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    Protocolo Tissue Microarray

    Integrantes:Tamara Orellana, Judit Ponce, Agustin Salvo, Brandon Troncoso


    Docente: Alejandra Velásquez Palma
    Asignatura: Gestión y garantía calidad en salud
    Introducción:
    Los microarrays, son herramientas que se utilizan para analizar el nivel de expresión
    de miles de genes a la misma vez, el cual su funcionamiento básico es el uso de
    sondas que se hibridan con muestras que contienen ADN o ARN, proveniente de
    células o tejidos.
    Existen diversos tipos de Microarray como el Tissue Microarray (TMA) o microarray
    de tejido, el cual contiene varias pequeñas muestras representativas sacadas de
    tejidos el cual todas las muestras están contenidas en un solo portaobjetos, es
    permite un análisis simultáneo de todas las muestras a nivel histológico, el cual
    podemos analizar su expresión a nivel molecular observando su ADN o ARNm,
    también su expresión proteica o su reacción antígeno/anticuerpo, el cual el último se
    puede hacer a través de la inmunohistoquímica (IHQ). El uso que se le da este tipo
    de microarray dependerá del objetivo del que lo realice, ya que se puede aplicar
    para la validación de nuevos test, fármacos, incluso para direccionar tratamientos,
    pero su principal aplicación es en la investigación de cáncer, esto para buscar
    nuevos marcadores que ayuden a pronosticar y diagnosticar.
    Al ser el TMA ayuda para pronosticar el cáncer, es importante una correcta
    realización de este tipo microarray, ya que se necesitan muestras específicas que
    estén fijadas e incluidas en parafina previamente, por ello el objetivo de este informe
    es la preparación de este microarray de modo convencional, con el fin de que el
    microarray realizado se haga una IHQ usando el anticuerpo HER2, porque es una
    proteína que se encuentra elevada en algunos cánceres pero sobre todo en el
    cáncer de mama, por lo cual estaremos usando muestras de mama previamente
    adquiridas.
    Desarrollo:
    Somos un laboratorio de Anatomía Patológica (APA) el cual se encuentra en el
    centro de la ciudad el cual está asociado con 4 hospitales de los alrededores, por
    ello nos llegan diariamente ciento de muestras, pero principalmente muestras de
    mama las cuales muchas veces al hacer su lámina con tinción de hematoxilina
    eosina (H/E), observamos cambios morfológicos que nos dan indicios de un posible
    cáncer por lo cual necesitamos un marcador que nos ayude en su diagnóstico, por
    ello seleccionamos el anticuerpo HER2 que es una tirosina quinasa unida a la
    superficie de la membrana celular y normalmente participa en las vías de
    transducción de señales que conducen a la célula y que en el cáncer de mama está
    sobre expresado, además también puede ser usado para direccionar el tratamiento.
    Por esto dicho anteriormente se realizará un protocolo de la realización de un tissue
    microarray convencional con muestras procesadas e incluidas en parafina de mama
    con sus correspondientes controles positivos y negativos, a las cuales ya hecho el
    Microarray se le realizará una inmunotinción con el anticuerpo HER2, porque
    queremos ver su capacidad de diagnosticar el cáncer de mama.

    Necesitaremos los siguientes materiales:


    ➢ 60 muestras que deben estar fijadas en formalina tamponada al 10% e
    incluidas en parafina (FFPE), las cuáles 48 son muestras de mama, 6 son
    controles positivos correspondiente a carcinoma de mama, y 6 son control
    negativo el que corresponde a muestras de mama normal.
    ➢ Rotulador o marcador
    ➢ 1 casete
    ➢ Pinzas
    ➢ Molde para TMA de 3 mm para 60 núcleos
    ➢ Punzón de tejido de 3 mm
    ➢ Molde metálico para parafina de 37x2x5 mm
    ➢ Portaobjetos
    ➢ Anticuerpo HER 2 neu
    Además tendremos que usar los siguientes equipos: Centro de inclusión, platina fría,
    microscopio, microtomo, baño de flotación, estufa.
    Preanalítica:
    1. Selección de muestras: Las muestras no
    fueron elegidas al azar, ya que al trabajar
    con 4 hospitales necesitamos tener todo
    en orden, por ello seleccionamos 12
    muestras cada hospital, las cuales llevan
    almacenadas hace 5 años, están FFPE,
    su fijación tiene un mínimo de 12 horas,
    cuenta con los datos del paciente, médico
    la información está asociado un código y
    el diagnóstico previo el cual debe
    corresponder a cáncer de mama, además
    tiene que tener su H/E intacta, ya que nos
    ayudará como guía, de donde se debe
    puncionar. Las muestras control fueron pedidas las cuales especifican que
    tienen más de 12 horas de fijación y que son perfectas para la realización de
    IHQ.

    2. Elegir zona de interés: Mirar al microscopio la H/E de cada muestra y con un


    marcador, al encontrar una zona representativa del cáncer (o donde se
    sospecha del mismo) marca en el bloque y lamina de H/E.

    Precaución: Una mala marcación, puede producir por un incorrecto


    punteado de la muestra si seleccionamos mal, lo que por consecuencia
    puede agotar la muestra.
    Analitica:
    3. Realización del Bloque de TMA. Poner el molde en el centro de inclusión y
    llenarlo de parafina, para luego poner el casete encima con las pinzas, dejar
    inmediatamente enfriar en la platina fría, para luego desmoldarlo y obtener el
    bloque de TMA. Este luego debe dársele un código para poder archivarlo al
    finalizar.
    Precaución: Revisar que no existan agujeros o grietas en el bloque,
    causados por burbujas o mal enfriamiento.

    4. Extracción de núcleo de los bloques, ya elegido la zona representativa con el


    punzón extraemos donde se marcó, para luego colocarlos núcleos de forma
    ordenada, donde cada hospital tiene 2 filas, y las últimas dos filas
    corresponde a los controles, la penúltima fila los controles negativos, y la
    última los controles positivos

    5. Reinclusion (opcional): Poner en el molde metálico el bloque de TMA para


    ponerlo en la estufa que debe estar a 70° C por unos 15 minutos, pero que no
    se derrita por completo la parafina, hacer una inclusión con el propósito de
    que todas las piezas estén al mismo nivel. Otro método es con un porta
    objetos presionando el bloque para alinear los cilindros y nivelar la superficie,
    dejarlo en una superficie recta es calentar un portaobjetos a 70°C y utilizarlo
    sobre el del bloque para derretir un poco la parafina y poder despegarlo sin
    dañar los cilindros, luego dejar a temperatura ambiente.
    1 2

    Precaución: En el caso de la reinclusion se puede producir lo que se


    muestra en la imagen, donde en la primera imagen se ve como se desprende
    el casete al tratar de sacarlo del molde, esto sucede por falta de parafina, o
    en el caso 2 que por un vertido fuerte de la parafina desordenen las muestras
    e incluso las ponga de forma vertical.
    6. Corte: Cuando el bloque de inclusión esté listo para ser usado se debe tener
    el baño de flotación preparado, con especial cuidado de que este no presente
    burbujas y que tenga una temperatura óptima que ronde los 40 grados. el
    portaobjetos bien rotulado debe presentarse silanizado para que el tejido esté
    adherido de manera adecuada y así realizar tinciones inmunohistoquímicas
    posteriores, se debe usar así mismo una navaja que no presente melladuras.
    todo esto para realizar un corte continuo y de buena calidad que al menos
    tenga 3 micrómetros de ancho.
    Precaución:Pérdida de núcleos→Se produce tras efectuar un gran número de cortes
    en el bloque y que no cumplan con el grosor recomendado. Es importante seleccionar
    bloques con el mayor grosor posible (mínimo 3 mm) para poder obtener un núcleo de
    grosor suficiente. En casos de que no se pueda tomar una muestra de 3 mm se puede
    intentar realizar un cilindro vertical al tejido teniendo más área de trabajo, además
    evitar el desgaste de la muestra.
    - Rotura del bloque →El error más grave que nos puede suceder al momento de cortar
    el bloque en el microtomo es que este se fraccione lo cual se debe a la manipulación
    incorrecta del mismo por consecuencia la pérdida del bloque. Es importante ser muy
    cuidadoso en el momento de efectuar los cortes del bloque, ya que se usan muestras
    de minúsculo tamaño.
    7. Realizar una H/E antes de la IHQ

    H: Hospital
    C: Control

    H1
    H2
    H3
    H4 -
    C +

    8. Pruebas inmunohistoquímicas:
    ● Realizar proceso de desparafinación hecha con xilol, hidratación en
    alcoholes de forma descendente de 100% al 70%, hasta llegar al agua
    destilada
    ● Recuperación antigénica con solución de Buffer EDTA o Citrato, la
    cual pondremos en un coplin dentro de una en olla a presión durante
    15 minutos a 150 °C y lavar con PBS
    ● Realizar bloqueo de peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno
    al 3% por 20 min y lavar con PBS
    ● Bloqueo de uniones inespecíficas usando suero de caballo por 20 min
    no lavar.
    ● Incubación de HER-2/neu durante 45 minutos a 60°C y lavar con PBS
    ● Amplificar con polímero por 30 min y lavar con PBS
    ● Usar DAB por 3 min y lavar con abundante agua corriente
    ● Hematoxilina por 1 min y dejar azular en agua corriente por 3 min
    ● Deshidratar con alcoholes ascendentes del 70 al 100, pasar por xilol y
    montar.
    Precaución: Mantener el frío del anticuerpo y polímero, revisar el database
    dependiendo de la marca puede que cambien los tiempos.
    Post analitica:
    1. Transcripción o redacción del informe de resultado, el cual nos dio que la IHQ
    con HER2 en TMA en su mayoría dieron positivo en un 95%, los controles
    positivos marcaron y los negativo no por lo cual la técnica fue bien hecha.
    2. Entregar el informe redactado al patólogo / médico.
    3. Almacenar los portaobjetos y bloques de tejidos sobrantes donde estaba
    anteriormente .
    4. El tissue microarray se guarda después que se le haga un archivo con el
    número o código que se le asignó, el cual contiene los códigos de las
    muestras usadas de forma ordenada, el día que se realizó, quien lo hizo, qué
    procedimientos se hicieron, y sus resultados.
    5. Mantener la trazabilidad correspondiente de las muestras sobrantes y
    resultados, ya sea si se mantienen en el laboratorio o si serán derivadas a
    otro.
    Bibliografía:
    ● Tecnología de microarrays (chips de ADN o ARN). (2024). Genome.gov.

    https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Tecnologia-de-microarrays

    ● Moreno, V., & Solé, X. (2004). Uso de chips de ADN (microarrays) en

    medicina: fundamentos técnicos y procedimientos básicos para el análisis

    estadístico de resultados. Medicina Clínica, 122, 73–79.

    https://www.elsevier.es/es-revista-medicina-clinica-2-articulo-uso-chips-adn-

    microarrays-medicina-13057538

    ● Gelabert Mas, A., & Rioja Sanz, L.A.. (2003). El Microarray Tisular (TMA):

    una nueva y poderosa herramienta para la investigación clínico-molecular al

    servicio de la Urología. Actas Urológicas Españolas, 27(1), 1-2. Recuperado

    en 20 de marzo de 2024, de http://scielo.isciii.es/scielo.php?

    script=sci_arttext&pid=S0210-48062003000100001&lng=es&tlng=es

    ● Jawhar N. M. (2009). Tissue Microarray: A rapidly evolving diagnostic and

    research tool. Annals of Saudi medicine, 29(2), 123–127.

    https://doi.org/10.4103/0256-4947.51806

    ● (2024). Patologia.es. http://www.patologia.es/volumen39/vol39-num1/39-

    1n03.htm

    ● neu, H.-2. (2019). PI2040ES - HER-2 neu (RBT-HER2).pdf. Google Docs.

    https://drive.google.com/file/d/1mcMraPChNUYrAf4KE-H4oo87UjbiNDX5/

    view

    ● HER2/neu Antibody 1. Intended Use. (n.d.). Retrieved March 20, 2024, from

    https://www.genomeme.ca/docs/datasheets/Her2%20IHC042%20CE

    %20Mouse%20.pdf
    ● Tissue Microarrays. (2024). Novus Biologicals.

    https://www.novusbio.com/tissue-microarrays

    ● Manual construction of a tissue microarray (TMA) with a 2 mm core... (2023).

    ResearchGate; ResearchGate. https://www.researchgate.net/figure/Manual-

    construction-of-a-tissue-microarray-TMA-with-a-2-mm-core-diameter-A-A-

    sheet_fig1_247772391

    ● Tissue Microarrays at Johns Hopkins – The Pathology Blog. (2010, May 21).

    Jhu.edu. https://blogs.pathology.jhu.edu/pathology/tissue-microarrays

    ● Eyre, J. (2018). How To Create A Tissue Microarray Block [YouTube Video].

    In YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=wPA2LEAqxuo

    ● Tissue Microarray Mold Kits. (2024). Tedpella.com.

    https://www.tedpella.com/histo_html/tissue-microarray-kits.aspx

    ● [email protected]. (2024). V Congreso Virtual Hispanoamericano de

    Anatomía Patológica. Uninet.edu.

    https://conganat.uninet.edu/conferencias/C017/index.html

    ● Eyre, J. (2011). Preparing a Tissue Microarray for Cutting Vol. 3 [YouTube

    Video]. In YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=w-NSfBDtTm4

    ● Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjöstedt, E., & Fredrik Pontén. (2018).

    Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and

    Digitalization Within the Human Protein Atlas. Jove.com.

    https://www.jove.com/es/t/3620/production-tissue-microarrays-

    immunohistochemistry-staining?language=Spanish

    ● Wisner, L., Larsen, B., & Maguire, A. (2022). Manual Construction of a Tissue

    Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer. Jove.com.


    https://www.jove.com/es/t/63086/manual-construction-tissue-microarray-

    using-tape-method-handheld?language=Spanis

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