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    Tecnicas Histológicas

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    Isabel Orta
    Este documento describe las técnicas histológicas utilizadas para preparar tejidos para su estudio microscópico. Incluye las etapas de obtención del material, fijación, deshidratación, aclaramiento, inclusión, microtomía, montaje, tinción y las técnicas específicas como inmunohistoquímica, histoquímica y coloraciones especiales. Explica los diferentes fijadores, medios de inclusión, colorantes y tinción utilizados para distinguir las estructuras celulares.

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    Tecnicas Histológicas

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    Isabel Orta
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    Este documento describe las técnicas histológicas utilizadas para preparar tejidos para su estudio microscópico. Incluye las etapas de obtención del material, fijación, deshidratación, aclaramiento, inclusión, microtomía, montaje, tinción y las técnicas específicas como inmunohistoquímica, histoquímica y coloraciones especiales. Explica los diferentes fijadores, medios de inclusión, colorantes y tinción utilizados para distinguir las estructuras celulares.

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    TECNICAS HISTOLÓGICAS

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    Este documento describe las técnicas histológicas utilizadas para preparar tejidos para su estudio microscópico. Incluye las etapas de obtención del material, fijación, deshidratación, aclaramiento, inclusión, microtomía, montaje, tinción y las técnicas específicas como inmunohistoquímica, histoquímica y coloraciones especiales. Explica los diferentes fijadores, medios de inclusión, colorantes y tinción utilizados para distinguir las estructuras celulares.

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    Este documento describe las técnicas histológicas utilizadas para preparar tejidos para su estudio microscópico. Incluye las etapas de obtención del material, fijación, deshidratación, aclaramiento, inclusión, microtomía, montaje, tinción y las técnicas específicas como inmunohistoquímica, histoquímica y coloraciones especiales. Explica los diferentes fijadores, medios de inclusión, colorantes y tinción utilizados para distinguir las estructuras celulares.

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    TECNICAS

    HISTOLÓGICAS
    INTRODUCCIÓN
    ⦿ HISTOLOGIA
    ιστός: histós "tejido"
    ⦿ TEJIDO
    Asociación de células de naturaleza similar,
    diferenciadas de modo determinado y ordenadas
    regularmente con un comportamiento fisiológico
    común.

    ⦿ CELULA
    INTRODUCCIÓN
    ⦿ Histología:
    Inmunohistoquímica
    Uso de anticuerpos marcados con un colorante fluorescente
    dirigidos a un componente celular particular o
    la actividad enzimática inherente”

    Citoquímica
    Identificación y localización de la proteína
    VASA
    (en verde.) Ovocitos
    INTRODUCCIÓN
    ⦿ Se utilizan para preparar tejidos para su estudio.
    ⦿ Las etapas son: - Obtención del material
    - Fijación
    - Deshidratación
    - Aclaramiento
    - Inclusión
    - Microtomía
    - Montaje y Rehidratación
    - Tinción
    FIJACIÓN

    ⦿ Tratamiento del tejido con sustancias químicas para retardar las


    alteraciones tisulares subsecuentes a la muerte celular
    ⦿ 6 – 24 horas
    ⦿ Antiséptico – bactericida
    ⦿ Relación fijador- material fijado 3:1
    ⦿ Inmersión o perfusión
    FIJACIÓN

    Cualidades que debe tener un fijador:


    1. Actuar con rapidez
    2. Poseer alto poder de penetración
    3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que
    presentaban in vivo.
    4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos
    necesarios para su observación ulterior
    5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la
    fijación o después de ella.
    6. No provocar o impedir la producción de estructuras
    artificiales.
    7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o
    quebradizos.
    FIJACIÓN
    Manera de actuar de los fijadores
    ⦿ Varía con la composición o naturaleza de los mismos:
    1.- Coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido
    pícrico, yodo, calor)
    2.- Formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas
    (ácido crómico y sus sales) o reduciéndose en contacto con las mismas
    3.- Originando un precipitado fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio,
    cloruro de oro).
    4.- Oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los tejidos
    FIJACIÓN

    Clasificación
    ❑Fijadores químicos
    - Fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química
    - Fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias
    sustancias intervienen en su constitución.

    ❑ Fijadores físicos
    1. Calor seco húmedo.
    2. Criodesecación
    3. Criosustitución
    4. Congelación
    FIJACIÓN
    FIJADORES SIMPLES FIJADORES COMPUESTOS
    a) Formol al 10%, es el más usado. a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-
    b) Alcohol etílico absoluto o de 96% osmio-acética.
    (microquímica)
    c) Alcohol metílico, se le emplea con b) Líquido de Zenker, mezcla
    frecuencia para fijar frotis bicromato-sublimado-acética.
    desecados (sangre, médula ósea,
    ganglio, bazo, líquidos de punción, c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-
    etc.). formol.
    d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco
    penetrante pero enérgico, conserva d) Líquido de Bouin, mezcla picro-
    muy bien estructuras celulares. formos-acética.
    e) Bicromato de potasio al 3-5%.
    e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin
    alcohólico.
    FIJACIÓN

    ¿ Que fijador utilizo?

    DEPENDE DEL TEJIDO QUE SE VA A FIJAR


    DESHIDRATACIÓN

    ⦿ Para eliminar H2O y sustituirla


    ⦿ Isopropilicovs. Etanol
    ⦿ Baños de alcohol gradualmente

    50% - 70 % hasta 100% o absoluto (1 hora c/u


    en promedio)
    ACLARAMIENTO

    ⦿ Xilol
    ⦿ Eltejido se torna transparente
    ⦿ Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la
    matriz extracelular
    INCLUSIÓN

    ⦿ PARAFINA.
    ⦿ Se coloca el tejido en un envase con parafina fundida
    hasta que se infiltre completamente.
    ⦿ Se sumergen las piezas en parafina (46-60º de punto de
    fusión)
    ⦿ Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina.
    ⦿ Luego se coloca en un receptáculo con parafina fundida,
    se deja endurecer para formar el bloque de parafina .
    ⦿ Conservar la muestra. Rigidez
    PROCESADOR DE TEJIDOS
    INCLUSION
    BLOQUES DE PARAFINA
    INCLUSION
    Otros medios de inclusión:

    › Celoidina, seca o húmeda


    › Metacrilato
    › Resinas
    › Nitrocelulosa
    › Hidrosolubles:
    - Cera carbólica
    - Gelatina
    - Compuesto de temperatura optima (OCT)
    MICROTOMÍA

    ⦿ Se colocan en el microtomo

    ⦿Cada corte debe medir aproximadamente 5 – 15 micras


    de grosor.**
    MICROTOMÍA
    MICROTOMÍA
    MICROTOMÍA
    - Nitrógeno líquido
    - Criostato a 0º C,se coloca en un portaobjeto frío y se
    corta con una hoja de acero enfriada con 24 horas
    de anticipación; luego se permite que alcancen la
    temperatura ambiente para luego colorearse o tratarse para
    inmunohistoquímica o histoquímica
    MONTAJE Y
    REHIDRATACIÓN

    ⦿ El montaje se hace en un portaobjeto cubierto con un adhesivo.


    ⦿ La parafina, se elimina del corte, después de lo cual se rehidrata y
    se tiñe.
    ⦿ Una vez teñido se deshidrata nuevamente para fijarse
    permanentemente colocando el cubreobjeto.
    COLORACIÓN

    ⦿ Aumentan el contraste de las estructuras biológicas


    ⦿ Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de
    la célula.
    ⦿ Colorantes especializados que distinguen componentes
    específicos
    ⦿ Salesmetálicas que precipitan en los tejidos y forman depósitos
    de materiales en ellos.
    COLORACION
    Clasificación de los colorantes según su origen
    ⦿ NATURALES:
    - Animales (carmín)
    - Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)

    ⦿ ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA):


    - Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o
    eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos.
    - Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de
    metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
    - Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados.
    Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
    - Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un
    poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la
    solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).
    COLORACION

    ⦿ Colorantes Ácidos
    - Carga negativa
    - Reaccionan con los grupos
    cationicos de las células y
    tejidos ⦿ Colorantes básicos
    -Acidofilia - Carga neta positiva
    - Reaccionan con los
    grupos aniónicos de
    las células
    - Basofilia
    COLORACION
    ⦿ Tambien pueden ser:

    - Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la


    solución colorante empleada.

    - Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se


    tiñe con un color diferente al del colorante empleado.
    COLORACION
    LOS MÁS UTILIZADOS…

    ⦿ HEMATOXILINA ⦿ EOSINA (ACIDO)


    (BASE)
    ⦿ Tiñe ⦿ Tiñe de color rosa muchos
    de azul los componentes
    ácidos de la célula (DNA, elementos del citoplasma.
    RNA, núcleo, citoplasma) ⦿ Es un colorante artificial.
    ⦿ Presenta autofluorescencia
    ⦿ Es un colorante vegetal.
    - Para ser utilizada debe ser espontánea.
    oxidada previamente ⦿ Se la emplea tanto en
    soluciones acuosas como
    ⦿- Es un colorante directo, pero alcohólicas.
    en la práctica se lo utiliza en
    forma de lacas hematoxilínicas
    COLORACIONES
    ESPECIALES…
    PAS MAGENTA: Moléculas ricas en
    glucógeno y CHO.
    AZUL OSCURO : Núcleo
    AZUL CLARO :Mucinógeno
    TRICRÓMICO DE MASSON ROJO: Músculo, queratina y
    citoplasma

    ORCEÍNA PARA FIBRAS PARDO


    ELÁSTICAS
    WREIGHT PARA FIBRAS AZUL
    ELÁSTICAS
    OTRAS COLORACIONES…

    SUDAN ROJO: GRASAS

    HEMATOXILINA NEGRO:
    FÉRRICA Estriaciones del
    músculo, núcleo y
    eritrocitos
    TINCIÓN ARGENTICA NEGRO : FIBRAS
    RETICULARES
    ROJO SUDAN
    GOMORI GROCOTT
    ZIEHL NEELSEN
    PAS
    TRICRÓMICO DE
    MASSON
    TECNICAS HISTOLOGICAS
    TECNICAS HISTOLOGICAS
    GRACIAS…

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