Memoire de Find'etude

‫الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية‬
RÉPUBLIQUEALGÉRIENNEDÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE
‫وزارة التعليم العالي والبحث العلمي‬
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
‫جامعة امحمد بوقرة بومرداس‬
UNIVERSITE M’HAMED BOUGARA DE BOUMERDES

Faculté Des Sciences
Département de Biologie
Mémoire de Master Académique

Filière Sciences Biologique
Spécialité Biologie des populations et des organismes
Thème
Evaluation de l’activité antibactérienne des huiles essentielles
d’une plante médicinale de la famille des Euphorbiaceas
Présenté par
AZZEDINE Nassima et NADJI Tinhinane
Membres du jury :
Mm BENHABYLES. N MAA Présidente ….. FS-UMBB
Mr ARAB. K PROFESSEUR Promoteur FS - UMBB
Mm LAOUFI.R MAA Examinatrice FS-UMBB

Mm Boumaza. S Doctorante Co-promotrice FS - UMBB
Année universitaire 2016/2017

Effet épuratoire du roseau (Arundo donax) sur les eaux usées industrielles d’Oued Boureah «Rouiba» 2
Remerciements
Tout d'abord nous remercions le bon Dieu tout puissant de la bonne santé, la volonté et la
patience qu'il nous a donné tout le long de la période de nos études.
Nous exprimons nos sincères remerciements :
A notre promoteur Pr ARAB.K
A notre Co-promotrice Mme BOUMAZA.S pour sa confiance, son soutien, son attention, ses
bons conseils, et sa disponibilité pour l’encadrement de ce travail.
On a eu la chance et le plaisir d’effectuer un stage pratique au laboratoire
« Bactériologie » à l’hôpital de Thenia. On tient à exprimer nos profonds remerciements au
médecin microbiologiste Mme Amraoui pour son chaleureux accueil au sein du laboratoire,
pour sa confiance et sa permission de réaliser ce travail dans les meilleures conditions. Pour
son aide et pour les discussions enrichissantes malgré toutes ses responsabilités et ses
nombreuses occupations.
A tous les membres du laboratoire bactériologie de l’hôpital de Thenia pour leur soutien et
les facilités accordées pour la réalisation de ce travail.
Aux membres du jury qui ont bien voulu consacrer une partie de leur temps pour juger ce
travail :
Mm Benhabyles. N pour l’honneur qu’il nous a fait en acceptant de présider le jury de notre
Soutenance.
Mm Laoufi. R pour l'honneur qu'il nous a accordé en acceptant d'examiner notre mémoire.
A tous Les collègues de la promotion BPO 2016-2017 pour les sympathiques moments
qu’on a passés ensemble.
Enfin un énorme Merci à tous ceux qui nous ont aidé, conseillé, et ouvert leurs portes,
parfois même avec un sourire, et qui se reconnaîtront certainement.
Dédicace
Tout d’abord, je remercie mon «Dieu» tout puissant qui m’a
donné, la volonté, le courage, la patience et l’endurance et
qui a guidé mes pas vers le droit chemin pour réaliser ce
travail.
Je dedie ce mémoire :
A ceux qui m’ont tout donné sans rien attendre en retour
A ceux qui m’ont encouragée et soutenue durant toutes mes
annéés d’etudes : mes parents tout les mots sont insuffisants
pour exprimer ma gratitude, ma reconnaissance et mon
amour. Que le tout puissant les garde et les protégé
A notre promotrice Mme Boumaza
A mes chères sœurs : Abla et Racheda
A mes chères frères :Djelali et Adel
A mes amis :Ichrak, Drifa, Nesrine, Sihem,
Zohra, Houda , Hayet, Soumia, Bouchra
A ma chère binôme Tina et sa Famille
Sima
Dédicace
Je dédie ce travail a tout ceux qui m’ont encouragé et soutenu dans mes
Moments les plus difficiles
Et à ceux qui je dois tant
A mes chers parents, Autant de phrases et d’expressions ne sauraient exprimer ma gratitude.

Vos conseils ont toujours guidé mes pas vers la réussite. Votre patience sans ﬁn, votre
compréhension et votre encouragement sont pour moi le soutien indispensable que vous avez
toujours su m’apporter.
A mes adorable sœurs : Kahina, Hanane, sarah, Magdouda et Yasmine, Merci d’être toujours
à mes côtés, par votre présence, par votre amour dévoué et votre tendresse, ainsi a mes beaux
frères : Hakim, Nourdine, Djamel eddine et Zakaria.
A tous les membres de ma famille en particulier ma chère grand-mère et mes adorable tantes,
vous avoir a mes cotés représente un bonheur pour moi.
Et surtout a mes nièces Nourssine et Hadil ainsi que notre petit chou Soliman eddine qui sont
les bijoux de notre petite famille.
A notre promotrice Mme BOUMAZA.S pour son encouragement et sa présence.
A ma chère Simma Votre amitié est un honneur et une ﬁerté pour moi. Je vous remercie pour
les moments inoubliables que nous avons partagés ensemble, Que notre amitié soit éternelle.
A tous mes amis avec lesquelles j’ai partagé les meilleurs moments de ma jeunesse : Nadia,
Zina, Kahina, Ichrak et Assia.
A la mémoire de mon ancle Nabil Qui a été toujours dans mon esprit et dans mon cœur, je te
dédie aujourd’hui ma réussite. Que Dieu, t’accueille dans son éternel paradis.
Enfin, a tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin.
Merci, merci, merci
♥
Tina
Sommaire
Sommaire
Liste des abréviations………………………………………………………………...
Liste des figures et planches…………………………………………………………
Liste des tableaux…………………………………………………………………….
Introduction………………………………………………………………………….1
Chapitre I. Partie bibliographique

I. 1 Description, composition et activité de la plante……………………………...3
I .1.1 Description botanique………………………………………………………...3
I.1.2 Taxonomie et systématique…………………………………………………….4
I.1.3 Répartition géographique………………………………………………………5
I.1.4 Usage d’Euphorbia sp………………………………………………………….5
I.1.4.1 Utilisation traditionnelle……………………………………………………..5
I.1.4.2 Utilisation contre les bactéries……………………………………………….5
I.1.4.3 Utilisation contre les insectes………………………………………………..6
I.1.5 Composition phytochimique et application pharmacologique d’Euphorbia sp.6
I.1.6 Toxicité d’Euphorbia sp……………………………………………………….7
I. 2. Les substances actives : Huiles essentielles………………………………….7

I.2.1 Historique……………………………………………………………………...7
I.2.2 Définition………………………………………………………………………7
I.2.3 Répartition et localisation……………………………………………………...8
1.2.3.1 Répartition…………………………………………………………………...8
I.2.3.2 Localisation…………………………………………………………………..8
I.2.4 Composition chimique…………………………………………………………9
I.2.4.1 Les composés terpéniques……………………………………………………9
I.2.4.1.1 Les monoterpènes…………………………………………………………10
I.2.4.1.2 Les sesquiterpènes………………………………………………………...10
Sommaire
I.2.4.2 Les composés aromatiques dérivés du phenylpropane……………………...10

I.2.4.3 Les composés d’origines diverses…………………………………………...11
I.2.5 Propriétés et caractéristique des huiles essentielles…………………………...12
I.2.5.1 Propriétés physicochimiques………………………………………………...12
I.2.5.2 Propriétés pharmacologiques et activités biologiques……………………….13
I.2.5.2.1 Pouvoir Antibactérien……………………………………………………...13
I.2.5.2.2 Pouvoir antivirale…………………………………………………………..14
I.2.5.2.3 Pouvoir antifongique……………………………………………………….14
I.2.5.2.4 Pouvoir antiparasitaires…………………………………………………….14
I.2.5.2.5 Pouvoir antiseptiques………………………………………………………14
I.2.5.2.6 Pouvoir insecticides………………………………………………………..15
I.2.5.2.7 Pouvoir anti-inflammatoire ………………………………………………..15
I.2.5.2.8 Pouvoir antispasmodique…………………………………………………..15
I.2.5.2.9 Pouvoir calmant, anxiolytique……………………………………………..15
I.2.5.2.10 Pouvoir cicatrisant………………………………………………………..15
I.2.6 Caractérisation phytochimiques des huiles essentielles……………………….15
I.2.6.1 Chromatographie en phase Gazeuse (CPG/DIF)……………………………16
I.2.6.2 Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse
(GPC/SM)…………………………………………………………………………..16
I.2.7 Procédés d’extraction des huiles essentielles………………………………….16
I.2.7.1 L’hydrodistillation…………………………………………………………..17
I.2.7.2 L’entraînement à la vapeur d'eau …………………………………………...18
I.2.7.3 L’hydrodiffusion…………………………………………………………….18
I.2.7.4 L'expression à froid………………………………………………………….19
I.2.7.5 L’extraction par solvants…………………………………………………….19
I.2.7.6 L’extraction par micro-ondes………………………………………………..19
I.3 Généralités sur les bactéries pathogènes d’origine tellurique………………20
I.3.1 Principales bactéries pathogènes du sol……………………………………….20
I.3.2 Infection bactérienne d’origine tellurique……………………………………..21
I.3.3 Transmission des bactéries pathogènes du sol à l’homme…………………….22
I.3.4 Isolement et identification des bactéries pathogènes du sol ..........................22
I.4 Lutte biologique contre les bactéries pathogènes telluriques…………………...22
Sommaire
Chapitre II. Matériel et méthodes

II.1 Matériel……………………………………………………………………….24
II.1.1. Matériel biologique………………………………………………………….24
II.1.1.1.Matériel végétal…………………………………………………………….24
II.1.1.2.Matériel microbiologique…………………………………………………..24
II.1.2.Matériel non biologique………………………………………………………24
II.2.Méthodes d’étude……………………………………………………………..25
II.2.1. Séchage………………………………………………………………………26
II.2.2. Broyage et de conservation de la poudre…………………………………….26
II.2.3 Tests phytochimiques (Screening phytochimique)…………………………..26
II.2.4. Extraction des huiles essentielles……………………………………………29
II.2.4.1. Rendement de l’extraction………………………………………………...30
II.2.5.Isolement des souches bactériennes………………………………………….30
II.2.5.1. prélèvement du sol………………………………………………………...30
II.2.5.2. préparation des dilutions…………………………………………………..30
II.2.5.3. Ensemencement dans une gélose nutritive………………………………..31
II.2.5.4. Repiquage…………………………………………………………………31
II.2.5.5. Identification des souches isolées………………………………………...31
II.2.5.5.1. Examen macroscopique………………………………………………...31
II.2.5.5.2. Examen microscopique (coloration de Gram)………………………….31
II.2.5.5.3. Recherche des caractères biochimiques………………………………..32
II.2.6. Sensibilité aux antibiotiques……………………………………………….34

Sommaire
II.2.7. Evaluation de l’activité antibactérienne…………………………………...35
II.2.7.1. Revivification et repiquage des espèces bactériennes……….……….…35
II.2.7.2 Préparation de l'inoculum……………………………………………......35

II.2.7.3 Préparation des disques……………………………………………….....35
II.2.7.4. Préparation des milieux de culture……………………………………...35
II.2.7.5. Ensemencement…………………………………………………………36
II.2.7.6. Expression des résultats ………………………………………………..36
Chapitre III. Résultats
III.1. Screening phytochimique…………………………………………………37
III.2. Extraction des huiles essentielles…………………………………………41
III.3. Identification des souches microbiennes isolées.………………………...42
III.4. Tests de sensibilité aux antibiotiques…………………………………….45
III.5. Evaluation de l’activité antibactérienne des huiles essentielles d’Euphorbia
Sp………………………………………………………………………………………...46
III.5.1. Densités optiques des suspensions bactériennes………………………46
III.5.2. Etude qualitative………………….…………………………………...46
Chapitre IV. Discussion
IV.1. Tests phytochimiques……………………………………………………50
IV.2. Rendement en huiles essentielles……………………………………......50
IV.3. Evaluation de l’activité antibactérienne………………………………....51

IV.4. Sensibilité aux antibiotiques……………….……………..………..……52
Conclusion………………………………………………………………….…53
Références bibliographiques ………………………………………………..55
Annexes…………………………………………………………………………
Liste des abréviations
ATB : Antibiotique
API : Appareillage et procédés d’identification
CPG : Chromatographie en phase gazeuse.
CuSO4 : Sulfate de cuivre
CT : Colistine
Cit : Citrate de Simmons.
Cat : Catalase.
Coa : Coagulase.
°C : Degré Celsius.
DIF : Détecteur à ionisation de flamme.
DMI : Dose minimale d’inhibition
DO : Densité Optique.
E. coli : Escherichia coli.
Esc : Esxuline.
FeCl3 : Chlorure de ferrique.
g : Gramme.
HE : Huile essentielle.
H2O : L’eau.
H2O2 : Eau oxygénée.
HCl : Acide chlorhydrique.
H2SO4 : Acide sulfurique
H2S : Thiosulfate de sodium.
Ind : Indole
Liste des abréviations
IRTF : spectrométrie infrarouge par transformée de Fourier
KOH : Hydroxyde de potassium
IPM : Imipénéme
Lac : Lactose
Mg : magnésiums
Nm : Nanomètre.
NaOH : Hydroxyde de sodium
NA : Acide nalidixique
O2 : Oxygène
RM : Rouge de Méthyle
RMN : Résonance magnétique nucléaire
Sp : Espèce
S aureus : Staphylococcus aureus
SM : Spectromètre de masse
S : Souche
S : Sensible
SCN : Staphylococcus a coagulase négatif
TSI : Triple sugar iron
V/V : Volume par volume
VA : Vancomycine.
Vp : Vosges Prauskauer.
Liste des figures et planches
Liste des figures
Figure.1 : Port de l’espèce, tige fleurie, détail d'une fleur d’Euphorbia sp……………………4
Figure.2 : Structure chimique de quelques composés des huiles essentielles……………….12
Figure.3 : Montage d'hydrodistillation……………………………………………………...17
Figure.4 : Entraînement à la vapeur d’eau ascendante et descendante……………………..18
Figure.5 : Principe schématisé de l’appareillage d’hydrodistillation sous micro-ondes……20
Figure.6 : Schéma général des différentes étapes du travail……………………………….25
Figure.7 : Poudre végétale………………………………………………………………….26
Figure.8 : Dispositif de l’hydrodistillation…………………………………………………29
Figure.9 : Echantillonnage en « zigzag »…………………………………………………..30
Liste de planches
Planche 01 : activité antibactérienne des huiles essentielles d’Euphorbia sp……………….48

Liste des tableaux
Liste des tableaux :
Tableau I : Sensibilité des bactéries aux antibiotiques……………………………………34
Tableau II : Résultats des tests phytochimiques…………………………………………..37
Tableau III: Extraction de l’huile essentielle……………………………………………...42
Tableau IV: Identification bactérienne…………………………………………………...43
Tableau V : Tests de sensibilité aux antibiotiques………………………………………...45
Tableau VI : Résultats de l’activité antibactérienne des huiles essentielles d’Euphorbia
Sp………………………………………………………………………………………………………47
Introduction
Introduction
Introduction
Depuis l’antiquité, l’homme utilise les plantes pour lutter contre diverses maladies qui
guettent sans cesse sa vie. De nos jours, une large couche de la population mondiale,
notamment celle des pays en voie de développement, utilise les plantes médicinales du fait de
son incapacité à accéder, voire bénéficier des vertus de la médecine moderne (Haba, 2008).
Actuellement, les plantes aromatiques possèdent un atout considérable grâce à la découverte

progressive des applications de leurs huiles essentielles (Tchamdja, 1995). Les huiles
essentielles et les plantes aromatiques en général sont utilisées pour leurs importante
propriétés médicinales principalement les propriétés anti-inflammatoires, antiseptiques,
antivirales, antifongiques, bactéricides, antitoxiques, insecticides, tonifiantes, stimulantes,
calmantes, etc. (Nicolas, 1991 ; Mishara et Dubey al., 1994).
L’Algérie est un pays connu pour sa biodiversité, il dispose d’une flore particulièrement
riche et variée. On compte environ 3000 espèces dont 15 % endémiques et appartenant à
plusieurs familles botaniques (Quenzel et Santa, 1963). Bien que le Sahara algérien soit
connu pour son hostilité, et son grand potentiel floristique constitué de plantes médicinales,
toxiques, et condimentaires, cette richesse connait une dégradation intense depuis quelques
décennies. Les espèces évoluant dans ce milieu tels que les Euphorbiaceaes renferment
diverses familles de composés chimiques tels que les alcaloïdes (Nazaré et al., 2005), les
saponines (Tripathi et al., 1980), les terpènes (Mazoir et al., 2008), les flavonoïdes, les
composés cyanogéniques (Hunsa et al .,1995) .
Ce mémoire est consacré à évaluer l’activité antimicrobienne des huiles essentielles d’une
plante médicinale Euphorbia sp sur les bactéries pathogènes d’origine tellurique.
La stratégie expérimentale de notre travail sera présentée comme suit :
 Une partie théorique citant des généralités sur la plante, les huiles essentielles et les
bactéries pathogènes du sol.
 Partie pratique comportant :
1- La récolte de la plante Euphorbia sp et son identification.
2- Séchage, broyage et conservation de la poudre végétale pour l’extraction des huiles
essentielles.
1
Introduction
3- Extraction des huiles essentielles.

4- Prélèvement des échantillons de différents sols.
5- Identification des souches bactériennes prélevées.
6- Evaluation de l’effet des huiles essentielles extraites sur les souches identifiées.
 Une conclusion.
2
Chapitre I
Synthèse
bibliographique
Chapitre 1 synthèse bibliographique
I.1 Description et composition d’euphorbia sp

I .1.1 Description botanique
La famille des Euphorbiaceae, avec ses 5000 à 10000 espèces regroupées dans près de 300
genres (Spichigera, 2000) est l’une des familles les plus vastes et les plus cosmopolites que
compte le sous embranchement des Angiospermes. Paradoxalement, il s’agit de l’une des
moins connue du point de vue systématique. Deux explications peuvent être apportées à cet
état de fait ; premièrement sa distribution, puisque elle est principalement localisée en des
zones tropicales, mais aussi en raison de l’existence de «fleurs minutes » chez certains de ses
représentants ne facilitant évidemment en rien toute étude botanique (Webster, 1987). Cette
famille est très hétérogène. Les plantes qui la constituent varient à la fois par leur appareil
végétatif ainsi que par la structure de leurs fleurs (Ozenda, 1991 ; Bruneton, 1996).
Les feuilles de formes très variables, sont en général longuement pétiolées, alternes, voire
plus rarement opposées, simples ou composées, palmatinervées ou pennatinervées (Ozenda,
1991 ; Spichiger et al., 2000). Pour certaines espèces, elles sont réduites à des épines. Le
limbe est le plus souvent denté. Des glandes sécrétrices sont généralement présentes sur le
pétiole, le limbe et la marge du limbe.
Les inflorescences sont très variables puisqu’il s’agit de cymes, de thyrses, de grappes,
d’épis ou de panicules, généralement bisexués.
Les fleurs sont déclines et rarement isolées, plus souvent groupées en grappes et chez
certains genres réunies pour former un dispositif appelé cyathe, comme dans le genre
Euphorbia. La fleur est cyclique, achlamyde ou haplochlamyde et dans ce cas, actinomorphe
et sépaloïde, trimère ou pentamère, hypogyne et unisexuée. Les sépales sont libres ou soudés
par la base. La fleur mâle, souvent exempte de pétales, contient de 0 à un nombre indéfini de
sépales et de 1 à un nombre indéfini d’étamines. Les anthères présentent une déhiscence qui
peut être longitudinale, transversale ou encore poricide. Un ovaire rudimentaire est parfois
présent. La fleur femelle ne contenant pas de pétales, peut compter de 0 à un nombre indéfini
de sépales et 3 carpelles. L’ovaire, la plupart du temps tricarpellé et triloculaire, est surmonté
de 3 styles libres ou partiellement soudés à la base, eux même surmontés de 3 stigmates.
Le fruit est une capsule tricoque à déhiscence loculicide, septicide ou encore un
schizocarpe à déhiscence explosive. La graine est albuminée et caronculée (Ozenda, 1991 ;
Spichiger et al., 2000).
3
Fig.1 : Port de l’espèce, tige fleurie, détail d'une fleur d’Euphorbia sp.
(Ionut-Florin, 2016).
I.1.2 Taxonomie et systématique

D’après les classifications botaniques classiques, les Euphorbiacées sont classées dans les
dicotylédones (Quenzel, 1963). Webster en 1987 propose une classification et reconnaît cinq
sous-familles des Euphorbiaceae: phyllanthoïdeae, oldfieldioideae, Acalyphoideae,
crotonoideae et Euphorbiadeae. Le genre Euphorbia est ainsi classée (Ozenda, 1991;
Spichiger RE, 2000; Bruneton, 1996):
Règne : Plantae
Embranchement : Magnoliophyta
Sous-embranchement : Angiospermes
Classe : Magnoliopsida-dicotylédones
Ordre : Malpighiales
Famille : Euphorbiaceae
Genre : Euphorbia
4
La majorité des Euphorbes sont connue par leur noms vernaculaires « bouhliba », qui
signifie plante à sève laiteuse (Bellakhdar, 1997), car les euphorbes contiennent un suc
laiteux (liquide blanc) collant et irritant appelée latex. Ce latex provoque des irritations pour
les peaux sensibles, et il est capable de provoquer de grave dégâts des muqueuses buccales et
digestives, et qui peut causer au contacte des yeux une cécité temporaire (Bruneton b, 1999).
I.1.3 Répartition géographique
Les plantes du genre Euphorbia existe dans les endroits sableux et au littoral, communes
dans tout le Sahara septentrional et les régions pré-désertiques et peut s’observer même en
Europe (Haba, 2008).
I.1.4 Usage d’Euphorbia sp
De nombreuses populations mondiales utilisent les Euphorbiacées dans le traitement de
plusieurs affections telles que les maladies gastro-intestinales et la migraine (Singla et
Pathak, 1990). Les espèces de cette famille, possèdent des propriétés anti-cicatrisantes,
antibactériennes, antifongiques, anti-inflammatoires, anti-tumorale et antivirale (Hernandez
et al., 2003; Mavar et al., 2004 ; LI et al., 2008).
I.1.4.1 Utilisation traditionnelle
Les Euphorbes ont de multiples utilisations, à titre médicinal, elles sont employées
comme purgatif ou vésicant, contre les parasites intestinaux, l’asthme, les bronchites
chroniques, la migraine (Chaabi, 2007), pour traiter les morsures de serpent, dans le
traitement de la dysenterie, du choléra, et de la syphilis. Le latex des euphorbes est parfois
employé pour pécher en le jetant dans l’eau pour empoisonner les poissons. Il a été aussi
exploité pour produire du caoutchouc (Karharo, 1974).
I.1.4.2 Utilisation contre les bactéries
Plusieurs plantes médicinales ont été utilisées comme agent antimicrobien et s’avère être
très efficace. Concernant le genre Euphorbia, très peu d’étude ont été réalisée pour la mise en
évidence de cette activité et ce avec des extraits polyphénoliques mais rarement avec des
extraits d’huiles essentielles. En outre, l’évaluation de l’activité antibactérienne de deux
extraits d’Euphorbia sp (Méthylène chloride-Méthanol, et le n-butanol) a été réalisée contre
quelques souches bactérienne ; soit : Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Klepsiella
pneumoniae, Enterobacter, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, et a donné des résultats
satisfaisants. (Zellagui et al., 2012).
5
I.1.4.3 Utilisation contre les insectes

Dans l’objectif de découvrir de nouvelles techniques pour lutter contre les insectes
nuisibles, l’utilisation des substances secondaires des plantes, a suscité de nombreux
chercheurs, les travaux les plus récents sont ceux de Kemassi et al (2014) où ils ont
démontrés que les extraits aqueux d’Euphorbia sp exerçait sur les larves comme sur les
adultes des insectes (schistocerca gregaria) ont une action sur leur prise de
nourriture manifestée par une diminution significative et une abstinence de la prise
alimentaire, une action sur la croissance pondérale et enfin une action sur la mortalité.
I.1.5 Composition phytochimique et application pharmacologique
d’Euphorbia sp
Les plantes du genre Euphorbia ont fait l’objet de nombreuses investigations
phytochimiques et pharmacologiques. Ces études qui concernent particulièrement leur latex,
ont permis l’isolement et la caractérisation d’un nombre important de métabolites secondaires
(Haba, 2008).
Les composés identifiés et souvent présents dans les plantes du genre Euphorbia
appartiennent à trois classes de métabolites secondaires : les diterpènes, les triterpènes et les
stéroïdes. Ils se repartissent comme suit : (Haba, 2008)
- un diterpène polycyclique nouveau à squelette tigliane, dérivé du phorbol
- un diterpène macrocyclique à squelette jatrophane
- deux diterpènes de type abiétane lactone appartenant à la série ent
- un diterpène à squelette ent-atisane.
- un triterpène de type cycloartane nouveau
- quatre triterpènes tétracycliques à squelette cycloartane
- deux triterpènes tétracycliques à squelette lanostane
- un triterpène tétracyclique à squelette euphane
- un triterpène tétracyclique à squelette tirucallane
- deux triterpènes pentacycliques à squelette multiflorane
- un triterpène pentacyclique à squelette taraxerane
- un triterpène acyclique
- deux stéroïdes.
6
Cette étude montre la richesse des plantes du genre Euphorbia en métabolites

secondaires de type diterpènes et triterpènes particulièrement tétracycliques. Ces derniers sont
d’ailleurs utilisés comme marqueurs chimiotaxonomiques.
I.1.6 Toxicité d’Euphorbia sp
Le genre Euphorbia contient du caoutchouc et des quantités importantes de résine, mais
le point principal commun de ce genre est la présence de la sève blanche, qui apparaît à la
cassure (tiges, feuilles, fruit et racines). La toxicité du latex d’Euphorbia sp est due à la
présence de l’Euphorbone (C15H24O) (Berthelot, 1912), les esters diterpèniques (les esters de
phorbol) à titre d’exemple sont un mélange complexe de dérivés acylés et acétylés en 12 et 13
(ou l’inverse) du phorbol, ingénol et du myrsinol. Le pouvoir irritant s’accroit lorsque la
longueur de la chaine augmente (Bruneton a, 1999).
I.2 Les substances actives : Huiles essentielles
I.2.1. Historique
Les huiles essentielles ont, à toutes époques, occupées une place importante dans la vie
quotidienne de l’homme dont il se servait pour se parfumer, aromatiser sa nourriture ou même
se soigner. La connaissance des huiles essentielles remonte à fort longtemps puisque l'homme
préhistorique pratiquait déjà, à sa manière, l'extraction des principes odorants des plantes. Il
plongeait, dans un récipient rempli d'eau, des plantes odorantes et des pierres brûlantes. La
vapeur dégagée entraînait les molécules volatiles, puis le tout était recueilli à l'aide d'une peau
d'animal dont l'essorage donnait quelques gouttes d'huile essentielle (Robert, 2000).
Au fil des siècles, l'extraction et l'usage des principes odorants des plantes se sont
développés, notamment par les civilisations arabe et égyptienne, qui leurs attribuaient avant
tout un usage religieux (Sell, 2006). Puis progressivement, ces huiles essentielles se font
connaître pour leurs vertus thérapeutiques et deviennent alors des remèdes courants de
médecine traditionnelle. (Buchbauer et al., 1993). De nos jours, la médecine moderne utilise
les vertus thérapeutiques des huiles essentielles et de leurs constituants. En effet, de nombreux
composés volatils sont aujourd'hui des ingrédients courants des préparations pharmaceutiques
(Pauli, 2001).
I.2.2 Définition
Les huiles essentielles encore appelées essences ou huiles volatils, sont des substances
huileuses, volatiles, d’odeur et de saveur généralement fortes, extraites à partir des différentes
parties de certaines plantes aromatiques, par des méthodes de distillation, d’enfleurage,
7
d’expression par solvant ou par d’autres méthodes (Belaiche, 1979 ; Valnet, 1984 ; Wichtel
et al., 1999).
D’après Bruneton a (1999), les essences sont «des produits de compositions généralement
assez complexes renfermant des principes volatils contenus dans les végétaux et plus ou
moins modifiés au cours de la préparation».
La norme française AFNOR NF T75-006 définit l’huile essentielle comme: «un produit
obtenu à partir d’une matière première végétale, soit par entraînement à la vapeur, soit par des
procédés mécaniques à partir de l’épicarpe des Citrus, et qui sont séparés de la phase aqueuse
par procédés physiques » (Garnero, 1996).
I.2.3 Répartition et localisation
On rencontre les huiles essentielles dans diverses familles botaniques elles se localisent
dans toutes les parties vivantes de la plante et se forment dans le cytoplasme des cellules
spécialisées (Degryse et al., 2008) .
I.2.3.1 Répartition
Les huiles essentielles sont largement répandues dans le règne végétal principalement
chez les végétaux supérieurs, il existe environ 17500 espèces aromatiques dans le monde.
Les familles botaniques capables d'élaborer les constituants qui composent les huiles
essentielles sont réparties dans un nombre limité de familles, Exemple : Myrtaceae (Girofie),
Lauraceae (laurier), Rulaceae (citron), Lamiaceae (Menthe), Apiaceae (Coriandre),
Zingiberaceae (Gingembre) … etc (Bellakhdar, 1997).
Les huiles essentielles peuvent être stockées dans tous les organes de la plante, tels que les
sommités fleuries (Menthe, Lavande), les feuilles (Eucalyptus, Laurier), les rhizomes
(Gingembre), les fruits (agrumes, badiane, anis), les racines (Vétiver), les graines (Muscades),
et plus rarement les écorces (Cannelier) (Bellakhdar, 1997).
I.2.3.2 Localisation
Les huiles essentielles sont élaborées par des glandes sécrétrices qui se trouvent sur
presque toutes les parties de la plante. Elles sont sécrétées au sein du cytoplasme de certaines
cellules où elles se rassemblent sous formes de petites gouttelettes comme la plupart des
substances lipophiles (Gonzalez-Trujano et al., 2007).
La synthèse et l'accumulation des huiles essentielles sont généralement associées à la présence
de structures histologique spécialisé, souvent localisée sur ou à proximité de la surface de la
plante. Ces structures peuvent être des cellules à huiles essentielles (Lauraceae) ; des poils
8
sécréteurs (laminaceaes), des poches sécrétrices (Myrtaceaes , Rutaceaes, Laminaceaes), et

des canaux sécréteurs qui existent dans de nombreuses familles. Il est intéressant de citer que
les organes d'une même espèce peuvent renfermer des huiles essentielles de composition
différente selon leurs localisations dans la plante (Degryse et al., 2008).
I.2.4 Composition chimique
Comme toute substance, les huiles essentielles se caractérisent par une composition
chimique analysable et très variable. Le nombre de composants isolés est de plusieurs milliers
et il en reste beaucoup à découvrir (Bruneton b, 1999) Ces constituants appartiennent, de
façon quasi exclusive, à deux groupes, caractérisés par des origines biogénétiques distinctes :
le groupe des terpénoїdes (les composés terpéniques) et le groupe des composés aromatiques
dérivés du phenylpropane, moins fréquents. Elles peuvent également renfermer d’autres
composants non volatils issus des processus de dégradation (Bruneton c, 1999).
I.2.4.1 Les composés terpéniques
Les terpènes constituent une famille de composés largement répandus dans le règne
végétal. Leur particularité structurale la plus importante est la présence dans leur squelette
d’une unité isoprénique à cinq atomes de carbone (C 5H8) reconnue par Wallach dès 1887
(Lamarti et al., 1994). Cet isoprène est à la base du concept de la «règle isoprénique»
énoncée en 1953 par Ruzicka (Lamarti et al., 1994).Cette règle considère le diphosphate
d’isopentényle (IPP), désigné sous le nom d’isoprène actif comme le véritable précurseur de
la molécule terpénique. Les systèmes enzymatiques responsables de cette conversion (IPP en
composés terpéniques dans les trois compartiments: cytoplasmes, mitochondries et plastes)
sont hydrosolubles ou membranaires. Ces derniers permettent l’élongation de la chaine
isoprénique conduisant à tout l’éventail des composés terpéniques à 10, 15, 20 et 30 atomes
de carbones (Lamarti et al., 1994). Seuls les terpènes dont la masse moléculaire est
relativement faible (mono – et sesquiterpènes) sont rencontrés dans les huiles essentielles
(Bruneton b, 1999), représentant la base de leurs propriétés olfactives, en leur conférant un
caractère volatil (Pibiri, 2006).
Il convient de souligner que la synthèse des terpènes n’est pas propre aux végétaux. Le
squalène, est un terpène abondant chez les requins. Des sesquiterpènes et des diterpènes se
rencontrent également chez les spongiaires et les coelenthérés (Guignard, 2000)
Les terpènes sont constitués d’un mélange d’hydrocarbures et de composés oxygénés
dérivés de ces hydrocarbures. Dans certaines huiles essentielles, les hydrocarbures
9
prédominent (comme l’essence de Térébenthine), dans d’autres, la majeure partie de l’essence

est constituée de composés oxygénés. Il est à noter que l’odeur et le goût des huiles
essentielles sont donnés par ces composés oxygénés. Parmi ces composés, on note les alcools
(géraniol, linalol), les esters (acétate de linalyle), les aldéhydes (menthone, camphre,
thuyone), les cétones, les éthers, les phénols et les peroxydes (Paris et al., 1981; Svoboda et
al., 1999).
I.2.4.1.1Les monoterpènes
Les composés monoterpéniques sont constitués de deux unités d’isoprène, leur formule
chimique brute est C10H16 (Rahal, 2004). Ces composés peuvent être: des monoterpènes
acycliques (myrcène, ocimènes), monoterpènes monocycliques (α- et γ-terpinène, p-cymène)
et des monoterpènes bicycliques (pinènes, Δ3-carène, camphène, sabinène). Selon Bruneton
b (1999), la réactivité des cations intermédiaires justifie l’existence de nombreuses molécules
caractérisées par différentes fonctions: alcools, cétones, esters, aldéhydes, éthers, peroxydes et
phénols.
I.2.4.1.2 Les sesquiterpènes
Ils comportent trois unités d’isoprène, leur formule est C15H24 soit une fois et demie
(sesqui) la molécule des terpènes (Belaiche, 1979). Ils présentent une grande variété dans les
structures conduisant à un nombre élevé de possibilités, ce qui a retardé l’élucidation de leurs
structures (Rahal, 2004). Les sesquiterpènes peuvent être également, comme les
monoterpènes, acycliques (farnésol), monocycliques (humulène, α-zingibèrène) ou
polycycliques (matricine, artéannuine, β,artémisinine). Ils renferment aussi des fonctions
comme les alcools (farnésol, carotol, β-santalol, patchoulol), les cétones (nootkatone, cis-
longipinane-2.7-dione, β-vétivone), les aldéhydes (sinensals), et les esters (acétate de cédryle)
(Bruneton b, 1999 ; Laouer, 2004).
I.2.4.2 Les composés aromatiques dérivés du phenylpropane
En plus des terpènes, les huiles essentielles renferment aussi des composés aromatiques
dérivés du phénylpropane (C6-C3), mais qui sont beaucoup moins fréquents que les terpènes et
dont la biogenèse est totalement différente (Paris et al., 1981). Bruneton c (1999) considère
que ces composés sont très souvent des allyl- et propenyl phénols, parfois des aldéhydes,
caractéristiques de certaines huiles essentielles d’Apiacées (Anis, Fenouil: anéthole,
anisaldehyde, méthyl-chavicol=estragole. Persil : apiole) mais aussi de celles du Girofle
(eugénol), de la Muscade (safrol, eugénol), de l’Estragon (eugénol), du Basilic (eugénol), de
10
l’Acore (asarones) ou des Cannelles (cinnamaldéhyde eugénol safrol). On peut également

selon le même auteur, rencontrer dans les huiles essentielles des composés en C6-C1 comme la
vanilline (assez fréquente) ou l’anthranilate de méthyle. Les lactones dérivées des
cinnamiques (par exemple les coumarines) étant, au moins pour les plus simples d’entre elles,
entraînables par la vapeur d’eau, sont également présentes dans certaines huiles essentielles.
I.2.4.3 Les composés d’origines diverses
Ce sont des produits résultant de la transformation de molécules non volatiles entraînables
à la vapeur d’eau. Il s’agit de composés issus de la dégradation d’acides gras et de terpènes.
D’autres composés azotés ou soufrés peuvent subsister mais sont rares. Enfin, il n’est pas rare
de trouver dans les concrètes, des produits de masses moléculaires plus importantes non
entraînables à la vapeur d’eau, mais extractibles par les solvants tels que les homologues des
phénylpropanes, diterpènes, etc… (Bruneton c, 1999). Abou Zeid (1988) signale que le
composé soufré le plus rencontré est l’allyl-isothiocyanate issu de la dégradation d’un
glucoside sinigroside qui se trouve dans les graines de moutarde noire. Ce composé est
incolore, fluide et de saveur piquante. Certaines plantes aromatiques produisent des huiles
essentielles dont les composés terpéniques renfermant l’élément nitrogène. Parmi ces
composés on cite l’indole, qui se trouve dans l’huile essentielle du citron et des fleurs de
jasmin.
11
Fig.2: Structure chimique de quelques composés des huiles essentielles

(Bakkali et al., 2008)
I.2.5 Propriétés et caractéristique des huiles essentielles
I.2.5.1 Propriétés physicochimiques
Les principales caractéristiques physicochimiques communes des huiles essentielles sont
(Bruneton a, 1999) :
 Liquides à température ambiante ;
 Elles n'ont pas le toucher gras et onctueux des huiles fixes ;
 Elles sont volatiles et très rarement colorées ;
 Les huiles essentielles à forte teneur en monoterpènes ont une densité faible ;
 Leur indice de réfraction vari essentiellement en fonction de la teneur en
monoterpènes et en dérivés oxygénés. Une forte teneur en monoterpènes donnera un
indice élevé, cependant une teneur élevée en dérivés oxygénés produira l'effet
inverse ;
 Elles sont solubles dans les alcools à titre alcoométrique élevé et dans la plupart des
solvants organiques mais peu solubles dans l'eau ;
12
 Elles sont dotées d'un pouvoir rotatoire puisqu'elles sont formées principalement de
composés asymétriques ;
 Elles sont très altérables, sensibles à l'oxydation et ont tendance à se polymériser
donnant lieu à la formation de produits résineux, il convient alors de les conserver à
l'abri de la lumière et de l'humidité (Zabeirou et al., 2005).
I.2.5.2 Propriétés pharmacologiques et activités biologiques
Depuis leur découverte les huiles essentielles sont très utilisées dans les préparations
pharmaceutiques, grâce aux diverses activités biologiques qu’elles possèdent (Luque de
Castro et al, 1999). En phytothérapie, elles sont utilisées pour leurs propriétés antiseptiques
contre les maladies infectieuses, cependant, elles possèdent également des propriétés
cytotoxiques qui les rapprochent donc des antiseptiques et désinfectants entant qu'agents
antimicrobiens à large spectre (Hammoudi, 2008; Ferhat et al., 2009).
I.2.5.2.1 Pouvoir Antibactérien
De nombreuses études ont été réalisées en vue de l’estimation du pouvoir antiseptique des
huiles essentielles depuis très longtemps, par exemple en 2000, Dorman et Deans ont étudié
l’activité de l’HE du poivre (Piper nigrum), du géranium (Pelargonium graveolens), d’origan
(Origanum vulgare) et du thym (Thymus vulgaris) sur 25 genres différents de bactéries. Les
huiles volatiles ont montré des effets inhibiteurs considérables contre tous les micro-
organismes testés, alors que leurs constituants majeurs ont montré des degrés différents au
niveau de la culture bactérienne.
Hammer et al (1999) ont conduit une étude qui portait sur l’activité antimicrobienne de 47
huiles essentielles contre 10 microorganismes dont une levure (Candida albicans), tous les
microorganismes sont inhibés par les huiles essentielles de Cymbopogon citratus, Origanum
vulgare et de Pimenta racemosa à des concentrations inferieurs ou égales à 2% par contre ces
microorganismes ne sont pas inhibés par l’huile essentielle de Salvia officinalis à la
concentration de 2%. Ohno et al. (2003), ont trouvé que les huiles essentielles de la
citronnelle et du citronnier, empêchent la croissance de Helicobacter pylori (même les
souches résistantes) et réagissent même dans des conditions d’acidité. D’après Mohammedi
(2006) l’essence des feuilles de Lavandula. stoechas est un agent antibactérien efficace contre
Klebsiella pneumoneae, Proteus mirabilis et E. coli. Tandis que, l’huile de Cistus ladaniferus
s’est avérée efficace contre Listeria monocytogenes.
13
Il a été montré également que certaines huiles essentielles ne manifestent aucun pouvoir
antimicrobien, citons celle de Cupressus dupreziana, testée par Ramdani et al. (2007) qui
s’est montrée complètement inactive contre trois souches bactériennes: E. coli, S. aureus et P.
aeruginosa. De même l’huile de Marrubium deserti étudiée par Benalia (2008) a été inactive
vis-à-vis plusieurs bactéries et deux champignons.
I.2.5.2.2 Pouvoir antivirale
Les huiles essentielles détruisent les agents pathogènes responsables de l'infection
(microbes, champignons, virus, toxines infectieuses). Elles sont donc utiliser dans le
traitement des affections virales, telles que la grippe, l'herpès, le zona, le sida et la
poliomyélite. Elles parviennent à chasser les déchets accumulés dans le corps et qui n'ont pu
être évacués par les voies naturelles d'élimination, tout en respectant la flore. Elles renforcent
également les défenses immunitaires du corps. Les molécules aromatiques qui agissent dans
ce sens sont ; les monoterpénols (sans effet secondaire) (Sylvie, 2001).
Plusieurs huiles essentielles possèdent des propriétés antivirales. Nous pouvons citer l’huile
essentielle de Ravintsara, l’huile essentielle de Bois de Hô, et l’huile essentielle de Cannelle
de Ceylan (Purchon, 2001 ; Willem, 2002).
I.2.5.2.3 Pouvoir antifongique
Les huiles essentielles agissent très bien sur différentes mycoses. Il est important de savoir
que celles-ci ne se développent pas sur un terrain acide. Ainsi, en alcalinisant un terrain non
acide mais prédisposé aux mycoses, il est tout à fait possible d'éviter les infections fongiques
(Sylvie, 2001).
Parmi les huiles essentielles ayant un pouvoir antifongique, on peut citer celle de Melaleuca
alternifolia (tea tree), de Syzygium aromaticum (giroflier) ou encore de Cinnamomun verum
(cannelle de Ceylan) (Bruneton, 2009).
I.2.5.2.4 Pouvoir antiparasitaires
Les huiles essentielles du thym à linalol, et de la sarriette des montagnes sont d'excellentes
antiparasitaires (Purchon, 2001 ; Willem, 2002).
I.2.5.2.5 Pouvoir antiseptiques
Les propriétés antiseptiques et désinfectantes sont souvent retrouvées dans les huiles
essentielles possédant des fonctions aldéhydes ou des terpènes comme l’huile essentielle
d’Eucalyptus radiata (Purchon, 2001 ; Willem, 2002).
14
I.2.5.2.6 Pouvoir insecticides

Certaines huiles essentielles sont insectifuges ou insecticides telles que celles possédant
des fonctions aldéhydes comme le citronnellal contenu dans l’Eucalyptus citronné ou la
citronnelle (Purchon, 2001 ; Willem, 2002).
I.2.5.2.7 Pouvoir anti-inflammatoire
Les huiles essentielles possédant des aldéhydes ont des propriétés actives contre
l’inflammation par voie interne comme l’huile essentielle du Gingembre (Purchon, 2001 ;
Willem, 2002).
I.2.5.2.8 Pouvoir antispasmodique
Les huiles essentielles possédant des esters ou des éthers possèdent une action sur les
spasmes des muscles lisses ou striés comme l’huile essentielle de l’Hélichryse (Purchon,
2001 ; Willem, 2002).
I.2.5.2.9 Pouvoir calmant, anxiolytique
Les aldéhydes de type citrals contenu par exemple dans l’huile essentielle de Mélisse ou
celle de la Verveine citronnée favorisent la détente et le sommeil (Purchon, 2001 ; Willem,
2002).
I.2.5.2.10 Pouvoir cicatrisant
Les huiles essentielles cicatrisantes sont les huiles essentielles de Ciste (Cistus
ladaniferus), de Lavande vraie (Lavandula vera ), d’Immortelle (Helichrysum italicum), et de
Myrrhe(Commiphora myrrha). On utilise souvent un mélange de plusieurs huiles essentielles
cicatrisantes avec une huile végétale comme l’huile d’amande douce (Purchon, 2001 ;
Willem, 2002).
I.2.6 Caractérisation phytochimiques des huiles essentielles
L’instrumentation moderne est progressivement confrontée à des analyses de plus en plus
complexes, liées au nombre important de constituant présents et aux quantités extrêmement
faibles à détecter. En effet l’analyse d’une huile est complexe, de par son très grand nombre
de constituants chimiques volatils mais aussi, souvent, de par l’importance des composés à
l’état de traces qui font le caractère spécifique de l’huile essentielle (France-Ida, 1998).
La technique incontournable pour individualiser les constituants d’un mélange reste la
chromatographie en phase gazeuse (CPG). Son couplage à un détecteur à ionisation de
flamme (DIF) permet la quantification des constituants et le calcul de leur indice de rétention.
15
La CPG est souvent combinée avec une technique d’identification spectrale. Généralement la
spectrométrie de masse (SM) ou la spectrométrie infrarouge par transformée de Fourier
(IRTF). Une nouvelle voie d’analyse est le recours à la RMN du carbone-13 décrite par
Formacek et Kubeczka et développée par Casanova et coll (Julien, 2005). Elle permet
d’identifier les constituants d’un mélange complexe sans individualisation et sans séparation
préalable.
I.2.6.1 Chromatographie en phase Gazeuse (CPG/DIF)
Cette technique permet l’analyse qualitative des mélanges très complexes de composés
gazeux ou susceptibles d’être vaporiser par chauffage sans décomposition.
La CPG repose sur le principe de migration différentielle des constituants d’un mélange à
travers une phase stationnaire. Elle est basée sur la partition des composés injectés entre une
phase stationnaire (liquide ou solide) et une phase mobile gazeuse (Castello, 1999).
I.2.6.2 Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de
masse (GPC/SM)
L’idée de coupler une autre méthode physique d’investigation après séparation
chromatographique, dans le but d’ajouter à la chromatographie une deuxième dimension
analytique, s’est concrétisée dès 1960 dans la combinaison entre la chromatographie en phase
gazeuse et la spectrométrie de masse CPG-SM (De Maack et al., 1994).
Le principe de cette méthode consiste à transférer par le gaz vecteur (phase mobile) les
composés séparés par chromatographie en phase gazeuse dans le spectromètre de masse au
niveau duquel, ils vont être fragmentés en ions de masse variables dont la séparation sera en
fonction de leur masse. La comparaison informatique du spectre d’un pic inconnu avec une ou
plusieurs librairies de référence permet son identification à condition que la similitude des
spectres, inconnus et référence, soit suffisant et que les indices de rétention soient identiques,
dans des conditions opératoires comparables (Desjobert et al., 1997; Bruneton c, 1999).
I.2.7 Procédés d’extraction des huiles essentielles
Différentes méthodes sont mises en œuvre pour l'extraction des essences végétales. En
général le choix de la méthode d'extraction dépendra de la nature du matériel végétal à traiter
(graines, feuilles, ...), de la nature des composés (par exemple, les l'huile essentielles, huiles
lourdes....), du rendement en huile et de la fragilité de certains constituants des huiles aux
températures élevées (Marie Elisabeth et al., 2005).
16
Les étapes de l'extraction des huiles essentielles d'origine végétale restent identiques quelque
soit le type d'extraction utilisé. Il est nécessaire dans un premier temps d'extraire de la matière
végétale les molécules aromatiques constituant l'huile essentielle, puis dans un second temps
de séparer ces molécules du milieu par distillation (Marie, 2005). Parmi les méthodes
d’extraction, nous citons :
I.2.7.1 Montage L’hydrodistillation
Il s'agit de la méthode la plus simple et de ce fait la plus anciennement utilisée. Le
principe de l'hydrodistillation correspond à une distillation hétérogène qui met en jeu
l'application de deux lois physiques (loi de Dalton et loi de Raoult) .Le procédé consiste à
immerger la matière première végétale dans un ballon lors d'une extraction au laboratoire ou
dans un alambic industriel rempli d'eau placé sur une source de chaleur. Le tout est ensuite
porté à ébullition. La chaleur permet l'éclatement des cellules végétales et la libération des
molécules odorantes qui y sont contenues. Ces molécules aromatiques forment avec la vapeur
d'eau, un mélange azéotropique. Les vapeurs sont condensées dans un réfrigérant et les huiles
essentielles se séparent de l'eau grâce à la différence de densité (Pavida et al., 1976). Au
laboratoire, le système équipé d'une cohobe généralement utilisé pour l'extraction des huiles
essentielles est le Clevenger (fig3)
Fig.3 : Montage d'hydrodistillation (Pavida et al., 1976)

Les eaux aromatiques ainsi prélevées sont ensuite recyclées dans l'hydrodistillateur afin de
maintenir le rapport plante/eau à son niveau initial. La durée d'une hydrodistillation peut
considérablement varier, pouvant atteindre plusieurs heures selon le matériel utilisé et la
matière végétale à traiter. La durée de la distillation influe non seulement sur le rendement
mais également sur la composition de l'extrait (Pavida et al., 1976).
17
I.2.7.2 L’entraînement à la vapeur d'eau

L’entraînement à la vapeur d’eau est l’une des méthodes officielles pour l’obtention des
huiles essentielles. A la différence de l’hydrodistillation, cette technique ne met pas en contact
direct l’eau et la matière végétale à traiter. De la vapeur d’eau fournie par une chaudière
traverse la matière végétale située au-dessus d’une grille. Durant le passage de la vapeur à
travers le matériel, les cellules éclatent et libèrent l’huile essentielle qui est vaporisée sous
l’action de la chaleur pour former un mélange « eau + huile essentielle ». Le mélange est
ensuite véhiculé vers le condenseur et l’essencier avant d’être séparé en une phase aqueuse et
une phase organique qui est l’huile essentielle. L’absence de contact direct entre l’eau et la
matière végétale, puis entre l’eau et les molécules aromatiques évite certains phénomènes
d’hydrolyse ou de dégradation pouvant nuire à la qualité de l’huile (Marie, 2005).
I.2.7.3 L’hydrodiffusion
L’hydrodiffusion (fig4) est une variante de l’entraînement à la vapeur, Dans le cas de
l’hydrodiffusion, le flux de vapeur n’est pas ascendant mais descendant. Cette technique
exploite ainsi l’action osmotique de la vapeur d’eau. Le principe de cette méthode réside dans
l’utilisation de la pesanteur pour dégager et condenser le mélange « Vapeur d’eau + huile
essentielle » dispersé dans la matière végétale. Comme pour l’entraînement à la vapeur d’eau,
l’hydrodiffusion présente l’avantage de ne pas mettre en contact le matériel végétal et l’eau.
De plus, l’hydrodiffusion permet une économie d’énergie due à la réduction de la durée de la
distillation et donc à la réduction de la consommation de vapeur (Marie, 2005).
Fig.4: Entraînement à la vapeur d’eau ascendante et descendante (Marie, 2005)
18
I.2.7.4 L'expression à froid

Elle constitue le plus simple des procédés, mais ne s'applique qu'aux agrumes dont
l'encore des fruits comporte des poches sécrétrices d'essences. Ce procédé consiste à broyer, à
l'aide de presses, les zestes frais pour détruire les poches afin de libérer l'essence. Le produit
ainsi obtenu porte le nom d'essence, car il n'a subi aucune modification chimique (Roux,
2008).
I.2.7.5 L’extraction par solvants
La méthode de cette extraction est basée sur le fait que les essences aromatiques sont
solubles dans la plupart des solvants organiques. L'extraction se fait dans des extracteurs de
construction variée, en continu, semi-continu ou en discontinu. Le procédé consiste à épuiser
le matériel végétal par un solvant à bas point d'ébullition qui par la suite, sera éliminé par
distillation sous pression réduite. L'évaporation du solvant donne un mélange odorant de
consistance pâteuse dont l'huile est extraite par l'alcool. L'extraction par les solvants est très
coûteuse à cause du prix de l'équipement et de la grande consommation des solvants. Un autre
désavantage de cette extraction est leur manque de sélectivité; de ce fait, de nombreuses
substances lipophiles (huiles fixes, phospholipides, caroténoïdes, cires, coumarines, etc.)
peuvent se retrouver dans le mélange pâteux et imposer une purification ultérieure (Brian,
1995).
I.2.7.6 L’extraction par micro-ondes
C’est un procédé utilisant les micro-ondes et les solvants transparents aux micro-ondes
pour extraire de façon rapide et sélective des produits chimiques de diverses substances
(Paré, 1997). Le matériel végétal est immergé dans un solvant transparent aux micro-ondes
de manière a ce que seul le végétal soit chauffé. Les micro-ondes vont chauffer l’eau présente
dans le système glandulaire et vasculaire de la plante, libérant ainsi les produits volatils qui
passent dans le solvant (non chauffé). On filtre et on récupère ensuite l’extrait. L’extraction
par micro-ondes a le grand avantage de réduire le temps d’extraction à quelques secondes
(Fig5) (France, 1996). Ce procédé très rapide et peu consommateur d’énergie, livre un
produit qui, est le plus souvent, de qualité supérieure à celle du produit d’hydrodistillation
traditionnelle (Bruneton a, 1999). Par ailleurs, l’analyse des huiles essentielles obtenues par
cette méthode a montré selon Scheffer (1996) que la composition qualitative des huiles
essentielles était la même que celle des huiles obtenues par distillation mais le pourcentage
des constituants variait de manière significative.
19
Fig.5 : Principe schématisé de l’appareillage d’hydrodistillation sous micro-ondes (Lagunez-

Rivera, 2006).
I.3 Généralités sur les bactéries pathogènes d’origine tellurique
I.3.1 Principales bactéries pathogènes du sol
Dans le sol, les microorganismes représentent la majorité des organismes vivants et
constituent une importante part de la diversité génétique de la planète. Il a été estimé qu’un
gramme de sol contenait de 10¹º à 10¹¹ bactéries (Horner-Devine et al., 2003), de 6000 à
50000 espèces bactériennes (Curtis et al., 2002) et jusqu’à 200 milles hyphes fongiques
(Leake et al., 2004). Les bactéries, représentent le groupe le plus nombreux et le plus varié,
puisque leur densité peut s’élever de dix millions à un milliard par gramme de sol. Du fait de
leur petite taille, leur poids reste inférieur à une tonne par hectare de sol. Ce qui donne aux
bactéries une place importante dans le sol, c’est leur extraordinaire variabilité biochimique qui
leur permet de transformer toutes les substances du sol et de les faire entrer dans le monde
vivant (Claude et al., 2008).
Au sein des communautés microbiennes du sol, certains microorganismes peuvent se
révéler pathogènes pour l’homme, les animaux et même les plantes. Le sol est un habitat
naturel pour certaines bactéries pathogènes primaires et opportunistes. Les bactéries
opportunistes telles que Burkholderia spp, Ochrobactrum spp et Stenotrophomonas spp sont
présentes dans la rhizosphère (Berg et al., 2005). Pseudomonas aeruginosa est aussi
rencontrée dans les sols (Colinon et al., 2013).
Les bactéries pathogènes primaires du genre Bacillus, telles que Bacillus cereus et
Bacillus anthracis sont des habitants naturels du sol (Ticknor et al., 2001; Granum, 2005).
20
Clostridium botulinum et Clostridium tetani sont également des bactéries telluriques

hautement pathogènes de l’homme (Smith, 1978; Smith, 1979). Listeria monocytogenes est
également une bactérie pathogène qui a une vie saprophyte dans le sol (Freitag et al. 2009).
I.3.2 Infection bactérienne d’origine tellurique
Les bactéries pathogènes peuvent être isolées du sol, des eaux douces, marines ou
saumâtres, de l’air, des profondeurs océaniques, des déchets radioactifs (Fredrickson et al.,
2004). Le sol est une source importante d’espèce pathogènes à l'origine de nombreuses
maladies infectieuses tel que le choléra, la syphilis, la peste, l’anthrax, la tuberculose (Kumar
et Tuteja, 2009 ; Xu et al., 2010).
La plupart des maladies provoquées par les bactéries pathogènes telluriques sont de nature
digestive. Elles peuvent être bénignes (troubles intestinaux, nausées) ou plus graves
(dysenteries). Citons comme exemple la Salmonella spp l’agent qui provoque le taux
d’hospitalisation le plus élevé et aboutit au plus fort taux de mortalité (Scallan et al., 2011).
La Listeria monocytogenes est également une bactérie pathogène qui entraine de forts taux de
mortalité parmi les personnes infectées. En revanche l’incidence de la listériose est plus faible
que celle des salmonelloses (EFSA, 2011; Goulet et al., 2012). Ces deux bactéries
manifestent leur symptomatologie par une gastroentérite chez les hôtes sains mais les
symptômes peuvent être plus graves (septicémies, méningites) chez les personnes
immunodéprimées (Sindic, 2002).
Enterococcus faecalis et Escherichia coli sont aussi des bactéries pouvant être isolées du sol,
elles font partie de la flore intestinale des individus et sont inoffensives chez un sujet sain. En
revanche, chez un sujet immunodéprimé, elles peuvent induire une infection dont les
symptômes sont variés et non spécifiques de la bactérie (Sindic, 2002).
Les bactéries d’origine tellurique peuvent provoquer différents symptômes, qui différent
d’une bactérie à une autre, ces derniers peuvent apparaitre assez rapidement, de quelques
heures à quelques jours après le contact, cependant de nombreux facteurs peuvent intervenir,
parmi ces facteurs (Sindic, 2002) :
 La résistance des bactéries ;
 leur capacité à se multiplier ;
 la dose minimale infectante (DMI : quantité minimale de pathogènes absorbée par une
personne pour que les symptômes de la maladie se manifestent),
 la réponse de la personne contaminée, qui varie selon l’âge, le sexe et l’état de santé
21
I.3.3 Transmission des bactéries pathogènes du sol à l’homme

Les sols, soumis à des actions anthropiques (agriculture, industrie, urbanisation), peuvent voir
la composition de leurs communautés bactériennes modifiée. En agriculture, le recyclage de
produits résiduaires organiques (fumiers, lisiers, boues de station d’épuration) comme
fertilisants des sols peut introduire dans ceux-ci des bactéries potentiellement pathogènes de
l’homme telles que Salmonella spp, Escherichia coli et Listeria monocytogenes. Le sol est
l’unique support des productions végétales composant l’alimentation humaine. La présence de
bactéries pathogènes dans le sol peut altérer la qualité des productions agricoles et avoir de
graves répercussions sur la santé humaine (Aude, 2013). Les êtres vivants sont exposés aux
microorganismes pathogènes en ingérant des particules de sol, des fruits ou des légumes mal
lavés, une mauvaise hygiène (mains sales), ou une inhalation, lors d’activités en plein air, des
particules de sol polluées en suspension ou lors d’une manipulation des matières organiques
brutes (lisiers, fientes, fumiers, boues d’épuration urbaine).
I.3.4 Isolement et identification des bactéries pathogènes du sol
Les espèces bactériennes peuvent être identifiées de leurs caractères soit biochimique ou
antigéniques, pathogénique (classification en parhotype ou pathovars), enzymatiques, de
sensibilité aux antibiotiques, de sensibilité aux bactériophages.
D’autre critères se basent sur la composition de la paroi après application du protocole de
Gram, la morphologie micro ou macroscopique, la mobilité, la capacité à sporuler, la
température de croissance, les besoins nutritionnels, le mode respiratoire, la capacité de
photosynthèse, l’utilisation des différentes sources de carbone ou d’azote.
La notion d’espèce bactérienne ne peut être déterminée seulement par l’utilisation de ces
critères, mais aussi les propriétés génomiques qui sont principalement le rapport entre les
bases guanines ,cytosines, adénine et thymine dans la séquence d’ADN et la similarité de
séquences d’ADN obtenue par la technique d’hybridation ADN-ADN (Oren, 2004).
I.4 Lutte biologique contre les bactéries pathogènes telluriques
L’utilisation des antibiotiques à long terme à conduit à la sélection de populations
microbiennes résistantes. Cette résistance est due à des mutations chromosomiques ou à
l’acquisition de gènes de résistance portés par des éléments génétiques mobiles (plasmides,
phages). Ces résistances ont conduits à chercher de nouveaux agents antimicrobiens possédant
une efficacité plus importante que les médicaments synthétiques d’une part et bien accepté
22
par l’organisme d’autre part (sans exercer des effets délétères sur la santé humaine) (Garcia-
Ruiz et al., 2008 ; Kempf et Zeitouni, 2009).
Beaucoup d’études ont essayé d’évaluer l’activité antimicrobienne des extraits de plantes
médicinales telles que le fenouil (Foeniculum vulgare), la menthe poivrée (Mentha piperita),
le thym (Thymus vulgaris), elles ont trouvé que ces extraits sont actifs non seulement contre
les bactéries mais aussi contre les champignons, les levures et les virus (Jürgen et al., 2009).
D’autres groupes de chercheurs ont franchi une étape plus loin, ils ont isolé et identifié les
métabolites responsables de l’activité antimicrobienne des extraits des plantes, cette étape
constitue une plateforme pour plusieurs implications incluant l’industrie pharmaceutique, la
médecine alternative, et la thérapie naturelle (Huang et al., 2008).
23
Chapitre II
Matériels et méthodes
Chapitre II Matériels et méthodes
Notre travail consiste en une étude phytochimique, suivi d’une évaluation de l’activité
antibactérienne des substances bioactives (huiles essentielles) d’une plante médicinale de la
famille des Euphorbiaceae et du genre d’Euphorbia sur des bactéries pathogènes d’origine
tellurique.
Ce présent travail a duré environ quatre mois, du mois de Février jusqu'à la fin du mois de
Mai. Il a été réalisé au niveau du laboratoire de biologie des populations et des organismes
(BPO) de l’université de M’hamed Bouguera Boumerdes (UMBB), et au laboratoire de
bactériologie de l’Etablissement Publique Hospitalier de Thenia.
II.1. Matériel
II.1.1. Matériel biologique
Le matériel biologique utilisé est constitué d’un matériel végétal représenté par la plante du
genre Euphorbia, et d’un matériel microbiologique constitué d’une vingtaine de souches
bactériennes.
II.1.1.1. Matériel végétal
Le matériel végétal est constitué de toutes les parties de la plante Euphorbia sp (aérienne et
souterraine) dont la récolte a été faite en mois de Février 2017 dans la région de Ghardaïa
avec l’aide d’un herboriste de cette région.
II.1.1.2. Matériel microbiologique
Le support microbien utilisé est composé de vingt souches microbiennes isolées d’un sol de
culture de pomme de terre de la région de Ain timouchent et d’un sol d’une écurie de la
région de Corso (Boumerdès) puis conservées dans de la gélose nutritive à une température de
4°C.
II.1.2. Matériel non biologique
Afin de réaliser cette étude un ensemble de matériel classique composé d’appareils, de

réactifs, de produits chimiques et de verreries ont été utilisé, celui-ci est décrit en annexe 1.
24
II.2. Méthodes d’étude
Notre travail a été réalisé en quatre étapes :
 Un screening phytochimique de la poudre végétale de la plante

 Une extraction des huiles essentielles
 Un isolement et une identification des bactéries pathogènes prélevées du sol
 Une Evaluation de l’activité antibactérienne des huiles sur les bactéries isolées
L’ensemble des étapes de ce travail est résumé dans le diagramme ci-dessous : (fig 6)
Choix de la plante : Euphorbia sp Choix de la région : Ain timouchent, Corso
Récolte-Séchage-Broyage Récolte des échantillons du sol
Etude phytochimique Préparation des dilutions
Extraction des molécules bioactives Isolement des bactéries
Huiles essentielles Identification des bactéries
Evaluation de l’activité antibactérienne
Antibiogramme
Fig.6 : schéma général des différentes étapes du travail.
25
II.2.1. Séchage
Cette étape est réalisée dans l’objectif d’abaisser la teneur en eau des feuilles de la plante et
d’empêcher ainsi les réactions d’altération qui peuvent se produire. Ceci limite la prolifération
des microorganismes. La plante est séchée à température ambiante et à l’abri des rayons
solaire pendant deux semaines.
II.2.2. Broyage et conservation de la poudre
Le matériel végétal séché est réduit en poudre fine à l’aide d’un broyeur électrique. La
poudre obtenue est conservée à l’abri de l’air et de l’humidité, dans des bocaux en verre
hermétiquement fermés. Le broyat va constituer la matière sèche qui sera utilisée pour les
tests phytochimiques.
Fig.7 : poudre végétale
II.2.3. Tests phytochimiques (Screening phytochimique)
Les tests phytochimiques réalisés sur la plante ont pour objectif de rechercher les substances
bioactives existantes chez cette dernière. Ils sont effectués soit sur la poudre de la plante, soit
sur son infusé à 5 %. Les méthodes de caractérisation utilisées dérivent de celle décrites par
Paris et Nothis (1978) ; Tona et al., (1998) et LONGANGA et al. (2000).
II.2.3.1. Préparation de l’infusé à 5%
L’infusé à 5% de la poudre végétale est préparé par l’ajout de 5g de cette dernière à 100 ml
d’eau distillée chaude. Après 15 à 20 mn de contacte, la solution est filtrée à l’aide d’un
papier filtre, puis le filtrat obtenue est ajusté à 100ml d’eau distillée.
26
II.2.3.2. Identification des anthocyanes

Cette identification est réalisée par l’addition de quelques gouttes d’HCl à 5 ml de l’infusé.
L’apparition d’une coloration rouge est signe de la présence de ces métabolites dans la plante.
II.2.3.3. Identification des leuco-anthocyanes
Pour ce métabolite, 2 g de la poudre végétale sont additionnée à 20 ml d’un mélange de
Propanol/Acide chlorhydrique (v/v). Le mélange est porté à ébullition dans un bain marie
pendant 15 min. Le développement d’une coloration rouge indiquera la présence des leuco-
anthocyanes.
II.2.3.4. Identification des tanins
À 5 ml de l’infusé, on ajoute quelques gouttes d’une solution de FeCl3 à 5 % (Annexe 13).
La coloration bleuâtre ou bleue noire indique la présence des tanins.
II.2.3.5. Identification des tanins catéchiques
L’identification des tanins catéchiques se fait par l’ajout de 15 ml d’infusé à 7 ml de réactif
de Stiansy (Annexe 13). Une coloration rouge se traduit par la présence de ces métabolites.
II.2.3.6. Identification des tanins galliques
2 g d’acétate de sodium et quelques gouttes de FeCl 3 sont ajouté à 5 ml de l’infusé. En
présence de tanins gallique la réaction donne une coloration bleu foncé.
II.2.3.7. Identification des quinones libres
2 g de la poudre humectés par 2 ml d’HCl, sont mis en contact avec 20 ml de chloroforme
pendant 3 heures. Le filtrat est agité avec 5 ml d’ammoniaque 1/2. Une coloration rouge
indique la présence des quinones libres.
II.2.3.8. Identification des saponosides
L’identification des saponosides nécessite l’addition de quelques gouttes d’acétate de plomb
à 2 ml d’infusé. La formation d’un précipité blanc indique l’existence des saponosides.
II.2.3.9. Identification des alcaloïdes
5 g de poudre humectés avec l’ammoniaque 1/2 sont macérés pendant 24h dans 50 ml d’un
mélange éther-chloroforme (3v/v).Le filtrat est épuisé par l’acide chlorhydrique 2N. Des
réactions de précipitations sont réalisées sur la solution chlorhydrique puis on rajoute
quelques gouttes de solution Dragendroff (Annexe 13). Ce dernier donne un précipité rouge
en présence des alcaloïdes.
27
II.2.3.10. Identification des coumarines

2 g de poudre sont bouillis dans 20 ml d’alcool éthylique pendant 15 mn puis filtrer. 10
gouttes de la solution alcoolique de KOH à 10% (Annexe 13) plus quelques gouttes d’HCl à
10% sont rajoutées à 5 ml du filtrat. La formation d’un trouble indique l’existence des
coumarines.
II.2.3.11. Identification de l’amidon
À 2 g de poudre végétale, on rajoute quelques gouttes d’iode (I2).Une coloration bleue
violette indique la présence d’amidon.
II.2.3.12. Identification des flavonoïdes
5 ml d’HCL, un coupeau de Mg et 1 ml d’alcool iso-amylique sont ajoutés à 5 ml d’infusé.
La présence de flavonoïdes se manifeste par une coloration rouge.
II.2.3.13. Identification des mucilages
Ajouter 5 ml d’alcool absolu à 1 ml d’infusé. La présence de mucilage se traduit par
l’apparition d’un précipité floconneux.
II.2.3.14. Identification des irridoïdes
À 2 ml de l’infusé, on rajoute quelques gouttes de l’acide chlorhydrique et on chauffe le
mélange sur une plaque chauffante. L’existence des irridoïdes se manifeste par l’apparition
d’une coloration bleue.
II.2.3.15. Recherche des Protéines
1g de poudre végétale est dissoute dans 2 ml d'hydroxyde de sodium (NaOH) à 20%
(Annexe 13), Rajouter quelques gouttes de CuSO4 à 2%. La réaction donne une coloration
violette avec une teinte rougeâtre en présence des protéines.
II.2.3.16. Recherche des Lipoïdes
5 g de poudre végétale sont macérés dans 30 ml d’éther de pétrole pendant 30 minutes.
Après filtration, évaporer le filtrat sur plaque chauffante. Ajouter au résidu graisseux 3 gouttes
de H2SO4. Une coloration violette signifie une réaction positive.
II.2.3.17. Recherche des Sucres réducteurs
5 ml de réactif de Fehling sont ajoutés à 5ml de l’infusé. La formation d’un précipité rouge
brique après 3 min de chauffage au bain-marie indique une réaction positive.
II.2.3.18. Recherche des Glucosides
Quelques gouttes de H2SO4 sont additionnées à 2 g de poudre végétale. La formation d’une
28
coloration rouge brique ensuite violette indique la présence des Glucosides.
II.2.3.19. Recherche des Caroténoïdes

A 10 ml de l’infusé, on ajoute 3 ml d’HCl et 3 ml de H2SO4. La présence de Caroténoïdes
se traduit par une coloration Vert-bleu.
II.2.3.20. Recherche des Polyphénols
Une goutte de chlorure ferrique (FeCl3) à 2% est ajoutée a 2 ml d’infusé. La présence des
polyphénols se traduit par une coloration bleue-noirâtre ou vert foncé.
II.2.4. Extraction des huiles essentielles
L’extraction des huiles essentielles à partir de la matière végétale fréche est réalisée par
hydrodistillation. 60g de la matière végétale constituée de différentes parties de la plante
(feuille, tige, fleur, racine) est introduite dans un ballon d’un litre rempli de 600ml d’eau
distillée. L’ensemble est porté à ébullition pendant 2h à 3h. Durant cette opération, la vapeur
chargée d’eau et d’huile traverse un réfrigérant incliné et se condense. Le distillat s’écoule
goutte à goutte et est recueilli dans une ampoule à décanter. La séparation entre la phase
organique représentée par l’huile essentielle et la phase aqueuse représentée par l’eau
aromatique est réalisée en ajoutant l’éther di-éthylique. Enfin, l’huile essentielle est récupérée
dans un flacon en verre stérile enveloppée avec papier aluminium et conservée au
réfrigérateur à une température comprise entre 4 et 6°C pour éviter toute dégradation des
huiles essentielles.
Fig.8 : dispositif d’hydrodistillation
29
II.2.4.1. Rendement de l’extraction
Le rendement en huile essentielle est le rapport entre le poids de l’huile extraite et le poids
de la plante utilisé (Bekhichi, 2001). Le rendement, exprimé en pourcentage, est calculé par
la formule suivante :
R%= (PB/PA) × 100
 R : rendement de l’huile en %
 PB : poids de l’huile en g
 PA : poids de la plante en g
II.2.5. Isolement des souches bactériennes

II.2.5.1. prélèvement du sol
Le prélèvement a été réalisé dans deux sols différents (sol de culture de pomme de terre et un
sol d’écurie) selon la méthode « zigzag » (Fig. 09), 03 échantillons ont été prélevés sur une
surface de 1,5 m2 à 15 cm de profondeur pour chaque sol, les échantillons de chaque sol sont
mélangés. Les deux échantillons ainsi obtenues subissent un tamisage dans l’objectif
d’éliminer les grosses molécules telles que les agrégats et les débris, et d’avoir un sol fin et
une solution homogène. (Chaussoud et al., 1992 ; Fardoux et al., 2000).
Figure 09 : Echantillonnage en « zigzag »
II.2.5.2. préparation des dilutions

Les dilutions sont réalisées dans l’objectif d’obtenir le maximum de microorganisme dans
le sol, 1gramme de chaque échantillon de sol est dilué dans 9mL d’eau physiologique ce qui
30
représente la solution mère. Les suspensions de sol sont agitées pendant 15 minutes, après
décantation, une série de dilutions est réalisée jusqu’à 10-6 à partir de chaque solution mère
(Bettache, 2013).
II.2.5.3. Ensemencement dans une gélose nutritive
1 ml de chaque dilution est ensemencé dans une boite de Pétri contenant de la gélose
nutritive, et incubé à 37°C pendant 24 h. L’ensemencement a été fait dans des conditions
d’asepsie totale à l’aide d’une anse de platine (Solbi, 2013).
II.2.5.4. Repiquage
Le repiquage des bactéries ainsi isolées est nécessaire dans le but de purifier l’espèce. Il
s’agit de prélever une petite partie d’une culture bactérienne pour la transplanter sur un milieu
neuf où elle continuera sa croissance (Place et al., 2004).
II.2.5.5. Identification des souches isolées
L’identification des bactéries se fait en trois étapes :
II.2.5.5.1. Examen macroscopique
Cet examen nous permet d’observer à l’œil nu quelques caractères de la colonie, il s’agit de
son aspect, sa couleur, sa forme, sa taille, et son relief.
II.2.5.5.2. Examen microscopique (coloration de Gram)
La coloration de Gram est utilisée dans l’objectif de différencier les bactéries en deux
groupes distincts, celui des Gram positif et celui des Gram négatif. Cette coloration
différentielle repose sur l’aptitude ou non de la paroi bactérienne à s’opposer à la coloration
par éthanol. Les bactéries dites Gram positif possèdent une paroi épaisse, composée de
peptidoglycane en leur donnant une imperméabilité à l’éthanol, alors que les bactéries Gram
négatif ne contiennent qu’une fine couche de peptidoglycane et surtout de lipide en quantité
importante ce qui va rendre la décoloration effective.
Mode opératoire
- A l’aide d’une anse de platine on prélève une colonie qu’on dépose sur une lame et qu’on
étale pour constituer un frotti. Une goutte d’eau distillée est déposée sur ce frotti qui sera
séché puis fixé à la flamme bleue.
- Recouvrir le frottis avec le violet de gentiane pendant 1 min.
- Rincer délicatement à l’eau du robinet. Faire égoutter pour enlever l’excès d’eau.
31
- Recouvrir le frottis avec une solution de Lugol pendant 1 min afin de consolider la fixation
du premier colorant sur la paroi.
- Rincer délicatement à l’eau du robinet et égoutter.
- Différencier à l’alcool éthylique à 95% pendant 5 à 10 seconde pour éliminé le violet de

gentiane jusqu’à décoloration totale.
- Colorer le fond à la fuchsine phéniquée pendant 20 à 30 secondes.
- Rincer la lame sous le robinet, et sécher a l’air libre.
- Observer au microscope optique en ajoutant une goutte de l’huile à immersion

(objectif×100) (Bouadjaib Sarah., 2013).
II.2.5.5.3. Recherche des caractères biochimiques

a- Recherche de la catalase
La catalase est une enzyme qui décompose l’eau oxygéné en eau et en oxygène gazeux. Le
principe consiste à mettre dans une lame quelques gouttes de H2O2 additionnées d’une
colonie bactérienne. Le test de la catalase se base sur la recherche d’un dégagement de gaz
(Jacques et André., 2004), selon la réaction suivante :
2H2O2 2H2O + O2
b- Galerie biochimiques classique
L’identification biochimique est un examen qui permet d’identifier une bactérie en

s’appuyant sur ces caractères biochimiques.
 Urée-Indole
Une suspension dense de bactéries est introduite dans 0,5 ml de milieu Urée-Indole, et
incuber à 37°C pendant 24 à 48 h.
Lecture
- Un virage de milieu au rouge violacé ou au rouge rose indique une réaction d’uréase
positive.
32
- Deux gouttes de réactif de Kovacs sont additionnées. L’apparition d’un anneau rouge
indique une réaction d’indole positif (Marchal et al., 1991).
 VP/RM
Deux tubes contenant chacun 0,5 ml du milieu Clark et Lubs sont ensemencés puis incubés
à 37°C pendant 18 à 48 h. Après incubation deux gouttes de réactif VP sont ajoutées dans l’un
des deux tubes et deux gouttes de réactif RM dans l’autre.
Lecture
- Un anneau rouge indique une réaction VP positive.
- Une coloration rose fuchsia indique une réaction RM positive (Marchal et al., 1991).
 TSI (Gélose Glucose-Lactose-Saccharose-H2S)

A l’aide d’une pipette contenant des colonies prélevées, on ensemence la pente puis le
culot d’un tube TSI par piqûre centrale. L’incubation se fait à 37°C pendant 48 à 72 h.
Lecture
- Une coloration jaune de la pente indique un lactose positif.
- Une coloration jaune du culot indique un glucose positif.
- Une coloration jaune de la zone intermédiaire indique un saccharose positif.

Ce test permet également de confirmer ou non la production de H2S (noircissement de la zone
joignant la pente et le culot) et du Gaz (bulles dans la gélose) (Marchal et al., 1991).
 Citrate de Simmons
Ce milieu ne contient qu’une seule source de carbone: le citrate. Seules les bactéries
possédant une citrate-perméase sont capables de se développer sur ce milieu. La pente du
milieu est ensemencée en stries longitudinales à l’aide d’une pipette contenant une colonie et
incubé à 37°C pendant 24h.
Lecture
- Citrate-positive : culture avec alcalinisation du milieu (virage de l’indicateur au bleu).
- Citrate-négative : pas de culture (coloration verte de milieu inchangée) (Marchal et al.,

1991).
 Esculine
La pente du milieu est ensemencée par piqure centrale à l’aide d’une pipette contenant des
colonies puis incubés à 37°C pendant 48 à 72 h.
33
Lecture
- L’hydrolyse de l’esculine (ou aesculine) qui rompt la liaison glucosidique et libère du

glucose et de l’esculitine donne une coloration noire en présence de citrate de fer ammoniacal.
Un résultat positif se traduit donc par un noircissement du milieu (Marchal et al., 1991).
 Recherche de la coagulase
La coagulase libre est présente chez les S.aureus, mais elle peut également être produite par
les S. intermedius ou les S.hyicus. Ce test consiste à mettre en évidence la coagulase libérée
dans le milieu extérieur (Garnier et Denis., 2007).
La détection de cette coagulase s’effectue en ajoutant dans un tube à hémolyse 0.5 ml de
plasma humain et 0.5 ml d’une culture de staphylocoques de 24h en bouillon. Le mélange est
placé à l’étuve à 37°C pendant 24 heures. Les souches de S aureus provoquent la coagulation
du plasma le plus souvent les trois premières heures.
Lecture
- Un test positif se traduit par la formation d’un coagulum.
II.2.6. Sensibilité aux antibiotiques
Dans le but de comparer l’effet de l’extrait et celui des antibiotiques auxquels les bactéries
isolées sont sensibles, quelques antibiotiques ont aussi été testés sur ces dernières (Tableau .I)
Tableau I : Sensibilité des bactéries aux antibiotiques
Souches E.coli S.aureus Pseudomonas Bacillus Enterococcus SCN

aeruginosa sp sp sp
ATB
VA (R) (S) (R) (S) (S) (S)
CT (S) (S) (S) (S) (R) (S)
IPM (S) / / / / /
NA (S) / / (S) / /
(S) : sensible (R) : Résistant
34
II.2.7. Evaluation de l’activité antibactérienne
La technique utilisée pour évaluer l’activité antibactérienne de notre extrait est

l’antibiogramme ou la méthode de diffusion en milieu gélosé en utilisant des disques stériles
(Cavallo et al., 2006). Cette méthode permet de déterminer l’activité inhibitrice de l’agent
antibactérien, par la mesure du diamètre de la zone d’inhibition autour du disque imprégné de
l’extrait à tester. Les principales étapes sont :
II.2.7.1. Revivification et repiquage des espèces bactériennes
La revivification des souches bactériennes est une étape nécessaire avant leur utilisation car
leur activité est nulle à l’état conservé. Elle a pour objectif l’obtention d’une culture jeune et
pure et des colonies bien isolées qui vont servir à préparé l’inoculum. Pour cela les souches
sont ensemencées par des stries dans des boites de pétries et incubées à 37°C pendant 24
heures.
Les souches bactériennes obtenues sont repiquées dans des boites de pétries renfermant le
milieu Muller-Hanton par la méthode des stries, puis incubées à l’étuve à 37°C pendant 24
heures.
II.2.7.2 Préparation de l'inoculum

L’inoculum est préparé à partir de colonies jeunes de bactérie dans de l’eau physiologique
stérile (0,9%). Les colonies sont prélevées à l’aide d’une anse de platine et homogénéisées
dans de l’eau physiologique. Il faut noter que pour l’obtention de la suspension 10 8 germes
par ml, l’absorbance à 620nm doit être comprise entre 0,2 et 0,3.
II.2.7.3 Préparation des disques

Des disques de papier Whatman de 6 mm de diamètre, stériles (stérilisation à 120°C
pendant 15 min par autoclavage), sont chargés de l'extrait naturel à tester a raison de 5µl par
disque, des disques d’antibiotiques spécifiques pour chaque bactérie sont aussi utilisés.
II.2.7.4. Préparation des milieux de culture
La gélose Muller Hinton stérile prête à l’usage sont coulée dans des boites de Pétri stériles
de 90 mm de diamètre en raison de 4mm d’épaisseur répartie uniformément dans les boites.
Laisser solidifier les boites leur emploi.
35
II.2.7.5. Ensemencement
Des boites de Pétri stériles préalablement préparées, ont été ensemencées par étalage à
l'aide d'un râteau stérile, l'ensemencement s'effectue de telle sorte à assurer une distribution
homogène des bactéries. À l'aide d'une pince stérile, les disques contenant les produits à tester
sont déposés à la surface de la gélose inoculée au préalable et le tout est incubés à 37°C
pendant 24h.
II.2.7.6. Expression des résultats
Après l’achèvement de la période d’incubation, la lecture du diamètre de la zone

d’inhibition se fait comme suit (Moreira et al., 2005):
 Non sensible (R) pour un diamètre de 10mm.

 Sensible (S) pour un diamètre entre 10 et 14mm.
 très sensible pour un diamètre entre 15 et 19mm.
 extrêmement sensible pour un diamètre plus de 20 mm.
36
Chapitre III
Résultats
Chapitre III Résultats
Dans ce chapitre, nous avons exposé les résultats obtenus. Ces derniers sont subdivisés en
quatre parties. La première traite les résultats des tests phytochimiques, la deuxième
comprend ceux concernant l’extraction des huiles essentielles, la troisième traite les résultats
de l’identification des bactéries pathogènes isolées du sol. Enfin, les résultats de l’évaluation
de l’activité antibactérienne des huiles essentielles sont mentionnés dans la quatrième partie.
III.1. Screening phytochimique
Les résultats des tests phytochimiques réalisés sur la poudre végétale de la plante Euphorbia
sp sont mentionnés dans le tableau suivant (Tableau .II).
Tableau II : résultats des tests phytochimiques
Composés chimiques Résultats positifs Résultats obtenus
Anthocyanes Coloration rouge
Leuco-anthocyanes Coloration rouge
Tannins totaux Coloration bleue noire
++
37
Tannins catéchiques Coloration rouge
Tannins galliques Coloration bleu foncé
quinones libres Coloration rouge
Saponosides Précipité blanc
+++
Alcaloïdes Précipité rouge
+++
38
Coumarines La formation d’un trouble
++
l’amidon Coloration bleue violette
Flavonoïdes Coloration rouge
++
Mucilages Précipité floconneux
++
Irridoïdes Coloration bleue
39
Protéines Coloration violette avec une

teinte rougeâtre
-
Lipoïdes Coloration violette
+++
Sucres réducteurs Précipité rouge brique
+++
Glucosides Coloration rouge brique

ensuite violette
+++
Caroténoïdes coloration vert-bleu
40
Polyphénols coloration bleue-noirâtre ou

vert foncé
++
Avec : (-) : Absence de substance active
(+) : présence de substance active
D’après le tableau, on constate que les principaux composés présents en quantités

importantes dans la poudre de la plante Euphorbia sp sont les saponosides, les alcaloïdes, les
lipoïdes, les glucosides, les sucres réducteurs. Les tannins totaux, les coumarines, les
flavonoïdes, les mucilages, et les polyphénols sont moyennement présents. Les autres
composants à savoir les anthocyanes, les leuco-anthocyanes, Tannins catéchiques, les tanins
galliques, les quinones libres, l’amidon, irridoïdes, protéines, caroténoïdes sont totalement
absents.
III.2. Extraction des huiles essentielles
L’huile essentielle d’une plante est le sec huileux qu’on peut extraire d’un végétal et qui
contient de très nombreuse espèces chimique dont certaines sont responsable du parfum
dégagé par la plante. L’espèce majoritaire est appelée principe actif de l’huile essentielle
(Aristidou et pentilla, 2000).
La technique utilisée dans notre travail est l’hydrodistillation par entrainement a la vapeur
d’eau permettant l’extraction de l’huile essentielle (ou distillat) par différence de densité
(Aristidou, 2000). Nous avons effectué plusieurs hydrodistillations sur la plante Euphorbia
sp, afin d’obtenir une quantité suffisante de l’huile, les résultats sont exprimés dans le tableau
III.
41
Tableau III: Extraction de l’huile essentielle.
Opération Durée de Matière Eau Volume Rendement

distillation (h) Végétal distillée de (%)
(g) utilisée l’H.E (ml)
(ml)
01 60 600
02 3 heures 60 600
4,9 ml 0,04
03 60 600
04 60 600
L’huile essentielle a été récupérée et conservé au sec, à l’abri de la chaleur et de la lumière.
Il ressort du tableau III, que le rendement en huiles essentielles est de l’ordre de 0,5% pour
une extraction.
III.3. Identification des souches microbiennes isolées :
Les résultats obtenus lors de l’identification des bactéries isolées sont représentés dans le
tableau suivant(IV) :
42
Tableau IV: Identification bactérienne
Aspect Coloration Test Numéro de

Gram Biochimiques souche et le
Cit Gaz Lac H2S Vp Rm Urée Ind Cat Esc Coa nom du germe
Colonie fine Cocci (S1)

couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / AH2
brillante
grisâtre
Couleur Gram + + ̶ ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / ̶ TN
blanche
couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / AH2
brillante
grisâtre
Colonie fine Bacille (S4)
Couleur Gram ̶ ̶ ̶ + ̶ + ̶ ̶ ̶ + / ̶ TN
blanche
couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / AH2
brillante
grisâtre
Couleur Gram + ̶ ̶ ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / + CH3
jaunâtre
couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / AH2
brillante
grisâtre
Colonie Bacille (S8)
Platte Gram + ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ / / E4
Couleur
Foncée
Platte Gram + ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ ̶ + / / E4
Couleur
Foncée
moyenne Gram - ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ + + / / AH8
couleur
jaune
couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / AH2
brillante
grisâtre
couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ + ̶ ̶ ̶ ̶ + / AH2
brillante
grisâtre
43
Colonie fine
couleur
brillante Cocci - - + - + - + - - + / (S13)
grisâtre Gram + AH2

couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / AH2
brillante
grisâtre

Couleur Gram + ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ + ̶ ̶ + / ̶ TN
blanche

couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / AH2
brillante
grisâtre
Couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ + ̶ + ̶ + / ̶ TN
blanche

Couleur Gram + ̶ ̶ + ̶ + ̶ ̶ ̶ + / ̶ TN
blanche
Couleur Gram+ ̶ ̶ + ̶ + ̶ + ̶ + / ̶ TN
blanche
plate Gram ̶ + ̶ ̶ ̶ + ̶ ̶ ̶ + / / T1
couleur
transparente
Avec : (+) : présence.
: (-) : absence
Pour toutes les souches bactériennes, le milieu Hektoen a été utilisé comme milieu
d’enrichissement, puis la gélose nutritive afin d’obtenir des colonies jeunes et pures.
L’incubation a été faite à 37°C pendant 24h.
III.4. Tests de sensibilité aux antibiotiques
Les antibiotiques sont par définition, des produits microbiens, ou leurs dérivés, capables de
tuer les micro-organismes sensibles ou d’inhiber leur croissance (Prescott et al., 1995).
L’étendue de l’activité antibactérienne d’un antibiotique définit son spectre d’action. Plus un
antibiotique agit sur des espèces bactériennes différentes, plus son spectre est large. Les
44
résultats de l’effet des antibiotiques synthétiques sur les souches isolées sont présentés dans le
tableau suivant :
Tableau V : Tests de sensibilité aux antibiotiques
Diamètre d’inhibition par les antibiotiques (mm)

Souches
VA CT IPM NA
AH8 10 6 (R) 15 (S) 32(S) 26(S)
CH3 6 37 (S) 14 (S) / /
T1 20 6 (R) 15 (S) / /
8 22 (S) 8 (R) / 19(S)

E4
9 34 (S) 18 (S) / 17(S)
1 26 (S) 8 (R) / /
AH2
3 48 (S) 6 (R) / /
15 49 (S) 16 (S) / /
TN 17 31 (S) 17 (S) / /
19 33 (S) 14 (S) / /
Avec : (S) : Sensible.
(R) : Résistant.
III.5. Evaluation de l’activité antibactérienne des huiles essentielles

d’Euphorbia sp
III.5.1. Densités optiques des suspensions bactériennes
45
Les densités optiques des suspensions bactériennes ont été mesurées par le
spectrophotomètre UV/Visible à une langueur d’onde 620 nm.
III.5.2. Etude qualitative
L’activité antibactérienne des huiles essentielles d’Euphorbia sp a été réalisée sur 10 bactéries
classées en six genres (AH2, TN, CH3, E4, AH8, T1).
Les résultats obtenus sont représentés dans le tableau VII
Tableau VI : Activité antibactérienne des huiles essentielles d’Euphorbia Sp
Souches bactériennes Nombre d’essai Diamètres de la Moyenne (mm)

zone d’inhibition
(mm)
AH8 10 2 25 26
27
CH3 6 2 17 17.5
18
T1 20 2 13 12.5
12
8 2 14 14.5
E4 15
9 2 17 16 15.25
15
1 2 16 16
AH2 16
3 2 17 16.5 16
16
15 2 18 16
TN 14
17 2 19 16
13 15.33
19 2 15 14
13
46
A partir de ces résultats et les diamètres d’inhibition obtenus, il ressort que : AH8 est
extrêmement sensible (26 mm), CH3 est fortement sensible (17.5 mm), AH2, TN sp et E4
sont sensibles (15 à 16 mm), T1 est faiblement sensible (12.5 mm).
On remarque que l’huile essentielle d’Euphorbia sp présente en général une action
inhibitrice sur la croissance de toutes les bactéries.
a-AH8 b-CH3
c-T1 d-E4
e- E4 f- AH2
47
g- AH2 h- TN
i-TN j- TN
Planche 01 : activité antibactérienne des huiles essentielles d’Euphorbia sp
48
Chapitre IV
Discussion
Chapitre IV Discussion
IV.1. les tests phytochimiques

L’étude phytochimique de la plante Euphorbia sp a révélé une grande diversité en
substances bioactives. Les plus abondantes sont les saponosides, les alcaloïdes, les lipoïdes,
les glucosides, les sucres réducteurs, suivis par les coumarines, les flavonoïdes, Les tannins
totaux, les mucilages, et les polyphénols. En revanche elle ne renferme pas les anthocyanes,
les leuco-anthocyanes, les tannins catéchiques, les tanins galliques, les quinones libres,
l’amidon, irridoïdes, protéines, caroténoïdes. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus
par plusieurs auteurs, qui mentionnent que la famille des Euphorbiaceaes renferment diverses
composés chimiques tels que les flavonoïdes responsables des activités anti-malariques (Liu
et al., 2007) et anti inflammatoires (Ekpo et Pretorius, 2007), les alcaloïdes qui possèdent
des propriétés anti-microbiennes (Dias et al., 2007) et anti-tumorales (Suarez et al., 2004) ,
les saponosides porteurs d’activités cytotoxiques (Kiem et al., 2009) et anti-ulcéreuses
(Ukwe, 1997), les tanins avec des propriétés anti-virales (Bessong et al., 2006 ; Liu et al.,
1999), antimutagéniques (Rossi et al., 2003) et anti-fongiques (Hwang et al., 2001), les
polyphénols aux propriétés anti-tumorales (Yu et al., 2005) et anti-oxydantes (Yang et al.,
2007) et enfin les coumarines ( Aynehchi et al., 1978) .
IV.2. le rendement en huiles essentielles
Les Euphorbiaceaes sont connus pour leur richesse en huiles essentielles (Kouamé, 2012).
Dans notre étude le rendement obtenu pour une extraction à partir de 60g de matière végétal
d’Euphorbia sp est de 0.5%. En comparant ce rendement avec ceux rapportés dans la
littérature, nous constatons que nos résultats sont proche de ceux obtenus par De Lima et al.,
(2012) qui mentionnent que le rendement des feuilles de Croton hirtus (Euphorbiaceae) en
huiles essentielles est de 0.3% à 0.4%. En revanche il existe d’autres espèces du genre Croton
connues pour leur très faible rendement en huile essentielle. Ce dernier vari de 0.12 à 0.14 %
pour C. adenocalyx Baill (Sidney et al., 2010), de 0.25% pour C. antanosiensis, de 0.19%
(tiges) et 0.29% (feuilles) pour C. decaryi Leandri, de 0.32% pour C. geayi Leandri et enfin le
rendement en huiles essentielles est de 0.15% (Tiges) et 0.38% (feuilles) pour C.
sakamaliensis.
Les différences de rendement en huiles essentielles d’un genre à un autre et d’une espèce à
une autre ont été rapportées. Selon plusieurs auteurs, l’origine de récolte de l’espèce, la
période de récolte, l’organe de la plante, la durée de séchage et la méthode d’extraction sont
des facteurs parmi d’autres qui peuvent aussi avoir un impact direct sur les rendements en
49
huile essentielle (Russo et al., 1998 ; Tonzibo, 1998 ; Vekiari et al., 2002 ; Karousou et al.,
2005 ; Kouamé, 2012).
IV.3. l’évaluation de l’activité antibactérienne
Les huiles essentielles ont été considéré comme agents antimicrobiens les plus efficaces
dans les plantes médicinales, la première mise en évidence de l’action des huiles essentielles
contre les bactéries a été réalisée en 1881 par Delacroix (Boyle, 1995). Depuis, de
nombreuses huiles ont été définies comme antibactériennes (Burt, 2004).
L’activité antibactérienne est variable d’une huile essentielle à l’autre et d’une souche
bactérienne à l’autre (Kalemba, 2003 ; Oussou, 2009 ; Avlessi, 2012).
Dans ce présent travail, nous avons évalué l’activité antibactérienne des huiles essentielles sur
20 souches bactériennes classées en six genres (AH8, TN, AH2, E4, T1, CH3).
Le pouvoir antibactérien le plus élevé de l’extrait huileux est observé pour AH8 avec une zone
d’inhibition de 26mm et le plus faible est celui de T1 avec une zone d’inhibition de 12.5mm,
tandis que pour CH3, AH2, E4 et TN, les zones d’inhibitions sont respectivement de 17.5, 16,
15.25, 15.33mm.
Babili et al. (2009) ont montré que l’huile essentielle des feuilles de Croton campestris
(Euphorbiaceae) inhibe la croissance de CH3. Une autre étude réalisée par Matias et al.
(2010) à également mis en évidence les propriétés antibactériennes de l’extrait des feuilles de
C. campestris sur CH3. En plus des CH3; Thiago et al, (2013) ont montré que l’huile
essentielle de C. campestis inhibe aussi la croissance T1. Par ailleurs Rodrigues et al, (2009),
ont montré que l’huile essentielle de Croton zehntneri exerce une activité inhibitrice sur la
croissance de CH3 et de T1. Ceci est en accord aves nos résultats obtenus pour CH3 et T1. Pour
AH8 à Gram négatif, nos résultats montrent que c’est la bactérie la plus sensible à l’action de
l’huile essentielle tandis que Burt (2004) mentionne que les huiles essentielles agissent aussi
bien sur les bactéries à Gram positif que sur les bactéries à Gram négatif. Toutefois, les
bactéries à Gram négatif paraissent moins sensibles à leur action et ceci est directement lié à
la nature de leur paroi cellulaire. Cette différence peut être due selon Surk (2003) aux
méthodes utilisées pour l’évaluation antibactérienne qui donnent parfois des résultats
différents selon les conditions opératoires expérimentales pour chaque manipulateur, ce qui
laisse conclure que les techniques utilisées ont une grande influence sur les résultats.
50
IV.4. la sensibilité des antibiotiques

La zone d’inhibition d’un bon agent antibactérien diffère d’un auteur à un autre, d’après
pereira et al (2006) la zone d’inhibition doit être égale ou supérieure à 10mm. Pour vieira et
al (2001) elle est de 13mm et selon seokwon kim et al (2006) elle doit être supérieure à 6mm.
AH8:
Le diamètre d’inhibition de la Colistine, de l’imipenème et de l’acide nalidixique varie entre
15 et 32 mm ce qui permet de classer AH8 dans la classe des microorganismes sensibles pour
ces antibiotiques. Pour la Vancomycine le diamètre d’inhibition est de 6 mm, ce qui classe la
bactérie dans les microorganismes résistants à cet antibiotique.
CH3:
Les diamètres d’inhibition de la Vancomycine et de la Colistine sont de 37-14 mm
respectivement, cela permet de classer CH3 dans la classe des microorganismes sensibles pour
ces deux antibiotiques.
T1:
Le diamètre d’inhibition de la Colistine est de 15 mm ce qui permet de classer T1 dans la
classe des microorganismes sensibles pour cet antibiotique. Pour la Vancomycine le diamètre
d’inhibition est de 6 mm, ce qui classe la bactérie dans les microorganismes résistants à cet
antibiotique.
E4:
La moyenne des diamètres d’inhibition de la Vancomycine, de la Colistine et de l’acide
nalidixique est respectivement de 28-13-18 mm, la bactérie est donc sensible à ces
antibiotiques.
AH2:
La moyenne des diamètres d’inhibition de la Vancomycine est de 37 mm cela permet de
classer AH2 dans la classe des microorganismes sensible à cet antibiotique. Pour la Colistine
la moyenne des diamètres d’inhibition est de 7 mm, ce qui classe la bactérie dans les
microorganismes résistants à cet antibiotique.
TN:
La moyenne des diamètres d’inhibition de la Vancomycine, et de la Colistine est de 37-15
mm cela permet de classer TN dans la classe des microorganismes sensible pour ces deux
antibiotiques.
51
Conclusion et
perspective
Conclusion et perspectives
Les extraits aromatiques des plantes ont été utilisés dans différentes formulations, comme
les médicaments et la parfumerie. Les huiles essentielles ont été considéré comme agents
antimicrobiens les plus efficaces dans ces plantes.
Le manque d’étude sur les activités biologiques des espèces d’Euphorbiaceae à suscité
l’intérêt de cette étude.
L’objectif de notre travail consiste à étudié l’effet des huiles essentielles d’Euphorbia sp sur
la croissance de certains souches bactériennes pathogènes d’origine tellurique isolées de deux
régions ; Ain timouchent et Boumerdes.
Le screening phytochimique de la plante montre que la poudre végétale est très riche en
saponosides, alcaloïdes, lipoïdes, glucosides, sucres réducteurs. Elle est moyennement riche
en tannins totaux, coumarines, flavonoïdes, mucilages, polyphénols. Cependant elle est
dépourvue d’anthocyanes, de leuco-anthocyanes, de Tannins catéchiques, de tanins galliques,
de quinones libres, d’amidon, d’irridoïdes, de protéines et de caroténoïdes. Le rendement
d’extraction en huile essentielle obtenu par hydrodistillateur est de 0.5%.
L’étude microbiologique du sol a permis d’identifier 10 souches bactériennes classées en six

genres : AH8, TN, AH2, E4, T1, CH3.
L’activité antibactérienne a été étudiée sur les 10 souches identifiées selon la méthode de
diffusion sur milieu gélosé. L’analyse et l’interprétation des résultats de l’effet des huiles
essentielles d’Euphorbia sp sur la croissance des différentes souches bactériennes testés, nous
a permis de conclure que toutes les bactéries testées sont sensibles a l’huile essentielle de la
plante dont le germe le plus sensible est AH8 avec une zone d’inhibition de 26mm.
A la lumière des résultats obtenus dans cette étude, on peut conclure que les huiles
essentielles d’Euphorbia sp présentent un bon effet antibactérien vis-à-vis de certaines
souches bactériennes.
En perspective, il serait souhaitable de :
 Identifier des souches bactériennes par Galerie API.
 Déterminer la composition chimique d’huiles essentielles d’Euphorbia sp.
52
Conclusion et perspectives
 Tester l’effet des huiles essentielles sur une large gamme de microorganismes
(bactéries, champignons et virus).
53
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Annexes
Annexe Bibliographique
Annexe 1 : appareillage et matériel utilisé au laboratoire
Equipements et appareils Verreries et petits matériels

Agitateur magnétique Anse de platine
Autoclave Béchers
Balance de précision Boite de Pétri
Bain marie Ciseau
Bec benzène Disques d’antibiogramme vierges
Broyeur Disques d’antibiotiques
Etuve Entonnoirs
Hôte Eprouvettes graduées
Hydrodistillateur Erlenmeyer
Microscope optique Flacon en verre
Plaque chauffante Micropipettes
Réfrigérateur Pipettes Pasteur
Spectrophotomètre Pince
Papier filtre
Portoir
Tubes à essai
Tubes secs
Spatule
Annexe 2 : réactifs et produits chimiques
Réactifs et produits chimique pour le Réactifs et produits chimiques pour

screening phytochimique l’identification bactérienne
Acide sulfurique : H2SO4 Fushine Basique Phéniquée
Acide chlorohydrique : HCL Kovacs
Acétate de plomb : C4H6O4Pb Lugol
Acétate de sodium : C4H6O4Na RM Rouge de méthylène
Alcool éthylique : Réactif 1 de voges proskauer VP 1
Alcool isoamylique : C5H12O Réactif 2 de voges proskauer VP 2
Ammoniaque : NH4OH Violet De Gentiane
Coupeau de Mg
Chlorure ferrique : FeCl3
Chloroforme : CHCl3
Ether : C4H10O
Ether di-Ethylique : C4H10O
Ether de pétrole : CH3-(CH2)n-CH3
Hydroxyde de sodium : NaOH
Hydroxyde de potassium : KOH
Iode : I2
Propanol : C3H8O
Réactif de Fehling
Annexe 3 : Spectrophotomètre
Annexe 4 : Disques d’antibiotiques
Annexe 5 : Disque stérile + Ecouvillon+ Eau Physiologique

Annexe 6 : Suspension Bactériennes
Annexe 7 : Galerie classique
Citrate TSI
Citrate (-) Citrate (+)

Lac (-) Lac (+)
RM Esculine
RM (-) RM (+) Esculine (+)
VP Coag
VP (-) VP (+) Coag (-) Coag (+)

Catalase
Catlase (-) Catalase (+)
Annexe 8 : Milieux utilisés dans la galerie classique
Annexe 9 : Réactif utilisés dans la galerie classique

Annexe 10 : Réactif utilisés dans la coloration de Gram
Annexe 12 : Tests de sensibilité aux antibiotiques
E.coli (N°10) S aureus (N°6)
Bacillus sp (N°8) Pseudomonas (N°20)

Bacillus sp (N°9) Enterococcus sp (N°1)
Enterococcus sp (N°3) SCN ( N°15)
SCN (N°17) SCN (N°19)

Annexe 13: Fiches techniques des réactifs et solutions utilisés.
Fiche technique 1 : chlorure de fer anhydre à 5%

FeCl3…………………..10g.
L’eau distillée…………200g.
Fiche technique 2 : Hydroxyde de sodium à 20%
Hydroxyde de sodium………20g.
Eau distillée……………...100ml.
Fiche technique 3 : Hydroxyde de potassium à 10 %
Hydroxyde de potassium….10g.
Eau distillée…………….100ml.
Fiche technique 5 : réactif de Drangendroff
Solution a : 0.85 g de nitrate de bismuth+ 40 ml d’eau distillée+ 10ml d’acide acétique.
Solution b : 8g d’iode de potassium+ 2 ml d’eau distillée.
On mélange a et b :
15 ml de mélange + 20 ml d’acide acétique puis compléter avec l’eau distillée.
Fiche technique 4 : réactif de stiansy
2 volume de formol……50ml.
1 volume de HCl 1N….25ml.
Fiche technique 6 : Eau physiologique
Sodium chloride……………9g.
Eau distillée……………1000ml.
Annexe 14 : Composition des milieux de culture
Milieu de culture Composition
Hydrolysat trypsique de caséine ...............2,5g

Extrait de viande ..........................................5g
Gélose nutritive Glucose ........................................................1g
Extrait de la levure ................................... 2,5g
Agar ...........................................................15g
Eau distillé q.s.p ................................ 1000 ml
pH=7 0.2 à 37°C (Bouadjaib Sarah, 2013)
Gélose Mueller-Hinton Infusion de viande de boeuf................... 300ml

Peptone de caséine...................................17.5g
Amidon de mais.........................................1.5g
Agar..........................................................10.0g
pH= 7.4 (Bouadjaib Sarah, 2013)
Protease- peptone ……………….........12,0g

Extrait de levure………………….…......3,0g
Hektoen
Lactose………………………..………..12,0g
Saccharose…………………..……........12, 0g
Salicine……………………………..…...2, 0g
Citrate de fer III et d’ammonium …....…1,5g
Sels biliaire….…………………………...9,0g
Fuschine acide………………………..…0,1g
Bleu de bromothymole………………..0,065g
Chlorure de sodium…………………...…5,0g
Thiosulfate de sodium…………...……....5,0g
Agar………………………………….....13,0g
pH = 7.5 (Amara et Khaldi , 2015)

Annexe 15 : Composition des milieux d’identification
milieux d’identification Composition
Extrait de viande de bœuf ...........................3 g

TSI Extrait de levure ......................................... 3 g
Peptone ......................................................20 g
Chlorure de sodium .................................... 5 g
Citrate ferrique ........................................ 0,3 g
Thiosulfate de sodium ............................ 0, 3 g
Lactose ......................................................10 g
Glucose .......................................................1 g
Saccharose................................................ 10 g
Rouge de phénol ....................................0,05 g
Agar……………………………………...12 g
Eau distillée q.s.p ................................1000 ml
pH=7,4 (Bouadjaib Sarah, 2013)
Peptone trypsique ou poly peptone ...... 5 – 7 g
Clark et Lubs Glucose .......................................................5 g
Phosphate dipotassique ...............................5 g
Eau distillée q.s.p ...............................1000 ml
pH =7 (Bouadjaib Sarah, 2013)
Urée –Indole L-tryptophane ..............................................3 g

KH2PO4 .....................................................1 g
K2PO4 ....................................................... .1 g
NaCl ............................................................5 g
Urée ..........................................................20 g
Alcool à 95° ............................................10 ml
Rouge de phénol à 1% ..........................2,5 ml
Eau distillée q.s.p ............................... 1000 ml
(Bouadjaib Sarah, 2013)

Esculine Polypeptone ................................................10g
Extrait de levure .......................................... 5g
Acétate de sodium ........................................5g
Tween 80 ...................................................1 ml
Mg SO4 ...................................................0.05g
Mn SO4 ................................................... 0.2 g
Esculine ........................................................5g
Citrate de fer ammoniacal ........................0.5 g
pH = 6.5(Bouadjaib Sarah, 2013)
Citrate de simmons Chlorure de sodium……………………..….5g

Sulfate de magnésium7H2O……………...0.2g
Phosphate di potassique PO4 H2…………....2g
Citrate trisodique…………………….…......2g
Solution bleu de bromothymol 1%...….......8ml
Agar…………………………………….....15g
Eau distillé………………………….....1000ml
Ph = 7 (Bouadjaib Sarah, 2013)
Résumé
Les plantes médicinales offrent une source antibactérienne naturelle, dans ce contexte le présent travail repose
essentiellement sur l’étude de l’effet des huiles essentielles d’une plante appartenant à la famille des
Euphorbiaceaes, très répandue au sud algérien et utilisée en médecine traditionnelle, sur des bactéries pathogène
isolées de différents sols.………………………………………………………………………………….
L’analyse phytochimique montre qu’Euphorbia sp est riche en saponosides, alcaloïdes, lipoïdes, glucosides et
sucres réducteurs. L’extraction des huiles essentielles effectuées par hydrodistillation, nous a permis d’obtenir
un rendement de 0.5 %...................................... .
vingt souches bactériennes ont été isolées à partir d’un sol d’une écurie et d’un sol de culture de pomme de terre,
identifiées par des galeries biochimiques et classée on six genres : AH8, TN, AH2, E4, T1, CH3. L’activité
antibactérienne a été déterminée sur ces bactéries selon la méthode de diffusion sur milieu solide. La sensibilité
des bactéries à l’extrait est représentée selon l’ordre suivant : AH8> CH3 > AH2 > TN > E4 > T1.
Mots clés : plante médicinale, Euphorbiaceaes, huiles essentielles, activité antibactérienne, bactéries pathogènes.
‫ملخص‬
‫ و في هذا الصدد يستند هذا العمل على دراسة تأثير الزيوت األساسية الموجودة في النبتة‬، ‫تعتبر النباتات الطبية مصدرا طبيعيا مضادا للبكتيريا‬
‫ على البكتيريا المسببة‬،‫الموجودة على نطاق واسع في جنوب الجزائر وتستخدم في الطب التقليدي‬، Euphorbiaceaes ‫التي تنتمي إلى عائلة‬
.‫لألمراض معزولة من أنواع مختلفة من التربة‬
.Sucres réducteurs ,glucosides ,lipoïdes ,alcaloïdes ,saponoside :‫ غني ب‬Euphorbia sp ‫يظهر التحليل الكيميائي النباتي أن‬
.٪0.5 ‫ سمح لنا بالحصول على المردود الذي يقدر ب‬،‫استخراج الزيوت األساسية عن طريق عملية ا لتقطير بالبخار‬
‫تم عزل عشرين ساللة بكتيرية من تربة مزروعة بالبطاطا و تربة إسطبل و التي حددت عن طريق المعارض البيوكيميائية و رتبت إلى ستة‬
.AH8, TN, AH2, E4, T1, CH3 :‫أنواع‬
:‫و يمثل حساسية هذه البكتيريا في الترتيب التالي‬.‫تم تحديد النشاط المضاد للبكتيريا على هذه البكتيريا وفقا لطريقة نشر القرص‬
AH8> CH3 > AH2 > TN > E4 > T1.
.‫ بكتريا ممرضة النشاط المضاد للبكتريا‬،‫ الزيوت األساسية‬،Euphorbiaceaes ،‫ النباتات الطبية‬:‫كلمات البحث‬
Abstract
Medicinal plants offer a natural antibacterial source, in this context the present work relies essentially on the
study of the effect of the essential oils of a plant belonging to the family Euphorbiaceaes, very widespread in the
south of Algeria and used in traditional medicine, on pathogenic bacteria isolated from different soils.
Phytochemical analysis shows that Euphorbia sp is rich in saponins, alkaloids, lipoids, glucosides and reducing
sugars. The extraction of the essential oils carried out by hydrodistillation, allowed us to obtain a yield of 0.5%.
Twenty bacterial strains were isolated from soil in a stable and potato soil identified by biochemical galleries
and classified into six genuses: AH8, TN, AH2, E4, T1, CH3 . The antibacterial activity was determined on
these bacteria according to the diffusion method on solid medium. The sensitivity of the bacteria to the extract is
shown in the following order: AH8> CH3 > AH2 > TN > E4 > T1.
Key words: medicinal plant, Euphorbiaceaes, essential oils, antibacterial activity, pathogenic bacteria.

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‫الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية‬

‫جامعة امحمد بوقرة بومرداس‬

UNIVERSITE M’HAMED BOUGARA DE BOUMERDES

Mémoire de Master Académique

Mr ARAB. K PROFESSEUR Promoteur FS - UMBB

Mm LAOUFI.R MAA Examinatrice FS-UMBB

Année universitaire 2016/2017

donné, la volonté, le courage, la patience et l’endurance et

qui a guidé mes pas vers le droit chemin pour réaliser ce

A ceux qui m’ont tout donné sans rien attendre en retour

A ceux qui m’ont encouragée et soutenue durant toutes mes

annéés d’etudes : mes parents tout les mots sont insuffisants

pour exprimer ma gratitude, ma reconnaissance et mon

amour. Que le tout puissant les garde et les protégé

A notre promotrice Mme Boumaza

A mes chères sœurs : Abla et Racheda

A mes chères frères :Djelali et Adel

A mes amis :Ichrak, Drifa, Nesrine, Sihem,

Zohra, Houda , Hayet, Soumia, Bouchra

A ma chère binôme Tina et sa Famille

Moments les plus difficiles

Et à ceux qui je dois tant

A mes chers parents, Autant de phrases et d’expressions ne sauraient exprimer ma gratitude.

A notre promotrice Mme BOUMAZA.S pour son encouragement et sa présence.

Liste des abréviations………………………………………………………………...

Liste des figures et planches…………………………………………………………

Liste des tableaux…………………………………………………………………….

Chapitre I. Partie bibliographique

I .1.1 Description botanique………………………………………………………...3

I.1.2 Taxonomie et systématique…………………………………………………….4

I.1.3 Répartition géographique………………………………………………………5

I.1.4 Usage d’Euphorbia sp………………………………………………………….5

I.1.4.1 Utilisation traditionnelle……………………………………………………..5

I.1.4.2 Utilisation contre les bactéries……………………………………………….5

I.1.4.3 Utilisation contre les insectes………………………………………………..6

I.1.5 Composition phytochimique et application pharmacologique d’Euphorbia sp.6

I.1.6 Toxicité d’Euphorbia sp……………………………………………………….7

I. 2. Les substances actives : Huiles essentielles………………………………….7

I.2.4.2 Les composés aromatiques dérivés du phenylpropane……………………...10

Chapitre II. Matériel et méthodes

II.1.1. Matériel biologique………………………………………………………….24

II.1.2.Matériel non biologique………………………………………………………24

II.2.2. Broyage et de conservation de la poudre…………………………………….26

II.2.3 Tests phytochimiques (Screening phytochimique)…………………………..26

II.2.4. Extraction des huiles essentielles……………………………………………29

II.2.4.1. Rendement de l’extraction………………………………………………...30

II.2.5.Isolement des souches bactériennes………………………………………….30

II.2.5.1. prélèvement du sol………………………………………………………...30

II.2.5.2. préparation des dilutions…………………………………………………..30

II.2.5.3. Ensemencement dans une gélose nutritive………………………………..31

II.2.5.5. Identification des souches isolées………………………………………...31

II.2.5.5.1. Examen macroscopique………………………………………………...31

II.2.5.5.2. Examen microscopique (coloration de Gram)………………………….31

II.2.5.5.3. Recherche des caractères biochimiques………………………………..32

II.2.6. Sensibilité aux antibiotiques……………………………………………….34

II.2.7. Evaluation de l’activité antibactérienne…………………………………...35

II.2.7.1. Revivification et repiquage des espèces bactériennes……….……….…35

II.2.7.2 Préparation de l'inoculum……………………………………………......35

II.2.7.6. Expression des résultats ………………………………………………..36