Biologie Moléculaire
Biologie Moléculaire
Biologie Moléculaire
Liaisons d’1 base azotée avec 1 des sucres = nucléoside, qui est donc constitué d’1 base et 1
sucre liés par l° N-osidique.
Atomes de la base numérotés par
chiffres et les C du sucre sont
numérotés : 1’,2’,3’…
L° d’un nucléoside avec un
phosphate se fait par estérification de
la fct alcool primaire du sucre et 1 des
3 fct ester avec un phosphate
Dans métabolisme, les nucléosides
triphosphates riches en NRJ
interviennent. Ce sont des nucléotides
dont le phosphate est lui-même relié
à 2 autres phosphates par l°
anhydride d’acides.
Transcription doit faire la copie de la séquence d’un brin d’ADN, qualifié de « brin sens ». La
transcription se fait en synthétisant un ARN complémentaire de la séquence du brin antisens,
donc identique à celle du brin sens.
Lors de la formation du complexe d’initiation de TFIID sur la boîte TATA se fait en premier et sur les
2 brins de façon symétrique. Lors de la fixation des autres protéines du complexe (NF-1 ou NF-Y
sur la boîte CAAT) il y a un brin sur lequel la boîte TATA est en aval (côté 3’) de la boîte CAAT, c’est
le brin sens qui contient le message et un brin où la boîte CAAT est en aval (côté 3’) de la boîte
TATA, c’est le brin antisens qui servira de modèle pour la transcription.
Régulation de l’expression
Elle a lieu à 4 niveaux :
1)Lors de la transcription = point de contrôle principal : ARN polymérase est l’enzyme-clé de
l’expression d’un
gène
2)Lors de la maturation
du transcrit
3)Lors de la traduction
4)Lors de l’activation
de la protéine
mature
Les séquences de
nucléotides du
promoteur (facteurs cis-
régulateurs) sont
reconnues par une
classe de protéines
spécifiques (facteurs trans-régulateurs) dont la structure permet 1 l° avec ADN.
Facteurs trans-régulateurs ont des effets sur la vitesse de la transcription : activateurs (séquences
enhancer) ou inhibiteurs (séquences silencer). Certains éléments répondent à des facteurs dont
la présence dépend de signaux qui parviennent à la cellule, principalement les hormones
comme l’insuline ou les seconds messages comme AMP cyclique. Dans le promoteur des gènes il
y a souvent 20 ou 30 sites de fixation pour des facteurs trans-régulateurs dont bcq ont un effet
inducteur ou répresseur.
DNA binding proteins
Protéines reconnaissant et se liant à ADN sont des
enzymes, protéines de structure, des facteurs de
transcription et éléments trans-régulateurs.
Domaine hélice-coude-hélice permet lien
spécifique des hélices αλπηα avec
nucléotides dans grand sillon sur une
longueur de 10 pdb.
Doigts de zinc sont des domaines formés d’1 ion Zn++ tétracoordonné avec 2 histidines et 2
cystéines de la protéine. Chaque doigt de zinc se lie à 5 nucléotides dans le grand sillon de
ADN. Souvent plusieurs doigts de zinc à la suite dans la même protéine.
Certaines protéines ont 1 domaine riche en aa basiques (K,R) qui se lie aux phosphates des
nucléotides. Ces protéines se lient à des séquences répétées inverses sur ADN, lorsqu’elles
sont associées en dimères par l° hydrophobe de 2 domaines riches en leucine.
Protéines régulatrices ont la capacité de se lierr de façon spécifique à de courtes séquences
d’ADN.
ARN polymérase II
= enzyme de la transcription des gènes
exprimés sous forme de protéines.
Elle est inhibée spécifiquement par un
poison extrait de l’Amanite phalloïde, l’α-
amanitine.
Présente dans tous les noyaux cellulaires
Masse moléculaire = 500 000 Da pour 10
sous unités
La transcription qu’elle catalyse nécessite des ribonucléosides triphosphates comme substrats
(ATP, CTP, GTP, UTP), plusieurs cofacteurs protéiniques (transcription factors TFIIA à TFIIJ). NRJ de la
réaction est fournie par hydrolyse des l° riches en NRJ des nucléosides triphosphates (42 kJ/mol)
Transcrit primaire synthétisé par ARN poly II, s’appelle aussi hnARN.
Initiation de la transcription :
1) Association de TBP (sous-unité reconnaissant ADN du facteur TFIID) avec boîte TATA du
promoteur, suite à la fixation de TFIID sur TATA (qui est symétrique) => constitution du
complexe d’initiation de la transcription ce qui déforme la double hélice. Cet ensemble
sert de point d’ancrage pour les autres facteurs.
2) TFIIB et petite sous-unité de TFIIF se fixent et déterminent le brin transcrit et le sens de la
transcription
3) S’ajoutent la grande sous-unité de TFIIF, TFIIE et TFIIH.
4) La transcription commence quand les ribonucléotides substrats sont présents.
Le complexe d’initiation de la transcription recouvre une séquence d’environ 100 nucléotides. La
transcription commence à 22 nucléotides de TATA et se poursuit en remontant le brin antisens en
direction de son extrémité 5’.
Régulation de l’ARN polymérase
Activateurs ou inhibiteurs de transcription
interviennent dans la régulation de ARN poly II.
Ces facteurs trans-régulateurs se lient à ADN
dans la région en amont de la partie transcrite.
Ils se fixent sur les cis-régulateurs. Le couple
formé entre en contact avec ARN polymérase
par intermédiaire d’un ensemble de protéines
appelé médiateur. La l° du régulateur et du
médiateur nécessite un repliement de ADN du promoteur.
Elongation de la transcription
1) Transcription commence au point d’initiation (environ 25 nucléotides après TATA) par
hybridation et condensation des premiers ribonucléotides du transcrit primaire.
2) Double hélice est ouverte en une boucle où se place ARN poly II. Transcrit primaire reste
hybridé sur qq nucléotides avec brin antisens puis s’en détache.
3) Extrémité 5’ du transcrit primaire libérée se condense en diverses structures secondaires.
4) Substrats de ARN poly sont les 4 ribnucléosides triphosphates
5) Polymérase lit brin antisens de 3’ en 5’, et poursuit synthèse du transcrit jusqu’à la rencontre
des signaux de terminaison.
6) Quand ARN poly II reonnait sur brin antisens : 3’-TTATTT-5’ suivie souvent de 3’-ATACAAAC-
5’.
La l° riche entre 1er phosphate estérifiant C5’ du ribose et les 2 autres phosphates est hydrolysée,
libérant un pyrophosphate qui sera ensuite hydrolysé par une pyrophosphatase. Le phosphate
restant est lié par l° ester au C3’ libre du dernier nucléotide du transcrit synthétisé.
Au cours de l’élongation, ARN poly II est accompagné d’une série de facteurs d’élongation
modifiant la chromatine pour permettre avancée de enzyme, empêchant formation d’obstacles
ou bien facilitant polycondensation.
Gène
Molécule d’ADN de chaque chromosome sont très longues, jusqu’à plusieurs centaines de
millions de paires de nucléotides avec plusieurs milliers de gènes mais ils représentent seulement
10% de ADN génomique total.
Un gène contient :
→ Exons : régions traduites
→ Introns : régions non traduites, séparant les exons
Le promoteur ne contient pas d’introns. Après excision et épissage des introns, le messager ne
contient plus que les exons réunis en une seule séquence codante.
Exon
Se sont des fragments de séquence primaire d’un gène qui seront recopiés dans structure
primaire de ARNm après épissage.
Leur taille est variable
Ils codent le plus souvent pour un domaine fonctionnel de la protéine ou une partie d’un domaine
Au cours de l’évolution il peut y avoir délétion, substitution ou insertion ce qui modifie, apporte ou
retire à la protéine un domaine fonctionnel entier.
Modification du transcrit
o Coiffe : une enzyme ajouté un nucléotide à guanine sur phosphate du C5’ du 1er
nucléotide et transfert des radicaux méthyle sur les premiers nucléotides.
o Queue poly-A : une enzyme coupe le transcrit environ 10 à 20 nucléotides au-delà de la
séquence AAUAAA et synthétise sur le C3’ libre du dernier nucléotide du transcrit restant
une longue chaîne de 500 à 2000 adénylates
o Excission et épissage
Enzyme coiffante
Extrémité COOH terminale est phosphorylée
Pour ajouter coiffe, un complexe multienzymatique
exerce 3 activités :
1) Hydrolyse du phosphate du nucléotide 5’
terminal du transcrit primaire
2) Transfert sur le phosphate restant d’un
guanylate à partir d’un GTP
3) Méthylation de ce dernier sur azote n°7 (en
présence du cofacteur S-adénosylméthionine,
transformé en S-adénosylhomocystéine)
Les 2 premières activités sont catalysées par une
protéine de 68 kDa et la méthylation par une autre sous-unité de 57 kDa.
Coiffe d’un messager
ARNm sont détruits par des
ribonucléases dans le cytoplasme.
Leur hydrolyse libére des nucléotides
qui seront réemployés.
Pour protéger ARNm de ce
catabolisme, une structure
particulière dissimule extrémté 5’ de
ces ARN => coiffe du messager
Au minimum, il y a fixation d’un GMP
sur le 2ème phosphate du
nucléoside triphosphate se trouvant
à l’extrémité 5’ du transcrit. Puis ce
GMP est méthylé sur son N n°7.
Si le nucléotide initial comprend une
adénine celle-ci peut-ê méthylée sur
fct amine. Riboses des nucléotides initiaux sont parfois méthylés sur O de fct alccol en 2’.
Chez mammifères, les coiffes sont plutôt type 1 ou 2. Elles sont nécessaires au transport vers
cytoplasme et jouent un rôle important dans initiation de traduction.
Lors de la rencontre des signaux de fin de transcription, transcrit primaire libéré, alors une
endonucléase coupe la fin du transcrit ~15 nucléotides après signal AAUAAA (boîte
polyadénylation). Sur l’extrémité 3’OH, une polyA polymérase condense bcq de nucléotides à
adénine => « queue polyA » de plus de 1000 nucléotides.
Indispensable à la maturation, exportation et activité de ARNm, elle est lentement digérée par
exonucléases quand le messager sera actif. Lorsqu’il sera réduit à qq centaines de nucléotides le
messager sera détruit totalement.
Excision et épissage
Action d’enzymes et de
ribozymes catalysant la
coupure de ARN
(endoribonucléase) et
fermeture de la brèche
(ARN ligase).
C’est l’étape la plus
importante de la
maturation du transcrit
dans le noyau.
Facteurs spécifiques :
ribonucléoprotéines
contenant des petits ARN
(snRNP), ribozymes (ARN
avec pptés catalytiques),
enzymes spécifiques
(maturases)…
Mise en contact de 3
séquences de intron :
début (site donneur), fin (accepteur) et un nucléotide à adénine ~40 nucléotides avant site
receveur.
Donneur commence généralement par nucléotide à guanine dont le phosphate est détaché de
exon précédent pour ê transféré sur C2’ de l’A du branchement. Le dernier nucléotide de
accepteur une guanine est détaché de exon suivant dont le 1er nucléotide est lié par son P5’ au
C3’ du dernier nucléotide de exon précédent. Intron libéré sous forme de lasso est détruit par
nucléases.
Epissages alternatifs
L’épissage se fait parfois de manière différente pour un même gène.
Pour transcrire les ARN des ribosomes, ARN poly I synthétise un transcrit primaire de 13 000nt et
ARN poly III synthétise petit ARNr 5S de 120nt.
Maturation du transcrit primaire donne ARNr 28S, 18S et 5.8S.
28S+5.8S+5S s’associent avec 49 protéines => grande sous-particule
18S => petite sous-particule
Ribosomes du cyto sont des complexes multienzymatiques associant 82 chaînes d’aa et 4 ARN
Ces molécules s’associent entre elles pour former : sous-unité 60S et sous-unité 40S.
Traduction
= lecture d’un ARNm par des ribosomes qui synthétisent des protéines dont la strcuture primaire
est déterminée par ARNm
Elle a lieu dans le cytoplasme des cellules :
Soit pour libérer des protéines cytoplasmiques
Soit pour conduire ces protéines dans les membranes ou les organites de la cellule
Soit pour excréter ces protéines à travers les membranes vers extérieur de la cellule
Expression d’un gène
Lecture de ARNm se fait par codons de 3 lettres. La protéine est synthétisée dans le sens NH2 vers
COOH.
Codon
= ensemble de 3 nt de la séquence d’un acide nucléique portant l’information génétique
permettant l’incorporation d’un aa dans séquence primaire d’une protéine
Position du codon = cadre de lecture
Code génétique est le même pour tous les êtres vivants. Il comporte 61 codons pour 20 aa. Le
code est dit dégénéré.
Polyribosome
Plusieurs ribosomes effectuent la traduction, le tout constitue un polyribosome.
Initiation est un phénomène permanent à extr 5’ et on a un ribosome tous les 100nt. Le 1er aa
incorporé constitue extr NH2 de la protéine. A extr 3’ du codon de terminaison, les sous-particules
du ribosome se séparent et libèrent protéine. Dernier aa incorporé constitue extr COOH de la
protéine.
Une activation brutale de la terminaison dissocie tous les ribosomes. Nbrx antibiotiques interfèrent
(streptomycine, cycloheximide, puromycine)
ARN de transfert
Il constitue le lien chimique entre structure du
codon et aa.
Les aa du cytoplasme doivent être activés par
catalysation par les aminoacyl ARNt synthétases
(au moins une pour chaque aa). Ces enzymes
ont une double spécificité : reconnaissent
spécifiquement aa et ARNt non chargé
correspondant. Aminoacyl-ARNt synthétase
Signal peptide
Chaînon de qq aa à extr N-terminale
de la forme traduite de certaines protéines devant être excrétées hors de la cellule. Sa structure
est riche en aa hydrophobes (Phe, Leu, Ile, Met, Val).
Lorsqu’un messager porte un signal peptide, traduction s’arrête peu après la synthèse du signal
peptide, dès que celui-ci apparaît hors de la structure du ribosome et se lie avec la SRP qui inhibe
l’élongation. Pour poursuivre l’élongation, la SRP doit être reconnue spécifiquement par un
récepteur de la membrane du retinaculum endoplasmique. Dès que la l° est établie, le ribosome
est lié par la ribophorine.
Réplication
= synthèe d’ADN reproduisant exactement le génome d’une cellule au cours du cycle cellulaire
afin de préparer la division de cette cellule
Se fait au cours de la phase S grâce à act des ADN-polymérases α et δ d’autres ADN polymérases
participent à la réparation de ADN lésé (ADN polymérase β) ou à la réplication de ADN
mitochondrial (ADN polymérase γ)
Réplication semi-conservatrice
Car chaque brin sert de modèle pour dupliquer, donc moitié des brins parentaux dans cellules
filles
Croissance des brins d’ADN se fait toujours par extr 3’ OH term
Condensation se fait à partir d’un substrat activé : 1 des désoxynucléosides triphosphates.
L’hydrolyse des 2 derniers phosphates fournira l’NRJ nécessaire à la condensation. Le DN
monophosphate sera estérifié par 1 fct acide de son phosphate sur la fct acool libre du C3’ du
désoxyribose. Le pyrophosphate résultant sera détruit par pyrophosphatase condensation est
irréversible.
En ajoutant une molécule d’eau sur la l° ester, on a réaction hydrolyse qui va à l’inverse détacher
le dernier nt et libérer le C3’.
ADN polymérase
Enzymes du noyau agissant en phase S pour doubler le génôme.
Elles ont aussi une act
exonucléasique (3’->5’) qui
leur permet en particulier
d’hydrolyser le dernier nt du
brin synthétisé si celui-ci ne
s’apparie pas correctement
avec le nt complémentaire.
Réplication se fait avec un
taux d’erreur < 1/109pdb
Boucle de réplication
Synthèse d’ADN commence
sur des amorces d’ARN/ADN
constituées par la primase et
ADN poly α. La synthèse du
brin discontinu est complexe
car enzyme parcourt brin
dans sens 5’->3’. Primase et
ADN poly α synthétisent des amorces de 30nt an avant de la zone de réplication et ADN poly
construit à la suite de petits fragments d’ADN de 5’->3’(fragments d’Okasaki). Ribonucléases
détruisent les amorces d’ARN du fragment précédent et les fragments sont ensuite reliés entre
eux par ADN ligase. Ǝ une dizaine d’isoenzymes d’ADN poly.
ADN polymérase ∆
Réplication commence par
séparation des 2 brins par
hélicase. Chacun des 2 brins est
stabilisé par des protéines SSB.
Sur un des 2 brins de 3’ vers 5’,
ADN poly ∆ synthétise un brin
complémentaire.
L’usine à réplication présente
dans le noyau comprend aussi
des enzymes de préparation des
substrats : nt kinases,
ribonucléotide réductase…
Topoisomérase I
Réplication ou transcription de
ADN nécessite ouverture partielle
de double hélice et modifie
enroulement des 2 brins grâce à
la topoisomérase, qui hydrolyse un brin et le reconstitue par la suite. Pas de l’hélice normal =
10pdb par tour. Au cours de la réplication et transcription, pas de l’hélice diminue en avant des
poly. En revanche, la topoisomérase ajoute des tours en arrière des poly.
Primase
ADN poly delta ne peut pas commencer réplication sans amorce qui est d’abord créée par ARN
poly particulière sur ~10nt : ARN hybridé avec ADN modèle. Le 1er ribonucléotide de cette
amorce garde ses 3P. Au bout de 10 ribonucléotides, ADN poly α prend le relai et poursuit sur 20
désoxyribonucléotides.
Amorce = brin mixte ARN puis ADN sur 30nt. Le dernier désoxyribonucléotide de amorce servira
de point d’initiation à act de ADN poly ∆.
ADN ligase
Enzyme capable de reconstituer la l° phosphodiester entre carbones 5’ et 3’ de 2 nt adjacents.
Interviennent pour lier ensemble les brins d’ADN ou les fragments d’Okasaki.
Télomères
Structure spécialisée à extr des chromosomes linéaires
Longueur des télomères :-15 kb
Séquence répétée TTAGGG
Rôle des télomères :
Maintien de la linéarité des chromosomes
Inhibition de la fusion entre chromosomes
Empêche une dégradation enzymatique
Télomérase
Le télomère est répété qq centaines de fois avant le 3’OH final. La télomérase est une ADN
polymérase pouvant continuer la synthèse d’un ADN simple brin. Cette enzyme comprend un
ARN de 450 nt dont extr terminale est 5’-CUAACCCUAAC… Cette extrémité sert de modèle pour
l’enzyme en vue de la synthèse de qq unités de la répétition TTAGGG.
Le brin modèle ainsi allongé peut servir à la fixation d’une amorce nouvelle : extr 3’OH de cette
amorce sert alors de point de départ pour l’ADN poly ∆ pour synthétiser l’autre brin.