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TD1 Corrige

L'exercice présente les résultats d'une étude cinétique enzymatique. Les données sont analysées pour déterminer les paramètres cinétiques Vmax et KM des enzymes à l'aide de représentations graphiques. Les constantes catalytiques kcat sont également calculées.

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Linda Koundzi
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Exercice N°1 Visiter eBoik.

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Une enzyme E catalyse la réaction d'hydrolyse: A + H2O <===> B + C

On suit la cinétique d'apparition du produit C, pour différentes


concentrations en substrat A. Les valeurs obtenues (en µmoles de C par
tube) sont présentées dans le tableau suivant:
[S0] (mM)
Temps (min)
10 30 100 150
0 0 0 0 0
2,5 0,9 1,9 3,2 3,6
5 1,8 3,9 6,4 7,1
7,5 2,5 5,6 9,6 10,7
12,5 3,7 7,6 15,2 17,6
17,5 4,4 9,1 18,3 --------
1. Représentez les cinétiques et déterminez la vitesse initiale de chacune
d'elle.
Dans quelle condition de concentration du substrat A s'est-on placé pour
suivre ces cinétiques ?
Pourquoi ne se préocupe-t-on pas de la concentration de l'eau ?

2. Tracez la courbe de saturation et commentez-la.


Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme à partir de cette
représentation.

3. Déterminez les paramètres cinétiques à l'aide de la représentation des


doubles inverses.
Expliquez la différence entre les valeurs déterminées à partir de ces deux
représentations.

4. Les réactions enzymatiques sont effectuées dans un tube contenant 1 ml


de la solution d'enzyme à une concentration initiale de 3 µM, le volume
réactionnel étant complété par 2 ml de substrat dans le tampon approprié.
Calculez les valeurs des paramètres cinétiques (exprimez la concentration
en molarité).

5. Une unité d'enzyme (U) est la quantité qui hydrolyse 1 µmole de substrat
par minute. Par ailleurs, l'activité spécifique d'une enzyme est le rapport de
l'activité maximale de l'enzyme à sa concentration (exprimée en mg/ml)
dans le milieu réactionnel. Enfin, la masse molaire de l'enzyme E est de
100.000 dalton.
Calculez l'activité spécifique en U.mg-1.

6. On considère que l'enzyme a été totalement purifiée. Calculez la valeur


de la constante catalytique (kcat) en s-1.

7. Si l'enzyme E est une enzyme dite "Michaelienne", à quelle constante du


schéma réactionnel classique pour une telle enzyme correspond cette
constante ? Expliquez-en les unités.
Retrouvez les unités de Km sur la base de celles des constantes de vitesse
k1, k-1 et k2.

Exercice N°2

L'étude préliminaire de l'activité de deux enzymes (E1 et E2) vis-à-vis du


même substrat donne les résultats suivants:
[S0] (mM) 1 2 3 4 5
E1 vi (µM.min -
1 0,040 0,078 0,124 0,160 0,205
)
E2 vi (µM.min-
1 0,270 0,280 0, 275 0,280 0,285
)

Tracez la courbe vi = f([S0]). Quelles conclusions pouvez-vous en tirer ?


Exercice N°3

La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse des esters de l'acide ortho-


phosphorique. Pour suivre l'activité enzymatique, on utilise un substrat
synthétique, le paranitrophénol-phosphate (M. M. = 371 g.mol-1) qui libère
du paranitrophénol (M. M. = 139 g.mol-1) qui absorbe à 410 nm avec un
coefficient d'extinction pondéral: ε1% = 1260 g-1.100 mL.cm-1.

Chaque réaction est effectuée dans un volume réactionnel de 10 ml


contenant 0,2 ml d'enzyme à une concentration initiale de 10 mg/ml. On
obtient les résultats suivants (longueur du trajet optique = 1 cm) :
[S0] (mg/tube) 0 0,26 0,39 0,65 1,50 1,95 3,80
vi (U. DO.min-1) 0 0,147 0,167 0,190 0,212 0,231 0,238
Déterminez les valeurs des paramètres cinétiques de cette enzyme vis-à-vis
de ce substrat (on exprimera la concentration en molarité).

Calculez l'activité spécifique de l'enzyme avec l'unité de concentration


précisée dans l'exercice N°1.
Exercice N°4

D'une part, on a purifié une isomérase. D'autre part, on a cloné la séquence


codant cette isomérase dans un vecteur d'expression et transformé des
bactéries. On a fait une culture de ces bactéries et induit la synthèse
protéique. Enfin, de l'extrait brut bactérien obtenu, une enzyme
recombinante a été purifiée que l'on appelle l'enzyme inconnue (Einc).

On étudie la réaction d'isomérisation d'un substrat S en un produit P, en


présence:

 1ère expérience: de l'isomérase seule


 2éme expérience: de l'isomérase ET de l'enzyme inconnue

Pour chaque expérience, on mesure la vitesse initiale de la réaction


(exprimée en nM.s-1) pour différentes concentrations [S0] du substrat. Les
résultats sont résumés dans le tableau suivant:
vi (nM.s-1)
[S0] (µM) 1ère expérience: [Isomérase] 2è expérience: [Isomérase] =
= 10 pM 10 pM + [Einc] = 10 pM
0,2 1,2 2,4
0,4 1,6 3,2
1 2,1 4,2
2 2,3 4,6
1. Pour chaque expérience, déterminez les paramètres cinétiques Vmax et
KM, à partir de la représentation graphique de votre choix.

2. Calculez la valeur de la constante catalytique de l'isomérase (kcatIso).

On a déterminé la constante catalytique de l'enzyme inconnue: kcatEinc =


15360 min-1.

3. Un seul paramètre cinétique diffère entre les 2 expériences (d'un facteur


2). Lequel et pourquoi ?

4. En conclusion, l'enzyme inconnue dont le gène a été cloné est-elle bien


l'isomérase ?
Correction des Exercices 1, 2, 3 et 4.
Question N°1

a. Tracé des cinétiques de la réaction enzymatique

b. Détermination graphique des vitesses initiales à partir des cinétiques


[S0] (mM) vi (µmoles C.tube-1.min-1)
10 0,34
20 0,56
30 0,75
100 1,28
150 1,42
c. Courbe de saturation issue des cinétiques

VMax = 1,47 µmoles C.tube-1.min-1 KM = 24 mM


d. Représentation des doubles inverses ou représentation de Lineweaver-
Burk

1/VMax = 0,54 µmoles C-1.tube.min -1/KM = - 0,022 mM-1


VMax = 1,85 µmoles C.tube-1.min-1 KM = 45,5 mM
e. Calcul de kcat

Volume réactionnel = 2 mL substrat + 1 mL enzyme à une concentration


de 3 µM => volume du tube = 3 mL = 3 10-3 L

Donc : [E0] = 3 µM x (1 mL / 3 mL) = 1 10-6 moles.L-1

VMax = 1,85 µmoles C.tube-1.min-1 = 1,85 10-6 moles C . 3 10-3 L-1 . min-
1
= 6,17 10-4 moles C.L-1.min-1 = 617 µM.min-1

VMax = kcat . [E0] => kcat = VMax / [E0] = 617 min-1 = 10,3 s-1

[l'acte catalytique a lieu 60 fois moins en 1 seconde qu'en 1 minute].


Question N°2

Dans les 2 cas, malgré les apparences, il s'agit de courbes de


saturation (hyperbole) : vi = f([S]0).

La gamme de concentrations de substrat étudiée (1 à 5 mM) n'est donc


adaptée à aucune des 2 enzymes :

 pour E1, la gamme n'est pas assez grande : on ne détermine que


les premiers points de la courbe de saturation.
 pour E2, la gamme étudiée ne correspond qu'aux vi les plus
élevées : il faut étudier des concentrations supplémentaires
inférieures à 1 mM pour avoir le début de la courbe de saturation.

Par ailleurs : KME1 > KME2. En effet, pour [S]0 = 5 mM, E2 est saturée
alors que l'on est au début de la courbe de saturation pour E1.

Vue l'allure de ces 2 courbes de saturation, il est probable que VMaxE1 >
VMaxE2.
Exercice N°3

Les valeurs des paramètres cinétiques déterminées d'après la


représentation des doubles inverses (figure ci-dessus) sont :
 1/VMax = 4,09 (unités D.O.)-1.min
 -1/KM = -5,8 mg-1.tube

Donc :

 VMax = 0,24 unités D.O. min-1


 KM = 0,17 mg.tube-1

a. Calcul de VMax

Une vitesse est la variation d'une concentration (et non d'une quantité)
par unité de temps.

La valeur du coefficient d'extinction pondéral donné pour le PNP est :


ε1% = 1260 g-1.100 mL.cm-1.
Ce qui signifie qu'une solution de PNP à 1% a une absorbance de 1260
unités D.O., pour un trajet optique de 1 cm.

Donc :

1% = 1g dans 100 mL ---> 1260 unités D.O.


=> 139 g dans 100 mL ---> 1260 x 139 unités D.O.
=> 139 g dans 1000 mL ---> (1260 x 139) / 10 unités D.O.
=> 1 mole de PNP par litre ---> 17514 unités D.O.

On obtient ainsi la valeur du coefficient d'extinction molaire : εMPNP =


17514 M-1.cm-1
On peut maintenant recalculer VMax à partir de cette valeur et de la loi de
Beer-Lambert :

VMax = 0,24 unités D.O. min-1 = 0,24/(17511 x 1) = 1,37 10-5 M.min-


1
= 13,7 µM.min-1
b. Calcul de KM

La masse molaire dont il faut tenir compte est celle du substrat, puisque
l'on calcule KM !
Par ailleurs, le volume réactionnel est de 10 mL.

Donc : KM = 0,17 mg.tube-1 = 0,17 10-3 g dans 10 mL


<==> KM = (0,17 10-3/371) moles dans 10 mL = ((0,17 10-3 x 1000) /
(371 x 10)) moles dans 1L.

KM = 45,8 µM

c. Calcul de l'activité spécifique (A.S.)

Expression de VMax :

VMax = 13,7 µM.min-1 = 13,7 µmoles.min-1.L-1 = 13,7 unités.L-1

Du fait de l'unité choisie pour la concentration, le volume est dans un


premier temps 1 litre de milieu réactionnel. Or, la réaction s'effectue
dans un volume réél de 10 mL.

Donc : VMax = 0,137 unités dans 10 mL = 0,137 U.tube-1

d. Expression de [E0]

On met 0,2 mL de solution d'enzyme à une concentration initiale de 10


mg.mL-1 dans un volume total de 10 mL.

Donc : [E0] = 0,2 (mL) x 10 (mg.mL-1) = 2 mg dans 10 mL = 2 mg.tube-1

Les unités de VMax et de [E0] sont cohérentes et les valeurs tiennent


compte du volume réactionnel réel.

L'activité spécifique est donc : A.S. = VMax/[E0] = (0,137 unités.tube-1) /


(2 mg.tube-1) = 68,5 mU.mg-1
Question N°4

Courbe de saturation

Les paramètres cinétiques sont déterminés à partir de la représentation


de Lineweaver-Burk (figure ci-dessous).
kcatIso = VmaxIso / [Iso]0 = 2,56 10-9 (M.s-1) / 10 10-12 (M) ===>
kcatIso = 256 s-1 = 15360 min-1

Donc : kcatIso = kcatEinc et KMIso = KMEinc

Par ailleurs : Vmax2ème expérience = Vmax(Iso + Einc) = 2 x Vmax1ère expérience

Donc puisque Vmax double quand la concentration en enzyme double et


que les autres paramètres ne sont pas modifiés, c'est que Einc est
l'isomérase.

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