RAPPORT TRAVAUX PRATIQUES

ANALYSE INSTRUMENTAL
2021-2022

Encadré par : Mr LHICHO Khalid Réaliser par :

• ALALA MOUNA
• CHIDMI FATIMA-ZAHRA
• OUAKRIM OUSSAMA
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Chromatographie sur couche mince des Amines biogènes

INTRODUCTION :
La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation de composés basée sur la
différence d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les composés, et la
phase stationnaire. ... la séparation de composés non colorés qu'il faudra révéler par un autre moyen.

OBJECTIF :
Identifier les constituants d’un mélange par la méthode de chromatographie sur couche mince

PRINCIPE :
La chromatographie sur couche mince s'effectue généralement sur une fine couche de silice (phase
stationnaire) de 5cm de largeur et 10 cm de hauteur déposée sur un support en alluminium. Le
mélange étudié(poisson) est ensuite posé à l'aide d'un capillaire à environ 1 cm du bord puis placé
dans une cuve contenante l'éluant. Le niveau de l'éluant devant être en dessous du produit déposé.
La cuve de chromatographie est ensuite refermée par un couvercle (boite de petri).

La chromatographie sur couche mince (CCM) sert aussi bien à séparer les produits qu’à les identifier.
Le procédé́ de la couche mince est le suivant, déposer une goutte du produit à analyser sur une
plaque sur la plaque puis y déposer aussi des gouttes des produit de références « Tryptamine ;
Tyramine ; Phènylèthylamine et l’Histamine ». La plaque est alors plongée dans une cuve avec du
solvant qui montera le long de la plaque par capillarité. Les différents composés migrent avec le
solvant à des vitesses différentes. Plus ils auront d’affinité́ avec le solvant plus ils migreront vite.

PROTOCOL D’ANALYSE :

1- Préparation du solvant « Éthanol 96% et Ammoniaque à 25% par un rapport de (4 ;1)

2- Préparation de la colonne de chromatographie « 5 cm – 10cm »

3- Tracage de la plaque de chromatographie en crayon « la ligne de dépôt et 5 points
d’echantillon »
4- Poser à l’aide d’un capillaire les 5 dépôts « Tyramine ; tryptamine ;Phènylèthylamine ;
histamine et le mélange »

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5- Laisser sécher et en renouveler deux fois (séchage à laide d’un séchoir manuel) pendant
quelques minutes
6- Immerger la colonne dans le solvant dans un béchers avec sa fermeture et laissez la
migration s effectuer jusqu’à le front du solvant approche le bord

7- Sortir le chrommatogramme et faire sécher à l’air

8- Pulvériser la ninhydrine sur toute la surface de la plaque chrommatogramme
9- Porter à l’étuve endant 10 min
10- Entourer les taches en croyon et faire calculer leurs rapport frontal

Les Questionnes/Réponses :

1) La CCM est une technique d’identification quantitative et qualitative ; elle permet de

séparer les constituants d’un mélange.
Une phase mobile appelée éluant (solvant(s)) progresse par capillarité le long d’une
phase

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stationnaire (silice). → plus une substance est soluble dans l’éluant, plus elle est facilement
entrainée.
→ une substance est plus ou moins retenue par la phase stationnaire
2) La composition exacte de la phases mobile : 80%ETANOLE (96%), AMMONIAQUE
20%(25%)
3) . Les différentes tâches qui présentent sur la plaque de la chromatographie : «
Tryptamine Tyramine ; Phènylèthylamine et l’Histamine »
4) La hauteur de l’éluant doit etre inférieure à 1,5 cm pour éviter les interactions des
échantillons par l’éluant.

5) Le calcules des RF :

Acide aminé Migration Spot (tache) Distance Rf

Forme Couleur d en mm D en mm
TYRAMINE OVALE VIOLET 3.3 4.3 0.77
tryptamine RONDE JAUNE 3.3 4.3 0.77
Phényléthylamine RONDE JAUNE 3.5 4.3 0.81
HISTAMINE RONDE BLANCHE 2.7 4.3 0.63

6) Le réactif qui migre le plus vite est histamine parce que qu’il a une grande affinité
Avec le solvant.

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Séparation des colorants du sirop de menthe par méthode

chromatographe sur colonne

Objectifs :

Le but de ce TP est de séparer les colorants d’un sirop de menthe en utilisant la méthode de séparation : la
chromatographie sur colonne.

Principe de la technique de séparation des colorants : la chromatographie sur colonne

Dans une colonne remplie de silice, un éluant coule par gravité ou par surpression en appuyant sur la
tétine, entraînant différemment les constituants du mélange selon l’affinité dans l’éluant utilisé. On se
sert successivement de 2 éluants : le premier entraine un colorant puis le second entraine l’autre
colorant. On peut alors recueillir séparément les constituants en bas de la colonne.

Les éluants utilisés sont l’eau salée et l’éthanol. Il s’agit de déterminer qu’éluant sera introduit en
premier dans la colonne, éluant qui ne devra entrainer qu’un seul colorant.0

Séparation des colorants :

Réaliser la chromatographie en mettant en œuvre le protocole suivant :

- Dans une pipette Pasteur, introduire une boulette de coton pas trop tassée, qui jouera le rôle
de filtre et de « bouchon ».

Photo : protocole de la chromatographie

- Introduire la silice dans la colonne ; la colonne doit être remplie au 2/3, de façon homogène
(sans trous)

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Photo 9 : protocole de l’expérience

- Introduire un bout de coton pas trop tassé en haut de la colonne

- Faire couler le 1er éluant (eau salée) en se servant de la tétine pour pousser, sans aspirer,
jusqu’à ce que toute la colonne soit imbibée. Rajouter de l’eau salée si besoin.
- Lorsque toute la colonne est imbibée et que l’éluant affleure le niveau supérieur du coton (haut
de colonne), introduire 5 gouttes de sirop de menthe par le haut de la colonne.

Photo 10 : le sirop de menthe

- Pousser le sirop dans la colonne sans aspirer, jusqu’à ce que le sirop affleure le niveau
supérieur du coton (haut de colonne).
- Ajouter alors de l’eau salée et la pousser sans aspirer.
- Observer la séparation des colorants et pousser celui entrainé par l’eau salée jusqu’au bas de
colonne ; ajouter régulièrement de l’eau salée pour éviter d’assécher la colonne.
- Lorsque tout le premier colorant a été récupéré, changer d’éluant (éthanol) ; pousser l’éthanol
à travers la colonne sans l’assécher, en ajoutant de l’éthanol si besoin.
- Récupérer le second colorant dans un second tube à essais.

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Photo : les deux colorants

On a calculé l’absorption du sirop et on a tracé la courbe d’absorption pour les deux composants :

Photo : les échantillons pour le calcul d’absorption

Le tableau suivant résume les résultats du calcul de l’absorbance et de la longueur d’onde du sirop et
des deux composants étudiés :

Absorbance Longueur d’onde (ʎ)

Bleu 0,232 630

Jaune 0,164 425

Vert 0,959 636

Blanc (eau distillée) 0,000 000

Conclusion :

Donc on peut conclure que le sirop de menthe dont on a travaillé avec est pur.

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DOSAGE DES NITRITES

Méthode de Bedschneider et Robinson

Objectif :

Détermination de la teneur en AZOTE NITREUX dans l’eau salin.

Traçage de la courbe d’étalonnage.

Principe :

La méthode utilisée est fondée sur la réaction de Griess, est une des plus sensibles et des plus spécifiques
pour l’analyse des eaux naturelles.

Mode opératoire :

-Nous avons pesé 0,15 g de Nitrite de sodium NaNO₂.

-Dilution avec de l’eau distillée jusqu’à avoir 100 ppm de la solution de NO⁻₂.
-Nous avons préparé 100 ml de la solution de NO⁻₂ à 1 ppm.
-Préparation par dilution les solutions standards de NO⁻₂ suivantes :

Volume en ml à prélever de la solution de Concentration à préparer (ml/ppm)

NO⁻₂ (1ppm)

20.0 100ml/0.20ppm
15.0 100ml/0.15ppm
10.0 100ml/0.10ppm
05.0 100ml/0.05ppm
02.0 100ml/0.02ppm

Photo 6 : solution filles avec

réactifs

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-Prélèvement de 25 ml de chaque échantillon.

-Ajout de 1 g de Réactif de Griess (RG).
-Attendre 15min.
-On mesure l’absorbance de chaque solution dans le spectrophotomètre

Photo : le spectrophotomètre

-Etablissement de la courbe d’étalonnage.

Résultats :

Concentration des échantillons en ppm L’absorbance

0.2 0.276

0.15 0.265

0.1 0.223

0.05 0.211

0.02 0.178

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La courbe d’étalonnage :

Concentration des
L’absorbance
échantillons en ppm

0.2 0.276
0.15 0.265
0.1 0.223
0.05 0.211
0.02 0.178
X/ Y/
0.104 0.1132

a 0.537

b 0.1748

Donc on la concentration en ppm des nitrites dans l’aliment est alors :

𝐴𝑏𝑠
[𝑁𝑂2-]al = [𝑁𝑂2-]et x 𝐴𝑏𝑠 𝐹 X 20
𝑒𝑡

0.178
[𝑁𝑂2-]al = 0.02 x 1.398 x 20

[𝑁𝑂2-]al = 0.0509 ppm

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DOSAGE D’HISTAMINE PAR FLUORIMETRIE

But : déterminer le taux d’histamine dans un échantillon De poisson

Introduction :

L’histamine est une amine biogène produite après la mort du poisson sous l’action de certaines
bactéries. Ces dernières produisent une enzyme qui va transformer l’histidine (acide aminé présent
à forte teneur dans certains poissons) en histamine. L’histidine peut se trouver sous forme libre mais
aussi sous forme liée dans les pigments tels que l’hémoglobine et la myoglobine.

Principe :

L’histamine est extraite par une solution d’acide trichloracétique (TCA) puis la fixée sur une colonne
remplie de résine échangeuse d’ions, l’élution se fait par l’HCl et le dosage par fluor métrie après
addition d’ortho-phtaladéhyde (OPA).

Réactifs :

✓ Solution d’acide trichloracétique à (10%) 10g/ 100ml.

✓ Tampon acétate 0.2N préparé en dissolvant 8.05g d’acétate de sodium anhydre dans quelques
ml d’eau, puis en ajoutant 5,9 ml d’acide acétique glacial et en complétant à un litre avec de
l’eau (le pH est ajusté à 4.620).

✓ Solution d’acide chlorhydrique 0,2N et 0,7N.

✓ Solution d’hydroxyde de sodium 1N.

✓ Solution d’O-phtaladéhyde (OPA) à 1g/ 100ml d’alcool méthylique.

✓ Résine Ambérlite CG 50 type échangeuse d’ions.75 a 100 microns

Solutions pour l’étalonnage du fluorimètre :

• Solution d’histamine à 1g/1L préparée en dissolvant 0,1656g de chlorhydrate d’histamine dans

100ml d’acide chlorhydrique 0.1N.

• Solutions étalon d’histamine de 0.02g/ 1000ml ((20 ppm,) : dans une fiole jaugée de 100ml
introduire 2 ml de la solution mère d’histamine et compléter

• avec l’acide trichloracétique à 10 % ; cette solution est stable plusieurs semaines au

réfrigérateur.

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Mode Opératoire :

A. Matériel utilisé :

• Spectrophotomètre

• Colonnes de verre de 150 x9mm munie d’un robinet et d’un réservoir de 250ml.

• Balance de précision.

• Hachoir de viande.

• Matériels courant de laboratoire.

• Mixeur à grande vitesse (8000 et 45 000 trs /min)

• Système de filtration sous vide – BÜCHNER

B. Préparation de l’échantillon :

Hacher un échantillon anchois sale ; en prélever 10 g± 0,1g et les ajouter à 90 ml d’acide

trichloracétique à 10g/ 100ml. Homogénéiser le mélange dans mixeur pendant 2 min puis filtrer. Cet
extrait peut être gardé pendant 7 jours à une température entre 2°C et 6°C.

C. Préparation de la résine échangeuse de cations :

Mettre en suspension 3g de résine (amberlite CG-50) dans la quantité nécessaire et suffisante de

tampon acétate pour maintenir le pH à 4,62. Transférer dans la colonne. La hauteur de la résine doit
être de 50 mm

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D. Purification de l’histamine :

Mettre 20ml de tampon acétate dans la colonne d’élution et ajouter 0.2ml d’extrait
trichloracétique. Faire écouler le liquide. Laver la colonne avec 150ml de tampon acétate. Éliminer
les solutions de lavage. Éluer l’histamine de la colonne avec 18 ml d’acide chlorhydrique 0,2N et
recueillir l’éluât dans une fiole jaugée de 20ml puis compléter avec de l’eau. Traiter dans les mêmes
conditions 0.2 ml de la solution d’étalon

E. Détermination de la quantité d’histamine :

Transférer 2ml de l’éluât dans un tube et ajouter dans l’ordre et en agitant après chaque addition:

1ml de NaOH 1N ; 0.1ml d’OPA à 1g/100ml, ; Après 3 minutes, ajouter 2ml d’HCl 0,7N.

Le blanc est l’eau distillée

La fluorescence des trois solutions (échantillon, blanc et étalon) est mesurée à des longueurs
d’onde d’émission et d’excitation respectives de 450nm et 360nm.

F. Résultat :

Après le calcule par le spectrofluorimétre. Le taux d’histamine est :

H= 32875.9 ppm

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DOSAGE D’HISTAMINE PAR FLUORIMETRIE

PRINCIPE :

La chromatographie est une méthode chimique de séparation des molécules en fonction

de leur différence affinité avec d’autres molécules. Il existe de nombreux types de
chromatographie mais celle qui nous intéresse est la chromatographie liquide haute
performance (HPLC).

On l’appelle chromatographie liquide car l’échantillon dont on veut séparé les composés
est entraîné par une phase mobile liquide dans une colonne contenant la phase
stationnaire qui est fixée à la paroi de la colonne.

Le principe de cette chromatographie repose donc sur la séparation de molécules en

fonction de leur polarité et de l’interaction que cette polarité peut entraîner en fonction
de la polarité de la phase mobile et de la phase stationnaire.

Dosage à l’aide d’un étalon interne

Préparation de la fiole étalon et injection du mélange étalon. Préparer la fiole étalon en
introduisant 30 µL de la solution de caféine de concentration 1,021 g.L-1 dans l’éluant et 30
µL de la solution de benzoïne de concentration 1,087 g.L-1 . Compléter à 20 mL avec
l’éluant. Injecter le mélange étalon préparé dans la boucle de 20 µL.

Photo : la solution de caféine et l’étalon interne

Préparation et injection de la fiole fille FEI. Dans une fiole de 20,0 mL, introduire 30,0 µL de la
solution mère SM et 30,0 µL de la solution de l’étalon interne (benzoïne) de concentration
1,087 g.L-1 . Compléter à 20,0 mL avec l’éluant. Injecter le mélange contenu dans la fiole
FEI dans la boucle de 20 µL.

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Photo : La solution mère

Photo : les deux solutions injectées

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