Curso Virtual “MICROBIOLOGÍA DE LAS INFECCIONES GASTROINTESTINALES: Abordaje de

infecciones gastrointestinales en el laboratorio de microbiología clínica”

MÓDULO II. VIROLOGÍA

Parte II
Diagnóstico virológico en gastroenteritis virales

Bioq. Juan Ignacio Degiuseppe, MPH

Laboratorio de Gastroenteritis Virales
Laboratorio Nacional de Referencia de Rotavirus y Norovirus
INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán
Presentación del contenido

Importancia del diagnóstico etiológico de certeza

Etapa preanalítica. Toma de muestra. Consideraciones generales

Etapa analítica. Técnicas inmunoenzimáticas. Métodos moleculares. Conceptos básicos de validación y verificación de ensayos
moleculares in-house y comerciales. Paneles sindrómicos. Abordaje en casos aislados y en contexto de brotes. Interpretación de
resultados

Etapa posanalítica. Informe. Vigilancia epidemiológica y notificación al SNVS2.0

Algoritmos diagnósticos según tipo de paciente y recursos disponibles. Desafíos y recomendaciones

 UTILIDAD DEL DIAGNÓSTICO

Diagnóstico de certeza y pronóstico de la enfermedad diarreica a nivel individual

Optimización en el uso de antimicrobianos
Cohortización de pacientes positivos internados para evitar diseminación
Cortar la cadena de transmisión en casos de brote
Fines epidemiológicos: estudio de la prevalencia, estacionalidad y distribución en grupos etarios
Análisis de impacto de la vacunación en la carga de enfermedad asociada
PROCESO DIAGNÓSTICO – GASTROENTERITIS VIRALES

Observación en
fresco
(400X)

Enzimoinmunoensayos
Métodos moleculares Informe
Solicitud médica
 PROCESO DIAGNÓSTICO – GASTROENTERITIS VIRALES

Etapa preanalítica Etapa analítica Etapa posanalítica

Observación en
fresco
(400X)

Enzimoinmunoensayos
Métodos moleculares Informe
Solicitud médica
 PROCESO DIAGNÓSTICO – GASTROENTERITIS VIRALES

Etapa preanalítica Etapa analítica Etapa posanalítica

Observación en
fresco
(400X)

Enzimoinmunoensayos
Métodos moleculares Informe
Solicitud médica
Muestra de elección: MATERIA FECAL
Caso de diarrea aguda
(< 72 horas de inicio de
síntomas)

o Frasco de polipropileno de boca ancha

o Sin conservantes
o Sin medio de transporte
o Volumen mínimo: 500 ul
o Almacenamiento: hasta 7 días 2 – 8ºC (heladera)
mayor a 7 días -20ºC (freezer)
SOLICITUD MÉDICA Tipo y nro de DNI
Apellido/s y nombre/s
Fecha de nacimiento/Edad
Fecha de inicio de síntomas
Ambulatorio vs. Internado
(fecha y causa de internación)
Tratamiento actual
Información relevante
- estado inmunológico
- contactos sintomáticos
- alimentos consumidos
- antecedentes de viaje
SOLICITUD MÉDICA Tipo y nro de DNI
Apellido/s y nombre/s
Fecha de nacimiento/Edad
Fecha de inicio de síntomas
Ambulatorio vs. Internado
Agentes virales
(fechasolicitados
y causa de internación)
Tratamiento actual
Información relevante
- estado inmunológico
- contactos sintomáticos
- alimentos consumidos
- antecedentes de viaje
 PROCESO DIAGNÓSTICO – GASTROENTERITIS VIRALES

Etapa preanalítica Etapa analítica Etapa posanalítica

Observación en
fresco
(400X)

Enzimoinmunoensayos
Métodos moleculares Informe
Solicitud médica
ENZIMOINMUNOENSAYOS. INMUNOCROMATOGRAFÍA
Dirigido a distintos epitopes
Tiempo: 10-15 minutos
Sensibilidad / Especificidad: variable según agente viral y fabricante
Establecimientos de salud con guardia
Carece de controles positivos/negativos
Subjetividad del operador
Coinfecciones deben confirmarse por otros métodos
ENZIMOINMUNOENSAYOS. ELISA

Anticuerpos policlonales anti-VP6

Tiempo: 1 hora 30 minutos
Sensibilidad/Especificidad: 98%/98% (RVA)
Hospitales pediátricos
Método recomendado por OMS para diagnóstico
de rotavirus
MÉTODOS MOLECULARES. RT-PCR / PCR

• Alta sensibilidad y especificidad

• Formato convencional o en tiempo real

• Tiempo: 3-6 horas

Desarrollos
• Requiere de equipamiento específico in-house

• Requiere de personal entrenado

• Costoso y laborioso Equipos

comerciales
MÉTODOS MOLECULARES. RT-PCR / PCR
Desarrollos in-house

OPTIMIZACIÓN: desarrollo primario de un método

VALIDACIÓN: serie de acciones o actividades para establecer evidencia documentada de
que un proceso específico cumple en alto grado de desempeño con las especificaciones
predeterminadas y atributos de calidad para el uso previsto
Normas CLSI

EP05-A3: Evaluation of Precision of

Quantitative Measurement Procedures

EP12-A2: User Protocol for Evaluation of

Qualitative Test Performance
MÉTODOS MOLECULARES. RT-PCR / PCR
Equipos comerciales
VERIFICACIÓN: confirmación a través de evidencias objetivas, que el método cumple
con los requerimientos especificados para el uso previsto (en las mismas condiciones)
MÉTODOS MOLECULARES. RT-PCR / PCR
Equipos comerciales

Preparación de mezclas Extracción de ácidos Corrida en

de reacción nucleicos termociclador
MÉTODOS MOLECULARES. RT-PCR / PCR
Equipos comerciales

Vórtex
15 segundos

Pretratamiento Utilizar el sobrenadante para

(clarificación) realizar extracción de ácidos
nucleicos

15-20 minutos
Dilución 1:5 en solución
5.000-6.000 rpm
fisiológica estéril o PBS estéril (ej.
50 ul MF + 200 ul SF)
MÉTODOS MOLECULARES. RT-PCR / PCR
Equipos comerciales – plataforma automatizada

BD MAX Enteric Viral Panel

• Hasta 24 muestras en ~ 3 horas
Xpert® Norovirus
• Rotavirus/Norovirus/Adenovirus • 1 hora
entéricos/Sapovirus/Astrovirus • Norovirus
• Sencillo de operar • Sencillo de operar
MÉTODOS MOLECULARES. RT-PCR / PCR
PANELES SINDRÓMICOS
Sensibilidad 98,5% y Especificidad 99,2%
Detección de 22 patógenos en forma simultánea BioFire® FilmArray®
Gastrointestinal (GI) Panel
1.5 horas
200 ul de MF en Cary Blair
Desafío en jerarquización de codetecciones
Costo
 PROCESO DIAGNÓSTICO – GASTROENTERITIS VIRALES

Etapa preanalítica Etapa analítica Etapa posanalítica

Observación en
fresco
(400X)

Enzimoinmunoensayos
Métodos moleculares Informe
Solicitud médica
INFORME Datos de la institución/laboratorio
Fecha
Datos del paciente
Profesional solicitante

Estudio de agentes virales

Metodología
Resultado
- Enzimoinmunoensayos: Negativo/Positivo/Indeterminado
- Métodos moleculares: No detectable/Detectable

Observaciones/notas

Firma y matrícula del profesional del laboratorio

ABORDAJE DIAGNÓSTICO DE LAS GASTROENTERITIS VIRALES
 ABORDAJE DIAGNÓSTICO
-
GASTROENTERITIS VIRALES

Recursos
Paciente
disponibles

Prevalencia de
agentes virales
 ABORDAJE DIAGNÓSTICO
-
GASTROENTERITIS VIRALES

Recursos
Paciente
disponibles

Prevalencia de
agentes virales

Rotavirus ~ Norovirus > Adenovirus entéricos > Sapovirus > Astrovirus

 ABORDAJE DIAGNÓSTICO
-
- Edad
GASTROENTERITIS VIRALES
- <5 años
- 5-64 años
- >65 años
- Tipo de atención
- ambulatoria
- internación
Recursos - Severidad del cuadro
Paciente
disponibles - diarrea leve
- diarrea moderada/severa
- Estado inmunológico
- inmunocompetente
- inmunosuprimido
- Contexto del caso
Prevalencia de - esporádico
agentes virales - brote

Rotavirus ~ Norovirus > Adenovirus entéricos > Sapovirus > Astrovirus

 ABORDAJE DIAGNÓSTICO
-
- Edad
GASTROENTERITIS VIRALES
- <5 años
- 5-64 años
- >65 años
- Enzimoinmunoensayos - Tipo de atención
- Inmunocromatografía - ambulatoria
- ELISA - internación
- Métodos moleculares Recursos - Severidad del cuadro
Paciente
- RT-PCR / PCR disponibles - diarrea leve
- RT-qPCR / qPCR - diarrea moderada/severa
- Paneles sindrómicos - Estado inmunológico
- inmunocompetente
- inmunosuprimido
- Contexto del caso
Prevalencia de - esporádico
agentes virales - brote

Rotavirus ~ Norovirus > Adenovirus entéricos > Sapovirus > Astrovirus

Paciente INMUNOSUPRIMIDO

Virus Metodología/s

Rotavirus X RT-PCR, ELISA, ICT

Norovirus X RT-PCR

Adenovirus entéricos X PCR, ELISA, ICT

Sapovirus X RT-PCR

Astrovirus X RT-PCR
Paciente INMUNOCOMPETENTE - internado

Edad
Virus Metodología/s
< 5a 5-64a > 65a

Rotavirus X X RT-PCR, ELISA, ICT

Norovirus X X X RT-PCR

Adenovirus entéricos X X PCR, ELISA, ICT

Sapovirus X X RT-PCR

Astrovirus X X RT-PCR
Paciente INMUNOCOMPETENTE - ambulatorio

Edad
Virus Metodología/s
< 5a 5-64a > 65a

Rotavirus X RT-PCR, ELISA, ICT

Norovirus (contexto de brote) X X X RT-PCR

Adenovirus entéricos X PCR, ELISA, ICT

Sapovirus X RT-PCR

Astrovirus X RT-PCR
BROTES DE GASTROENTERITIS
Criterios clínico-epidemiológicos de Kaplan Criterios diagnósticos

• Vómitos en más de la mitad de los afectados RT-PCR

• Período de incubación de 24-48hs Al menos 1 positivo entre 2-4 testeados

Al menos 2 positivos en 5-10 muestras testeadas

• Sintomatología entre 12-60 hs

• Ausencia de enteropatógenos bacterianos en el ELISA:

coprocultivo 1 positivo en 2-6 muestras

Sensibilidad: 68%
2 positivos entre 7-11 muestras
Especificidad: 99%

Costantini, 2010
Notificación de las diarreas
Sistema Integrado de Información Sanitaria Argentina
El Sistema Integrado de información Sanitaria Argentina tiene como visión
general contribuir al fortalecimiento del Ministerio de Salud de la Nación y
los Ministerios de Salud Provinciales en su función de rectoría del sistema de
salud, así como a la mejora en la toma de decisiones, a partir de la
integración de la información, de todos los actores del sistema de salud.

Es un Sistema de información digital en el que los profesionales

de la salud de todo el país registran los casos de enfermedades
consideradas de “notificación obligatoria”

Las diarreas se notifican de forma obligatoria a través del

SNVS 2.0
Área de Vigilancia, Dirección Nacional de Epidemiología - MSAL
 La vigilancia de Enfermedades Transmitidas por
Alimentos, agua o ruta fecal-oral constituyen

Eventos de Notificación
Obligatoria
Resolución 2827/2022

https://www.argentina.gob.ar/salud/epidemiologia/eventos-
de-notificacion-obligatoria

Área de Vigilancia, Dirección Nacional de Epidemiología - MSAL

Área de Vigilancia, Dirección Nacional de Epidemiología - MSAL
Notificación de las diarreas
Notificación clínica
Cantidad de casos Por semana Por grupo de edad
Consiste en el registro de todos los casos asistidos durante una semana que se correspondan con la
definición de caso

Definición de caso
Caso de Diarrea aguda
Deposiciones aumentadas en número y cantidad con menor consistencia que puede o no contar con
identificación del agente etiológico por laboratorio.

Registro de Sinónimos diagnósticos

consultas, Gastroenteritis con o sin deshidratación; Enterocolitis; GEA - Gastroenteritis aguda; GEC -
Gastroenterocolitis; EDA - Enfermedad diarreica aguda; Diarrea aguda; Diarrea acuosa; Colitis; Disentería;
emergencias o Sindrome diarreico.
internación

Área de Vigilancia, Dirección Nacional de Epidemiología - MSAL

Vigilancia epidemiológica de agentes etiológicos

Notificación por laboratorio

Diarreas virales Cantidad de muestras
Por agente etiológico Por semana
Diarreas bacterianas estudiadas y positivas

Se realiza la vigilancia por laboratorio en los casos cuyo estudio es indicado

por el médico tratante.

La vigilancia por laboratorio de las diarreas es útil para monitorear la

circulación de agentes etiológicos de las diarreas.

Área de Vigilancia, Dirección Nacional de Epidemiología - MSAL

Notificación de las diarreas sanguinolentas y
diarreas por STEC

Notificación nominal inmediata

Diarreas agudas Diarreas agudas por Diarreas causadas por agentes de transmisión alimentaria
sanguinolentas STEC capaces de generar brotes

Ante la sospecha A través de la vigilancia por red de laboratorios de diarreas

Ante la confirmación
clínica bacterianas y gastroenteritis virales

Definición de caso
Caso de Diarrea aguda Sanguinolenta (DAS)
Paciente que presenta en forma aguda, con duración menor a 14 días, deposiciones
aumentadas en número y cantidad, con menor consistencia, con sangre, con o sin moco, con
o sin fiebre, dolor cólico o abdominal.

Área de Vigilancia, Dirección Nacional de Epidemiología - MSAL

Sospecha de brote
Podría encontrarse ante un brote si se tiene un número inusual de casos de diarrea aguda y los pacientes
presentan las siguientes características en común:

Tienen síntomas clínicos similares Se encuentran en un ámbito espacial Han comido los mismos alimentos y/o
definido (instituciones cerradas, comparten la misma fuente de agua
escuelas, clubes, etc)

¿Qué hacer cuando se sospecha de un brote?

Dar aviso a la Informar y notificar Investigar la existencia de otros casos Iniciar el Recomendar
autoridad local inmediatamente en el área programática del tratamiento medidas de
establecimiento de salud de los casos prevención

Área de Vigilancia, Dirección Nacional de Epidemiología - MSAL

Síntesis

El diagnóstico etiológico en determinados casos es crucial para el correcto manejo del paciente y para evitar brotes
Los métodos moleculares representan el método de elección para la mayoría de los enteropatógenos virales
El abordaje diagnóstico debe establecerse de acuerdo a la evaluación simultánea de la prevalencia de los agentes virales, el
tipo de paciente y las metodologías disponibles
La vigilancia epidemiológica constituye uno de los aspectos fundamentales para el diseño de políticas y la implementación de
estrategias para la prevención y control de las diarreas agudas
“El que quiere, busca. El que busca, encuentra”
(no aplica para dinero, llaves, celulares ni controles remotos)

Curso Virtual “MICROBIOLOGÍA EN LAS INFECCIONES

GASTROINTESTINALES: Abordaje de infecciones gastrointestinales en el
laboratorio de microbiología clínica”

¡Muchas gracias!

Bioq. Juan Ignacio Degiuseppe, MPH

[email protected]