TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

Preparación del tejido para microscopia electrónica

1. Fijación con glutaraldehído
2. Tetróxido de osmio que además de fijar, se une con membranas lipoproteicas
3. Deshidrata e incluye con resinas epoxi
4. Cortes con ultramicrótomo con cuchilla de vidrio o diamante
5. Los cortes también contrastan por inmersión en acetato de urallilo o de plomo
Preparación de tejidos para microscopia óptica
1. Fijación: formalina/formaldehído/formol al 37%
 Muestra características estructurales, no la composición química.
 Sirve para
o Abolir metabolismo celular
o Impide degradación enzimática
o Destruir microorganismos patógenos
o Endurecer el tejido
 Para conservar lípidos neutros: cortes por congelación con fijación en
formalina y colorantes que se disuelven en grasa.
 Para conservar estructuras de membrana: fijadores con metales
pesados (permanganato y osmio).
 Componentes que perduran: nucleoproteínas, proteínas intracelulares y
extracelulares, y complejos de fosfolípidos.
 Componentes que se pierden
o Proteínas pequeñas y ácidos nucleicos pequeños
o Líquidos neutros (uso de solventes orgánicos)
o Glucógeno, proteoglucanos y GAGs (fijadores acuosos)
o Metabolitos, glucosa, sodio, cloro (no constituyen los elementos
morfógenos de un tejido)
2. Inclusión en parafina: permite el corte de 5 a 15 micras.
 Se deshidrata con concentraciones crecientes de alcohol hasta 100%
hasta llegar al anhidro
 Aclarado con agua destilada o solventes orgánicos: sirve para extraer
alcohol antes de la infiltración en parafina
o Por ejemplo en xileno o tolueno
 Se enfria y endurece: se corta con un micrótomo.
 Los cortes se colocan en un portaobjetos con un medio de montaje:
o Pineno o resina que son adhesivos.
3. Tinción
 La parafina debe disolverse y extraerse con xileno o tolueno
 Los tejidos deben rehidratarse con alcohol decreciente
 El tejido se tiñe con hematoxilina en agua porque la eosina es más
soluble en alcohol
 Se deshidrata la muestra y se tiñe con eosina en alcohol
 La muestra pasa por xileno o tolueno
  La HyE no permite ver componentes de elastina, fibras reticulares,
membranas basales y lípidos.
o Se usa: orceína, fuscina-resorcina para el material elástico e
impregnación argéntica para fibras reticulares y membranas
basales.
Eosina
 Colorante ácido con carga negativa
 Reacciona con grupos catiónicos con acidofilia
 + sustancias en la C y MEC presentan acidofilia
o Filamentos citoplasmáticos
o Componentes membranosos intracelulares
o Fibras extracelulares
Técnica de Mallory
 Se usan 3 colorantes ácidos
o Anilina azul (colágeno)
o Naranja G (citoplasma y núcleo)
o Fuscina ácida (eritrocitos)
Hematoxilina
 + mordiente
 Colorante básico con carga positiva
 No se disocia del tejido cuando se la coloca en agua
 Reacciona con componentes aniónicos (grupos fosfato de AN, grupos sulfato de
GAG y grupos carboxilo de proteínas) con basofilia y varía según el PH:
o Alto (10): los 3 grupos
o Ácido a neutro (5 a 7): fosfatos y sulfatos
o Bajo (menor a 4): sólo grupos de sulfato
 Cantidad limitada de sustancias basófilas dentro de la C y en la MEC
o Heterocromatina y nucléolos (fosfatos de AN)
o Compuestos citoplasmáticos como ergastoplasma (fosfatos de ARNr)
o Materiales extracelulares como HDC del cartílago (sulfatos)
Localización de un antígeno
En la inmunocitoquímica se utilizan dos tipos de anticuerpos
 Policlonales: producidos por animales inmunizados
o Diferentes clones de linfocitos B se activan y conducen a la producción y
secreción de anticuerpos
 Monoclonales: producidos por líneas celulares inmortalizadas (duplicación
continua).
o Deriva de un solo clon de linfocitos B
 Inmunofluorescencia directa
o Anticuerpo primario marcado con fluorocromo
o Procedimiento de 1 paso
 o Baja intensidad de señal
 Inmunofluorescencia indirecta
o El fluorocromo tiñe un anticuerpo secundario que se dirige a uno
primario
o Mayor sensibilidad, aumenta la emisión de señal
 Inmunoperoxidasa
o Se conjugan anticuerpos con enzimas que convierten sustratos incoloros
en un producto insoluble con color, el cual precipita
o Se observa con microscopio óptico
 Con oro coloidal o ferritina solo se ven con microscopía
electrónica
Técnicas de hibridación
o Capacidad de moléculas monocaternarias de ARN o ADN para
interactuar con secuencias complementarias
o El ARN y ADN se aisla y mezcla con las secuencias complementarias
 Hibridos que se detectan con marcador radiactivo
o FISH
 Se usa para pruebas genéticas
 Sondas de nucleótidos + colorantes fluorescentes
o Enlace más fuerte = sonda de ADN y cadena de ADN
o Enlace más débil= sonda de ARN y cadena de ARN
o Muestra con poco ARNm o transcripto vírico
 Se usa la amplificación de PCR para el ADN
 PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para el ARN
Autorradiografía
o Precursores moleculares pequeños de moléculas más grandes como los
AA y nucleótidos
o Son marcados con un átomo radiactivo
o Se montan en portaobjetos, se sumerge en emulsión y produce una
película fotográfica
 Días o semanas después la emulsión se revela y el portaobjetos se
sella con el cubre
o Los preparados se tiñen antes o después de la exposición y revelado
o Se usa para microscopía óptica y electrónica

Tinción ¿Qué tiñe?

Hematoxilina Núcleo
MEC
RER
Eosina Citoplasma
Fibras de colágeno
Proteínas
PAS Núcleo
HDC
Fibras de colágeno
 Tricómica de Masson Núcleo
Citoplasma
Fibras de colágeno/cartílgo
Fibras musculares
Tricómico de Mallory Núcleo
Citoplasma
Fibras musculares
Fibras de colágeno
Matriz ósea
Cartílago
Tricómico de Gomori Núcleo
Citoplasma
Fibras de colágeno
Fibras musculares
Impregnación argéntica Fibras nerviosas
Fibras reticulares
Azul de toluidina Núcleo
Citoplasma
PRESENTA METACROMASIA (se
Fibras de colágeno
cambia a púrpura o rojo violáceo)
Gránulos de mastocitos
Wright Núcleo
Gránulos basófilos
Eritrocitos y gránulos neutrófilos
Citoplasma
Gránulos eosinófilos
Orceína Núcleo
Músculo liso
Fibras de colágeno
Fibras elásticas

Método del ácido peryódico-reactivo de Schiff (PAS)

 Determina la presencia de HDC que se tiñen de color rojo magenta.
 Fundamento:
o Cada anillo hexosa de HDC lleva un grupo hidroxilo (–OH).
o Las hexosaminas de GAGs contienen C, uno lleva un grupo –OH,
mientras que el otro lleva un grupo amino (–NH2).
o El ácido peryódico escinde la unión entre átomos de C contiguos y
forma grupos aldehído.
 Reaccionan con el reactivo de Schiff y dan un color púrpura.
Método de Feulgen
 Se basa en una hidrólisis débil con ácido clorhídrico
 Determinación de ADN
 Se colorea de rojo
 Cortes con la enzima desoxirribonucleasa antes de la tinción de Feulgen
Colorantes Sudán
 Tiñen TAGs
 Los adipocitos con rojo Sudán
 El negro Sudán para vainas de mielina de las fibras nerviosas.
Metacromasia
 Con Azul de toluidina
 Componentes que se colorean por metacromasia
o GAGs
o Callos sulfatados de la matriz cartilaginosa
o Granulocitos basófilos de la sangre
o Mastocitos del tejido conectivo
 Contienen la sustancia polianiónica heparina.
o Nucleoproteínas presentan metacromasia moderada

MICROSCOPÍA

Poder de resolución
 Distancia mínima entre dos puntos del objeto que pueden ser visualizados
separados por el respectivo objetivo.
 Depende de la longitud de onda de la luz y de la apertura numérica del
objetivo y el condensador (el ocular sólo aumenta la imagen del objetivo, no
contribuye al poder de resolución)
Aumento
 Relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño del objeto en valores lineales.
 No depende del poder de resolución.
Componentes del microscopio de campo claro
 Fuente luminosa para la iluminación de la muestra
 Lente condensador para enfocar el haz de luz a la altura de la muestra
 Platina sobre la que se coloca el portaobjetos
 Lente objetivo para recoger la luz que ha atravesado la muestra
 Lente ocular para examinar la imagen formada por la lente de objetivo
Microscopio Características
Campo claro  Fondo claro
 Muestra muerta y teñida (salvo inmunofluorescencia)
 Límite de resolución de 0,2 micras
Campo  Fondo negro
o Solo entran al objetivo los rayos que pasan por la muestra
oscuro  Estructuras se ven blancas
 Muestras vivas y sin teñir
Contraste de  Aprovecha las diferencias en el índice de refracción
 Capta las longitudes de onda fuera de fase y las dirige en las lentes
fases  Partes oscuras: regiones densas de la muestra
Fluorescencia  Utiliza fluorocromos
 Muestras vivas o muertas
 Se utilizan 2 filtros
o El primero activa la luz fluor (se absorbe)
o El segundo la luz se emite
 Se asocian a anticuerpos específicos
Barrido  En la formación de la imagen se excluye la luz no emitida por el plano
focal.
confocal  Imagen bidimensional
 Imágenes desde distintos planos, es posible reconstruir una imagen 3D
Polarización  Rayos:
o Amorfo: monorrefringente
o Cristalino: ordenado y birrefringente
  Polarizar: ordenar dando un rayo extraordinario mediante la vibración de 2
ondas en planos perpendiculares
 Se puede ver colágeno y microtúbulos, estructura a nivel molecular
 C vivas
 Estructuras anisótropas: afectan la luz polarizada de este modo
Electrónico  Se observan organelas
 Muestras muertas
de  Usa dispersión de electrones (penetran la muestra)
transmisión  Longitud de onda de 9 pm
 Límite de resolución de 0,2 nanometros
 Se utilizan bobinas electromagnéticas
 2D y blanco y negro
Electrónico  Muestra muerta
 Dispersión de electrones (rebotan)
de barrido  Limite de resolución de 2,5 nanometros
 3D y blanco y negro
 Luego de deshidratar el tejido, se baña con moléculas de oro
Fuerza  Púa tocando la muestra (modo de contacto) o da golpecitos a través de la
superficie (modo de percusión)
atómica  Los movimientos se registran en el diodo como movimientos del haz láser
 Células vivas y de su medio circundante