GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Microbiología Ambiental
PRÁCTICA No. 5
METODOS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO
DOCENTE PERÍODO ACADÉMICO
Diana Vela Aparicio 2024-2

PRÁCTICA DE LABORATORIO No. 5

METODOS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO

1. INTRODUCCIÓN

Las técnicas de inoculación o siembra de microorganismos en medios de cultivo hacen parte de las
habilidades que los ingenieros ambientales en formación deben adquirir para poder diagnosticar la
presencia de microorganismos en muestras de agua y suelos. Igualmente, el reconocimiento del
crecimiento microbiano en medios generales y selectivos permitirá evaluar adecuadamente
impactos ambientales y rutas de acción para enfrentar dichos problemas.

2. OBJETIVOS

2.1. Desarrollar habilidades en las técnicas de siembra o inoculación en diferentes medios de

cultivo (sólidos y líquidos)

2.2. Identificar el crecimiento de Escherichia coli, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae

en medios genéricos como el caldo nutritivo y agar Tripticasa de soya (TSA).

2.3. Comparar el crecimiento de Escherichia coli y Staphylococcus aureus en medios selectivos

y diferenciales como el agar MacConkey.

3. MARCO TEÓRICO
El cultivo de microorganismos en el laboratorio se realiza en medio de cultivo líquidos o sólidos,
que contienen los nutrientes necesarios para su crecimiento como agua, nutrientes orgánicos
(carbohidratos, aminoácidos, etc.), nutrientes inorgánicos (nitrógeno, fosforo, magnesio, calcio,
azufre). Algunos componentes alternativos pueden ser factores de crecimiento (vitaminas),
isosmotizantes (NaCl), agente gelificante (agar-agar), tampones, colorantes, indicadores de pH,
etc. Los medios de cultivos pueden clasificarse según su composición química o función, como se
muestra en la figura 1.

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 Figura 1. Tipos de medios de cultivo

Algunos medios, como el agar Tripticasa de soya (TSA) y el caldo nutritivo permiten el crecimiento
de una gran diversidad de microorganismos. Otros en cambio, como el agar MacConkey se utilizan
para la selección de determinados grupos de organismos, como bacterias coliformes. También
existen medios de cultivo específicos para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas o
bioquímicas.

Adicionalmente, la siembra en estría sobre un medio sólido permite aislar colonias de un tipo de
microrganismos que están en una población mixta, como sucede en muestras de agua o suelo, de
forma que se puede obtener cultivos puros después de varias resiembras para obtener cultivos
puros. pasos

4. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y MATERIALES

Reactivo Cantidad
TSA (agar Tripticasa de soya) 2 cajas por grupo
agar MacConkey 1 caja por grupo
agar Sabourand 1 caja por grupo
caldo nutritivo 2 tubos por grupo
Cultivo celular de E. coli, Bacillus subtillis,
1 tubo y caja por grupo
Staphylococcus aureus y Saccharomyces cerevisiae
Material / Equipo Cantidad
Asa bacteriológica 1 por grupo
Mechero de Bunsen 1 por grupo

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5. PROCEDIMIENTO

5.1. ESTERILIDAD DEL AREA DE TRABAJO

1. Use los elementos básicos de protección personal que se requieren para el trabajo con
cepas bacterianas guantes, bata de laboratorio, guantes (de látex, vinilo o nitrilo) y
tapabocas.

2. Limpie el mesón con alcohol antiséptico, encienda el mechero y regule la llama.

3. Para mantener el área de trabajo estéril durante la siembra de las muestras se utilizará el
mechero de bunsen (se pueden utilizar dos mecheros o tres mecheros). El calor genera
que el aire se caliente alrededor y circule por convección, produciendo así un área estéril
(aproximadamente 15 cm en cualquier dirección desde la flama):

Figura 2. Esterilidad mediante calor seco con mechero

Imágenes tomadas de https://www.jove.com/es/t/3064?language=Spanish

5.2. TOMA DE LA MUESTRA EN MEDIO SÓLIDO Y SIEMBRA EN MEDIO SÓLIDO

1. Marque las cajas de medio sólido con el nombre del microorganismo que va a sembrar en
él de acuerdo con la siguiente tabla:
Medio Microorganismo
Agar TSA Bacillus subtilis (B. subtilis)
Agar TSA Escherichia coli (E. coli)
Agar Sabourand Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)
o Candida albicans (C. albicans)
2. Esterilice el asa bacteriológica en el mechero: Poner en la llama hasta que el asa se ponga
roja y luego dejar enfriar por unos segundos.
3. Ubíquese cerca del mechero, abra la caja de uno de los cultivos preparados previamente
de B. subtilis, E. coli, S. cerevisiae o C. albicans y tome una muestra de una colonia
(inóculo) con el asa bacteriológica.

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 4. Siembre el inóculo en un costado de la caja de medio sólido que le corresponda (TSA, agar
Sabourand) y extienda la muestra siguiendo un patrón de zigzag según la técnica de
agotamiento por estría o siembra en estría en agar (Figura 3).
5. Esterilice el asa de siembra y enfríela en el agar. Repita la extensión de la muestra
partiendo de la estría realizada previamente hasta cubrir la superficie del medio.
6. Colocar las cajas en la incubadora con la tapa hacia abajo a 30°C durante 24 a 48 horas.
Revisar su crecimiento al pasar ese tiempo.

Figura 3. Método de siembra en estría o por agotamiento

5.2 TOMA DE MUESTRA EN MEDIO LÍQUIDO Y SIEMBRA EN MEDIO SÓLIDO

1. Trace una línea en la base de la caja de medio agar MacConkey de forma que divida en dos
la caja y marque una mitad como E. coli y la otra con S. aureus (Staphylococcus aureus).
2. Esterilice el asa en el mechero
3. Ubíquese cerca del mechero, destape uno de los tubos con un cultivo líquido preparado
previamente de E. coli o S. aureus y flamee la boca del tubo.
4. Introduzca el asa sin tocar las paredes del tubo y póngala en contacto con el cultivo líquido
5. Retire el asa, flamee el tubo y tápelo como se observa en la Fig 4.
6. Siembre el inóculo en el asa en la mitad de la caja de agar MacConkey que le corresponda
y extienda la según la técnica de agotamiento por estría o siembra en estría en agar descrita en
la Fig 3.
7. Repita el procedimiento con el otro cultivo líquido.
8. Coloque la caja en la incubadora con la tapa hacia abajo a 30°C durante 24 a 48 horas.
Revisar su crecimiento al pasar ese tiempo.

Fig 4. Toma de muestra desde cultivo líquido

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 5.3. TOMA DE MUESTRA EN MEDIO SÓLIDO Y SIEMBRA EN MEDIO LÍQUIDO
1. Marque dos tubos con caldo nutritivo estéril: Uno con E. coli y otro con B. subtilis
2. Esterilice el asa bacteriológica en el mechero y tome con ella un inóculo o muestra de
bacterias (colonia) de los cultivos sólidos preparados previamente de B. subtilis o E. coli, teniendo
cuidado con mantener la esterilidad.
3. Destape el tubo del medio líquido y flamee la boca del tubo
4. Introduzca el asa sin tocar las paredes del tubo y póngala en contacto con el caldo
nutritivo
5. Mueva el asa hasta que observe que el inóculo quede suspendido en el caldo. Flamee la
boca del tubo y tápelo.
6. Esterilice el asa
7. Repite el procedimiento para el otro cultivo e incube los tubos a 35°C

6. DATOS, OBSERVACIONES Y CÁLCULOS

Tras 24-48 h de incubación observe si hubo crecimiento y describa las características del
crecimiento microbiano en los medios sólidos y líquido en la siguiente tabla.

Microorganism Medio de cultivo Descripción crecimiento

o

Para el medio líquido indique la forma del crecimiento: suspensión, grumos, hilos.

Para el medio sólido indique si se formaron estrías, si hay colonias aisladas; describa el color,
forma, consistencia (dura, suave, elástica), aspecto (opaco, brillante), forma del borde y elevación
de las colonias. Tenga en cuenta la siguiente figura para la descripción de las colonias:

Figura 5. Morfología de colonias microbianas. Tomada de https://www.lifeder.com/morfologia-colonial-bacteriana/

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 7. REFERENCIAS

 L. Vega, LA Cuéllar y W.B. Borda (2022) Guía de prácticas de laboratorio de microbiología

ambiental. Ediciones Usta, Universidad Santo Tomás
 Bonilla Salinas M., Silvia Pajares S., Vigueras G., Sigala JC., Le Borgne S. (2016) Material
Didactico-Manual de Practicas de Microbiología Básica. División de Ciencias Naturales E
Ingeniería. Universidad Autónoma Metropolitana.
 https://www.lifeder.com/morfologia-colonial-bacteriana/
 https://learn.chm.msu.edu/vibl/vibl/StreakPlate/streak_plate_HTML5Canvas.html