ELISA (immunoensüümmeetod)

ELISA ehk immunoensüümmeetod (inglise keeles enzyme-linked immunosorbent assay) on biokeemias laialdaselt kasutatav laboratoorse diagnostika meetod, mis võimaldab selektiivselt tuvastada valke ning neid kvantitatiivselt iseloomustada määramispiiriga alla ühe nanogrammi. ELISA on mugav ja kiire meetod, mis kasutab sihtmärkide tuvastamiseks antikehi ja värvimuutust.

ELISA meetodit kasutatakse diagnostikavahendina meditsiinis, taimepatoloogias ning kvaliteedi kontrollimiseks paljudes muudeski tööstusharudes. ELISA meetodeid on kolme tüüpi: otsene (direct) ELISA, kihiline (sandwich) ELISA ja konkureeriv (competitive) ELISA.

Põhimõte

ELISA toimib spektrofotomeetrilise meetodina tänu ensüümidele, mis katalüüsivad substraadist värvilise saaduse teket. Ensüüm on kovalentselt seotud antikehaga, mis tuvastab spetsiifiliselt huvipakkuva antigeeni. Antigeeni olemasolu korral seostub sellega antikeha-ensüüm kompleks. Signaal tekib, kui uuritav lahus sisaldab antigeeni. Tavaliselt on signaaliks värvimuutus. Juhul, kui lahus ei sisalda antigeeni, ensüümi-antikeha kompleks pinnale ei seondu ning substraadi lisamisega signaali ei kaasne.

ELISA katse läbi viimiseks peab vähemalt üks antikeha olema spetsiifiline konkreetse antigeeni suhtes. Teadmata hulgal antigeeni sisaldav proov immuniseeritakse tahkele pinnale kas mittespetsiifiliselt (adsorptsioon) või spetsiifiliselt (kihiline ELISA). Pärast antigeeni immuniseerimist lisatakse tuvastusantikeha, mis moodustab antigeeniga kompleksi. Tuvastusantikeha võib kovalentselt seonduda ensüümiga. Teise võimalusena võib tuvastusantikeha tuvastada sekundaarse antikehaga, mis on seotud ensüümiga biokonjugatsiooni abil. Iga etapi vahel pestakse üldjuhul plaat pesulahusega, et eemaldada valgud või antikehad, mis pole spetsiifiliselt seondunud. Pärast viimast pesu lisatakse substraat nähtava signaali saamiseks, mis näitab antigeeni kogust proovis.

ELISA on heterogeenne meetod, mis immobiliseerib analüüdi lahusest tahkele faasile ehk pinnale. Proovilahus lisatakse eriliste sidumisomadustega statsionaarsele faasile. Üksteise järel lisatakse mitmed reagendilahused, inkubeeritakse ja pestakse. Sellele järgneb lõpplahuse värvimuutus, millest mõõdetakse analüüdi hulka. Kvalitatiivne lugemine põhineb tavaliselt valguse intensiivsuse mõõtmisel spektrofotomeetriga. Tuvastamise intensiivsus sõltub signaali võimendusest analüütilise reaktsiooni vältel. Kuna ensüümireaktsioonid on väga hästi tuntud võimendusprotsessidena, tekitatakse signaal ensüümidega, mis on seotud tuvastusantikehade külge kindlates kogustes, et võimaldada täpne kvantitatiivne määramine.

Tüübid

Otsene ELISA

Otsene ELISA

96 kaevukesega immunoensüümmeetodi plaat

Etapid

1. Igasse mikroplaadi kaevukesse lisatakse analüüsitav antigeeni puhverlahus. Oodatakse, et lahus saaks laengu interaktsioonide abil kinnituda plastile.
2. Kaevukesse lisatakse mittereageeriva valgu lahus (nt BSA või kaseiin), et katta antigeeni katmata plastpind. Tavaliselt kasutatakse 96 kaevukesega plaati.
3. Lisatakse primaarne antikeha, mille külge on kinnitatud konjugeeritud ensüüm. See seostub spetsiifiliselt analüüsitava antigeeni külge, mis katab kaevukest.
4. Lisatakse ensüümi substraat. Tihti muudab substraat värvi pärast ensüümiga reageerimist.
5. Mida kõrgem on seerumis oleva primaarse antikeha kontsentratsioon, seda suurem on värvimuutus. Sageli kasutatakse ka spektromeetrit, et anda värvi intensiivsusele vastavaid kvantitatiivseid tulemusi.

Ensüüm käitub võimendava reagendina isegi siis, kui ainult mõned ensüüm-seotud antikehad jäävad seotuks, tootes ensümaatilise katalüüsiga suures koguses saadust. Sisuliselt ensüümi toodetavat saadust pole ja seetõttu on signaali võimendus piiratud. Mida rohkem antikeha on seostunud, seda kiiremini värv muutub. Põhiliseks otsese ELISA puuduseks on, et antigeeni immobiliseerimine pole spetsiifiline. Kui seerumit kasutatakse uuritava antigeeni allikana, võivad kõik proteiinid proovis jääda mikrotiitri plaadi kaevukese külge. Väikse kontsentratsiooniga analüüdid, seostudes kaevukese pinnaga, peavad konkureerima teiste seerumis olevate valkudega. Kihilises või kaudses ELISA-s kasutatav primaarne antikeha on spetsiifiline uuritava antigeeni suhtes, et seda välja tõmmata seerumi molekulaarsest segust.

Nimetuste "otsene ELISA" ja "kaudne ELISA" (inglise indirect) kasutus erineb kirjanduses vastavalt katse kontekstile. Kui analüüsitakse antigeeni olemasolu, siis viitab nimetus "otsene ELISA" meetodile, kus kasutatakse ainult märgistatud primaarset antikeha. Nimetus "kaudne ELISA" viitab meetodile, kus antigeen on seotud primaarse antikehaga, mis tuvastatakse märgistatud sekundaarse antikehaga. Viimasel juhul on kihiline ELISA selgelt eristatav kaudsest ELISA-st. Kui huvi pakub just primaarne antikeha (nt immunisatsiooni analüüsides), siis antikeha tuvastatakse otseselt sekundaarse antikeha abil ja kasutatakse nimetust "otsene ELISA".

Kihiline ELISA

Kihiline ELISA. 1. Plaat on kaetud primaarse antikehaga. 2. Lisatakse proov. Kõik olemasolevad antigeenid seostuvad primaarse antikehaga. 3. Lisatakse teine primaarne antikeha, mis seostub antigeeniga. 4. Lisatakse ensüüm-seotud sekundaarne antikeha, mis seostub teise primaarse antikehaga. 5. Lisatakse substraat, mis muudetakse ensüümi abil tuvastatavaks

Etapid

1. Pinnale on seotud kindel hulk primaarset antikeha.
2. Pinnal olevad mittespetsiifilised seostumissaidid blokeeritakse.
3. Plaadile kantakse antigeeni sisaldav proov ja see püütakse antikeha abil kinni.
4. Plaat pestakse, et eemaldada sidumata jäänud antigeen.
5. Lisatakse spetsiifiline antikeha, mis seostub antigeeniga. Antigeen on kahe antikeha vahel kinni (inglise sandwich).
6. Kasutatakse ensüüm-seotud sekundaarseid antikehi, et tuvastada antikehi, mis seostuvad spetsiifiliselt antikeha konstantse regiooniga.
7. Plaat pestakse, et eemaldada sidumata jäänud antikeha-ensüümi konjugaadid.
8. Lisatud kemikaal muudetakse ensüümi abil värviliseks saaduseks.
9. Mõõdetakse signaali plaadi kaevukestes, et kindlaks teha antigeeni kogus.

Pilt paremal illustreerib sekundaarse antikeha kasutust, mis on konjugeeritud ensüümi külge. See pole vajalik, kui primaarne antikeha on konjugeeritud ensüümi külge (otsene ELISA). Sekundaarse antikeha konjugaadi kasutamine võib ära hoida kulukate ensüüm-seotud antikehade tootmist iga antigeeni jaoks, mida soovitakse tuvastada. Ensüüm-seotud antikeha, mis seostub teise antikeha konstantse regiooniga, saab kasutada mitmesugustes olukordades. Ilma esimese primaarse antikeha kihita võivad proovis olevad valgud konkureerivalt adsorbeeruda plaadi pinnal, vähendades immobiliseeritud antigeeni hulka. Antikeha kinnitamiseks plasti külge kasutatakse puhastatud antikeha. See välistab vajaduse puhastada antigeeni keerulistest segudest enne mõõtmist, tehes sellega meetodi lihtsamaks ja tõstes meetodi spetsiifilisust ja tundlikkust. Kihilist ELISA-t kasutatakse tihti valideerimist vajavates teadustöödes valede positiivsete tulemuste ohu tõttu.

Konkureeriv ELISA

Etapid

1. Märgistamata antikeha inkubeeritakse tema antigeeni (proovi) juuresolekul.
2. Omavahel seotud antikeha-antigeen kompleksid lisatakse antigeeniga kaetud kaevukesse.
3. Plaat pestakse, et eemaldada sidumata jäänud antikehad. Mida rohkem on antigeeni proovis, seda rohkem antigeeni-antikeha komplekse moodustub, mille tulemusena on vähem sidumata jäänud antikehi, mis oleksid võimelised seonduma antigeeniga kaevukeses.
4. Lisatakse primaarse antikeha spetsiifiline sekundaarne antikeha. Teine antikeha haagib end ensüümi külge.
5. Lisatakse substraat ja alles jäänud ensüümid kutsuvad esile kromogeense või fluorestseeriva signaali.
6. Reaktsioon peatatakse, et ära hoida edaspidist signaali küllastumist.

Mõned konkureeriva ELISA komplektid sisaldavad ensüüm-seotud antigeeni ensüüm-seotud antikeha asemel. Märgistatud antigeen konkureerib primaarse antikeha sidumissaitide pärast proovi märgistama antigeeniga. Mida vähem on antigeeni proovis, seda rohkem märgistatud antigeeni säilitatakse kaevukeses ja seda tugevam on signaal. Tavaliselt pole antigeen esimesena kaevukeses.

HIV antikehade tuvastamiseks on mikrotiiterplaadi kaevukesed kaetud HIV antigeeniga. Kasutatakse kahte spetsiifilist antikeha, üks on konjugeeritud ensüümiga ja teine on seerumis (kui seerum on positiivne antikeha jaoks). Kaks antikeha hakkavad konkureerima sama antigeeni pärast, põhjustades tugevama nähtava signaali. Analüüsitav seerum lisatakse kaevukestesse, inkubeeritakse 37 kraadi juures ja pestakse. Kui antikehad on olemas, toimub antigeeni-antikeha reaktsioon. Antigeeni pole alles jäänud ensüüm-märgistatud spetsiifilise HIV antikeha jaoks. Need antikehad jäävad vabaks pärast lisamist ja pestakse ära. Lisatakse substraat, kuid puudub ensüüm, mis selle alusel tegutseks. Seega positiivne tulemus korral värv ei muutu.

Rakendused

Inimese anti-IgG, topelt antikeha kihiline ELISA

Doktor Dennis E. Bidwell ja Alister Voller lõid ELISA meetodi, et diagnoosida teatud haigusi (malaariat, Chagasi haigust, Johne haigust). ELISA meetodit kasutatakse ka in vitro diagnostikas meditsiinilaborites ning tuberkuloosi mükobakterite antikehade, rotaviiruse, B-hepatiidi markerite ja HIV-infektsiooni tuvastamiseks.

ELISA oli esimene laialt kasutatav analüüs tänu suurele tundlikkusele HIV-infektsiooni avastamisel. ELISA meetodi puhul lahjendatakse seerumilahus 400 korda ja kantakse HIV antigeenidega kaetud plaadile. Juhul kui HIV antikehad on seerumis olemas, võivad nad seonduda nende HIV antigeenidega. Plaat pestakse, et eemaldada kõik seerumi komponendid. Spetsiaalselt ette valmistatud sekundaarne antikeha (antikeha, mis seondub teiste antikehadega), kantakse plaadile ja korratakse pesu. See sekundaarne antikeha on keemiliselt seotud ensüümi külge. Niisiis sisaldab plaat ensüümi vastavas koguses sekundaarse antikehaga, mis on seotud plaadi külge. Lisatakse ensüümi substraat ja ensüümi katalüüs viib värvi muutuseni. ELISA tulemused esitatakse numbriliselt. Kõige vastuolulisem testi juures on määramispiiri kindlakstegemine, mida määratakse võrreldes seda referentsväärtusega. Narkootikumide määramise puhul on avastamispiiriks seatud 50 ng/ml.

ELISA-t saab kasutada nii antigeeni kui ka antikeha olemasolu hindamiseks proovis. Seega on ELISA-t hea kasutada seerumis antikeha kontsentratsioonide (Lääne-Niiluse viirus) määramiseks. Samuti on ELISA kasutust leidnud toidutööstuses võimalike allergeenide (piim, maapähklid, Kreeka pähklid, mandlid ja munad) tuvastamiseks. Toksikoloogias kasutatakse ELISA-t teatud narkootikumide kiirprooviks.