Miel
Miel
Miel
et de la Recherche Scientifique
∗∗∗ ∗ ∗∗∗
Université de Carthage
∗∗∗ ∗ ∗∗∗
Institut National des Sciences
Appliquées et de Technologie
Pour l’obtention du
Sujet :
Entreprise d’accueil :
Soutenu le 17/01/2013
L’apiculture en Tunisie est une activité marginale qui reste peu développée.
Cependant, le pays offre des conditions favorables à la production du miel, dont une richesse
botanique constituant un environnement mellifère important et des conditions climatiques
permettant des sécrétions nectarifères abondantes.
Étant un produit noble, naturel et sain, le miel doit faire l’objet dʼaucune addition de
produits alimentaires, il doit être dans la mesure de possible exempt de toutes matières
organiques et inorganiques étrangères à sa composition. Cependant, ces dernières années dans
certaines publications le problème des résidus d'antibiotiques et de sulfonamides dans le miel
a été mentionné [1].
Ces antibiotiques sont principalement utilisés dans l'apiculture pour le traitement des
infections bactériennes causant les maladies du couvain, par exemple, la loque
américaine (Paenibacillus larvae) [1]. L’usage des antibiotiques est devenu un geste banal
pratiqué par tout le monde. Ce qui nous emmène à parler de notion de résistance aux
antibiotiques ainsi que de leurs résidus dans les denrées alimentaires d’origine animale. Les
bactéries montrent de plus en plus de phénomènes de résistances même aux antibiotiques de
dernière génération et le problème des résidus est devenu la première préoccupation de
l’industrie alimentaire vu les pertes économiques qui s’en suivent.
La situation en Tunisie est loin d’être résolue en faveur d’une prise de position ferme
vis-à-vis de l’utilisation intempestive des antibiotiques en pratique vétérinaire.
2|Page
Chapitre I : Synthèse Bibliographique
Synthèse Bibliographique
1. Miel
1.1. Définition
Selon le Codex Alimentarius (2001), le miel est définit comme suit : « Le miel est la
substance sucrée naturelle produite par les abeilles à partir du nectar de plantes ou des
sécrétions provenant de parties vivantes des plantes ou des excrétions d'insectes suceurs
de plantes sur les parties vivantes de plantes. Les abeilles butinent, transforment et
combinent cela avec des matières spécifiques qui leur sont propres, et ensuite le stock et le
laisse dans le nid d’abeilles pour qu’il soit affiné et mûri. »
1.2. Composition
Minéraux - 0,02-1,03
Nitrogène (protéine) - 0-0,13
Enzymes - >0,1%
Aromes - >0,1%
Autres (HMF :hydroxymethylfufural, ect…) - >0,1%
4|Page
Synthèse Bibliographique
Acidité
L’acidité est un critère de qualité important. L'ancienne norme prescrit une valeur
maximale de 40 milliéquivalents/kg. Dans le projet du Codex Alimentarius, elle a été
augmentée à 50 milliéquivalents/kg, étant donné qu'il existe quelques sortes de miels qui
ont une teneur naturelle en acide plus élevée [5].
Activité de la diastase
Conductivité électrique
5|Page
Synthèse Bibliographique
6|Page
Synthèse Bibliographique
Étant d’origine naturelle, le miel est considéré généralement comme un produit sain et
propre. Cependant, les produits apicoles sont aujourd'hui produits dans un environnement
pollué par les différentes sources de contamination.
L’abeille, comme les autres espèces élevées, fait l'objet de traitements vétérinaires
destinés à lutter contre les maladies bactériennes et parasitaires. Elles sont traitées
régulièrement contre le parasite Varroa jacobsoni causant la varroase et occasionnellement
contre les loques, la nosémose, l'acariose. Ces traitements sont effectués en dehors des
miellées. Selon des études menées par Stefan Bagdanov en 2009 [8], ont permis d’identifier
les sources de contaminations du miel et de mettre en évidence le risque d'apparition de
résidus de traitements dans cette matrice (figure 2).
Air, Eau
Plantes
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Synthèse Bibliographique
2. Les Antibiotiques
2.1. Définition
2.2. Danger
Selon la Food and Drug Administration (FDA) 13 000 tonnes d’antibiotiques ont été
administrés aux animaux destinés à l’alimentation en 2009, pour la plus grande partie à des
animaux en bonne santé. Cette large utilisation d’antibiotiques chez les animaux s’est traduite
par une augmentation de la résistance bactérienne et qui est actuellement considérée parmi les
majeurs problèmes.
Toutefois, les dangers pour la santé, liés à l'augmentation des résistances bactériennes
dans les élevages intensifs, ont été mis en évidence dès la fin des années 60 (rapport du
Comité Swan-UK), et dénoncés par l'OMS, dès 1977. La Commission Européenne a déjà
interdit l'administration de certaines molécules antibactériennes comme un facteur de
croissance chez les animaux. D’autres antibiotiques sont encore autorisés ce qui nécessite des
mesures de surveillance et du contrôle afin de réduire le développement de la résistance
microbienne [10].
8|Page
Synthèse Bibliographique
2.3. Législation
Comme pour tous les autres médicaments, l’utilisation d’antibiotiques est soumise à
une autorisation préalable, selon une procédure bien définie. Deux notions très importantes
sont utilisées par la réglementation: la notion de Limite Maximale de Résidus (LMR ou en
anglais MRL) et la notion de Dose Sans Effet (DSE).
La LMR correspond à la concentration maximale en résidus, résultant de l’utilisation
d’un médicament vétérinaire, sans risque sanitaire pour le consommateur et qui ne doit pas
être déposé dans ou sur les denrées alimentaires [11].
Les LMRs sont établies au nom de chaque molécule pour chaque espèce de destination et non
au nom de la spécialité pharmaceutique.
Les résultats des études pharmacologiques et de toxicité permettent de déterminer une
Dose Sans Effet (DSE), c’est-à-dire une dose qui ne montre pas d’effets toxicologiques ou
pharmacologiques dans les différentes études. Cette DSE est divisée par un facteur de sécurité
(100 à 1000) selon le profil toxicologique de la molécule pour aboutir à la Dose Journalière
Admissible (DJA) [11].
Le contrôle officiel: Règlement 2377/90 classe les LMRs selon la substance active et
l’espèce animale en 4 annexes (tableau II). Selon les substances actives les LMRs sont
classées dans différentes Annexes du Règlement Européen 2377/90/CEE (ANMV, (e) (f) (g)
(h) 2008).
Tableau II: Annexes réglementaires pour l'inscription des substances pharmacologiquement
actives (date de validité 2002) [11]
Nb de substances
Annexe Définitions
inscrites
9|Page
Synthèse Bibliographique
Ainsi, les LMRs sont établies dans la réglementation au niveau européen, pour chaque
substance pharmacologiquement active selon une procédure bien établie afin de déterminer
les quantités résiduelles ingérables lors de la consommation des différentes denrées d’origine
animale [12].
Durant l’année 2001, une première alerte a été lancée, lors de la publication de la
première enquête du magazine des consommateurs belges Test-Achats [13]. L’article mettait
en évidence qu’un pourcentage important de miels d’importation (plus de 80 %) présentait des
traces d’antibiotiques, ainsi que deux miels bio sur quatre [13].
D’où aujourd’hui, la présence des résidus d’antibiotiques dans le miel est devenue une
préoccupation pour les consommateurs qui sont devenus très stricts et exigeants vis-à-vis leur
alimentation.
Nb de miel+ / Substances
Pays Nb total du
miel Streptomycine Tétracyclines Sulfonamides Chloramphénicol
Belgique 13/20 6 1 2 9
Italie 3/20 2 1 0 0
Espagne 7/20 3 1 5 4
Portugal 10/20 3 3 5 4
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Synthèse Bibliographique
La loque américaine est l'épizootie la plus dangereuse pour les abeilles. Elle est due à
la bactérie Paenibacillus larvae qui produit des spores affectant la reine des abeilles et les
larves (figure 3). Ces spores sont extrêmement résistantes et restent infectieuses pendant des
décennies dans les colonies d'abeilles, sur les rayons et autres matériaux. En conséquence, une
lutte rigoureuse est indispensable.
Larve infestée
Quant à la loque européenne, elle est moins grave que la loque américaine, elle est
causée par la bactérie Melissococcus pluton et elle se produit généralement lors d’une période
où les colonies se développent rapidement. La lutte contre cette maladie se fait par
l’application de certains antibiotiques tels que l'oxytétracycline (la terramycine), la
dihydrostreptomycine (la didromycine) ou l'erythromycine.
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Synthèse Bibliographique
Antibiotiques Références
Sulfonamides
(Martel and Zeggane, 2003; Reybroeck, 2003;
sulfathiazole, sulfamerazine, sulfamethazine Wallner, 2003; Kaufmann and Känzig, 2004)
sulfaméthaxazole, sulfadiazine,
sulfaméthoxypiridazine,
sulfadoxine, sulfadimidine, sulfanilamide
Pénicilline
Métabolites du Nitrofurane (Stiftung Warentest, 2004; Jenkins and Young,
AOZ, SC 2005)
Le traitement par les antibiotiques n’est pas permis en Europe. Par conséquent, la
limite maximale des résidus n’est pas définie dans la majorité des pays européens. Il résulte
alors que le miel contenant les antibiotiques n’est pas autorisé sur le marché. Et comme aucun
antibiotique n’est permis, aucune LMR n’est établie. Toutefois, certains pays, tel que la
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Synthèse Bibliographique
Suisse, le Royaume-Uni et la Belgique, ont mis en place des limites d'action, qui se situent
généralement entre 0,01 et 0,05 mg / kg pour chaque groupe d'antibiotiques [15].
Tableau V: Comparaison des différents règlements pour les antibiotiques utilisés dans le
miel [16].
Codex
Classe Antibiotiques EU USA Canada
Alimentarius
LMR provisoire
Tétracycline Oxytétracycline
25 ppb 300 ppb
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Synthèse Bibliographique
En conséquence, même les analyses de routine offrent un seuil de détection beaucoup plus bas
: 0,3 ppb (0,0003 gr/tonne) [18]. C'est sur la base de ces analyses qualifiées par la presse
apicole de " non fiables " et " non validées " que l'Union Européenne a bloqué les
importations de toutes les productions animales d'origine Chinoises. (Miel, volailles, lapins,
mollusques, crevettes, crustacés et même les aliments pour chiens et chats).
Le 25 janvier 2002, la commission de Bruxelles a décidé l'arrêt total des importations
de miels chinois (acte n° 2002/69/CE du 30 janvier 2002). Cette décision est consécutive à la
découverte de résidus de chloramphénicol dans le miel [19].
L’abeille tellienne est l’abeille tunisienne appartient à la race Nord Africaine Apis
mellifera intermissa.
Cette abeille est menacée par plusieurs ennemis et maladies infectieuses. Les maladies
les plus répandues en Tunisie sont : Les loques, les acarioses, la nosémose, la fausse teigne.
La Varroase est la maladie principale du rucher tunisien ainsi que les deux loques Américaine
et Européenne. La plus redoutable s’est la loque Américaine dont l’agent causal est
Peribacillus larvae. Des mesures législatives on été adoptées suite à l’augmentation du
pourcentage d’infestation au cours des 5 dernières années (cire importée) [7].
En Tunisie la lutte contre la loque s’est toujours faite par l’utilisation des sulfamides et
des antibiotiques comme la terramycine ou la sanclomycine. Quant à la néo-terramycine, elle
est utilisée d’une façon systématique en traitement préventif lors du nourrissement stimulateur
au début du printemps [7].
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Synthèse Bibliographique
15 | P a g e
Synthèse Bibliographique
• Tests commerciaux
De nombreux tests existent sur le marché, mais sont surtout consacrés aux analyses du
lait. Très performants vis-à-vis des pénicillines, des sulfamidés et des tétracyclines, mais sont
insuffisamment sensibles pour les autres familles [18]. Parmi les principaux tests utilisés pour
la détection des antibiotiques dans le lait on peut citer le Delvotest ® (DSM) (figure 6) et
BrTest. Beaucoup des copies de ces tests existent (Copan, Eclipse...). Tous ces tests utilisent
la même bactérie : Bacillus stearothermophilus.
Ces tests utilisent des technologies différentes. Ils fournissent une analyse de la qualité
en quelques minutes (présence ou absence) permettent d’effectuer «Les tests libératoires»: le
lait recueilli dans les camions est testé avant et en cours de déchargement.
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Synthèse Bibliographique
Parmi les tests les plus souvent utilisés pour une détection rapide des antibiotiques sont :
• Penzym test: test enzymatique et colorimétrique. Une enzyme (DD carboxypeptidase)
est inhibée par la présence du bêta-lactamine [22].
• Delvo-X-PressM BL: immuno-enzymatique test basé sur un dosage par colorimétrie
de l'excès d'un réactif donné.
• Betastar: test basé sur l'utilisation d'un récepteur spécifique lié à des particules
d'or. Ces récepteurs migrent différemment sur une bande selon qu'ils sont liés à des
antibiotiques bêta-lactamines ou pas.
• Snap: utilise une méthode immuno-enzymatique. Les récepteurs peuvent êtres liés soit
à l'antibiotique (s'il est présent) ou aux antibiotiques fixés à la surface de test.
• Les test immunologiques : Sur le marché les immuno-essais décrits pour l’analyse
des antibiotiques sont réparties en deux groupes : les tests RIA(Radio
ImmunoAssay)et les tests ELISA (Enzyme-LinkedIimmuno-Sorbent Assay).
Au début des années 1980, les progrès techniques ont permis un bond spectaculaire
dans les méthodes de détection avec notamment le développement de la Chromatographie
Liquide Haute Performance (HPLC). Ceci permet la recherche et la quantification d’une
molécule donnée. C'est la raison pour laquelle tout résultat positif obtenu ainsi est
systématiquement validé ensuite par l'HPLC que personne ne conteste.
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Chapitre II : Matériels&Méthodes
Matériels & Méthodes
Ce présent travail est une continuité d’un ensemble de travaux réalisés au sein des
laboratoires du CNSTN, ayant pour objectif de valider et d’optimiser les conditions
expérimentales du kit Honey test.
Honey test est un nouveau kit développé au sein des laboratoires du CNSTN. C’est
une méthode alternative d’analyse plus fiable et rapide que la méthode validé AFNOR qui est
le Premi®Test.
Cependant même si ce test est reconnu comme une méthode fiable pour les matrices
viande, œuf et poisson, ne l’est pas encore pour le miel du fait de :
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Matériels & Méthodes
1.1. Définition
Honey test est un test microbiologique à large spectre qui permet de détecter au moins
de trois heures la présence ou l’absence de substances antibactériennes dans le miel.
1. 2. Principe
Honey test est basé sur l’inhibition de la croissance de la souche D. ra, c’est une
bactérie radio résistante et très sensible à de nombreux antibiotiques. Le miel est utilisé
comme milieu de culture pour cette bactérie.
1. 3. Méthode de lecture
2. Culture bactérienne
L’isolement de notre souche d’intérêt D. ra sur milieu solide de TGYMnMg est réalisé
dans le but de contrôler la pureté de cette bactérie et afin d’éviter toute source de
contamination susceptible d’influencer le résultat du kit. Une série de dilution de notre
suspension bactérienne mère a été réalisée allant de 10-1 à10-9 suivie par des étalements sur
des milieux solides de TGYMnMg et une incubation pendant 48 heures à 37°C. Les colonies
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Matériels & Méthodes
séparées de la souche D.ra de la dilution 10-7 seront toujours pris comme colonie de départ
pour la réalisation des culots bactériens.
Par soucis de confidentialité de notre travail, nous allons désigner les différents
indicateurs colorés testés par les lettres suivantes : X, Y, W et Z. Au cours de la phase
d’optimisation, différentes concentrations de l’indicateur coloré ont été utilisées de l’ordre 10
mg/100mL et 30 mg/100mL.
La zone de virage varie selon la nature de l’indicateur. Pour l’indicateur coloré X elle
est située entre le pH 6,6 et le pH 8,4. Pour l’indicateur Y elle est comprise entre les pH 6 et
7,6, Elle entre 5,2 et 6,8 pour l’indicateur W, et entre 4,2 et 6, 3 pour l’indicateur Z. Ces
indicateurs sont préparés dans un volume égal à 10 ml, stérilisés avec un filtre de 45 µm et
conservés à 4°C à l’abri de la lumière.
Le fructose sera utilisé comme matrice pour optimiser les paramètres du kit. Une
masse de 30 g de fructose est dissoute dans 100 mL d’eau distillée, suivie d’un réglage du pH
de manière que le fructose soit dans la zone de virage de chaque indicateur coloré. La solution
est ensuite filtrée par un filtre à seringue de 0,2 µm.
Le miel utilisé est un miel commercialisé, il est conservé à 4°C tout au long de son
utilisation. La dilution du miel au ½ est réalisée avec la solution d’antibiotique directement.
Avec :
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Matériels & Méthodes
On a : C=300 ppb=300µg/L
P=98%=980mg/g
V=10 mL
% eau=11%
Pour tester la sensibilité de la souche , nous avons utilisé la méthode des disques. Cette
méthode consiste à déposer un volume de 10 µL de l’antibiotique sur un disque dans un
milieu gélosé (TGYMnMg) contenant un volume de 100 µL de notre souche. Les boites sont
ensuite incubées à 37°C pendant 48°h.
Après l’optimisation des conditions expérimentales du kit sans antibiotiques, on a
réalisé le test de contamination artificielle du miel par les antibiotiques.
22 | P a g e
Matériels & Méthodes
Figure 8: Lampe UV
23 | P a g e
Matériels & Méthodes
deuxième, noté a*, révèle la composante chromatique Rouge-Vert et le troisième, noté b*,
défini la composante chromatique Jaune –Bleu (figure 10).
Figure 10: Espace CIELAB modèle tridimensionnel de la couleur international utilisé pour le
colorimètre Minolta CR-210
8. Validation du kit
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Chapitre III : Résultats & Discussion
Résultats & Discussion
Nous avons utilisé le fructose (30%) en tant qu’une source de carbone au lieu du miel
comme matrice alimentaire. Le choix du fructose a été basé sur le fait qu’il présente la
fraction majeure du miel.
Afin de s’assurer de la pureté de la souche utilisée, les cultures de départ sont toujours
dénombrées sur milieu TGYMnMg solide (figure 11). Le culot utilisé après le test de
dépistage par le kit Honey test est aussi analysé dans les mêmes conditions. Cette étude nous
a confirmé la pureté de la souche bactérienne D. ra étudiée puisqu’aucune contamination par
d’autre type de souche n’a été observée.
26 | P a g e
Résultats & Discussion
T+B : témoin bactérie à 4°C, 37 : traitement 2 h à 37°C, T37 : témoin sans bactérie à Tab
T+B : témoin bactérie à 4°C, 37 : traitement 2 h à 37°C, T37 : témoin sans bactérie à Tab
Pour l’indicateur Z, dont la zone de virage est située entre 4,2 et 6,3, à un pH inférieur
à 4,2 la couleur devient rouge. Ceci ne permettra pas une bonne distinction du virage de la
couleur orangée vers le rouge.
Contrairement aux autres indicateurs colorés, l’indicateur X testé dans un milieu ayant
un pH= 8,5, a montré un changement net de la couleur. En effet, pour une concentration de
27 | P a g e
Résultats & Discussion
Figure 13: Variation de la coloration au niveau du tube testé pour l’indicateur coloré
X(20mg/100 mL)
T+B : témoin bactérie à 4°C, 37 : Traitement 2 h à 37°C, T37 : témoin sans bactérie à Tab
Sur la base de ces résultats l’indicateur coloré X, qui semble être le plus intéressant
avec une concentration optimale de 20 mg/100 mL, sera retenu pour la partie de la validation.
Étant donné que notre kit se base sur un test microbiologique, la concentration
bactérienne peut affecter le résultat de la variation de l’intensité de couleur. Pour ceci, nous
avons testé la variation de la couleur de l’indicateur coloré X sous deux conditions
différentes : la première utilise une densité optique égale à 1 (équivalente à 109 UFC /mL) et
la deuxième une densité égale à 2 (équivalente à 2. 109 UFC /mL). Les résultats obtenus n’ont
pas montré de différence de variation de couleur entre les deux concentrations du culot
bactérien testées (figure 14). D’où, une concentration équivalente à 109 UFC /mL du culot
bactérien pourrait être suffisante pour continuer le teste de validation du kit.
28 | P a g e
Résultats & Discussion
29 | P a g e
Résultats & Discussion
Deux analyses ont été réalisées sous rayons UV et à 37°C en variant seulement la
durée d’incubation (30 min et une heure). Les résultats obtenus ont montré que la différence
n’est pas remarquable entre les deux cas. D’où on a opté pour un traitement de 30 minutes à
37°C combiné à un traitement UV (figure 16).
Figure 16: Variation de la coloration de l’indicateur coloré X (20 mg/100 mL) après
traitement 30 min à 37°C +UV
T : tube témoin bactérie à 4°C ; 2 : bactéries incubées pendant 30 min à 37°C sous UV ; T’2 : tube sans bactérie
incubées pendant 30 min à 37°C sous UV
30 | P a g e
Résultats & Discussion
Conclusion
Cette première partie nous a permis la mise au point des conditions expérimentales
adéquates de notre kit HONEY test, en utilisant le fructose et le milieu TGYMnMg et en
appliquant un traitement de durée de 30 minutes à 37°C+UV. En effet, le résultat du test est
dit négatif, si un virage de l’indicateur coloré X du rouge vers l’orangé est observé (tableau
VI). Cette variation de l’intensité de couleur est due essentiellement à la diminution du pH
suite à la croissance bactérienne de notre souche d’intérêt D. ra. Dans le cas contraire,
absence de croissance bactérienne, aucun changement de couleur n’est observé (couleur
rouge).
31 | P a g e
Résultats & Discussion
Au cours de cette partie, nous allons testés les conditions déjà optimisées sur le miel.
La confirmation visuelle reste toujours un résultat qualitatif qui dépend de l’appréciation et
des facultés humaines d’où l’intérêt de l’utilisation d’un moyen de mesure quantitatif qui est
le colorimètre.
Moyenne ± Ecartype
Test de Student
Témoin (TUV) UV
Cinq répétitions ont été effectuées sur les mesures des trois paramètres L*, a* et b*.
L’étude statistiques moyennant le test de Student montre l’absence d’une différence
significative entre le témoin TUV et l’essai UV (tableau VII). Ce résultat confirme que le
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Résultats & Discussion
traitement UV n’a pas d’influence sur la variation de la couleur de l’indicateur coloré X et que
cette variation est due essentiellement à la diminution du pH par acidification bactérienne du
milieu réactionnel.
Moyenne ± Ecartype
Test de Student
TB B
33 | P a g e
Résultats & Discussion
Tableau IX: Coefficients de variation (%) pour les paramètres de couleur L*, a*, b*
CV(%)
B TB
L* 10,949 4,138
a* 15,516 10,389
b* 3,851 23,426
TB : témoin bactérie à 4°C, B: traitement 30 min à 37°C+UV
Après avoir optimisé et vérifié la répatatbilité de notre kit, nous devons nous assurer
qu’il est apte à détecter toute présence d’antibiotiques dans le miel. Dans cette partie, on a
réalisé un test de diffusion par disque sur des milieux solides (TGYMnMg) afin de tester
34 | P a g e
Résultats & Discussion
l’activité des antibiotiques. Ce test sera confirmé par des essais sur des milieux liquides,
contenant le miel comme matrice, pour pouvoir détecter la limite d’inhibition du D. ra par les
antibiotiques.
Nous avons réalisé un test de diffusion sur milieu solide TGYMnMg et en utilisant
deux concentrations différentes (0,5 et 1ppm) de tétracycline (TC) ainsi que de pénicilline
(P). Le résultat observé montre l’apparition des zones d’inhibition à diamètres différents
autour des disques pour la concentration de 0,5 ppm (50 mm et 35 mm respectivement pour la
pénicilline et la tétracycline) et pour celle de 1ppm (60 mm et 40 mm respectivement pour la
pénicilline et la tétracycline) (figure 18). Ce test nous a permis de vérifier de l’activité de nos
antibiotiques avant de chercher la limite d’inhibition minimale en milieu liquide.
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Résultats & Discussion
DO = 1
Moyenne ± Ecartype
Test de Student
TB B
36 | P a g e
Résultats & Discussion
Tableau XI: Comparaison statistique des paramètres colorimétriques lors du test d'inhibition
pour une DO=1 et une [TC]=100 ppb
Moyenne ± Ecartype
Test de Student
TB B
DO=0,5
Pour une DO = 0,5 et en absence de tétracycline, le test est toujours négatif (virage du
l’indicateur coloré X du rouge vers l’orangé). Toutefois, à l’œil nu, nous pouvons percevoir
que l’intensité du virage n’est pas trop importante par rapport à une DO=1. En terme
quantitatif, les mesures colorimétriques pour L*, a* et b* montrent nettement la présence de
différence significatives entre le tube témoin et le tube traité pendant 30 minutes à 37° C sous
rayons UV (tableau XII).
L’étude du test d’activité de la TC sur un milieu solide TGYMnMg, avec une densité
optique de l’ordre de 0,5 et une concentration de l’antibiotique égale à 1 ppm, montre une
zone d’inhibition ayant un diamètre de l’ordre de 40 mm (figure 19).
37 | P a g e
Résultats & Discussion
Moyenne ± Ecartype
Test de Student
TB B
L’analyse de ces mêmes conditions dans un milieu liquide au niveau des tubes a
montré aussi l’existence d’une inhibition. En fait, les valeurs calculées de P via le test t pour
les moyennes des trois paramètres colorimétriques sont toujours supérieure à 0,05 d’où
l’absence des différences significatives entre le tube témoin (TB) et le tube testé (B) (tableau
XIII). Ce résultat s’explique par l’action bactériostatique de la tétracycline, qui interrompe la
multiplication des bactéries par inhibition de la synthèse protéique et l’absence de
l’acidification du milieu réactionnel.
38 | P a g e
Résultats & Discussion
Moyenne ± Ecartype
Test de Student
TB B
Afin de définir une limite minimale d’inhibition par la tétracycline, nous avons
diminué la concentration de la tétracycline à 0,5 ppm. Les résultats de cet essai ont montré
également l’absence de différences significatives (p>0,05) entre le tube témoin et le tube testé.
D’où pour une DO= 0,5 et une concentration [TC]=0,5 ppm une action inhibitrice a été
révélée (tableau XIV).
Moyenne ± Ecartype
Test de Student
TB B
En gardant la même densité optique que l’essai précédant (DO= 0,5) et en diminuant
la concentration de la tétracycline à 50 ppb. Nous avons observé nettement une variation de la
couleur du tube après traitement du rouge vers l’orangé même en présence de l’antibiotique
(figure 20), ceci est dû à la faible concentration de la tétracycline qui n’a pas pu inhiber
l’activité du D. ra.
39 | P a g e
Résultats & Discussion
Figure 20: Test d’inhibition en milieu liquide pour une DO=0,5 et [TC]=50ppb
T : tube témoin à 4°C
Tableau XV: Comparaison statistique des paramètres colorimétriques lors du test d'inhibition
pour une DO=0,5 et [TC]=50ppb
Moyenne ± Ecartype
Test de Student
TB B
Les résultats obtenus lors de ce dernier test ne permettent pas de détecter une limite
minimale d’inhibition d’où la nécessité de diminuer la DO à 0,3 et essayer de chercher une
limite d’inhibition. N’ayant pu effectuer ce test d’inhibition en milieu liquide, cependant en
milieu solide TGYMnMg (pour une DO= 0,3 et une concentration de tétracycline égale à 50
ppb), nous avons révélé la présence d’une zone d’inhibition ayant un diamètre de 20,3 mm
(figure 21).
40 | P a g e
Résultats & Discussion
Figure 21: Test d’inhibition sur milieu solide TGYMnMg pour une DO=0,3 et [TC]=0,5 ppb
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Conclusion & Perspectives
Conclusion & Perspectives
Honey test est un kit qui a été mis en œuvre et développé auparavant grâce aux efforts
des chercheurs au sein du laboratoire microbiologique du CNSTN.
Ce kit apparaît comme une méthode alternative très intéressante pour la détection des
résidus d’antibiotiques dans une matrice complexe qui est le miel.
Grâce à cette étude, nous avons pu optimiser les conditions expérimentales ainsi que
la durée et la nature du traitement appliqué. En effet, après avoir confirmé que l’indicateur
coloré X (20 mg/100 mL) est le meilleur parmi les autres qui ont été testés, nous avons pu
réduire le temps du traitement à 30 minutes sous un traitement à UV à 366 nm et à 37°C.
Tous nos essais ont été quantifiés grâce à une étude colorimétrique et validés par des
tests statistiques le test de Student. La comparaison de notre kit aux autres méthodes de
détection d’antibiotiques dans les aliments, tel que Premi®Test, montre que Honey test offre
certains avantages :
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Références Bibliographiques
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Medecine Veterinaire, 1986, pp. 61-63.
Introduction ............................................................................................................................... 1
Chapitre I : Synthèse Bibliographique ..................................................................................... 3
1. Miel ..................................................................................................................................... 4
1.1. Définition ..................................................................................................................... 4
1.2. Composition ................................................................................................................. 4
1.3. Facteurs de qualité du miel .......................................................................................... 5
1.4. Apiculture en Tunisie ................................................................................................... 6
1.5. Miel contaminé ............................................................................................................ 7
2. Les Antibiotiques ................................................................................................................ 8
2.1. Définition ..................................................................................................................... 8
2.2. Danger .......................................................................................................................... 8
2.3. Législation .................................................................................................................... 9
3. Dépistage des antibiotiques dans la matrice du miel ........................................................ 10
3.1. Antibiotiques utilisés dans le miel ............................................................................. 10
3.2. Limites maximales des résidus .................................................................................. 12
4. Méthodes de détection des résidus d’antibiotiques dans le miel ...................................... 15
4.1. Méthode qualitative ................................................................................................... 15
4.2 Méthode de confirmation ............................................................................................ 17
Chapitre II : Matériels&Méthodes ......................................................................................... 18
1. Présentation du Honey test ............................................................................................... 20
1.1. Définition ................................................................................................................... 20
1. 2. Principe ..................................................................................................................... 20
1. 3. Méthode de lecture .................................................................................................... 20
2. Culture bactérienne ........................................................................................................... 20
3. Test de la pureté de la souche bactérienne ....................................................................... 20
4. Préparation des solutions .................................................................................................. 21
4. 1. Préparation de l’indicateur coloré.............................................................................. 21
4. 2. Préparation de la solution du fructose à 30 % ........................................................... 21
4.3. Préparation du miel .................................................................................................... 21
4.4. Préparation des solutions d’antibiotiques .................................................................. 21
5. Test de sensibilité de la souche D. ra vis-à-vis des antibiotiques .................................... 22
6. Description du déroulement du test .................................................................................. 22
7. Mesure de la variation de la coloration par colorimètre ................................................... 23
8. Validation du kit ............................................................................................................... 24
Chapitre III : Résultats & Discussion .................................................................................... 25
1.Pré-optimisation de conditions expérimentales du kit de dépistage en utilisant le fructose
.............................................................................................................................................. 26
1.1. Étude de la pureté de la souche .................................................................................. 26
1.2. Choix de l’indicateur coloré et sa concentration........................................................ 26
1.3. Optimisation de la densité du culot bactérien sans traitement UV ............................ 28
1.4. Effet de la concentration bactérienne avec un traitement par UV ............................. 29
1.5. Choix de la durée et du traitement (température et/ou UV) ....................................... 30
2. Validation des résultats optimisés pour la matrice le miel ............................................... 32
2.1. Étude du traitement de l'UV sur la variation de la couleur ........................................ 32
2.2. Détermination des paramètres colorimétriques pour le kit Honey test ...................... 33
2.3. Étude de la répétabilité............................................................................................... 34
2.4. Étude de l’inhibition par les antibiotiques ................................................................. 34
Conclusion & Perspectives ...................................................................................................... 42
Liste des figures
Figure 1:Evolution de la production du miel(en tonnes) issu des ruches traditionnelles et
modernes en Tunisie .................................................................................................................. 6
Figure 2:Source de la contamination du miel ............................................................................ 7
Figure 3: La loque américaine ................................................................................................. 11
Figure 4: Abeille tellienne ....................................................................................................... 14
Figure 5: La méthode de 4 boites (Four Plates Test(FPT)) ...................................................... 15
Figure 6: DelvoTest . ................................................................................................................ 16
Figure 7: Premi® Test ............................................................................................................. 16
Figure 8: Lampe UV ................................................................................................................ 23
Figure 9: Colorimètre Minolta CR-210 .................................................................................... 23
Figure 10: Espace CIELAB modèle tridimensionnel de la couleur international utilisé pour le
colorimètre Minolta CR-210 .................................................................................................... 24
Figure 11: Pureté de la souche D. ra ........................................................................................ 26
Figure 12: Résultat de l'indicateur coloré Y et W traités 2 h à 37°C ....................................... 27
Figure 13: Variation de la coloration au niveau du tube testé pour l’indicateur coloré
X(20mg/100 mL)...................................................................................................................... 28
Figure 14: Effet de la densité du culot bactérien sur la variation de la coloration .................. 29
Figure 15: Variation de la coloration sous l’effet de la concentration bactérienne suite à un
traitement par UV ..................................................................................................................... 29
Figure 16: Variation de la coloration de l’indicateur coloré X (20 mg/100 mL) après
traitement 30 min à 37°C +UV ................................................................................................ 30
Figure 17: Illustration de la variation des paramètres colorimétriques dans le système
CIELAB suite à un traitement de 30 min à 37°C+UV ............................................................. 34
Figure 18: Test d’inhibition de la Tétracycline et la Pénicilline sur milieux solides ............... 35
Figure 19: Test d'activité de la Tétracycline à 1 ppm et DO=0,5............................................ 38
Figure 20: Test d’inhibition en milieu liquide pour une DO=0,5 et [TC]=50ppb ................... 40
Figure 21: Test d’inhibition sur milieu solide TGYMnMg pour une DO=0,3 et [TC]=0,5 ppb
.................................................................................................................................................. 41
Liste des tableaux
Monsieur Issam BEN SALEM, pour l’orientation, la patience, qui ont constitués
un apport considérable sans lequel ce travail n’aurait pas pu être mené au bon
port.
FDA : Food and Drug Administration : Agence fédérale américaine des produits alimentaires
et médicamenteux.
min: minutes
P: Pénicilline
TC: Tétracycline
UV: Ultraviolet
Le Centre a pour mission de réaliser les études et recherches nucléaires à caractère pacifique
dans les différents domaines, ainsi que la maîtrise des technologies nucléaires, leur
développement et leur utilisation aux fins du développement économique et social", et
notamment dans les domaines de l'agriculture, de l'industrie, de l'énergie, de l'environnement
et de la médecine.
D’une façon générale, la réalisation de toutes les activités tendant à assurer le développement
des sciences nucléaires, la promotion de ses différentes applications et la maîtrise des
technologies nucléaires à des fins pacifiques.
-Dépistage des résidus d’antibiotiques dans les denrées alimentaires : dont le laboratoire
de microbiologie est reconnu comme laboratoire de référence.
تحسين واعتماد عدة الكتشاف المضادات الحيوية في العسل
تلخيص
Premi®Test
وفقا لھيئة الدستور الغذائي و توجيھات المفوضية األوروبية كل المواد الغذائية لديھا حد أدنى متبقي من المضادات الحيوية ماعدا العسل حيث ان لم يتم بعد
Premi®Test من ابرز الطرق التي تضمن الكشف عن بقايا المضادات الحيوية يمكن ذكر على سبيل المثال.ضبط حد أدنى متبقي من المضادات الحيوية
. ولكنھا تبقى طريقة غير خاصة بالعسل و تتطلب فترة رخم تدوم ثالث ساعات،طريقة ذات صبغة نوعية للكشف عن المضادات الحيوية في العسل:
D.ra قادرة على اكتشاف المضادات الحيوية في العسل بفضلHONEY test تمكنا من تطوير وتحسين عدة جديدة تدعى،عن طريق ھذا العمل
.بكتيريا مقاومة لألشعة الفوق البنفسجية
. نانو متر366 درجة مئوية والعالج باألشعة الفوق البنفسجية في37 دقيقة فقط باالعتماد على فترة رخم في30 يتطلب الكشف عن المضادات الحيوية.
.سوف يكون ھذا العمل موضوع براءة اختراع وطني
HONEY test, D.ra, Premi ® Test ،عدة كشف،حد ادنى متبقي، مضادات حيوية،عسل:المفاتيح
Résumé : Selon le Codex Alimentarius ainsi que la directive de la Commission Européenne chaque aliment présente
une limite maximale résiduelle d’antibiotique (LMR), cependant pour le miel aucune limite n’est encore fixée. Parmi
les principales méthodes qui assurent la détection des résidus d’antibiotiques, on peut citer le Premi®Test : c’est une
méthode qualitative permettant la détection d’antibiotiques dans le miel, mais elle reste une méthode non spécifique
pour cette matrice et assez longue (trois heures d’incubation).
A travers ce travail, on a pu développer et optimiser un nouveau kit appelé HONEY test. Ce kit est capable de détecter
la présence des résidus d’antibiotiques dans le miel grâce à une souche bactérienne radio résistante D. ra. La durée du
traitement est seulement de 30 minutes, nécessitant une incubation à 37°C et un traitement à UV à 366 nm.
Ce travail fera l’objet d’un brevet national
Mots clés : Miel,Antibiotiques, LMR, kit de détection, D.ra, Premi ® Test, HONEY test.
Abstract: According to the Codex Alimentarius and the European Commission Directive each food has a maximum
residual antibiotic (MRLs) however, for honey is still no limit set.
Among the main methods that guarantee the detection of antibiotic residues include the Premi ® Test which is a
qualitative method for the detection of antibiotics in honey, but it remains a non-specific method for this matrix and
long enough (three hours of incubation).
Through this work, we were able to develop and optimize a new kit called HONEY test. This kit is able to detect the
presence of antibiotic residues in honey by a bacterial strain radio-resistant called D.ra. The duration of treatment is
only 30 minutes, requiring incubation at 37 ° C and treatment with UV at 366 nm.
This work will be the subject of a national patent.
Key Word: Honey, Antibiotics, LMR, kit of detection, D.ra, Premi ® Test, HONEY test.