TEMA 5: CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN

INTRODUCCIÓN
La ingeniería genética es el área de la genética aplicada donde se llevan a cabo métodos, técnicas y
procedimientos de manipulación de ácidos nucleicos (tanto ADN como ARN), destinados al
aislamiento y la caracterización de dichas moléculas, subrayando que la clonación y secuenciación
se consideran esenciales en dicha ciencia.
Literalmente, clonar es el acto de obtener dos copias genéticamente idénticas, es decir, es el proceso
mediante el cual se obtiene un clon. De acuerdo con Alberts, B., et al. (2008), en Biología
Molecular el término clonación de ADN puede ser usado en dos sentidos.
En su primera acepción se trataría de copiar ADN para dar como resultado dos moléculas de
material genético completamente iguales. En el segundo caso, el concepto clonación de ADN o de
genes posee connotaciones puramente procedimentales, ya que todo lo referente a ello indica los
métodos usados en el laboratorio para generar copias idénticas de un determinado segmento de
ácido nucleico. Concretamente se trata de la inserción de un segmento polinucleotídico en otro
fragmento de ácido nucleico que posee ciertas particularidades.
Las moléculas de ácido nucleico resultantes son denominadas moléculas de ADN recombinante. Por
tanto, la tecnología del ADN recombinante alberga las técnicas que periten aislar un gen de un
organismo para posteriormente insertarlo en otro diferente donde se lleva a cabo la copia de dicho
material.
Para concluir el estudio del material genético, tras la clonación de los fragmentos diana de ADN es
posible llevar a cabo el análisis de la secuencia de nucleótidos que lo constituyen. La llamada
secuenciación es el proceso experimental donde se determina el orden preciso de
nucleótidos que forman parte de una molécula de ADN y/o ARN, es decir, se determina la
estructura primaria de un polinucleótido.
Finalmente, hay que destacar que desde el desarrollo y la evolución en las últimas décadas de
dichos métodos moleculares se vislumbran multitud de aplicaciones prácticas en campos como el
diagnóstico de enfermedades y la medicina legal.
1. CLONACIÓN
La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN basada en la
tecnología del ADN recombinante. Esta tecnología permite crear moléculas de ADN recombinante
que serán introducidas en una célula huésped. Posteriormente, estas células en cultivo se
multiplicarán y se obtendrá multitud de copias del ADN recombinante y en consecuencia del
fragmento amplificado de interés. Los participantes en este proceso son:
 ADN exógeno (gen). También se denomina inserto. Es la molécula o segmento
polinucleotídico que se desea clonar. Su origen es variopinto, desde síntesis química, hasta
simplemente aislamiento de ADN genómico.
 Vector de clonación. Molécula de ácido nucleico usada para transportar el ADN exógeno
hasta la célula huésped (ej. plásmido) .Esta se une al ADN exógeno para que se pueda
producir la transferencia e inserción en el ADN de la célula huésped. La molécula resultante
de la unión del ADN exógeno con el vector de clonación se denomina ADN recombinante.
 Célula huésped: Célula eucariota o procariota
encargada de recibir el ADN recombinante y
conservarlo, además de llevar a cabo su amplificación
y expresión mediante el uso de su maquinaria
molecular, es decir, sus propios sistemas bioquímicos
y genéticos. Si se hace efectiva la replicación del
ADN inserto esta célula es denominada célula recombinante.
1.1. Vectores de clonación
Un vector de clonación es una molécula de ADN, a la cual se une el ADN exógeno para que se
pueda producir la transferencia e inserción en el ADN de la célula huésped, es decir, es la vía usada
para la inserción. Además, se encarga de facilitar la replicación del ADN exógeno y su posterior
propagación.
Las propiedades de los vectores para que el proceso de clonación
sea exitoso son:
 Capacidad de replicación activa en la célula huésped.
 Tamaño adecuado para la manipulación.
 No modifica el ADN de la célula huésped.
 Posee lugares de restricción, es decir, secuencias de corte
reconocidas por endonucleasas
 Posee marcadores de selección que permiten la selección
positiva de las bacterias transformantes en medios de
cultivo específicos.
En la actualidad existen multitud de vectores de clonación. Los
más utilizados en ingeniería genética son:

1.2. Células hospedadoras

Se introduce el vector de clonación para su amplificación mediante replicación. Tipos:
a) Células hospedadoras bacterianas
Son las células más ampliamente utilizadas como hospedadoras para clonar plásmidos por la
escasa complicación que supone su manipulación, aportan versatilidad y rapidez. La bacteria
más utilizada es E. coli en concreto la cepa K12, aunque también se utilizan otras especies
como Bacillus subtilis y especies del género Streptomyces.
b) Células hospedadoras eucariotas
Células vegetales y animales: su uso está más encaminado a la inserción de genes extraños
en el genoma de la célula hospedadora y su posterior expresión para obtener organismos
transgénicos.
Ejemplo en las células vegetales: plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens.
Ejemplo en animales: uso de vectores víricos como que infectan células de insecto o
retrovirus que infectan células de mamífero.
Levadura como: S. cerevisiae
1.3. Etapas de la clonación del ADN recombinante
La clonación del ADN es un proceso que presenta cuatro fases importantes.
1. Construcción del ADN recombinante. El ADN recombinante se construye mediante la
utilización de endonucleasas. Estas cortan el ADN por lugares específicos y con ayuda de
las ADN ligasas se unirán al vector (inserción) formando parte de éste y constituyéndose lo
que se denomina ADN recombinante.
2. Transferencia del ADN a la célula huésped. La célula huésped utilizada en el proceso de
clonación puede ser una célula bacteriana o una célula eucariota. Si se utiliza una célula
bacteriana, el proceso de transferencia del ADN a su interior se le denomina transformación,
 mientras que si lo que se utiliza es una célula eucariota, al proceso de transferencia de ADN
a su interior se le denomina transfección. Existen diferentes métodos para conseguir que el
ADN recombinante sea transferido al interior de la célula huésped, por ejemplo:
◦ Transformación por choque térmico: El ADN
recombinante pasa al interior de la célula bacteriana
mediante el aumento de la temperatura del medio, pero para
que sea posible las células bacterianas han sido tratadas
previamente con iones metálicos que alteran su pared
celular, favoreciendo la entrada del ADN con el choque de
temperatura.
◦ Transformación por liposomas o lipofección: El ADN
recombinante entra en la célula bacteriana utilizando
vesículas lipídicas que contienen el ADN recombinante.
Éstas se fusionan con la membrana plasmática de la célula
bacteriana mediante la fusión de las membranas.
◦ Infección por bacteriófagos o virus: El ADN recombinante es transferido a la célula
huésped por el propio sistema de infección del virus sobre la célula, facilitando así el
paso del ADN recombinante al interior de la célula huésped y su integración en la misma.
Este proceso se denomina transducción.
◦ Electroporación: Se consigue la entrada e
integración del ADN recombinante en la célula
huésped por la alteración de la envoltura celular
de la misma generada por una serie de descargas
eléctricas ejercidas.
◦ Microinyección: El ADN recombinante se
introduce en la célula huésped mediante el uso
de microjeringas/microagujas.
3. Selección de las células huésped. Se seleccionan las células transformantes (que han
incorporado de forma efectiva y real el ADN recombinante). Para ello, se cuenta con la
ayuda de los marcadores de selección. Estos marcadores suelen ser genes de resistencia a
antibióticos o enzimas para el metabolismo de determinados analitos, que se han introducido
en la secuencia del vector de clonación. De esta forma,
las células que no hayan transferido a su interior el ADN
recombinante morirán o no se dividirán en presencia del
antibiótico, seleccionando las células donde se haya
producido crecimiento para hacer resiembras y obtener
cultivos que contengan únicamente células con el ADN
recombinante.
4. Construcción de Genotecas. o bibliotecas de ADN, son conjuntos representativos de ADN
recombinante que se almacenan para utilizarse a posteriori de forma rutinaria en diferentes
procesos de clonación o secuenciación, así como para diversas técnicas de ingeniería
genética. Existen fundamentalmente dos tipos de
Genotecas:
◦ Bibliotecas genómicas: son colecciones de
vectores recombinantes clonados que incluyen
el genoma completo de un organismo.
◦ Bibliotecas cromosómicas: bibliotecas de
ADN construidas a partir de un único
cromosoma.
◦ Bibliotecas de ADNc: se construyen a partir de
ARNm de un tejido o una población celular
 determinada, previa transcripción inversa con una retrotranscriptasa
Imagen → proceso completo de clonación del ADN, usando plasmidos como vector de clonación
¡A recordar!
Las endonucleasas son enzimas de restricción que tienen la capacidad de cortar los enlaces fosfato
del material genético. Conocen y cortan secuenciasmás o menos específicas en regiones internas de
la molécula, denominándose esa secuencia de reconocimiento, sitio de restricción.
La utilidad de las enzimas de restricción en el área de la ingeniería genética es:
 Fragmentar el ADN genómico para la separación por electroforesis y su uso en técnicas
como el Southern blot o el Northern blot.
 Generar fragmentos para ser clonados en los vectores de clonación apropiados.
Al cortar las dos cadenas que forman la molécula de ADN, pueden
producir dos tipos de corte: COHESIVOS y ABRUPTOS.
a) Los cortes cohesivos. cortes escalonados, dejan extremos
complementarios o cohesivos libres, convirtiéndose en
lugares donde insertar con facilidad otro fragmento de ADN,
o que dicho fragmento se inserte con facilidad.
b) Los cortes abruptos. cortes simétricos que generan extremos
ciegos o romos, ya que la enzima corta la doble hebra por el
mismo lugar. Por ello, la inserción del ADN exógeno no es
muy fácil en ese tipo de extremo

2. SECUENCIACIÓN GENÓMICA
La secuenciación genómica es el proceso mediante el cual se establece el orden exacto de los
nucleótidos que forman una secuencia concreta de ADN o ARN, se representa por las bases
nitrogenadas que portan. Éste, permite:
 Conocer los sitios exactos de corte de las enzimas de restricción.
 Estudiar las diferentes variantes nucleotídicas normales de un determinado gen, así como las
secuencias mutacionales del mismo, pudiendo determinar así la naturaleza de la alteración
en la cadena de ácido nucleico.
 Identificar los exones y los intrones de los genes, es decir, regiones codificantes o no
codificantes.
  Predecir la proteína codificada por cada gen.
2.1. Métodos de secuenciación de ADN
Se identifican diferentes métodos para la secuenciación del ADN, éstos son:
 Métodos de Maxam y gilbert de secuenciación química del ADN
Modificación de las bases nitrogenadas mediante reacciones químicas específicas, a continuación,
se produce la rotura química específica del ADN.
Tiene como ventaja el permitir secuenciar fragmentos cortos de ADN, pero requiere cantidades
elevadas de la molécula de ADN purificada, presenta elevada complejidad técnica y los reactivos
son peligrosos. Etapas generales:
1. Marcaje radiactivo en los extremos del ADN con isótopo 32P (fósforo 32). Normalmente el
extremo 5´
2. Reacciones de modificación química de las bases nitrogenadas. Se marca específicamente
cada una de las bases. La muestra se divide en cuatro alícuotas y en cada una de ellas se
lleva a cabo una reacción química distinta:
Tubo 1: modificación de guanina por la acción de dimetil sulfato (DMS)
Tubo 2: modificación de adeninas y guaninas por acción del ácido fórmico.
Tubo 3: modificación de citosina y timina con hidracina
Tubo 4: modificación de citocinas con hidrazina + sales.
3. Adición de piperidina que rompe la cadena a nivel de las bases modificadas.
4. Electroforesis en gel de poliacrilamida: se separan los fragmentos por tamaños presentes en
cada tubo.
5. Autoradiografía del gel y análisis: se obtiene un patrón de bandas oscuras que permite
descifrar la secuencia de la molécula. La lectura se inicia por el extremo inferior de la
autoradiografía, que corresponde al extremo 5’ de la molécula secuenciada
 Método de Sanger y Coulsan o de secuenciación enzimática del ADN
La muestra se divide en cuatro alícuotas para la realización de cuatro reacciones de polimerización,
una por cada base nitrogenada. Cada tubo de reacción contiene los siguientes componentes:
 Hebra molde monocatenaria de ADN, que es la que se quiere secuenciar.
 Un cebador marcado en extremo 5´con 32P y complementario al 3´de la hebra molde.
 ADN polimerasa.
 Los 4 dNTP.
 Uno de los cuatro ddNTP posibles, que es el que marca la especificidad de cada reacción, en
una concentración mucho menor que los dNTP
Los ddNTP son desoxinucleótidos que carecen del grupo 3´OH necesario para formar un
nuevo enlace fosfodiéster, por lo que cuando se unen a la cadena impide que otros
nucleotidos se unan. Actúan como terminadores de cadena y detienen la síntesis. Se
genera una monocadena de ADN de un tamaño determinado cuyo extremo es un ddNTP.
Durante la reacción de polimerización, la ADN polimerasa extiende el cebador marcado,
sintetizando una cadena de ADN complementaria a la hebra molde, hasta que, por azar, incorpora
un ddNTP, lo que detiene la elongación de la cadena. Todos los fragmentos están marcados
radiactivamente por el marcaje del cebador.
ETAPAS GENERALES:
1. Preparación de cuatro reacciones independientes donde se añaden dNTP y ddNTP.
2. Reacción de síntesis.
3. Electroforesis de los productos de las reacciones de síntesis ocurridas en cada tubo.
4. Lectura de resultados mediante fluorescencia o autoradiografía.
Por ejemplo, en el tubo de la Adenina, habrá dATP y ddATP. Por ello, en la electroforesis se
observarán fragmentos de distintos tamaños finalizados siempre en Adenina.
En cada calle el último nucleótido (en posición 3´) del fragmento que representa a cada banda es el
ddNTP que se añadió en el tubo correspondiente. En consecuencia, se puede determinar la
secuencia completa según el orden escalonado de las bandas en las cuatro calles del gel, realizando
la lectura de abajo arriba de la auto radiografía (los fragmentos más cortos migran más rápidamente
que los largos). Hay que tener en cuenta que la secuencia que se lee directamente de la
autoradiografía corresponde a la cadena de nueva síntesis en dirección 5´→ 3´, por lo que la
secuencia de la hebra molde será la complementaria e irá en sentido contrario
 Métodos automáticos de secuenciación del ADN
Los métodos de secuenciación automáticos se basan en el método
enzimático de Sanger y en el uso de cuatro fluoróforos como
marcadores. En esta técnica se utilizan los secuenciadores
automáticos de 1ª generación en los que se automatizan las fases
de electroforesis, la detección de las bandas de fluorescencia y el
análisis de los resultados. Se realizan 4 PCR en tubos separados:
 En todas ellas se utiliza el mismo cebador, pero marcado
con un fluoróforo distinto por tubo.
 En cada tubo se añade a la mezcla de reacción un ddNTP
distinto en la proporción adecuada, de manera que se
asocia un color fluorescente distinto a cada ddNTP
Al terminar las PCR, cada tubo contiene todos los fragmentos
posibles que terminan en un mismo nucleótido, marcados con el
mismo fluoróforo en el extremo 5’ del cebador. Finalmente, los
productos de las cuatro PCR se mezclan en un único tubo y se
cargan en el secuenciador
 Secuenciación Masiva
La necesidad de secuenciar genomas completos individuales en poco tiempo y a bajo coste ha
impulsado el desarrollo de plataformas automáticas de secuenciación basadas en diferentes
tecnologías es la llamada secuenciación masiva de concesión de segunda generación o en GPS. son
tecnologías de alto rendimiento que generan un volumen enorme de datos e información ya que
generan cientos de miles de reacciones de secuenciación diferentes en paralelo y simultáneamente.
 Secuenciación de ARN
Para la secuenciación del ARN se usan métodos similares a los explicados anteriormente. Estos se
clasifican en dos tipos:
 Los métodos directos sólo se utilizara cuando es complicado secuenciar la molécula de
ARN deseado con el método indirecto. Son métodos de determinación como el método
de Sanger para secuenciar ADN.
 Los métodos indirectos se basan en la obtención previa de un ADN mediante
transcripción inversa, El ADN es luego secuenciado por de manera automática y la
secuencia obtenida se traduce a ARN teniendo en cuenta la complementariedad de base
 Proyecto del genoma humano
Nació en el año 1986, cuando desde el Departamento de Energía de los Estados Unidos se lideró
una tanda de contactos y reuniones, con el propósito de desarrollar el mayor proyecto biomédico de
la historia de la Humanidad, el cual consistía en conseguir secuenciar el genoma humano completo
en el 2005.

TEMA 6: EL CULTIVO CELULAR

INTRODUCCIÓN
Los cultivos celulares son todas las técnicas que permiten la cría y el mantenimiento a lo largo del
tiempo de células eucarióticas o procarióticas “in vitro”, es decir, fuera del organismo del que
proceden, manteniendo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Las condiciones para
el cultivo son concretas y determinadas, teniéndose en cuenta aspectos como:
 Alto nivel de asepsia y esterilidad, evitando contaminaciones cruzadas. Para ello, es de
importancia la utilización de cabinas de flujo laminar con filtros HEPA altamente selectivos)
  Control continuado de las condiciones ambientales de cultivo: se centra entre otros
aspectos en la concentración de oxígeno necesitándose en ocasiones una saturación de
oxígeno elevada, así como una concentración adecuada de glucosa, aa, factores de
crecimiento, vitaminas y antibióticos bacterianos.
 La acidificación del medio debido a los residuos metabólicos celulares. Se usan
indicadores como método de aviso para la realización de un cambio de medio.
 El espacio en el cultivo es un factor limitante sobre todo en cultivos monocapa (células
adheridas sobre un soporte sólido).
 En la actualidad, las áreas de investigación dependientes de técnicas de cultivo celular son la
virología, investigación del cáncer y estudio de oncogenes, genes supresores de tumores,
ciclo celular, reproducción y diferenciación celular, inmunología, estudios enzimáticos y
hormonales, etc.
1.TIPOS DE CULTIVOS
Se identifican 3 tipos de cultivos: cultivo de órganos, explantes y de células.
1. Cultivos de organos → Consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase
entre un medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada. Se dispone el órgano sobre
una rejilla situada en una interfase líquido-gas que permite la nutrición y la eliminación de
desechos.
Una de las ventajas es que se conserva la arquitectura característica del tejido “in vivo”, aun
así, la proliferación y el crecimiento celular es escaso y está muy limitado. Únicamente se
produce crecimiento de algunas células indiferencias o embrionarias presentes en los tejidos,
fundamentalmente en la zona periférica, que no conservan la estructura tisular típica del
órgano.
Como ejemplo → cultivos de ganglios, fragmentos hepáticos o de piel.
Se utilizan para estudiar interacciones y relaciones intercelulares, respuestas globales a
estímulos y sustancias, etc.
2. Fragmentos de tejido vivos o explantes que también se pueden cultivar. Consiste en adherir
un fragmento de tejido a una superficie (placa o frasco de cultivo) y nutrirlo con un medio
de cultivo.
Las células de la periferia del explante se multiplican, proliferan y migran a la
superficie del soporte. Ej: tejidos epiteliales.
3. Cultivos de celulas. Se realizan a partir de suspensiones celulares introducidas en un
recipiente con un medio de cultivo determinado en condiciones óptimas. Según la
procedencia de la suspensión, distinguimos:
◦ Cultivo celular primario → la suspensión celular de partida se obtiene disgregando las
células por métodos enzimáticos o mecánicos. De ello se obtiene una mezcla celular
compleja formada por varios tipos celulares presentes en el tejido. El cultivo se puede
realizar a partir de esta mezcla seleccionando un tipo celular concreto.
◦ Cultivo celular secundario → la
suspensión celular de partida se
obtiene a partir de un cultivo
primario o de otro cultivo
secundario mediante un
subcultivo o “pase”. Muestras de
partida: cualquier tipo de tejido,
sangre periférica células
hematopoyéticas, células madre.
TIPO CELULAR: grupo de células con un mismo origen, estructura o función. En el proceso de
disgregación de un órgano se obtienen distintos tipos celulares.

2. CURVA DE CRECIMIENTO EN LOS CULTIVOS

La curva de crecimiento es la representación gráfica del crecimiento de las células en un cultivo a lo
largo del tiempo una vez y se han depositado en el recipiente adecuado y con las condiciones
óptimas. Se identifican 4 fases:
1. Fase de latencia: en ella se produce la adaptación de las células al cultivo. No hay
crecimiento por lo que es un tramo recto sin pendiente, corresponde a las primeras 24 horas.
Algunas células no se adaptarán y morirán; otras células sí lo harán, comenzando a
proliferar y consecuentemente pasando a la siguiente fase.
2. Fase exponencial: aumento exponencial del número de células hasta alcanzar un máximo,
tramo con pendiente elevada, dura aproximadamente 6-7 días. Ocurre porque en el medio
hay disponibilidad de espacio y una alta concentración de nutrientes.
3. Fase estacionaria: tramo de meseta, ocurre a partir de los 6-7 días, el número de células
permanece constante. Al aumentar tan rápidamente el número
de células en la fase exponencial, comienzan a disminuir los
nutrientes y a escasear el espacio, además aumentan los
desechos celulares tóxicos. Debido a esto, las células
comienzan a morir y se iguala el número de nacimientos con
el número de muertes, por lo que el número total de células
en el cultivo se mantiene constante.
4. Fase de declinación: También se denomina fase de muerte del
cultivo, aumenta significativamente la tasa de mortalidad
celular respecto al nacimiento. Se produce la senescencia del
cultivo, y los desechos siguen acumulándose, hay déficit de
nutrientes.

3. FORMAS DE CRECIMIENTO
El crecimiento de las células en el cultivo puede ser:
 Crecimiento en monocapa
◦ En él las células crecen adheridas sobre una superficie sólida de plástico o vidrio.
◦ Este tipo de células de son dependientes anclaje: necesitan adherirse a una superficie
sólida para poder crecer.
◦ Es el método utilizado para el cultivo de la mayoría de las células.
◦ Se pueden distinguir diferentes momentos de desarrollo:
1. Adhesión a una superficie: período durante el cual las células se adhieren al
soporte. Coincide con el período de latencia de la curva de crecimiento.
2. Proliferación y formación de colonias: cuando las células se han pegado a la pared
del frasco de cultivo, empiezan a proliferar expandiéndose por toda la superficie y
formando colonias celulares. Corresponde con la fase exponencial de crecimiento.
3. Inhibición por contacto: con el paso del tiempo las células ocupan toda la
superficie disponible y entran en confluencia estableciendo contactos entre ellas. En
este momento se produce un fenómeno denominado inhibición por contacto en el
que las células detienen su crecimiento, se mantienen vivas. Inicio fase estacionaria.
Para que las células reanuden su crecimiento se necesita hacer un subcultivo o “pase” de
parte de las células en el nuevo frasco de cultivo. El momento ideal para hacerlo es al final
de la fase exponencial.
 Crecimiento en suspensión
◦ En este caso las células no necesitan adherirse a una superficie para crecer, por lo que se
mantienen dispersas en el seno del medio de cultivo y proliferando.
◦ Crecimiento característico de: células sanguíneas circulantes, células hematopoyéticas,
células madre, algunas líneas tumorales. Podemos distinguir las siguientes fases:
1. Adaptación al medio de cultivo (f.latencia)
2. Proliferación en suspensión (f. exponencial)
3. Inhibición por densidad. Momento en el que se alcanza un número de celular crítico en relación
con el volumen del medio de cultivo y de los nutrientes que quedan en él. En este momento es
necesario hacer un pase para que el crecimiento se reanude (f. estacionaria)

4. COMPORTAMIENTO VITAL TRAS SUCESIVOS PASES

Los sucesivos pases a partir del cultivo primario dan origen a una línea celular primaria o a una
línea celular continua.
Línea celular primaria
 Es aquella obtenida a partir de un tejido u órgano mediante un cultivo primario y que se
mantiene en cultivo mediante pases seriados durante un tiempo limitado
 La población celular aumenta en cada pase y a partir del tercer pase se estabiliza.
 Esto significa que las células se hacen uniformes y homogéneas; las características
morfológicas y fisiológicas estables durante las sucesivas generaciones.
 Senescencia: las líneas celulares primarias tienen una vida finita. Las células van perdiendo
su capacidad de dividirse y el cultivo mure, esto es debido a que tras sucesivas divisiones las
células van acumulando anomalías genéticas y perdiendo funciones. Se puede conservar una
línea celular primaria congelando células antes de alcanzar la senescencia
Línea celular continua
Se obtienen a partir de un cultivo primario y se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante
pases sucesivos. Estas líneas aparecen espontáneamente en algunos cultivos que se mantienen
durante más de lo esperado, debido a la aparición en el cultivo de células inmortales capaz de
originar línea estable y permanente. Aparecen como consecuencia de un fenómeno de
transformación de las células normales relacionado con la pérdida de los mecanismos de control
celular. Las células transformadas tienen las siguientes características
 Crecen indefinidamente en cultivo, son inmortales
 Pierden la dependencia del anclaje para crecer, por lo que pueden crecer en suspensión.
 Pierden la inhibición por contacto.
 Pueden invadir tejidos y producir tumores.
 Acumulan anomalías genéticas, normalmente son aneuploides (cambio en el numero de
genes), con múltiples aberraciones cromosómicas.
*Transfección: introducción de material genético externo en células eucariotas mediante el uso de
plásmidos, vectores víricos u otras técnicas

5. MEDIOS DE CULTIVO
El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados que contienen una mezcla de
componentes purificados, o soluciones complejas. Se realizan en el interior de instrumentos que
mantienen las condiciones fisicoquímicas adecuadas, y sobre soportes que los contienen y aíslan del
medio. Los factores que hay que tener en cuenta son:
a) Soporte físico
b) Composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo.
c) La atmósfera gaseosa.
d) Las condiciones de incubación.
a- Soporte físico
 Recipientes de vidrio. Fáciles de limpiar y esterilizar y es posible la observación directa al
microscopio a través de ellos. Además, el coste es relativamente bajo.
 Recipientes de plástico. Tienen la ventaja de ser desechables y coste bajo. Buena calidad
óptica, es el soporte más común. Los más comunes son: placas multipocillo, place de Petri,
frascos o botellas roux (frascos planos con tapón de rosca), botellas incubadoras tipo roller.
 Otros: poliacrialmida, metales, matrices tridimensionales (colágeno, celulosa)
b-Composición y propiedades fisicoquimicas del medio de cultivo
Los componentes de un medio de cultivo dependen principalmente del tipo celular que se quiera
cultivar, además de la finalidad u objetivo del experimento. Por ejemplo, en un medio agar-sangre
sólo crecerán organismos hemolíticos.
 Composición del medio de cultivo
Los medios de cultivo están formados fundamentalmente por los siguientes elementos.
◦ Soluciones salinas equilibradas. Son una mezcla de sales inorgánicas como NaCl, KCl,
NaHCO 3 , CaCl 2 , MgCl 2 , etc.
◦ Aminoácidos. suplementar con los aa esenciales y añadir otros que requiera el cultivo.
◦ Vitaminas. Como la biotina y la riboflavina. Son factores limitantes para el
crecimiento del cultivo.
◦ Glucosa. fuente de energía, como componente único o con otros hidratos de carbono.
◦ Hormonas y factores de crecimiento. Lo más común es utilizar suero fetal bovino,
necesario para la proliferación celular.
◦ Inhibidores del crecimiento de microorganismos contaminantes
antibióticos/antimicóticos
◦ Solución tampón (bicarbonato sódico). El medio tiene que estar muy tamponado para
evitar los cambios bruscos de ph.
◦ Indicador de pH (rojo fenol).
 Características fisico-quimicas del medio de cultivo
ATMÓSFERA GASEOSA: mezcla de gases en que se mantienen los cultivos, sus dos
componentes principales son el O2 y el CO2.
◦ Concentración de 02. Descrita como la concentración de oxígeno necesaria para que un
cultivo se desarrolle y prolifere correctamente, dependerá del tipo celular cultivado.
Generalmente, la concentración de oxígeno usada es la atmosférica, aunque existen
cultivos, como los de órganos completos, que debido a la dificultad de difusión del
oxígeno al interior del órgano, requieren un ambiente de saturación de oxígeno, es decir,
una concentración superior a la atmosférica.
◦ Concentración de CO2: influye en el ph, puesto que la fracción disuelta en el medio está
en equilibrio con el ión bicarbonato.
TEMPERATURA. gran influencia en la tasa de crecimiento de las células. La Tº óptima de
crecimiento suele ser la misma a la que las células están sometidas fisiológicamente en los
individuos. Así, las células de mamíferos crecen bien a 37ºC.
pH. El pH fisiológico (pH=7,4) es el valor óptimo para el crecimiento de la mayoría de los
tipos celulares en cultivo. Por ello, el medio debe estar tamponado para evitar cambios
bruscos, siendo el carbonato-bicarbonato el tampón más usado. Además, se utiliza rojo fenol
como indicador de pH incorporado en el propio medio de cultivo. Este cambia su coloración
ante variaciones del valor de pH.
OSMOLARIDAD. Para controlarla se emplean medios ligeramente hipotónicos o isotónicos,
lo que compensa la pérdida de agua por evaporación durante la incubación del cultivo. Con
ello, se consigue que las células sean hipertónicas con respecto al medio de cultivo, y así el
agua del medio de cultivo entre dentro de las células por ósmosis, manteniendo las células
hidratadas. Por tanto, se compensa la pérdida de agua por evaporación y las células
cultivadas no se deshidratan.
HUMEDAD: debe se suficientemente elevada para evitar las pérdidas por evaporación.
Otros: viscosidad

6. ¿COMO SE HACE UN CULTIVO CELULAR?

Se identifican una serie de etapas estándar que vamos a describir en orden cronológico:
1. Disgregación celular → El primer paso para realizar un cultivo celular es aislar y separar
los diferentes componentes del tejido u órgano, así separaremos las células entre sí y de la
matriz extracelular en la están inmersas. Métodos de disgregación:
 ◦ Mecánica: se basa en cortar, picar e incluso triturar suavemente fragmentos de
órgano o tejido colocados en una placa de Petri con tan pocos medios de cultivo.
◦ Enzimáticos: se basa en el uso de enzimas proteolíticas que digieren las proteínas de
la matriz extracelular, liberando las células englobadas en ella. Ejemplos: tripsina
colagenasa papaína, en las tasas. Se suelen combinar ambos mecanismos.
2. Separación de los distintos tipos celulares → Para ello, se pueden utilizar diferentes
métodos como la centrifugación, permitiéndose la separación de células por su tamaño.
3. Recuento y viabilidad celular (se explicará a continuación)
4. Descongelación de células → es un procedimiento habitual del laboratorio de cultivos
celulares para iniciar cultivos secundarios a partir de líneas celulares mantenidas en
congelación en nitrógeno líquido o a -80 grados.
5. Siembra → una vez conseguido el tipo celular de interés para realizar el cultivo, se realiza
la siembra del mismo, consiguiendo el cultivo primario, a partir del cual se tendrán que
hacer resiembras.
6. Mantenimiento del cultivo → (cambio de medio , subcultivo o pase: se suele realizar cada
2-3 días y siempre que se observe un cambio de color del medio (viraje del indicador de ph)
y conservación de células (congelación)

7. RECUENTO Y VARIABILIDAD CELULAR

Una vez obtenida la suspensión celular de partida, para iniciar el cultivo es necesario conocer su
densidad celular ,es decir, el número de células por mililitro. Además, hay que comprobar la
viabilidad de las mismas, es decir confirmar que están vivas. Ambos procesos se realizan
simultáneamente diluyendo las células con un colorante vital y contándolas en una cámara de
recuento.
 Colorante vital → Permite distinguir las células vivas de las muertas. Para ello, el
colorante más utilizado es el azul de tripá, es un colorante que tiene la capacidad de
introducirse en las células que presentan la membrana plasmática rota, dándoles un color
azul. Utilizando esta técnica, únicamente se realiza un recuento del número de células
coloreadas (células no viables) y del número de células brillantes/no coloreadas de azul
(células viables). Calculando el porcentaje de las últimas obtendremos un valor de viabilidad
celular del cultivo. No obstante, dicha técnica tiene un error asociado, debido a la afirmación
de que todas las células brillantes son viables, sobrevalorando de esta forma la viabilidad de
las células. Aun así, es un método muy extendido, puesto que dicho valor de error es
relativamente bajo y puede asumirse. Además, es un método muy sencillo, rápido y de
escaso costo.
 Contaje → recuento de las células blancas (viables) y azules (no viables). Se identifican
diferentes tipos de métodos de conteo.
◦ Cámara de Neubauer → se utilizan para determinar el número de células por unidad de
volumen del líquido donde están suspendidas. Las células se cuentan visualmente con un
microscopio óptico. Es un portaobjetos especial que presenta ranuras en la superficie.
Posee una cuadrícula de recuento que muestra 9 cuadrados grandes de 1mm2 cada uno.
Los 4 cuadrados grandes de las esquinas están señalados con una “L” y se encuentran
divididos en 16 cuadrados cada uno, estos cuadrados grandes se utilizan normalmente
para el recuento de leucocitos. El cuadrado grande central, está dividido en 25 cuadrados
medianos, cada uno de estos cuadrados medianos se
encuentra dividido en 16 cuadrados. Los 5 cuadrados
medianos que forman la diagonal superior-izquierda del
cuadrado grande central, están señalados con la letra “E”, se
utilizan para recuento de eritrocitos.
Además, todos los cuadrados medianos presentan en todos
sus lados líneas triples de límite, siendo la línea central la
frontera del cuadrado, y gracias a ella se decide si la célula a
 contar está o no en la zona que se debe contar. Una vez contadas las células de cada uno
de los cuadrados correspondientes se debe hacer la valoración de la cantidad de células
presentes por unidades de volumen.
◦ Citometría de flujo → La Citometría de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular
multiparamétrico, cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de células por
un haz de luz (láser), midiendo las características de dispersión de la luz y/o
fluorescencia asociadas a cada tipo celular a medida que pasan a través del rayo.
El impacto de cada célula con el haz de luz produce señales que se traducen en
información correspondiente a diferentes parámetros celulares. De esta forma se obtiene
información sobre tamaño, estadío de diferenciación, características antigénicas, etc. Por
tanto, con el uso de la CMF hace posible la identificación de una célula a través de la
descripción de sus características morfológicas.
Para el análisis mediante CMF las células se deben encontrar en suspensión en un fluido.
Siendo este uno de los inconvenientes, ya que se pierde información sobre la
arquitectura del tejido y sobre las interacciones entre las células que lo constituyen.
Del mismo modo, se identifican numerosas ventajas respecto a otras técnicas de conteo
de células. Algunas de ellas son:
1. Posibilidad de analizar un elevado número de células en un corto periodo de
tiempo (5000 células/segundo).
2. Gran sensibilidad y precisión, ya que es posible detectar células de una
enfermedad incipiente o residual, así como poder detectar poblaciones celulares
muy escasas en condiciones normales, como los basófilos.
3. Posibilidad de almacenar informáticamente los datos resultado del análisis.

8. APLICACIONES DEL CULTIVO CELULAR

Los cultivos celulares se pueden utilizar para múltiples funciones entre las que destacan:
 Determinación de microorganismos infecciosos → El cultivo celular es la técnica con
mejores resultados para poder determinar e identificar el microorganismo causante de un
área infectada. Habitualmente, tras la toma de muestras se procede a la realización de
cultivos en medios selectivos donde se busca el crecimiento de un determinado
microorganismo. Si existe crecimiento se llevan a cabo resiembras con el fin de poder
realizar técnicas específicas de biología molecular para la identificación.
 Diagnóstico citogenético postnatal → Para el diagnóstico citogenético postnatal, se suele
obtener muestras de sangre periférica, ya que los tipos celulares objeto de estudio son las
células pertenecientes a la serie blanca de la sangre. Estas son de fácil aislamiento y
manipulación. También se pueden realizar a partir de biopsias de piel o de gónadas.
Cultivo de sangre periférica (es un protocolo) → La muestra debe llegar fresca al laboratorio, para
que todavía contenga células vivas capaces de dividirse. Es necesario un volumen aprox. de 1 a 5
ml de muestra conservados en un tubo con heparina sódica al 1%. Una vez en el laboratorio, el
cultivo debe hacerse en las primeras 24 horas después de la extracción.
Las células se cultivan en medio acuoso a una temperatura de 37ºC. El medio de cultivo contiene
una solución salina con un sistema tamponado que mantiene el pH con suplemento de suero fetal
bovino y factores de crecimiento y antibióticos.
Además contiene lecitina nitrogenada, que se une a la membrana de los glóbulos blancos
estimulando su proliferación en el cultivo.
Una vez preparado el medio de cultivo, se siembra 1ml de muestra, manteniéndose el cultivo en
posición horizontal, con el tapón herméticamente cerrado, en una incubadora a 37ºC, durante 72
horas desde su inicio. Transcurrido este tiempo, se observará la calidad del cultivo a través del
microscopio.
 Diagnóstico citogenético prenatal → Para el diagnóstico citogenético prenatal se llevan a
cabo cultivos celulares con muestras procedentes de líquido amniótico, vellosidades
coriónicas y en algunas ocasiones de sangre fetal de cordón umbilical.
 ◦ Líquido amniótico. Mediante amniocentesis. Considerada técnica invasiva de
diagnóstico prenatal que conlleva un pequeño riesgo de aborto (entre el 0,2 y el 0,5%).
Para este análisis es necesario obtener un gran volumen de líquido, aproximadamente
20ml. Una vez obtenido el líquido, se realiza el cultivo, obteniendo gran cantidad de
células fetales.
◦ La biopsia de vellosidades coriónicas se realiza vía transcervical. Solamente se
indicará en caso de que exista un alto riesgo de anomalía fetal, puesto que es una técnica
invasiva con un riesgo de aborto de entre el 0,5 y el 1 %,
◦ Sangre fetal de cordón umbilical. Se obtiene por cordocentesis. Prácticamente no es
usada ya que presenta un riesgo muy elevado para el feto.
 Diagnóstico oncológico → Los cultivos para el diagnóstico oncológico se realizan a partir
de muestras de sangre periférica, de médula ósea, de ganglios linfáticos o directamente de
biopsias de tumores. En ellos, se procede según los procedimientos y técnicas ya descritos.
 Biobanco → institución que recoge, almacena y distribuye material biológico, así como
todos los datos asociados a dicho material. Es un establecimiento público o privado, sin
ánimo de lucro, tiene colección de muestras biológicas, concebido con fines diagnóstico o
de investigación biomédica, organizado como una unidad técnica con criterios de calidad,
orden y destino. Se han convertido en una plataforma de apoyo a la investigación médica,
permitiendo un tratamiento eficaz y seguro de las muestras biológicas y sus datos asociados.
Para la obtención de muestras destinadas a biobancos de referencia se deberán realizar unos
protocolos de selección predeterminados, siendo lo más importante la toma de la muestra del
paciente, siempre teniendo en cuenta que todo individuo debe ser informado de que su
material biológico y sus datos clínicos, van a ser manipulados por un biobanco y van a servir
para la investigación médica. Por ello, es un aspecto a considerar y de vital importancia el
hecho de informar a los pacientes, haciéndoles leer y entender los consentimientos
informados que deben firmar antes de realizarse la toma de la muestra.

9. VENTAJAS E INCONVENIENTES DEL CULTIVO CELULAR

 VENTAJAS
◦ Control preciso del ambiente donde crecen y proliferan las células. El cultivo celular
como técnica permite controlar todos los factores ambientales que influyen sobre el
crecimiento y la proliferación celular. Partiendo de un medio celular conocido es posible
controlar los factores fisicoquímicos y biológicos.
◦ Homogeneidad de las muestras. Las células de un cultivo que pertenecen a una misma
línea celular son clones, por lo que todas serán idénticas genéticamente a menos que
produzcan mutaciones de novo. Por tanto, se caracterizan por ser homogéneas en cuanto
a morfología y fisiología.
◦ Economía. El gasto económico asociado a esta técnica respecto a otras es bajo, ya que
se trabaja con volúmenes de reactivos muy pequeños. Del mismo modo, cabe destacar
que las concentraciones de dichos reactivos son significativamente menores comparando
con el uso de órganos o animales completos.
◦ Motivaciones éticas. Las técnicas de cultivo celular buscan ser una alternativa al uso de
animales de laboratorio, aunque actualmente no son un sustitutivo de estos.
 INCONVENIENTES:
◦ Escasa producción de células. La concentración de células resultado del proceso es
baja.
◦ Técnica sensible. El crecimiento de las células que pertenecen al cultivo celular es
significativamente más lento que el de microorganismos contaminantes (bacterias y/o
hongos). Por ello, es estrictamente necesario mantener de forma constante las
condiciones de asepsia. Esto supone un gasto destacado de recursos y una dedicación
adicional.
 ◦ Perdida de la estructura tridimensional del tejido. Las técnicas de cultivo celular
conllevan la disgregación celular, lo que conduce a la pérdida de la organización espacial
tridimensional de los tejidos, eliminándose así las interacciones entre los tipos celulares.
En ocasiones

TEMA 7: PRINCIPIOS BÁSICOS DE CITOGENÉTICA. CITOGENETICA HUMANA Y

ANÁLISIS CROMOSOMICOS
La citogenética es la rama de la genética centrada en el estudio de la estructura, función y
comportamiento de los cromosomas.
1. EL CROMOSOMA
Se puede definir el cromosoma de la una célula eucariótica como una estructura organizada,
formada por la asociación de una molécula helicoidal de ADN, que porta parte de la información
genética del individuo y un conjunto de proteínas.
El estudio citogenético se lleva a cabo en el periodo de metafase del ciclo celular, cuando la
cromatina adquiere el máximo grado de compactación y es perfectamente visible e identificable por
microscopía óptica.
1.1. Estructura del cromosoma
 Cromátidas: estructuras idénticas en morfología e información ya que cada cromátida es
una de las dos moléculas de ADN idénticas resultantes de la replicación del ADN. Se mantienen
unidas mediante complejos proteicos denominados cohesinas.
 Centrómero: punto de contacto de las dos cromátidas y la frontera que delimita los dos
brazos del cromosoma, funcionalmente la importancia del centrómero radica en que sobre él se
sitúan los cinetocoros, estructuras proteicas en las que se anclan las fibras
que constituyen el huso acromático o huso mitótico. Su posición es
característica de cada cromosoma y va a permitir clasificarlos en tipos
morfológicos. Es una región rica en ADN repetitivo, concretamente en
ADN satélite.
 Telómero: es una palabra de etimología griega: telos, extremo, y
meros, parte o región, que hace referencia a regiones situadas en los
extremos de los cromosomas eucarióticos. Están constituidos por
secuencias especializadas de DNA asociado a proteínas, y con
características estructurales y funcionales que las diferencian de otras
regiones cromosómicas. Está también relacionado con el envejecimiento
celular y algunos tipos de cáncer.
1.2. Tipos de cromosomas
Vistos al microscopio los cromosomas metafásicos están constituidos por dos brazos unidos por el
estrechamiento del centrómero. La longitud de cada brazo la marca la posición del centrómero: uno
corto, brazo p y otro largo, brazo q.
Metacéntricos: el centrómero está en la mitad del cromosoma, por lo que los dos brazos de cada
cromátida miden lo mismo.
Submetacéntricos: el centrómero está algo desplazado del centro, por lo que un brazo es
ligeramente más grande que otro.
Acrocéntricos: el centrómero está lejos del centro, por lo que uno de los brazos es muy corto y el
otro muy largo.
Telocéntricos: el centrómero está tan cerca del extremo que solo se ve un brazo.
1.3. Numero de cromosomas
Los organismos superiores se originan a partir de la unión de dos gametos (óvulos y
espermatozoides), cada uno de los cuales aporta un juego completo de cromosomas, cuyo número
es característico de la especie (n, haploide, en la especie humana n=23). Cada individuo tiene dos
juegos cromosómicos completos (2n, diploide, en la especie humana 2n=46)
Los humanos tenemos 23 parejas de cromosomas (2n=46) , 23 cromosomas heredados de la madre
(óvulo) y 23 del padre (espermatozoide)
Cromosomas sexuales: son los responsables de las características diferenciadoras de cada sexo. En
humanos hay dos cromosomas sexuales, el X y el Y, de modo que las mujeres son XX y los
hombres XY.
Cromosomas autosomas: los cromosomas autosómicos son los que codifican para todas las
características que no son sexuales.
2. EL CICLO CELULAR
El ciclo celular se puede considerar como una sucesión de etapas por las que transcurre la vida de
una célula. Una célula "nace" a partir de la división de una predecesora, pasa por una serie de etapas
donde crece, duplica su tamaño y, por último, se divide para dar dos células hijas que comenzarán
de nuevo el ciclo. Esto es lo que ocurre a las células que proliferan. Sin embargo, hay otras
posibilidades. Así, muchas células no se dividirán nunca, como las neuronas, y otras nacerán no de
la división sino de la fusión de dos células, como ocurre cuando se fusionan dos gametos para dar
un zigoto y crear un organismo nuevo, o cuando se fusionan los mioblastos para dar las células
musculares esqueléticas. Finalmente, algunas células morirán.
El ciclo celular se divide en dos grandes fases:
1. Interfase
Es el periodo que transcurre entre dos mitosis consecutivas, es decir, entre el final de una división
celular y el inicio de la siguiente:
 Fase G1: es la fase primera por la que pasa una célula. Es la etapa más larga y más variable,
y en ella se produce crecimiento celular hasta alcanzar el tamaño óptimo. Existe un sistema
molecular, denominado punto de control, que impide que la célula comience la siguiente
etapa, fase S, si no se han alcanzado todos los requisitos necesarios para avanzar en el ciclo
célula.
  Fase S: en la fase S o de síntesis se duplica el ADN. La replicación del ADN debe cumplir
dos condiciones: una sola replica y cometer
los menos fallos posibles. Cualquier error en
la copia del ADN puede llevar a daños
letales para las células hijas o incluso para la
totalidad del organismo. En mamíferos este
periodo dura unas 5-10 horas.
 Fase G2:es la segunda etapa de crecimiento,
más breve que la G1, en la queademás se
sintetizan productos necesarios para la
siguiente etapa, la fase M,en la que se
producirá la división celular.
2. Mitosis
La fase M es quizás la más compleja y la que supone una mayor reordenación de los componentes
celulares. Durante esta fase se separan todos los componentes celulares en dos partes para formar
dos células nuevas e independientes.
 Profase: comienza con la condensación del ADN, de manera que llegan a ser visibles las
cromátidas aisladas y con la desaparición del nucléolo. En el citoplasma también se
producen acontecimientos. Hay una desorganización parcial de los filamentos del
citoesqueleto, y pérdida de adhesividad de la célula, lo que hace que adquiera una forma
redondeada. Cuando se inicia la profase los centrosomas viajan a polos opuestos del
citoplasma, conducidos por proteínas motoras y microtúbulos. Entonces ambos centrosomas
polimerizan y organizan un sistema de microtúbulos que posteriormente se organizarán y
formarán el denominado huso mitótico.
 Metafase: al final de la profase (o prometafase) las cromátidas hermanas están unidas entre
sí y también a los microtúbulos cinetocóricos del huso mitótico, a través del centrómero. Las
dos cromátidas hermanas unidas forman los cromosomas, que son desplazados hacia el
centro del huso mitótico, equidistante de los dos centrosomas, formándose la denominada
placa ecuatorial. Esto define la metafase. Los desplazamientos son consecuencia del
acortamiento y alargamiento de los microtúbulos, así como de la acción de las proteínas
motoras.
 Anafase: comienza con la rotura de las conexiones entre cromátidas hermanas a nivel del
centrómero gracias a la participación de proteasas.Los microtúbulos se despolimerizan lo
que da lugar al acortamiento del huso mitótico, esta “tensión” provoca el desplazamiento de
las cromátidas hermanas a ambos polos de la célula. Esta fase concluye cuando las
cromátidas (los consideramos ya cromosomas) alcanzan los polos celulares.
 Telofase: durante esta fase se organiza de nuevo la envuelta nuclear alrededor de cada
conjunto de cromosomas y aparecen los
nuevos nucleolos. Los cromosomas
comienzan a descondensarse. Las fibras
del huso se despolimerizan y desaparecen.
 Citocinesis: es la etapa final del ciclo
celular y supone la separación del
citoplasma de la célula madre en dos
 partes que conformarán a las células hijas. Esta separación tiene lugar tras la segregación
completa de los cromosomas. En las células animales, la citoocinesis se produce mediante
un estrangulamiento de la región ecuatorial de la célula parental originado por un anillo de
proteínas contráctiles, que acaba separando las dos células hijas.
3. TÉCNICAS DE OBTENCIÓN DE EXTENCIONES CROMOSÓMICAS
Son un tipo de técnica que permite visualizar el genoma completo de una determinada célula
(cariotipo). En el ámbito clínico, un estudio citogenético no se considera definitivo. Éste aporta el
análisis del cariotipo, a partir de células en metafase y mediante la realización de extensiones
cromosómicas. Aunque cada equipo técnico tenga sus propios protocolos optimizados para la
realización de un estudio de células en metafase, es posible reconocer una serie de etapas
estandarizadas:
1. Extraer una muestra de sangre periférica anticoagulada en condiciones de máxima
esterilidad. Esta se someterá a cultivo durante 72 horas.
2. Introducir la muestra en un medio de cultivo con extracto embrionario (suero bovino fetal) y
antibióticos.
3. Añadir al medio fitohemaglutinina, una lecitina que se une a la membrana plasmática de los
linfocitos, provocando su desdiferenciación hacia linfoblastos. (24horas).
4. Transcurridas las 24 horas, añadir interleucina II, para estimular los linfoblastos y que éstos
se dividan. Mantener durante 48 horas, con el objetivo de obtener una gran cantidad de
células en mitosis.
5. Transcurridas 72 horas desde el comienzo del cultivo, se realiza la extracción de células en
metafase. Este proceso se denomina sacrificio celular, y en él se llevan a cabo dos
procedimientos:
a) Inhibición del huso acromático con colchicina. Con la adición de colchicina se inhibe la
polimerización de los microtúbulos de la célula, por lo que se destruye el huso
acromático impidiendo que las células entren en anafase, por lo que se consigue que
todas los linfoblastos estén en metafase.
b) Choque hipotónico. La adición de una solución de KCl muy diluida (solución hipotónica)
provoca que las células absorban agua hasta que estalle su membrana plasmática,
conservándose los núcleos en perfecto estado. Con ello, se consiguen aislar los núcleos
de los linfoblastos en metafase con los cromosomas perfectamente separados.
6. Fijación de los cromosomas con fijador Carnov (metanol/acético, proporción 3:1).
7. Realización de las extensiones sobre los portaobjetos. Se deben mantener los cromosomas
extendidos y pegados al portaobjetos. Se recomiendan condiciones ambientales estables
(temperatura y humedad)
3.1.
Calida
d de la
extenci
ón
cromos
ómica
Previo
al
estudio citogenético se debe valorar la calidad de la extensión cromosómica. Para ello se valoran los
siguientes factores:
 Densidad celular. Se valora la dispersión de las células sobre el portaobjetos, debiendo
presentar una densidad o dispersión moderada y uniforme, para que el secado de la
preparación y su posterior análisis sean correctos. Así, una densidad muy baja dificulta el
análisis por la escasez de células en la preparación, mientras que una densidad excesiva
dificulta el secado del preparado y provoca problemas de interpretación del análisis.
 Morfología de los cromosomas. La morfología de los cromosomas debe determinarse
mediante microscopia con contraste de fase. Es una etapa fundamental para los análisis
posteriores. Se valora que los cromosomas se distribuyan con muy pocos entrecruzamientos
entre ellos, con un color oscuro uniforme y con los bordes nítidos y bien definidos.
 Grado de distribución cromosómica. La distribución va a permitir un mejor análisis de cada
uno de los cromosomas. Ello se consigue realizando una correcta técnica de sacrificio y
empleando soluciones hipotónicas bien reguladas.
4. MÉTODOS DE TINCIÓN Y BANDEO CROMOSÓMICO
Cuando hablamos de métodos de bandeo cromosómico hacemos referencia a métodos y técnicas de
tinción de cromosomas en extensiones cromosómicas.
Estas permiten identificar cada uno de los cromosomas y estudiar su estructura y morfología,
además de la organización espacial del material genético. Así, cada cromosoma tiene un patrón de
bandas característico.
El patrón de bandas de un cromosoma y concretamente las bandas identificadas como Q , R y G
indican el estado funcional de la cromatina. Este estado depende del grado de empaquetamiento
(compactación o condensación) del material genético y no es uniforme a lo largo de todo el genoma.
Hay varias técnicas de bandeo cromosómico.
Bandeo G
 Técnica de bandeo más utilizada en citogenética clínica.
 Basada en la realización de un tratamiento con tripsina antes de aplicar coloración Giemsa.
 Como resultado se obtienen bandas claras y oscuras en los cromosomas. Las bandas oscuras
se denominan G+ y las claras (G-), correspondiente a regiones de ADN ricas en AT Y GC,
respectivamente.
 Método de tinción permanente (no se puede eliminar).
 Permite la identificación de todos los cromosomas. Por ello, se considera una técnica óptima
para la realización de microfotografías para el cartografiado de cariotipos.
 Para la visualización de los cromosomas teñidos con el bandeo G es necesaria la
observación con microscopio de campo claro.
Bandeo Q
 Basada en la tinción de extensiones cromosómicas con mostaza de quinacrina o acridina.
 Los cromosomas presentan un patrón específico de bandas oscuras y brillantes de distintas
intensidades. Las bandas brillantes corresponden con las bandas G+ del bandeo G.
 Técnica que permite eliminar la tinción empleada muy fácilmente, para poder realizar otra
técnica de bandeo sobre la misma extensión cromosómica.
 Es posible identificar todos los cromosomas y su patrón de bandas.
 Se visualizan las preparaciones con un microscopio de fluorescencia.
Bandeo R
  Técnica basada en la aplicación de un tratamiento previo con calor para posteriormente teñir
con Giemsa sobre el extendido cromosómico.
 Se obtienen las bandas R, bandas inversas a las obtenidas con el bandeo G ( es el negativo o
reverso de las bandas G)
 Es posible identificar la totalidad de los cromosomas y su patrón de bandas característico,
visualizando las zonas de los cromosomas que no quedan bien definidas en el bandeo G o en
el bandeo Q, como por ejemplo, los extremos de los cromosomas.
 La visualización de las extensiones se realiza en el microscopio de campo claro.
Bandeo C
 Técnica de tinción específica basada en el tratamiento previo de los extendidos
cromosómicos con HCl, un álcali (hidróxido de bario) y posteriormente tinción con Giemsa.
 Se consigue teñir específicamente el centrómero. Además de todas las regiones que
contengan heterocromatina constitutiva.
 Permite la evaluación de polimorfismos ciertos polimorfismos.
 La observación de los extendidos se realiza en un microscopio de campo claro
Bandas T
 Permite la identificación de las regiones telomericas. Bandas NOR
 Tinción con nitrato de plata.
 Observación en microscopio de campo claro.
 Tiñen específicamente la región organizadora nucleolar (nucleolar organizer region = NOR).
Permiten el estudio de regiones NOR activas, así como posibles polimorfismos y
reordenamientos de los cromosomas acrocéntricos.
Importante pag 13
5. FÓRMULA CROMOSÓMICA
Es el número y estructura de que presentan los cromosomas en una determinada célula. Esta
formula se representa con el número de cromosomas que tiene en total la célula, seguido de la
representación de los cromosomas sexuales, que sería X para el cromosoma femenino, e Y para el
cromosoma masculino. Así, la fórmula cromosómica de una mujer normal sería 46,XX y la de un
hombre normal sería 46, XY. No obstante, para poder determinar con claridad la fórmula
cromosómica es necesario conocer toda la nomenclatura citogenética así como la de las anomalías.
cromosómicas.
Todo lo relacionado con la nomenclatura citogenética se recoge en el An International System for
Human Cytogenetics Nomenclature (ISCN), publicado por Cytogenetic and Genome Research,
existiendo varias publicaciones desde 1978, y siendo la última
publicación en el 2013, que recoge los últimos avances en citogenética
molecular. Para la correcta designación de la nomenclatura cromosómica
hay que concretar tres cuestiones:
1. Descripción del cariotipo. Primeramente debe designarse el
número total de cromosomas. Tras poner una coma, se hace
referencia a los cromosomas sexuales. Así, el cariotipo de una
mujer normal sería 46,XX.
* Anomalías. Si el cariotipo presenta anomalías se describen de
la siguiente manera:
 a) Se describen las anomalías en los cromosomas sexuales, indicando primero el
cromosoma X y después el cromosoma Y;
b) Se citan las alteraciones de los cromosomas autosómicos.
Ejemplo: 45,XY,-18 (hombre con 45 cromosomas, debido a la pérdida de un cromosoma
en el par 18)
2. Número de cromosomas y su morfología. En el cariotipo humano hay un total de 22
cromosomas autosómicos más los cromosomas sexuales X, el femenino e Y el masculino.
En la construcción del cariotipo, los autosomas se numeran del 1 al 22 en orden decreciente
(según la longitud), con la excepción del cromosoma 21 que es más corto que el 22. Para
visualizar los cromosomas se tiñen con técnicas que no producen bandas en su estructura,
identificándose siete grupos según el tamaño y la posición del centrómero. Por tanto,
aparecen grupos de la A hasta la G, y tres tipos de cromosomas según la posición del
centrómero.
3. Nomenclatura de las bandas cromosómicas: existe una nomenclatura estándar para
localizar de forma exacta y descriptiva una zona concreta de un cromosoma (locus: posición
espacial fija en un cromosoma, puede ser la ubicación de un determinado gen). Esta consta
de un ideograma con las bandas típicas de cada cromosoma a distintos niveles de resolución
(acercándose). Para llevar a cabo la identificación de un área cromosómica concreta se debe
tener en cuenta los siguientes puntos:
a) Las regiones y las bandas se enumeran a partir del centrómero y hacia los telómeros. El
centrómero no constituye una banda.
b) Para nombrar áreas concretas y fenómenos de alteración cromosómica se reconocen las
siguientes abreviaturas.
c) Se debe seguir el siguiente orden: primero el número del cromosoma seguido del
símbolo del brazo, el número de la región, el número de la banda, subbanda y
subsubbanda. Todo se debe escribir seguido y sin dejar espacios.
d) La identificación y localización de bandas en el cromosoma permiten también el mapeo
de genes en el cromosoma, es decir la designación del locus (pl. loci).

Cuadros de interés de la pag 16 a la pag 20

6. ALTERACIONES CROMOSÓMICAS
El cariotipo humano normal de las células somáticas está formado por 46 cromosomas, siendo 22
pares de cromosomas autosómicos y 1 par de cromosomas sexuales. Sin embargo, en la naturaleza
se encuentra gran cantidad de alteraciones que afectan a esta dotación normal, pudiéndose dividir
estas alteraciones en dos grupos:
1. Alteraciones estruturales
A) Alteraciones estructurales Equilibradas
a) Translocaciones
I. Recíproca
II. Robertsoniana
III. Insercional
b) Inversiones
B) Alteraciones estructurales Desequilibradas
a) Duplicación
b) Deleción (terminal o intersticial)
c) Anillo cromosómico
d) Isocromosoma
2. Alteraciones numericas
A) Aneuploidía
a) Monosomía
b) Trisomía
B) Poliploidías
a) Triploide
b) Tetraploide
6.1. Alteraciones estructurales
También denominadas reordenamientos cromosómicos.
Se producen por la rotura de cromosomas y su posterior reconstrucción, dando lugar a una
combinación anómala. Afectan a 1/400 nacidos vivos, por lo que tienen una repercusión del 0,25%
en la población.
No suelen tener repercusiones fenotípicas graves en el individuo que las presenta, pero si pueden
tener una gran repercusión en la descendencia de ese individuo.
Se identifican diferentes dos tipos de alteraciones estructurales:
 Alteraciones estructurales equilibradas
◦ Translocaciones
▪ Translocación recíproca → Se produce una transferencia recíproca de material
genético entre dos cromosomas no homólogos. Por lo que se producen cambios en la
configuración cromosómica, pero no en el número total de cromosomas. La
incidencia es de 1/600 nacidos vivos, representando el 0,17% de la población. Puede
tener repercusiones fenotípicas, si en la ruptura del material genético se fragmenta
algún gen, pero por noma el portador es asintomático.
▪ Translocación robertsoniana → Se produce por la fusión del centrómero de dos
cromosomas acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22), por lo que se pierde el brazo corto
de ambos cromosomas, dando lugar a un cariotipo con 45 cromosomas. La
incidencia es de 1/1000 nacidos vivos. No presenta repercusiones fenotípicas. En la
descendencia, un individuo con translocación robertsoniana tiene un alto riesgo de
formar gametos con trisomías.
 ▪ Translocación insercional → También llamada inserción. Se produce la
translocación de un fragmento de material genético de un cromosoma para insertarse
en otro. En este caso es necesario que se produzcan tres puntos de rotura, por lo que
es una alteración muy poco frecuente. Fenotípicamente no tiene repercusión, a
menos que en alguna de las roturas se fragmente un gen, pero si suele tener
repercusión en la descendencia del portador.
◦ Inversión: Rotura de un fragmento de material genético, con dos puntos de
fragmentación en un cromosoma, fusionándose de nuevo ese fragmento en el mismo
lugar pero con un giro de 180º, con lo que se invierte su posición. Repercusión de
1/1000 nacidos vivos. Normalmente sin repercusiones fenotípicas, a menos que las
rotura afecte a la estructura de algún gen.

 Alteraciones estructurales desequilibradas

Las alteraciones estructurales desequilibradas, implican pérdida o ganancia de material
genético. Por ello, suelen tener repercusiones fenotípicas asociadas.
◦ Duplicación → Se produce la repetición de un fragmento de material genético,
normalmente en tándem con la secuencia original, pudiendo tener la misma orientación
que la secuencia original o estar invertida. Tiene repercusión fenotípica, pero la
afectación será más o menos grave dependiendo de los genes implicados en el proceso
de duplicación.
◦ Deleción → Es la pérdida de un fragmento de material genético. Incidencia de 1/7000
nacidos vivos. La repercusión fenotípica suele ser mayor que la de las duplicaciones,
produciéndose, bien por monosomía parcial o por nulisomía, si la deleción se produce en
el cromosoma X de un Hombre.
 Anillo cromosómico → Se forma por la rotura del material genético y su posterior fusión de
forma anular. Si supone repercusión fenotípica, la cual será más o menos grave dependiendo
de los genes afectados.
 Isocromosoma → Consiste en que un cromosoma pierde uno de sus brazos y en
contraposición duplica de forma especular el otro. Tiene repercusión fenotípica.
6.2 Alteraciones numericas (mas comunes)
Las alteraciones numéricas tienen una mayor incidencia, aparecen en 1/300 nacidos vivos. Son
alteraciones en las que siempre se produce pérdida o ganancia de material genético, causándose un
desequilibrio cromosómico. Por ello, siempre van a tener repercusiones fenotípicas asociadas, las
cuales serán más o menos graves dependiendo del volumen de material genético que se pierda o se
gane. Se identifican diferentes tipos de alteraciones numéricas:
 Aneuploidias → variación del número de copias de un cromosoma concreto. Puede
producirse tanto en cromosomas sexuales como autosómicos. Aparece con mayor frecuencia
en la población, representando el 5% de todos los embriones en gestación. Las más comunes
son:
◦ Monosomía → Cuando aparece una única copia de un determinado cromosoma. Suelen
producirse durante las sucesivas meiosis para la formación de los gametos o mitosis para
la formación del embrión. No son viables con la vida, por lo que los cigotos que las
presenten nunca llegarán a término. Sólo se reconoce una excepción, producida cuando
 aparece un único cromosoma sexual correspondiente al cromosoma X, siendo el
individuo 45X. Estas son mujeres presentan el síndrome de Turner
◦ Trisomía → Cuando aparecen tres copias de un determinado cromosoma. Las únicas
trisomías viables con la vida, o vistas en recién nacidos son las que se producen en los
cromosomas 13, 18, 21 y en los cromosomas sexuales. Molecularmente ocurre porque
no se produce la disyunción de cromosomas homólogos durante las fases de meiosis,
necesarias para la formación de gametos y del cigoto. Repercusión fenotípica de cada
una de estas trisomías depende del cromosoma que esté afectado.

 Poliploidias
Las poliploidías son euploidias, en la cuales el número de cromosomas presentes en el individuo es
un múltiplo exacto de la carga haploide superior a 2, es decir, que serían individuos triploides,
tetraploides, etc. Según tuvieran 3 ó 4 copias del numero haploide de cromosomas encontramos
◦ Triploide → Individuos con el triple de cromosomas que la configuración haploide
normal, por lo que presentan 69 cromosomas (3n). La formación de triploides ocurre
porque un mismo óvulo es fecundado por dos espermatozoides a la vez, en el proceso
denominado dispermia, o bien, porque se producen fallos de segregación de cromosomas
homólogos durante el proceso de meiosis, para la formación de los gametos.
La dotación cromosómica de estos individuos sería 69,XXX, 69,XXY, 69,XYY ó
69,YYY.. Algunas son compatibles con la vida.
◦ Tetraploide → Individuos con cuatro veces más cromosomas que la configuración
haploide normal, por lo que presentan 92 cromosomas. Su formación ocurre porque se
produce un fallo durante el proceso de finalización de la división temprana del cigoto,
quedando todo el material genético duplicado en una misma célula. La dotación
cromosómica de los tetraplodes siempre va a ser 92, XXXX o bien 92, XXYY. Es letal
para el embrión.

7. DIAGNOSTICO CITOGENÉTICO PERNATAL

Muchas de las alteraciones cromosómicas descritas con anterioridad, dan lugar a embriones viables
que conducirán a un embarazo a término, aunque la su esperanza de vida posterior es muy limita y
débil. Por ello, el diagnóstico citogenético prenatal es una herramienta preventiva de gran utilidad.
Las principales alteraciones cromosómicas que se detectan en el estudio citogenético prenatal son
las aneuploidías de los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. Siendo estas alteraciones en las que se
centran los estudios primarios que se llevan a cabo, aunque todo diagnóstico citogenético prenatal
finaliza con la determinación del cariotipo del feto estudiado.
Las principales indicaciones para que se realice un diagnóstico citogenético prenatal son las
siguientes:
1. Para el cribado bioquímico del síndrome de Down patológico. Esto se lleva a cabo
cuando, tras una analítica sanguínea de la madre, en la cual se han detectado valores
elevados de ciertas sustancias y hormonas relacionadas con la formación de un feto con
síndrome de Down.
2. Estudio ecográfico de rutina en el que se detectan malformación fetales asociadas a
alteraciones cromosómicas, es necesario realizar el diagnóstico prenatal para confirmar si
existen o no esas alteraciones.
3. Identificación de padres portadores de alteraciones cromosómicas conocidas.
4. Antecedentes familiares de cromosopatía.
7.1. Metodología a seguir para el diagnostico citogenetico parental
Para obtener extensiones cromosómicas de calidad se llevan a cabo dos tipos de técnicas de
obtención de muestras:
 Amniocentesis consiste en la obtención de líquido amniótico mediante la punción
abdominal del útero. El líquido amniótico es el líquido que rodea y protege al feto, por lo
que al estar en contacto con él, posee células y fragmentos de tejido fetal, los cuales se
utilizan para llevar a cabo las extensiones cromosómicas y así el diagnóstico citogenético
prenatal.
 Estudio de las vellosidades coriónicas consiste en la obtención de un pequeño fragmento
del corión, o placenta en desarrollo, mediante aspirado del corión o bien con una aguja a
través de punción abdominal. Se obtienen pequeños fragmentos o vellosidades del corión, a
partir de los cuales se obtendrán las extensiones cromosómicas. Esta técnica sólo se lleva a
cabo en casos muy concretos de antecedentes o riesgo muy grave de alteraciones
cromosómicas.
Con ambas técnicas el mayor inconveniente es el tiempo, ya que para poder realizar unas buenas
extensiones cromosómicas, es necesario realizar cultivos del tejido, los cuales suelen tardar unas
dos semanas. Del mismo modo cabe destacar el desarrollo de técnicas de biología molecular como
la hibridación con sondas fluorescentes, estas son específicas y se unen a regiones microsatélite
presentes en los cromosomas, ayudando así a la identificación de anomalías y alteraciones que
pongan en riesgo la vida del feto. En cualquier caso, el diagnóstico citogenético prenatal no estará
completo hasta que no se determine el cariotipo del feto, donde además de las posibles alteraciones
de los cromosomas 13, 18, 21, X e Y, también pueden encontrarse otros reordenamientos
cromosomas u otras alteraciones que puedan ser contrarias con la vida o el desarrollo del feto.

8. CITOGENÉTICA Y CÁNCER
Con el estudio citogenético molecular de células tumorales a través del seguimiento clínico de los
marcadores citogenéticos, se ha demostrado que aparecen alteraciones cromosómicas en más de
30000 neoplasias en humanos. Por lo que conocer qué tipo de alteración cromosómica se asocia con
un determinado tipo de cáncer, es una herramienta muy valiosa tanto para el diagnóstico de la
enfermedad como para el seguimiento de la evolución de la misma. Todo en base a que con estas
técnicas se puede valorar la respuesta de la enfermedad al tratamiento y detectar y cuantificar la
presencia de células tumorales en un organismo, por muy escasa o residual que sea.
Además, es posible la localización y detección de los genes implicados en la formación de tumores,
siendo este aspecto de gran importancia para el diagnóstico preventivo o en las primeras etapas de
neoplasia.
El campo donde mayor evolución se ha producido es en el de las neoplasias hematológicas,
ya que es muy fácil obtener extensiones cromosómicas de calidad a partir de cultivos de muestras
tomadas de la médula ósea.
Por lo que el análisis citogenético molecular, así como la elaboración de cariotipos en células
tumorales hematopoyéticas son técnicas de rutina en el diagnóstico y seguimiento de muchos
tumores hematológicos. Sin embargo, en los tumores sólidos, existen varios factores que
no han permitido la incorporación del análisis citogenético a la rutina diagnóstica de los mismos.
Entre algunos de estos factores, cabe mencionar, por su importancia, la dificultad de obtener
extensiones cromosómicas con metafases de calidad. Esta dificultad es debida a la baja variabilidad
celular que presentan los tumores sólidos, ya que la necrosis celular y la concentración de
contaminantes son altamente significativos
No obstante, en los últimos años, y gracias a la incorporación de técnicas de citogenética molecular
al diagnóstico oncológico, como la hibridación in situ fluorescente (FISH) es posible identificar
reordenamientos cromosómicos que no pueden ser detectados con las técnicas de bandeo
convencionales, además del estudio de reordenamientos cromosómicos en células que están en
continua división, como son las tumorales. Por su parte, el desarrollo de técnicas de hibridación
genómica comparada con arrays (CGH), ha permitido identificar de manera rápida la pérdida o
ganancia de material genético de una célula aunque para determinar de manera aún más
precisa las alteraciones con base genética implicadas en procesos tumorales, es necesario el
desarrollo de marcadores cromosómicos aún en desarrollo.