TECNICOS EN HEMATOLOGIA

Asignatura: LEUCEMIAS AGUDAS Y MIELODISPLASIAS

CLASE NUMERO 5 ( suma de conceptos generales , leucemias agudas y mielodisplasias )

Agregados a clases de Leucemias

Agudas y Mielodisplasias

2022
Dra. Rey Irene
División Hematología
Hospital J. M. Ramos Mejía
 Cómo participan los técnicos/as ante estas
patologías en las que el análisis de la morfología
celular, la citoquímica son tan fundamentales en el
diagnóstico?
LINFOMAS:

LEUCEMIAS + MIELODISPLASIAS Ante la definición diagnóstica de

las neoplasias sólidas, los
oncohematologos debemos
* Médico: Historia clínica + Examen físico
- tiempo de evolución; factores de riesgo: apoyarnos en la experiencia y las
técnicas que utilice el
- edad, fumar, químicos,
anatomopatólogo para precisar
- radiación tóxicos, al máximo la histología y definir
- genéticos, inciertos. qué tipo de linfoma padece el
-Exámenes de la química general paciente.
- HEMOGRAMA + COAGULOGRAMA

- *CITOMORFOLOGIA + CITOQUIMICA
- FROTIS de sangre
- FROTIS de Médula Ósea
Manipulación de las muestras
garantizar la calidad de los resultados
obtenidos por el laboratorios

nte s o
c a da a
d e n ti fi
s e r i sm a
d e b e la m i
ló g i ca ó n d e
t ra b io t e n c i
m ue s l a o b
La r a nt e
d u
Reacciones citoquímica = 7 grandes grupos:

Reacciones citoquímica enzimáticas: de las peroxidasas, de la fosfatasa alcalina

leucocitaria, fosfatasa ácida leucocitaria y esterasas inespecíficas y específicas

Reacciones citoquímica para ácidos nucleícos: ADN: reacción de Feulgen; ARN: método de
extinción del azul de metileno; ADN y ARN: método combinado de Brachet y de Kurnick.

Reacciones citoquímica para polisacáridos: en especial glucógeno y mucopolisacáridos:

reacción de PAS o del ácido periódico de Schiff.

Reacciones citoquímica para proteínas

Reacciones citoquímica para lípidos: método del Negro Sudán B.

Reacciones citoquímica para reconocer hemoglobina fetal: método de Kleinhauer y Betke.

Reacciones citoquímica para la determinación de metales: reacción de Perls para hierro

no hemínico.
CITOQUIMICA

LMA MPO aNAE CAE PAS

M0 Indiferenciada - - - -
M1 S/Maduración + - + -
M2 Diferenciada ++ -/+ + -
M3 LPA +++ +/- + +/-
M4 Mielo Monoc. + + + +/-
M5 Monocítica + + + +/-
M6 Eritroleucemia + + - +
M7 Megacarioblastica - - + +
LLA:
Mieloperoxidasa Negativo
Cloroacetatoesterasa Negativo
Sudan Black Negativo
ACIDO PERYODICO de SCHIFF POSITIVO
P.A.S. Gránulos finos o gruesos, en bloque o lacunar.
Para realizar una reacción citoquímica es importante tener en cuenta:

• Usar siempre un frotis control, extraído y conservado en las mismas condiciones que el
frotis a investigar. El frotis control nos permite controlar si se realizó correctamente la
reacción (detección de fallas en reactivos, temperatura, conservación de la muestra, etc).

• Conservación de los frotis. Lo ideal es someter la muestra a la reacción citoquímica

inmediatamente después de su extracción, si esto no es posible, los frotis deben
conservarse envueltos en papel absorbente, y en algunos casos refrigerados a 4ºC.

• Reactivo para la fijación: no debe extraer ni inhibir la sustancia a detectar.

• Tiempo de fijación: algunos fijadores pueden dañar las enzimas, por lo que es importante
respetar el tiempo de fijación, que por lo general es de segundos.

• Recordar que si la reacción es citoplasmática, se debe contracolorear el núcleo para

identificar las células. Si la reacción es nuclear se debe contracolorear el citoplasma
 EXAMEN DE LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO

FISICOQUIMICO:
por contador automático y análisis
químico (glucorraquia, proteinorraquia)

RECUENTO EN CAMARA : de NEUBAUER

o de NAGEOTTE

CYTOESPIN : citomorfología (tinción con

Wright Giemsa)

INMUNOMARCACIÓN: Por CMF

En un medio de transporte adecuado (obtenido

mediante punción no traumática), el hallazgo de
más de 10 eventos correspondientes a células de
inmunofenotipo anormal coincidentes con las
células leucémicas de la MO y/o SP
INMUNOMARCACIÓN: Por CMF
Las muestras de SP y MO deben ser conservadas a temperatura
ambiente (18-25°C).
Admite emplear HEPARINA o EDTA (ácido etilendiaminotetracético) para
muestras de sangre periférica y médula ósea.

(como se solicita simultáneamente con otros estudios, EDTA es de elección ante la necesidad
de realizar recuentos celulares y estudios de biología molecular. HEPARINA es de elección
para estudios citogenéticos. )

El LCR requiere aditivos especiales como TRANSFIX® (Citomark UK)

o médio de cultivo RPMI (Roswell Park Memorial Institute) con
suero fetal bovino al 5%.
(minimizan la degeneración celular que se produce de manera acelerada desde el
momento de la toma de la muestra. Mientras RPMI conserva a un máximo de 18 horas, y
TRANSFIX® 24-48… horas.
Los fragmentos tisulares y ganglios linfáticos deben ser recolectados en solución salina
isotónica estéril. )
• En el caso de los LCR se recoleta 1 ml de la muestra
en un tubo de EDTA que contiene la solución
estabilizante ( Tranfix 0,2 ml preparado en el
laboratorio). Importante respetar la proporción.

• El empleo de una solución estabilizante previene la

pérdida celular debida a los efectos citotóxicos in
vitro del líquido cefalorraquídeo sobre los leucocitos,
manteniéndose la eficacia de la estabilización por
periodos superiores a las 24-48 horas de su
obtención, sin estabilizante la viabilidad de las
células es de media hora.
Conservación de Muestras de CMF
 INMUNOMARCACIÓN: Por CMF
B-ALL LLA T-ALL
<18
<18

≥18
Armstrong, SA and Look, AT JCO 2005; 26:6306-6315
≥18
•CITOMETRIA de FLUJO MULTIPARAMETRICA (MFC)
ENFERMEDAD RESIDUAL MEDIBLE
•REACCION en CADENA de la POLIMERASA en TIEMPO REAL CUANTITATIVA (qPCR)

•PCR digital

•SECUENCIACION DE ALTO RENDIMIENTO (NGS

LLA : LMA:
UMBRAL UMBRAL
0.01% 0.1%
(1 en 1000 células)

Advertencia:
Niveles de EMR por
debajo de 0.1% podrían
indicar pronóstico
 INMUNOMARCACIÓN: Por CMF
LLA

Impacto en la INMUNOTERAPIA

Blinatumomab (CD19 –CD3)

AntiCD22 + Quimioterapia

Anti CD33 + Quimioterapia

 Leucemias Mieloides Agudas

• Conjunto heterogéneo de neoplasias hematológicas

• Mucho más frecuentes en adultos

• Surgen de la expansión clonal de precursores mieloides

indiferenciados que alteran la hematopoyesis
 MEDICINA
PERSONALIZADA
“on size
fits all”
“targeted
therapy”
MEDICINA DE PRECISION

LMA

Aplicar ESTRATEGIAS de
DIAGNOSTICO, PREVENCION y TRATAMIENTO
más eficaces y seguras, teniendo en cuenta la
variabilidad individual de FACTORES GENETICOS.
 LMA
Enfermedad compleja y DINAMICA evoluciona con tiempo
“genéticamente diversa , clonalmente heterogénea con múltiples
mutaciones adquiridas y los procesos epigenéticos son flexibles”

Desregulación de mecanismos
epigenéticos
18 de Febrero del 2015, se publicó
por primera vez un mapa del
Epigenoma humano
“ epi” quiere decir “sobre” Ah!!!!

Un GENOMA
por encima del
GENOMA!!!!!

Los genes que se expresan (o se “prenden”) no solo lo hacen porque sí, sino que
la mayoría depende de cierto tipo de secuencias genéticas (de A, C, T y G) que
funcionan como interruptores (de tipo ON/OFF).

Además, miles de proteínas pueden compactar o alivianar el empaquetamiento

del ADN.

Como “UN ACORDEON”, cuanto más compactado menos genes se expresan y

viceversa.
 Aja!!!
Pero … …
¿ impactan en la Mutaciones
decisión clínica…??? Somáticas
¿¿¿ Conductoras!!

Genéticamente
DIVERSA
Clones
coexistentes Clonalmente
competitivos!! HETEROGENEA

Mecanismos
Epigenéticos Mútiples
Desregulados!!! mutaciones
adquiridas
…es una enfermedad
DINAMICA… evoluciona Los procesos
con el tiempo… epigenéticos:
HEREDABLES Y
REVERSIBLES
 Jóvenes
LMA… la evolución hacia una clasificación integral
CLASIFICACION OMS Revisión 2017
Genoma más simple
AML y neoplasias relacionadas
Promedio bajo de
AML con anomalías genéticas recurrentes
AML con t (8; 21) (q22; q22.1); RUNX1-RUNX1T1 . mutaciones adquiridas
AML con inv (16) (p13.1q22) o t (16; 16) (p13.1; q22); CBFB-MYH11 Suficientes para el
Leucemia promielocítica aguda con PML-RARA
AML con t (9; 11) (p21.3; q23.3); MLLT3-KMT2A diagnóstico
AML con t (6; 9) (p23; q34.1); DEK-NUP214 PRONOSTICO
AML con inv (3) (q21.3q26.2) o t (3; 3) (q21.3; q26.2); GATA2,
MECOM FAVORABLE
AML (megacarioblástica) con t (1; 22) (p13.3; q13.3); RBM15-MKL1
AML con BCR-ABL1
AML con NPM1 mutada
AML con mutaciones de CEBPA b zip
AML con RUNX1 mutado CLASIFICACION OMS Revisión 2017
AML y neoplasias relacionadas
AML con anomalías genéticas recurrentes
AML con t (8; 21) (q22; q22.1); RUNX1-RUNX1T1 .
AML con inv (16) (p13.1q22) o t (16; 16) (p13.1; q22); CBFB-MYH11
Leucemia promielocítica aguda con PML-RARA
AML con t (9; 11) (p21.3; q23.3); MLLT3-KMT2A
AML con t (6; 9) (p23; q34.1); DEK-NUP214
AML con inv (3) (q21.3q26.2) o t (3; 3) (q21.3; q26.2); GATA2,
MECOM
AML (megacarioblástica) con t (1; 22) (p13.3; q13.3); RBM15-MKL1
AML con BCR-ABL1
PRONOSTICO AML con NPM1 mutada
AML con mutaciones bialélicas de CEBPA
ADVERSO AML con RUNX1 mutado
 LMA
Anormalidades
Presentaciones Edad
citogenéticas Morfología
recurrentes clínicas N°GB

RC
Tasa de recaída
No se Sobrevida Global
superponen
“… marcadores Genéticos participan en la construcción de la
DECISIÓN CLÍNICA …”
LMA: 11 Subtipos
combinando información clínica y citogenética con secuenciación
dirigida de 111 genes candidatos
“Es posible que una clasificación basada en la
causalidad sea duradera reproducible y
clínicamente relevante”
 LMA… CLASIFICACION
la evolución hacia
OMS Revisión 2016una clasificación integral
AML y neoplasias relacionadas
AML con anomalías genéticas recurrentes
AML con t (8; 21) (q22; q22.1); RUNX1-RUNX1T1 .
AML con inv (16) (p13.1q22) o t (16; 16) (p13.1; q22); CBFB-MYH11
Leucemia promielocítica aguda con PML-RARA
AML con t (9; 11) (p21.3; q23.3); MLLT3-KMT2A
AML con t (6; 9) (p23; q34.1); DEK-NUP214 PRONOSTICO
AML con inv (3) (q21.3q26.2) o t (3; 3) (q21.3; q26.2); GATA2,
MECOM FAVORABLE
AML (megacarioblástica) con t (1; 22) (p13.3; q13.3); RBM15-MKL1
AML con BCR-ABL1
AML con NPM1 mutada
AML con mutaciones bialélicas de CEBPA
AML con RUNX1 mutado CLASIFICACION OMS Revisión 2016
AML y neoplasias relacionadas
AML con anomalías genéticas recurrentes
AML con t (8; 21) (q22; q22.1); RUNX1-RUNX1T1 .
AML con inv (16) (p13.1q22) o t (16; 16) (p13.1; q22); CBFB-
MYH11
Leucemia promielocítica aguda con PML-RARA
AML con t (9; 11) (p21.3; q23.3); MLLT3-KMT2A
AML con t (6; 9) (p23; q34.1); DEK-NUP214
AML con inv (3) (q21.3q26.2) o t (3; 3) (q21.3; q26.2); GATA2,
MECOM
AML (megacarioblástica) con t (1; 22) (p13.3; q13.3); RBM15-
MKL1
PRONOSTICO AML con BCR-ABL1
ADVERSO AML con NPM1 mutada
AML con mutaciones bialélicas de CEBPA
AML con RUNX1 mutado
 GENES
Metilación e hidroximetilación DNMT3A Individuos
TET2 “sanos”
IDH 1/2
antes de
RNA m /Splicing alterado por el complejo U2 SF3B1
SRSF2 desarrollar
U2AF1 LMA
Modificación de la arquitectura de la ASXL1
cromatina EZH2
KMT2A
Transcripción desregulada CEBPA
RUNX1 HEMATOPOYESIS
WT1 CLONAL COMO EN
Factor Nuclear NPM1 SMD
Complejo de cohesión SMC1
SMC3
STAG2
RAD21

LMA-Secundaria
 Evolución del tratamiento / Quimioterapia

1964  Antifolatos: METOTREXATO

 Antimetabolitos: 6-MP; 6-TIOGUANINA
Fundación  Corticoesteroides sintéticos
ASCO  Alcaloides de la Vinca: VCR
 Alquilantes del ADN: BUSULFAN;CICLOFOSFAMIDA;

CLORAMBUCILO

HIDROXIUREA

1° Antraciclina: DAUNORRUBICINA
LMA

Blood Cells, Molecules and Diseases 50 (2013) 119-130

 LMA
1980 -1990 ¿Qué hay de nuevo?

LPA
Terapias dirigidas a una alteración molecular
Epigenética : factores de transcripción
oncogénicos
Síndrome de diferenciación celular
EMR / Enfermedad Residual MEDIBLE Tratamientos dirigidos
Targeted

Inmunoterapia
Anti CD 33 (GO)
Quimioterapia
Tratamiento CAR-T cell
LMA TPHP

TR Breitman, SJ Collins, BR Keene : Terminal differentiation of human promyelocytic leukemic cells in primary culture in response to retinoic acid Blood
57: 1000– 1004,1981. TR Breitman, SE Selonick, SJ Collins : Induction of differentiation of the human promyelocytic leukemia cell line (HL-60) by retinoic
acid Proc Natl Acad Sci U S A 77: 2936– 2940,1980. ME Huang, YC Ye, SR Chen , etal: Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic
leukemia Blood 72: 567– 572,1988
 LMA. Evolución del tratamiento

LMA-FLT3 +
A
LM

NPM1 c/ FLT3

LMA-CBF
P53
Cariotipo complejo

IDH1
MLL
(KMT2A)
IDH2
MLL-PTD TET2 WT1
Subtipo
Leucemias Mieloides Agudas

Hiper -aguda

Emergencia médica

Trombo -
hemorrágica
 PATOGENESIS DE LA COAGULOPATIA
Está determinada por las propiedades de los promielocitos
leucémicos y su interacción con otras células
Actividad
FIBRINOLITICA
Generación de Plasmina
Actividad PROCOAGULANTE incrementada
CID HIPERFIBRINOLISIS
Consumo PRIMARIA
Factores;
Plaquetas;
Anticoagulantes fisiológicos:
Prots C, S y AT

FIBRINOLISIS
SECUNDARIA

What's new in the pathogenesis of the coagulopathy in acute promyelocytic leukemia?

Mantha, Simon; Tallman, Martin S.; Soff, Gerald A.
Aditi Choudhry and Thomas G. DeLoughery . Am. J. Hematol. 87:596–603, 2012
Takayuki I Kezoe International Journal of Hematology . Vol 100, Issue 1,pp 27-37. 2014
 LPA
MUERTES TEMPRANAS

siguen siendo la razón principal de fracaso del

tratamiento
LPA - Subtipo de LMA

 Presentación clínica
Hipofibrinogenemia
Adulto Joven
Fibrinólisis-
Hemorragia CID
 Coagulopatía *Hemorragia catastrófica
Leucopenia
Plaquetopenia
 Citomorfología Coagulograma alterado

t(15;17) (q24;q21)

 Alt.Citogenética
“Oncoproteína”
PML-RARa
 Alteración molecular
 “Mielodisplasia” = Síndrome Mielodisplásico (SMD)????

Citoquímica: Cuáles son importantes ?

Hierro medular
Peroxidasa PERLS

deleción Sideroblastos en anillo

Histología: Precursores Inmaduros de Localización Anormal (ALIP)

Citometría de Flujo Multiparamétrica

Estudio CITOGENETICO
 Cómo participan los técnicos/as ante estas
patologías en las que el análisis de la morfología
celular, la citoquímica son tan fundamentales en el
diagnóstico?

La calidad de la muestra analizada condiciona de manera

considerable la del resultado obtenido.

La información brindada al laboratorio no sólo permitirá una

evaluación mas eficaz, sino también más veloz y certera.

El aprendizaje, el entrenamiento y la evaluación continua de las

destrezas técnicas, pueden minimizar los factores que causan las
principales alteraciones que afectan el resultado de los análisis .
TECNICOS
TÉCHNE

ARTE
Conocimientos
Habilidades
Destrezas Mundo laboral
Actitudes Educación Superior

Desempeño Integral en la
VIDA - Personal- Social - Profesional