Microscop Í A

Teoría celular. Antecedentes.
• 1665  Robert Hooke observa con lentes trocitos de

corcho: observa que tiene aspecto de celdillas, establece el
término célula (cell).
• 1674  A. van Leeuwenhoek, perfecciona los microscopios
y describe los “animálculos” (bacterias, protozoos…)
• 1838-39  M. Schleiden y T. Schwann proponen que la
célula es la unidad de los seres vivos (base de la Teoría
celular).
• 1855 R. Virchow: toda célula proviene de otra célula.
• S. XX  Santiago Ramón y Cajal universaliza la teoría
celular al demostrar que incluso el tejido nervioso está
formado por células.
Teoría celular. Ideas fundamentales.
• Todos los organismos están formados por células (una
o muchas).
• La célula es la unidad estructural de los seres vivos.
• La célula es la unidad fisiológica de los seres vivos
(capaz de realizar las tres funciones vitales – nutrición,
relación, reproducción-).(Aportaciones de Schleiden y
Schwann).
• Es la unidad reproductiva de los seres vivos, ya que
cada célula proviene de otra preexistente. (Louis
Pasteur descarta en el siglo XIX la teoría de la
generación espontánea, léase el cuadro de la p. 91 de
libro de texto). (aportación de Virchow).
Métodos de estudio de las células
• Microscopía:
– Óptica.
– Electrónica.
• Preparación de muestras.
• Cultivos celulares.
Microscopía óptica
• Se basa en la ampliación de imágenes
mediante la transmisión y captación de la luz
utilizando un sistema de lentes (microscopio
óptico).
Microscopía óptica
• Parámetros importantes:
– Aumento: Relación entre el tamaño de la imagen que
vemos y el objeto real.
– Poder de resolución (lo más importante): Capacidad
de separar dos objetos muy cercanos en una imagen
como entidades independientes: una limitación muy
importante para este parámetro (aparte de las
características técnicas del instrumento) es la longitud
de onda de la radiación utilizada (por ejemplo, con luz
ultravioleta se consigue mayor resolución). El poder
de resolución máximo que se alcanza en microscopía
óptica, con luz UV, es de unos 200 nm.
Diferentes técnicas o tipos de
microscopía óptica
• Microscopía de campo brillante o campo claro
(técnica tradicional):
– El condensador está debajo de la muestra, con lo
que la luz forma un cono que la atraviesa. Vemos
las imágenes en función de la luz que absorben o
que las atraviesa, lo que se puede potenciar con el
uso de pigmentos (técnicas de tinción).
Tipos de microscopía óptica
Células de Sertoli.
M.o. campo claro
• Microscopía de campo oscuro:
– Utiliza un haz de luz muy intensa en forma de cono hueco.
– La muestra dispersa la luz y se hace así visible contra el
fondo oscuro que tiene detrás, “como las partículas de
polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una
habitación cerrada”.
– Las porciones transparentes de la muestra quedan oscuras,
mientras que las superficies y partículas se ven brillantes.
– Se utiliza para observar muestras transparentes y sin
pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la
muestra, es decir, sin matarla.
Funcionamiento del
microscopio de
Daphnia sp. campo oscuro.
• Microscopios de contraste de fases y de
interferencia:
– Se transforman las diferencias en el índice de
refracción de las partes de la muestra en
diferencias de intensidad (brillo y oscuridad),
visibles para nosotros.
– Con algunos tipos, se consiguen imágenes
aparentemente tridimensionales.
http://www.youtube.com/watch?v=DD3IQknC
Edc
• Microscopía de fluorescencia
– Se puede usar para muestras vivas.
– Se basa en la capacidad de absorción de distintos
pigmentos fluorescentes (fluorocromos) por las
diversas estructuras celulares.
– Fluorescencia: capacidad que tienen algunos
pigmentos de absorber ciertas longitudes de onda
para después emitir longitudes de ondas más
largas.
Técnicas de microscopía óptica
• La microscopía confocal es una mejora sustancial de las
técnicas clásicas de microscopía óptica (campo claro y
fluorescencia).
• En las técnicas clásicas de observación en microscopia
óptica, la luz interacciona con la muestra a varias
profundidades por lo que la imagen que llega al observador
presenta áreas borrosas debido a la luz procedente de
zonas fuera del plano de enfoque, lo que produce una
degradación en el contraste y resolución de la imagen.
• El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar
la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos
fuera de foco.
• Microscopía multifotónica: Iluminación de los
fluorocromos con distintos tipos de fotones:
Microscopía electrónica
• Se basa en utilizar, en lugar de luz, haces de
electrones que son atraídos mediante campos
electromagnéticos (lentes magnéticas) e
impresionan pantallas.
• En muestras biológicas, el poder de resolución
alcanza los 2 nm.
• Desventajas: No puede usarse para muestras
vivas. Nunca vemos colores naturales. Sólo b/n.
• Procesado de las muestras es mucho más
complejo.
• Dos tipos principales: M.E.T. y M.E.B.
Microscopía electrónica de
transmisión (M.E.T.)
• El haz electrónico atraviesa una muestra que
se ha teñido con metales pesados (osmio,
plomo…).
• Dependiendo de la cantidad de metal que
hayan absorbido las distintas partes de la
muestra, se obtendrán en la imagen zonas
claras u oscuras.
Microscopía electrónica de
transmisión (M.E.T.)
Microscopía electrónica de barrido
(M.E.B.)
• La muestra también se recubre de metales pesados.
• Los electrones no la atraviesan, sino que se reflejan
en ella, así forman imágenes con aspecto
tridimensional.
• Menor poder de resolución (máximo, 10 nm)
SEM=MEB
Microscopía electrónica de barrido
(M.E.B.)
Procesado de las muestras
• Para microscopía óptica:
– Fijación: Estabilización de la muestra, evitando la putrefacción.
Puede ser física (congelación) o química (etanol,
formaldehído…)
– Deshidratación: La muestra se deshidrata sumergiéndola en
varios baños de alcohol, cada vez con mayor graduación.
– Inclusión en parafina: Muchos tipos de muestras (como tejidos
animales), hay que meterlos en parafina líquida, que al
solidificarse forma un bloque.
– Así, la muestra puede cortarse (corte) en láminas muy finas,
usando un microtomo.
– Desparafinado (con disolventes orgánicos como el tolueno)
Procesado de las muestras
• Para microscopía óptica (II):
– Hidratación: mediante baños de alcohol de graduación
decreciente:
– Tinción:
• Colorantes vitales: Se usan en células vivas (verde Jano, azul de
metileno…).
• Colorantes ácidos y básicos que se unen a distintas estructuras. (p.
ej, la eosina, básica, es acidófila, o hematoxilina, básica).
• Otros, muy específicos de ciertas estructuras celulares (como el
lugol, que tiñe de azul granos de almidon).
– Montaje de la preparación: porta, medio de montaje,

cubre
Preparación de las muestras
• Para microscopía electrónica:
– Deshidratación e inclusión en resinas.
– Cortes ultrafinos en ultramicrotomos.
– Contrastado de los cortes en disoluciones de
metales pesados.
– Montaje sobre rejillas y observación.
– A veces, técnicas especiales de corte y
contrastado, para MEB.
Criofractura
• Es una técnica que se usa para la observación de
ciertas estructuras, como membranas, en M.E.B.
• Consiste en congelar muy rápido la muestra, y
después golpearla para que se rompa por las zonas
más frágiles.
Cultivos celulares
• Consisten en conseguir que las células se
mantengan y se multipliquen in vitro.
• Cultivos bacterianos: fáciles.
• Cultivos de células eucariotas: más difíciles de
mantener, los requerimientos son más complejos.
• En ambos casos, se utilizan medios de cultivo, con
nutrientes y con la posibilidad de incluir
sustancias que nos interesen por distintos
motivos.

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– Montaje de la preparación: porta, medio de montaje,

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