 217,893 8 87 5,242 82 10 100 0.1
T5bX 5,181,902 50.71 229,587 7 85 5,229 82 8 100 0.1
R6c2 4,616,297 50.85 83,004 14 97 4,559 76 6 100 0.2
R3cX 5,306,726 50.35 117,185 14 150 5,358 77 4 100 0.1
88
Anexo 3
Tabla de información compilada de secuencias de genoma completo de diverso origen geográfico y de origen local
Biosample Bioproyect Pais Cepa Continente Año Origen Descripción
SAMN12676282 PRJNA563564 Alemania EK5.12 Europe 2017 Alimentario Cilantro
SAMN12676364 PRJNA563564 Alemania RE3 Europe 2016 Alimentario Rúcula
Carne de cerdo
SAMN21210949 PRJNA760238 Alemania STEC 826a Europe 2019 Alimentario
(congelada)
SAMN21210946 PRJNA760238 Argentina STEC 816b America 2019 Alimentario Carne de res (congelada)
SAMN21210952 PRJNA760238 Argentina STEC1828-1 America 2020 Alimentario Carne de res (congelada)
SAMN21210939 PRJNA760238 Australia STEC 908e2 Oceania 2019 Alimentario Carne de res (congelada)
SAMN21210940 PRJNA760238 Australia STEC 1309b Oceania 2020 Alimentario Carne de res (congelada)
SAMN21210958 PRJNA760238 Australia EPEC 1668-4a Oceania 2020 Alimentario Carne de res (congelada)
SAMN10585802 PRJNA509640 Chile UC-457 America 2016 Humano Orina
Sedimentos de canal de
SAMN20560762 PRJNA751928 Ecuador UTA144 America 2018 Ambiental
riego
SAMN24594990 PRJNA751928 Ecuador UTA069 America 2018 Animal Heces
89
Guiso de Vaca (comida

SAMN28681462 PRJNA415804 Ecuador M1_1 América 2020 Alimentario
callejera)
Huevos de cordorniz
SAMN28681463 PRJNA415804 Ecuador C2_1c1 América 2021 Alimentario
(comida callejera)
Tomate (Solanum
SAMN28681464 PRJNA415804 Ecuador T5bX América 2021 Alimentario
lycopersicum)
Lechuga (Lactuca
SAMN28681465 PRJNA415804 Ecuador L6bY América 2021 Alimentario
sativa)
Frijoles hervidos, cerdo
SAMN28681466 PRJNA415804 Ecuador Hmm América 2021 Alimentario y batatas de comida
callejera
Col Blanca (Brassica
SAMN28681467 PRJNA415804 Ecuador C5b1 América 2021 Alimentario
oleracea)
Ensalada Lupinus
SAMN28681468 PRJNA415804 Ecuador Ch5_1a1 América 2021 Alimentario mutabilis (comida
callejera)
Jugo de caña (comida
SAMN28681469 PRJNA415804 Ecuador Jc5_2C2 América 2021 Alimentario
callejera)
90
Col Roja (Brassica

SAMN28681470 PRJNA415804 Ecuador CM3aX América 2021 Alimentario
oleracea)
Rábano (Raphanus
SAMN28681471 PRJNA415804 Ecuador R3cX América 2021 Alimentario raphanistrum subsp.
Sativus)
Merengue dulce de
SAMN28681472 PRJNA415804 Ecuador E2_2b América 2021 Alimentario
huevo (comida callejera)
Ensalada (comida
SAMN28681473 PRJNA415804 Ecuador N1_1 América 2020 Alimentario
callejera)
Rábano (Raphanus
SAMN28681474 PRJNA415804 Ecuador R6c2 América 2021 Alimentario raphanistrum subsp.
Sativus)
SAMN16293344 PRJNA666443 Egipto 23ST Africa 2017 Humana Heces
SAMN16293350 PRJNA666443 Egipto 21M Africa 2017 Alimentario Carne molida
SAMN16293354 PRJNA666443 Egipto 71CH Africa 2017 Alimentario Carcasas de pollo
Carne de cerdo
SAMN21210937 PRJNA760238 España STEC 1053l-2 Europe 2020 Alimentario
(congelada)
91
Carne de cerdo
SAMN21210956 PRJNA760238 España EPEC 765e Europe 2019 Alimentario
(congelada)
SAMN07224767 PRJNA390247 Francia MC2 (O157:H7) Europe 2014 Animal Heces
SAMN21210955 PRJNA760238 Francia EPEC 1095a Europe 2020 Alimentario Carne de cerdo
SAMN10219877 PRJNA495131 India NAEC1042 Asia 2015 Alimentario Carne de pollo cruda
SAMN10219878 PRJNA495132 India NAEC1115 Asia 2015 Animal Ciego de pollo
SAMN21210954 PRJNA760238 Indonesia EPEC 919f Asia 2019 Alimentario Caracol de mar
SAMN11246386 PRJNA528851 Italia EC269 Europe 2010 Alimentario Leche
SAMN11246461 S/N Italia EC845 Europe 2018 Alimentario Espinaca
SAMN11246617 PRJNA528851 Italia EC850 Europe 2018 Humana Heces
SAKAI (EHEC)
SAMN01911278 PRJNA226 Japón Asia 1996 Humana Heces
(O157:H7)
SAMN03256246 PRJNA269669 Malasia EC14 Asia 2013 Ambiental Agua
SAMEA3678975 PRJEB11777 Mexico 10270 America 2013 Humana Absecesos hepatico

STEC 343
SAMN03736827 PRJNA285020 Paises Bajos Europe 2013 Humana Heces
(O157:H7)
92
Carne de cerdo
SAMN21210938 PRJNA760238 Paises Bajos STEC 778g Europe 2019 Alimentario
(congelada)
SAMN11266321 PRJNA293225 Sudáfrica MEZEC10 Africa 2018 Animal Oveja
SAMN12285021 PRJNA554852 Sudáfrica CFG_335 Africa 2017 Animal Heces
SAMN12288806 PRJNA555014 Sudáfrica CFC_154 Africa 2017 Animal Heces
SAMN10839620 PRJNA517648 Suecia B1483-PB_2012 Europe 2012 Humana Sangre
SAMN05190012 PRJNA323827 Suiza S51 Europe 2015 Alimentario Carne de ave
SAMN15497997 PRJNA525849 Tailandia 53037 Asia 2016 Humana Orina
SAMN22350876 PRJNA525849 Tailandia C2117 Asia 2019 Humana Pus

C1-057
SAMN03462359 PRJNA280460 USA America 2008 Animal Heces rectales
(O157:H7)
93
Anexo 4
Códigos de identificación (CI) y tipo de complejo clonal (ST Complex)
Código de
Biosample País Cepa Origen Descripción ST ST Complex
Identificación
Carne de cerdo
SAMN21210956 España EPEC 765e Alimentario 1 17 ST20 Cplx
(congelada)
SAMN12288806 Sudáfrica CFC_154 Animal Heces de Ganado 2 1308 ST86 Cplx
SAMN11246386 Italia EC269 Alimentario Leche 3 2328 S/N
SAMN12676364 Alemania RE3 Alimentario Rúcula 4 58 ST155 Cplx
SAMN12285021 Sudáfrica CFG_335 Animal Heces Ganado 5 58 ST155 Cplx
Carne de ave
SAMN05190012 Suiza S51 Alimentario 6 7060 S/N
congelada (pollo)
SAMN16293354 Egipto 71CH Alimentario Carcasas de pollo 7 156 ST156 Cplx
Ensalada (comida
SAMN28681473 Ecuador N1_1 Alimentario 8 101 ST101 Cplx
callejera)
SAMN11266321 Sudáfrica MEZEC10 Animal Oveja 9 1844 S/N
Carne de res
SAMN21210952 Argentina STEC1828-1 Alimentario 10 937 S/N
(congelada)
Carne de res
SAMN21210946 Argentina STEC 816b Alimentario 11 679 ST469 Cplx
(congelada)
94
Código de
Identificación
SAMN21210954 Indonesia EPEC 919f Alimentario Caracol de mar 12 12360 ST29 Cplx
Tomate (Solanum
SAMN28681464 Ecuador T5bX Alimentario 13 677 S/N
lycopersicum)
SAMN12676282 Alemania EK5.12 Alimentario Cilantro 14 6186 S/N
Col Blanca (Brassica
SAMN28681467 Ecuador C5b1 Alimentario 15 677 S/N
oleracea)
SAMN24594990 Ecuador UTA069 Animal Heces de Canis lupus 16 1196 S/N
SAMN22350876 Tailandia C2117 Humana Pus 17 410 ST23 Cplx
SAMN15497997 Tailandia 53037 Humana Orina 18 410 ST23 Cplx
Carne de cerdo
SAMN21210938 Paises Bajos STEC 778g Alimentario 19 360 ST23 Cplx
(congelada)
Carne de res
SAMN21210939 Australia STEC 908e2 Alimentario 20 360 ST23 Cplx
(congelada)
Frijoles hervidos,
cerdo y batatas de
SAMN28681466 Ecuador Hmm Alimentario (habas melloco y 21 607 S/N
mapahuira) comida
callejera
95
Código de
Identificación
Carne de cerdo
SAMN21210937 España STEC 1053l-2 Alimentario 22 1112 S/N
(congelada)
SAMN11246461 Italia EC845 Alimentario Espinaca 23 34 ST10 Cplx
Ensalada Lupinus
SAMN28681468 Ecuador Ch5_1a1 Alimentario 24 10 ST10 Cplx
mutabilis
SAMN10219878 India NAEC1115 Animal Ciego de pollo 25 10 ST10 Cplx
SAMEA3678975 Mexico 10270 Humana Absecesos hepatico 26 617 ST10 Cplx
SAMN11246617 Italia EC850 Humana Heces 27 69 ST69 Cplx
Rábano (Raphanus
SAMN28681471 Ecuador R3cX Alimentario raphanistrum subsp. 28 6506 S/N
Sativus)
SAMN03256246 Malasia EC14 Ambiental Agua 29 9074 S/N
Jugo de caña (comida
SAMN28681469 Ecuador Jc5_2C2 Alimentario 30 13273 S/N
callejera)
SAMN10219877 India NAEC1042 Alimentario Carne de pollo cruda 31 117 S/N
Carne de res
SAMN21210958 Australia EPEC 1668-4a Alimentario 32 6323 ST28 Cplx
(congelada)
96
Código de
Identificación
B1483-
SAMN10839620 Suecia Humana Sangre 33 131 ST131 Cplx
PB_2012
Lechuga (Lactuca
SAMN28681465 Ecuador L6bY Alimentario 34 1286 ST10 Cplx
sativa)
Carne de cerdo
SAMN21210949 Alemania STEC 826a Alimentario 35 993 ST10 Cplx
(congelada)
SAMN16293344 Egipto 23ST Humana Heces 36 226 ST226 Cplx
SAMN28681462 Ecuador M1_1 Alimentario Guiso de Vaca 37 10 ST10 Cplx
Carne de res
SAMN21210940 Australia STEC 1309b Alimentario 38 10 ST10 Cplx
(congelada)
SAMN28681463 Ecuador C2_1c1 Alimentario Huevos de cordorniz 39 10 ST10 Cplx
Merengue dulce de
SAMN28681472 Ecuador E2_2b Alimentario 40 10 ST10 Cplx
huevo
SAMN10585802 Chile UC-457 Humano Orina 41 4204 ST10 Cplx
Col Roja (Brassica
SAMN28681470 Ecuador CM3aX Alimentario 42 10 ST10 Cplx
oleracea)
SAMN16293350 Egipto 21M Alimentario Carne molida 43 48 ST10 Cplx
97
Código de
Identificación
Rábano (Raphanus
SAMN28681474 Ecuador R6c2 Alimentario raphanistrum subsp. 44 48 ST10 Cplx
Sativus)
Sedimentos de canal
SAMN20560762 Ecuador UTA144 Ambiental 45 5876 S/N
de riego
SAMN21210955 Francia EPEC 1095a Alimentario Carne de cerdo 46 137 ST32 Cplx
SAKAI
SAMN01911278 Japón (EHEC) Humana Heces 47 11 ST11 Cplx
(O157:H7)
MC2
SAMN07224767 Francia Animal Heces (Bos tauro) 48 11 ST11 Cplx
(O157:H7)
STEC 343
SAMN03736827 Paises Bajos Humana Heces 49 11 ST11 Cplx
(O157:H7)
C1-057 Heces rectales
SAMN03462359 USA Animal 50 11 ST11 Cplx
(O157:H7) (ganado)
98

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UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN

Análisis de secuencias de genoma completo de Escherichia coli aisladas de

Informe Final de Integración Curricular, Modalidad Proyecto de Investigación, previo

AUTORA: Lissette Katherine Sánchez Gavilanes

PhD. William Ricardo Calero Cáceres.

Que el presente Informe Final de Integración Curricular ha sido prolijamente revisado.

Ambato, 10 de febrero del 2023

Firmado electrónicamente por:

PhD. William Ricardo Calero Cáceres.

Lissette Katherine Sánchez Gavilanes

Los suscritos Profesores Calificadores, aprueban el presente Informe Final de

Por constancia firman:

Firmado electrónicamente por:

Presidente del Tribunal

Firmado electrónicamente por:

B.F. Irvin Ricardo Tubón Usca, PhD.

Firmado electrónicamente por:

Blga. Helena Maritza De la Torre Olvera, PhD

Ambato, 08 de marzo del 2023

Cedo los derechos en línea patrimoniales de mi Informa Final de la Integración

Lissette Katherine Sánchez Gavilanes

A Dios y la Virgen María, por guiar

Lo más importante en mi mundo es mi Familia.

Mis padres Elsa y Wilson por ser la luz

A cada persona que ha ayudado en mi crecimiento profesional, mi más sincero

A la Universidad Técnica de Ambato y Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y

APROBACIÓN DEL TUTOR ....................................................................................... ii

DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD ...................................................................... iii

APROBACIÓN DE LOS MIEMBROS DEL TRIBUNAL DE GRADO ....................... iv

DERECHOS DE AUTOR ............................................................................................. v

AGRADECIMIENTO ................................................................................................. vii

ABSTRACT ................................................................................................................ xiii

1.1. Antecedentes investigativos ......................................................................... 1

1.1.1. Emergencia de la resistencia antimicrobiana ........................................... 1

1.1.2. Patógenos alimentarios............................................................................. 3

1.1.3. E. coli: mecanismos de resistencia y producción de toxinas. .................. 6

1.1.4. Investigación epidemiológica de E. coli ................................................ 10

1.1.5. Análisis de secuencias de genoma completo. Herramientas

1.2. Objetivos .................................................................................................... 19

1.2.1. Objetivo General .................................................................................... 19

2.1. Materiales ................................................................................................... 20

2.2. Métodos ...................................................................................................... 22

2.2.1. Análisis de la calidad del genoma de las secuencias ensambladas ........ 23

2.2.2. Caracterización de secuencias ................................................................ 24

2.2.3. Determinación de profagos y elaboración de gráficos circulares .......... 27

2.2.4. Comparación de secuencias de genoma completo de diversos orígenes

3.1. Análisis y discusión de los resultados ............................................................ 31

3.1.2. Evaluación de la distancia filogenética entre aislamientos de E. coli de

3.1.2.1. Estructura de población basada en la estrategia cgMLST ..................... 51

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................ 62

4.1. Conclusiones ....................................................................................................... 62

4.2. Recomendaciones ................................................................................................ 64

MATERIALES DE REFERENCIA ......................................................................... 65

Tabla 1 Toxinas bacterianas, fuentes asociadas y toxicidad que generan en células

Figura 1 Línea de tiempo. Relación entre la introducción de nuevos antibióticos e

Anexo 1 Tabla de identificación de las secuenciaciones del genoma completo de 13

La secuenciación de genoma completo (WGS) es una herramienta fundamental para

Palabras clave: Secuenciación de genoma completo, Escherichia coli, resistencia,