QUIMICA

INSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA DE TÉCNICO DE LABORATORIO
PRÁCTICA DE LABORATORIO II (R.M. 5905/07) 1er. año 2do.

cuatrimestre
UNIDAD III: QUÍMICA
Espectofotometría
El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas
analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su
caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles,
útiles y utilizados es la espectroscopía ultravioleta-visibler. Se pueden identificar y
cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo de reactivos
específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado
que permite detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para
absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las
longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con
la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH,
temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica, por lo que dicha técnica constituye un
valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas
Transmitancia y Absorbancia
Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide

perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que absorbe luz o
cromóforo, el compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará pasar
el resto (It), de forma que se cumple: I0 = Ia + It.
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz

transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, I t, y la cantidad de
luz que incidió sobre ella, I0, y se representa normalmente en tanto por ciento. La
transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida
al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal, pero asume
una relación logarítmica inversa.
La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica
la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T.
Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (I0 = It), la transmitancia es del
100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces
A vale log 1 = 0.
La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la

luz a través de la solución del cromóforo y de la concentración de éste.
1
cuatrimestre
Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda
fija) y concentración de un cromóforo en solución,
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración (a mayor

número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas); también depende de la
distancia que recorre la luz por la solución (a igual concentración, cuanto mayor distancia
recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará); y por último, depende de ε,
una constante de proporcionalidad (denominada coeficiente de extinción) que es específica
de cada cromóforo. Como A es adimensional (sin unidades).
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de altos, varía
con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de
moléculas, cambios del medio, etc.
Instrumentación para la medición de absorbancias de la luz visible y ultravioleta:

espectrofotómetro UV-visible
La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos

llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la
incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros
constan, según se indica en la figura, de:
1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de
onda: filtros, prismas, redes de difracción.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que
contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en
UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación
UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales
eléctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos
Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud
de onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotómetros de un solo haz (con
una sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas
para dos cubetas); en nuestro caso se trabajará con los de un solo haz.
Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le
asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente
y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuación se
pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de ésta.
Curvas de calibrado
Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones de

diferentes concentraciones del mismo, determinándose para cada una de ellas el valor de
absorbancia a λ máxima. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de
abscisas (eje de x) y los de concentración en el eje de ordenadas (eje de y). Se observará
que, a bajas concentraciones, el aumento de concentración se corresponde con un
incremento lineal en la absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A
2
cuatrimestre
concentraciones altas la linealidad se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo

que las medidas son poco fiables.
La representación de Lambert-Beer, nos permitirá calcular el valor del coeficiente de

extinción molar, que corresponde a la pendiente de la recta.
MUESTRA X
Concentración X
Considerando que S es el testigo que se le conoce su concentración C, para calcular la

concentración de la muestra incógnita M se procede al siguiente cálculo:
Absorvancia S CS
Absorvancia M x
Abs M x Cs
CM =
Abs S
Cs
= F (factor)
Abs S
Como el factor siempre es el mismo, en cada analito, se multiplica la absorvancia de cada
muestra por dicho factor.

QUIMICA

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

QUIMICA

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

QUIMICA

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

INSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA DE TÉCNICO DE LABORATORIO

PRÁCTICA DE LABORATORIO II (R.M. 5905/07) 1er. año 2do.

UNIDAD III: QUÍMICA

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide

La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz

La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la

La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración (a mayor

Instrumentación para la medición de absorbancias de la luz visible y ultravioleta:

La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos

1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones de

concentraciones altas la linealidad se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo

La representación de Lambert-Beer, nos permitirá calcular el valor del coeficiente de

Considerando que S es el testigo que se le conoce su concentración C, para calcular la

También podría gustarte