2010 Etienne Severac
2010 Etienne Severac
2010 Etienne Severac
Etienne Severac
en vue de l'obtention du
Doctorat de l’universite de toulouse
N° d’ordre :
Cette thèse a été préparée au Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés
(UMR CNRS 5504, UMR INRA 792) de l'INSA de Toulouse en convention cifre avec Syngenta
Seeds SAS, dans le cadre de l’école doctorale SEVAB.
Nom : SEVERAC Prénom : Etienne
4
Name : SEVERAC First name : Etienne
ABSTRACT:
This work focused on the development of efficient continuous processes for the production of esters
from crude or refined high oleic sunflower oil with enzymatic packed bed reactor presenting high
levels of productivity and stability.
A process of continuous transesterification in packed bed reactor using Novozyme 435 (lipase B from
Candida antarctica immobilized onto Lewatit VP OC 1600), a non-specific biocatalyst, was optimized
to transformation of high-oleic sunflower oil into butylic esters. The phenomena of partition of polar
compounds (phospholipids found in crude oils, produced glycerol etc.) between the reaction medium
and the enzymatic support were managed using tert-butanol, a polar solvent. The conditions that
enabled the best compromise between stability, productivity and production yields were obtained with
an initial oil concentration of 500 mM and a molar ratio between co-substrates of 5. Such conditions
enabled a productivity of 13.8 tons.kg-1.kg of Novozyme 435-1 to be reached. The reactor exhibited
great stability for 50 consecutive days without any loss of activity. That enabled to minimize the high
costs of the enzyme. The novelty of the process was the use of crude oils, containing high levels of
natural antioxidants (phospholipids, tocopherols etc.). We demonstrated that these minor components
of oils were preserved during the transesterification process. It conferred the synthesized esters some
remarkable properties of oxidative resistance.
The economic relevance of the process was improved thanks to the development of a new biocatalyst
onto a very hydrophobic support (Accurel MP) in order to avoid any adsorptions of polar compounds.
An economic analysis (maximisation of the net present value) enabled to rationalize the optimal
immobilisation conditions. Over the whole process, it enabled a 50% saving on the global expenses.__
In continuous transesterification conditions, no difference in the product profile was noticed between
the new biocatalyst and Novozyme 435.
Finally, an alternative to direct transesterification of oil was considered. A first stage of oil hydrolysis
is followed by a process of fatty acid recovery and a stage of enzymatic esterification into esters. In
order to realize/complete this last stage, the best reaction system was a solvent-free medium. A
continuous reactor for the esterification of oleic acid with isobutanol was optimized. It enabled a
reactor stable/a stable reactor for 54 consecutive days, respecting the conditions of white
biotechnologies. An annual productivity of 126 tons.year-1.kg of Novozyme 435-1 was reached. That
represented a productivity improvement by a factor of 9.2 in comparison with the transesterification
process.
Key words : lipases, vegetable oils, fatty acid alkyl esters, transesterification, esterification, packed bed
reactor, operational stability, productivity, oxidative stability, economic pertinence/relevance.
JURY :
Marianne GRABER, Professeur, Université de la Rochelle / Rapporteur
Eric DUBREUCQ, Professeur, Montpellier SupAgro / Rapporteur
Jean Stéphane CONDORET, Professeur INP, Toulouse/ Examinateur
Pierre MONSAN, Professeur INSA, Toulouse / President
Fabrice TURON, Syngenta Seeds SAS, Toulouse /
Alain MARTY, Professeur INSA, Toulouse / phD Director
Defense planned October, the 21st 2010 at National Institute of Applied Sciences in Toulouse
Doctorate school: SEVAB (Ecological, Veterinary and Agronomic Sciences and Bioengineering)
Laboratory: Laboratory for Biosystems and Chemical Engineering UMR5504 CNRS/INSA, UMR792 INRA/INSA.
Sponsored by Syngenta Seeds SAS.
6
Publications
Etienne Séverac, Olivier Galy, Fabrice Turon, Pierre Monsan et Alain Marty. 2011.
Etienne Séverac, Julien Cescut, Fabrice Turon, Pierre Monsan and Alain Marty.
Soumis dans Journal of the American Oil Chemists’ Society (impact factor: 1,803)
Etienne Séverac, Olivier Galy, Fabrice Turon, Catherine Azzaro Pantel, Jean-Stéphane
Condoret, Pierre Monsan et Alain Marty. 2011. Enzyme and microbial technology, 48(1), 61-
Olivier Galy, Etienne Séverac, Yohann Allouche, Pierre Monsan & Alain Marty.
En préparation
8
REMERCIEMENTS
MERCI !
A l’heure où j’écris ces remerciements, beaucoup de m3 sont passés sous les ponts et tant de
montagnes à gravir se sont dressées pour me retarder dans le dépôt de ce manuscrit. Malgré
tout, les sentiments de gratitude envers toutes les personnes qui ont participé de loin ou de
près à ces travaux sont encore bien présents dans ma tête. Les voici….
En tout premier lieu, je remercie chaleureusement Thierry Véronese et Pierre Monsan sans
lesquels ce projet de doctorat en convention CIFRE n’aurait pas vu le jour. Je remercie par la
même occasion la société SYNGENTA SEEDS SAS pour avoir financé l’ensemble de ces
travaux.
J’adresse mes chaleureux remerciements au Professeur Alain Marty pour avoir dirigé ces
travaux mais surtout pour toutes ces années de collaboration dans tous ces différents projets.
Alain, Merci pour ton soutien et ton expertise apportée à cette thèse. Merci pour toutes nos
Mes chaleureux remerciements également à Fabrice Turon, mon responsable industriel, pour
son soutien tout au long de ces travaux, même lorsque les eaux étaient agitées. Je te suis aussi
très reconnaissant pour la suite des évènements. Sacrée aventure, quoi qu’on en dise !
Je remercie Marianne Graber et Eric Dubreucq pour avoir accepté d’être rapporteurs de ce
travail, pour l’attention qu’ils y ont portée et la qualité de leurs critiques très constructives.
10
Je continue en remerciant Jean Christophe Condoret et Catherine Azzaro Pantel du
Laboratoire de Génie Chimique de l’INP/ENSIACET avec qui nous avons eu une très
Je ne saurais trop te remercier Magali (Rault) d’avoir sauvé la validité de mon jury de thèse à
la dernière minute. Tu venais assister à une soutenance et te voilà à la table de jury avec 20
minutes pour feuilleter le manuscrit ! Dans tous les cas, je suis très fier d’avoir été ton tout
premier jury.
Meric bien entendu à tous mes Lab-Mate : Flo B., Sophie D., Miguel Angl C., Valérie D.,
Oliv’, Yoann B., Vince L., Sandra P., Nelly M., Etienne W., Mélu, Steph Emond dit Google,
Manue, Emeline, Elise, Ana, Ann, Gaétan, David G., Sandrine, Péco, Régis, Fernando, Seb et
tous ceux que j’oublie, vous êtes bien trop nombreux. Merci pour tous ces bons moments
Enfin, un grand merci à toi Laurence pour ton soutien sans faille, pendant cette thèse mais
11
SOMMAIRE
Remerciements ......................................................................................................................... 9
Sommaire ................................................................................................................................ 13
14
I.3 Les esters d’acides gras. ........................................................................................... 90
I.3.1 Les Marchés cibles. ....................................................................................................................... 90
I.3.1.1 Les biodiesels. ...................................................................................................................... 91
I.3.3 Influence de la composition des esters sur les propriétés physico-chimiques des esters d’alkyle.
102
I.3.3.1 Effet sur le nombre de cétanes. .......................................................................................... 103
15
I.5.5.1 La typosélectivité ............................................................................................................... 131
I.5.6 Mise en œuvre des lipases pour la synthèse d’esters d’acides gras. ........................................... 142
I.5.6.1 Immobilisation des lipases. ................................................................................................ 142
I.6 Synthèse d’esters à partir d’huiles végétales par les lipases .................................. 157
I.6.1 Mécanisme réactionnel. .............................................................................................................. 157
I.6.2 Migration d’acyle. ....................................................................................................................... 160
I.6.3 Alcoolyse enzymatique des huiles................................................................................................ 164
I.6.3.1 Généralités......................................................................................................................... 164
I.6.5.2 Interestérification des huiles avec des carbonates d’alkyle. .............................................. 184
I.6.6 Procédés continus de production d’esters d’acides gras à partir d’huile. .................................. 186
16
II.5.2 Crude oil vs refined oil ................................................................................................................ 233
II.5.3 Effect of the butanol/TAG molar ratio in continuous packed bed reactor. ................................. 235
II.5.4 Effect of initial TAG concentration in continuous PBR. ............................................................. 237
II.5.4.1 Effect of initial TAG concentration on final product mixture. ........................................... 237
17
IV.5 Material and Methods............................................................................................. 290
IV.5.1 Materials ..................................................................................................................................... 290
IV.5.2 Glycerol and butanol adsorption on enzymatic support. ............................................................ 290
IV.5.3 Enzyme immobilisation on Accurel MP ...................................................................................... 291
IV.5.4 Assay of free lipase activity ......................................................................................................... 292
IV.5.5 Assay of immobilized lipase activity ............................................................................................ 292
IV.5.6 Analytical methods ...................................................................................................................... 293
18
V.5.1.2 Experimental comparison of solvent.................................................................................. 343
19
INDEX DES FIGURES
Figure I.1-1: Schéma du développement durable : à la confluence des trois piliers du
développement durable [3]. ............................................................................................... 42
Figure I.1-2 : Schéma de la hiérarchisation de la minimisation des déchets[4] ........................ 43
Figure I.1-3 : Calendrier d’enregistrement du Règlement REACH [15]. .................................. 51
Figure I.1-4 : Diagramme des 4 étapes d’analyse du cycle de vie[18]....................................... 54
Figure I.2-1 : Production mondiale (x106 tonnes) d’huiles végétales selon les continents entre
1990 et 2007[23]................................................................................................................. 57
Figure I.2-2 : Représentation schématique d’un triacylglycérol, portant un résidu d’acide
oléique (C18 :1∆9) en position 1, un résidu d’acide linoléique (C18 :2∆9,12) en position 2
et un résidu d’acide linoléique (C18 :3∆9,12,15) en position 3. ........................................... 58
Figure I.2-3 : Représentation schématique de la formule générale des phosphoglycérides. ... 62
Figure I.2-4 : Représentation schématique de la formule générale de la sphingomyéline. ...... 63
Figure I.2-5 : Structure des Tocophérols et Tocotriènols......................................................... 64
Figure I.2-6 : représentation du noyau cyclopentanophénanthrène, motif de base des stérols. 65
Figure I.2-7 : Représentation schématique de phytostérols courants. ...................................... 66
Figure I.2-8 : Teneur en stérols totaux (mg/100g) de quelques huiles d’intérêt industriel[32].. 67
Figure I.2-9 : Comparaison entre la teneur en stérols libres (mg/100g) (violet) et la teneur en
stérols estérifiés (vert) de quelques huiles d’intérêt industriel[32]. ................................... 68
Figure I.2-10 : Représentation schématique des structures de polyphénols présents dans les
huiles végétales. ............................................................................................................... 71
Figure I.2-11 : Diagramme des opérations élémentaires du raffinage chimique des huiles
végétales[45]....................................................................................................................... 75
Figure I.2-12 : Orbitales moléculaires des oxygènes à triplet 3O2 et à singulet 1O2 [34, 48] ....... 80
Figure I.2-13 : Energie nécessaire pour la formation d’un radical lipidique selon la position de
l’hydrogène sur la chaîne carbonée de l’acide linoléique[34]. ........................................... 82
Figure I.2-14: mécanisme chimique de la formation de l’oxygène à singulet en présence de
sensibilisateur, de lumière et d’oxygène à triplet[48]. ....................................................... 83
Figure I.2-15: formation du sensibilisateur excité à triplet (3sen*) et ses réactions avec les
substrats selon des réactions de type I ou de type II[48]. ................................................... 84
Figure I.2-16 : Stabilisation par résonance d’un radical antioxydant[34]. ................................. 86
Figure I.3-1: Evolution de la production de biocarburants dans le monde (en millions de
tonnes). [61] ........................................................................................................................ 91
Figure I.3-2: Production (A) et Capacités de production (B) européennes (violet) et mondiales
(vert) de biodiesel depuis 2002[62]. ................................................................................... 93
21
Figure I.3-3: Segmentation du marché européen des lubrifiants[64]. ........................................ 94
Figure I.3-4: Segmentation du marché européen des biolubrifiants[64]. ................................... 95
Figure I.3-5 : Répartition des marchés des solvants en 2000 en Europe selon les secteurs
d’application[67]. ............................................................................................................... 97
Figure I.3-6 : Corrélation entre nombre de cétane et nombre de carbone d’esters méthyliques.
Influence des doubles liaisons[77]. .................................................................................. 103
Figure I.3-7: Points de fusion (°C) d’esters méthyliques d’acides gras saturés linéaires[74]. . 105
Figure I.3-8: Températures de fusion (°C) d’esters méthyliques (□) cis mono-insaturés ω-9 de
longueur de chaîne carbonée croissante, comparées aux esters méthyliques saturés
équivalents (◊)[74]............................................................................................................ 106
Figure I.3-9: Températures de fusion (°C) d’esters de l’acide oléique avec des alcools
aliphatiques linéaires de 1 carbone à 12 carbones[79]. .................................................... 107
Figure I.3-10 : Températures de fusion (°C) d’esters linéaires et ramifiés d’huile de soja[79].
........................................................................................................................................ 108
Figure I.3-11 : Viscosité d’esters méthyliques (□) et éthyliques (○) purs à 40°C[81]. ............ 109
Figure I.3-12 : Effet du nombre de carbone de l’alcool d’estérification sur la viscosité
dynamique (cP) d’esters de l’acide oléique en fonction de la température (°C) [79]. ..... 110
Figure I.4-1 : Représentation schématique du cycle de la biocatalyse [86] ............................. 116
Figure I.5-1 : Réaction d’hydrolyse des Tri-Acyl-Glycérols par les lipases. ......................... 118
Figure I.5-2 : Réactions catalysées par les lipases. ................................................................ 119
Figure I.5-3: Repliement chez les α/β.hydrolases[103]. ........................................................... 121
Figure I.5-4 : Taux d’hydrolyse de la triactéine partiellement soluble dans l’eau par les
estérases et les lipases[106]. .............................................................................................. 123
Figure I.5-5 : mécanisme d’activation de la sérine catalytique chez les α/β hydrolases. ...... 125
Figure I.5-6: Mécanisme catalytique des lipases [110]. ............................................................ 127
Figure I.5-7 : Classification des α/β Hydrolases[115]. ............................................................. 130
Figure I.5-8 : Représentation schématique des sites actifs des lipases de Candida antarctica
(CALB), de Burkholderia cepacia (BCL=PCL), de Rhizomucor miehei (RML), et de
Candida rugosa (CRL)[123]. ............................................................................................ 133
Figure I.5-9 : Représentation de Fisher d’une molécule de triacylglycérol. Identification des
liaisons esters potentiellement hydrolysables par les lipases. ........................................ 134
Figure I.5-10 : Site actif de la lipase de Burkholderia cepacia[138]. ....................................... 137
Figure I.5-11 : Représentation des différents types de fossés histidine[139]. .......................... 138
22
Figure I.5-12 : Exemple de molécules chirales. ..................................................................... 140
Figure I.5-13 : Règles de Kazlaukas pour la résolution enzymatique des alcools
secondaires[151]. .............................................................................................................. 142
Figure I.5-14 : Représentation schématique des procédés classiques d’immobilisation
enzymatique. .................................................................................................................. 145
Figure I.5-15 : Schématisation des phénomènes de transfert rencontrés au cours des réactions
mettant en œuvre une lipase immobilisée sur un support poreux[179]. ........................... 151
Figure I.5-16 : Effet de la teneur en eau (aw) sur l’activité de synthèse de 2-monoglycérides
lors de l’éthanolyse de triglycérides catalysée par la lipase de Candida antarctica B
(Novozyme 435) (○), de Rhizomucor miehei (Lipozyme RM IM) (□), de Bulkorderia
cepacia (Lipase PS C-I) (●) et Thermomyces lanuginosa (Lipozyme TL IM) (■)[186]. . 155
Figure I.6-1: Schéma du mécanisme réactionnel de type Ping-Pong Bi-Bi chez les lipases. 157
Figure I.6-2 : Processus d’isomérisation (migration d’aycle) des MAG ou DAG avec
formation d’un intermédiaire cyclique à 5 atomes. ........................................................ 161
Figure I.6-3: Influence de la température lors de l’isomérisation naturelle des sn2-MAG en
sn1(3) MAG (figure A) et des sn1, 2-DAG en sn1, 3-DAG (figure B)[205, 207]
. Les
températures respectives sont indiquées sur les figures. ................................................ 162
Figure I.6-4 : Effet des solvants organiques sur les rendements de transestérification[225]. Les
solvants listés en abscisses sont classés selon leur Log(P). ........................................... 175
Figure I.6-5 : Taux de transestérification d’un mélange d’huile de soja et de colza par le
méthanol catalysé par Novozyme 435 : effet inhibiteur du méthanol à ratio molaire
méthanol/huile supérieur à 1,5[248]. ................................................................................ 176
Figure I.6-6 : Cinétique de méthanolyse d’huile végétale par Novozyme 435[248]. .............. 177
Figure I.6-7: Interestérification entre triglycérides et acétate de méthyle pour la production
d’esters méthyliques d’acides gras ................................................................................. 183
Figure I.6-8: Transestérification de triglycérides par les dialkyl carbonate. (A) diméthyl-
carbonate. (B) diéthyl-carbonate. ................................................................................... 185
Figure I.6-9 : Schéma du Réacteur Continu Agité et du Réacteur à Lit Fixe. ....................... 187
Figure I.6-10 : Procédé continu de production de biodiesel avec trois réacteurs à lit fixe en
série[277]........................................................................................................................... 189
Figure II.5-1 Kinetics of transesterification of refined high-oleic sunflower oil with butanol in
tert-butanol catalyzed by Novozyme 435 (A) at 60°C, Lipozyme RM IM (B), Lipozyme
TL IM (C) and Lipase PS Amano IM (D) at 40°C......................................................... 229
23
Figure II.5-2 : Kinetics of transesterification of refined high oleic sunflower oil with butanol
in solvent free medium catalyzed by Novozyme 435 (A) at 60°C, Lipozyme RM IM (B),
Lipozyme TL IM (C) and Lipase PS Amano IM (D) at 40°C. ..................................... 230
Figure II.5-3: butyl ester yields obtained during transesterification of refined (◊) and crude (□)
high-oleic sunflower oils for production of fatty acid butyl esters with tert-butanol
(empty signs) or without solvent (filled signs)............................................................... 234
Figure II.5-4 : DAG (∆), MAG (◊) and Ester (□) yields measured in the PBR outflow at
equilibrium with increasing butanol / oil ratio. .............................................................. 236
Figure II.5-5 MAG yield (♦ / left axis) and butyl ester yield (■ / right axis) measured in the
PBR outflow at equilibrium flow rate and at steady state versus the initial TAG
concentration. ................................................................................................................. 238
Figure II.5-6 : Flow rates (ml.h-1) obtained at equilibrium versus initial TAG concentration
(mM)............................................................................................................................... 240
Figure II.5-7 : Productivity of final mixture (♦) and productivity of purified butyl esters (□)
versus initial TAG concentrations (mM). ...................................................................... 241
Figure III.5-1: Total tocopherol concentration (mg/kg) in high-oleic sunflower oil (♦) and
butyl ester mixtures (□), at different stages of the aqueous refining process. ................ 266
Figure III.5-2: Sterols (mg.100g-1) contained in high-oleic sunflower oil (♦) and butyl ester
mixtures (□), at different stages of the aqueous refining process. ................................ 268
Figure IV.6-1: Relative initial reaction rates of esterification in presence of Novozyme 435®
pre-treated with glycerol. ............................................................................................... 294
Figure IV.6-2 : Residual glycerol concentrations (mM) after contact of different quantities (g)
of Accurel (■) & Lewatit VP OC 1600 (♦). .................................................................. 295
Figure IV.6-3 : Residual glycerol concentrations (mM) after contact with different quantities
(g) of Accurel (□), Lewatit VP OC 1600 (◊) with a butyl-oleate and butanol containing
solution of glycerol at room temperature. ...................................................................... 296
Figure IV.6-4 : Comparison of adsorption curves for the adsorption of CalB on Accurel
MP1000 with protocol A (○), protocol B (∆) and protocol C (◊) at room temperature. 299
Figure IV.6-5 : Comparison of adsorption curves for the adsorption of CalB on Accurel
MP1000 (◊) and on Accurel MP1001 (□) pre-wetted with acetone (Protocol C) at room
temperature. .................................................................................................................... 300
Figure IV.6-6 : Comparison between the yield of Candida Antarctica lipase B immobilization
on Accurel MP1001 using Protocol C (□ / right axis) and the resulting production cost of
the immobilized lipase (◊ / left axis). ............................................................................. 304
24
Figure IV.6-7 : Comparison between the costs of packed bed reactor designed for different
conditions of immobilization of CalB on Accurel MP1001 (◊) and the cost of
corresponding volumes of immobilized enzyme (∆). .................................................... 311
Figure IV.6-8 : Total reactor and enzyme cost optimisation for a butyl-oleate production of
10000 tons per year, for a process lifetime of 10 years with an enzyme renewal every 6
months (◊), 12 months (□) and 24 months (∆). ............................................................. 314
Figure V.5-1: Computed water solubility in the reaction media at 100% conversion at 60 °C
with OAi = 1 M (A) or 1.5 M (B) and three initial IB:OA ratios, Ratio = 1 (black bar), R
= 2 (gray bar) and R = 3 (light gray bar). ....................................................................... 337
Figure V.5-2: Variations in aw in the reaction medium as a function of the stage of
advancement of the reaction (with 10% of conversion increments) in solvent systems (A)
or solvent free-system (B). ............................................................................................. 340
Figure V.5-3: Comparison of K values calculated from modeled activities at hypothetical
conversions of 85% (A), 90% (B) at 60 °C. ................................................................... 342
Figure V.5-4 : Influence of the IB:OA molar ratio on continuous conversion of OA in SFS at
flow rates of 1 ml.min-1 (■), 0.5 ml.min-1(▲) and 0.1 ml.min-1(●). .............................. 345
Figure V.5-5 : Conversion measured in the reactor outflow (▲) and pure ester productivity
(□) vs. IB:OAi molar ratio.............................................................................................. 346
25
INDEX DES TABLES
Table I.2-1: Composition moyenne en acide gras (% mol) de quelques huiles végétales
d’importance industrielle.................................................................................................. 59
Table I.2-2: Classification des huiles selon leur teneur en acides gras majoritaires[26]. .......... 60
Table I.2-3: Distribution positionnelle des acides gras majeurs dans les triglycérides de
certaines huiles végétales (%mol)[28]................................................................................ 61
Table I.2-4: Teneur en tocophérols d’huiles végétales (mg/kg) [30, 31]. .................................... 65
Table I.2-5: Composition en stérols (mg/100g) d’huiles d’intérêt industriel[33]. ..................... 68
Table I.2-6: Teneur en métaux de quelques huiles d’intérêts [43]. ............................................ 73
Table I.2-7: Méthodes de raffinage physique des huiles végétales brutes[47]........................... 79
Table I.3-1 : Quelques propriétés physico-chimiques d’huiles végétales et des esters
méthyliques issus de ces mêmes huiles [55]. ..................................................................... 90
Table I.3-2: Viscosité cinématique dans les normes diesels. ................................................. 100
Table I.3-3 : Valeurs de résistance oxydative mesurée par la technique de Rancimat à 110°C,
avec 10L.min-1 d’oxygène[73]. ........................................................................................ 102
Table I.3-4 : Mesure de l’index de stabilité oxydative (OSI) (h) de 5g de composés lipidiques
purs à 70°C et 90°C [83]. ................................................................................................. 112
Table I.4-1 : Image de l’intéret industriel pour la biocatalyse et de la biotransformation au
travers de brevets d’intérêts publiés dans le domaine entre 2000 et 2004[87]. ................ 114
Table I.5-1 : Spécificité, support et producteur de lipases commerciales usuelles[135]. ........ 136
Table I.5-2 : Exemples de résolution de mélanges racémiques par les lipases. ..................... 141
Table I.5-3: Exemple de supports d’immobilisation des lipases commerciaux classiquement
rencontrés dans la littérature. ......................................................................................... 146
Table I.5-4 : Activité de l’eau de solutions de sels saturées à 25°C[191]................................. 156
Table I.6-1: Comparaison des temps de demi-vie des sn1,2-DAG et des sn2-MAG lors du
processus de migration d’acyle en fonction la température[205, 207]. ............................... 163
Table I.6-2: Production d’esters d’acides gras par catalyse enzymatique à partir de différentes
matières premières, alcools et type de réacteur. ............................................................. 166
Table II.4-1Characteristics of the immobilized lipase tested for transesterification of high-
oleic sunflower oil. ......................................................................................................... 224
Table III.4-1: Fatty acid compositions of the oils used in this study. .................................... 258
Table III.5-1: Phosphorus concentrations and calculated phospholipid concentrations in crude
RSO (rapeseed oil) and butyl-ester mixtures. ................................................................ 263
Table III.5-2: Individual tocopherol/tocotrienol concentrations (mg/kg) in crude and refined
HOSO (High-Oleic Sunflower Oil) and butyl esters produced from them. ................... 267
28
Table III.5-3: Individual sterol proportions (%) in crude and refined HOSO (high-oleic
sunflower oils) and butyl esters produced from them. ................................................... 269
Table III.5-4: Phenolic compound content in crude and refined olive oils (OO) and fatty acid
alkyl esters (FAAE), expressed as g equivalents caffeic acid per L. ............................. 270
Table III.5-5: Induction periods (h) of oils and fatty acid alkyl esters (FAAE) from different
sources, obtained with the Rancimat method. ................................................................ 272
Table IV.6-1 : Characteristics of the PBR developed for different conditions of CalB
immobilisation on Accurel MP1001 using protocol C carrying out acetone for support
pre-treatment. ................................................................................................................. 307
Table IV.6-2 : Marshall and Swift Equipment Cost Index (MSECI) (1926 Index =100) and
theChemical Engineering Plant Cost Index (CEPCI) used in the reactor cost estimation.
........................................................................................................................................ 307
Table V.5-1: Initial rates and steady-state conversion of esterification batch reaction of OA by
IB. ................................................................................................................................... 344
Table V.5-2: Conversion obtained with the production of first and second generation FAAE.
........................................................................................................................................ 349
29
INDEX DES ABBREVIATIONS
Acronymes Français.
AC Acide Caprique
AG Acide Gras
AL Acide Linoléique
AM Acide Myristique
AS Acide Stéarique
DAG DiAcylGlycérols
HFC Hydrofluorocarbure
MAG MonoAcylGlycérols
PFC Perfluorocarbure
32
Sen Sensibilisateur
TAG TriAcylGlycérols
English Acronyms
2M2B 2-méthyl-2-butanol
BP Boiling Point
CP Cloud Point
DAG DiAcylGlycerols
FA Fatty Acids
IB IsoButanol
MAG MonoAcylGlycerols
33
OA Oleic Acid
OO Olive Oils
PLs Phospholipids
PP Pour Point
TAG TriAcylGlycerols
34
INTRODUCTION GENERALE
Introduction Générale
"Mieux vaut prendre le changement par la main avant qu’il ne vous prenne par la gorge."
Winston Churchill
L’humanité fait peut-être face actuellement à l’un des plus grands challenges de son histoire :
pétrole dans la synthèse des dérivés chimiques devient l’enjeu clé de cette mutation. En effet,
l’amoindrissement des ressources pétrolières, la versatilité des cours du pétrole, les émissions
matières premières renouvelables. Cette prise de conscience collective est le premier moteur
Soucieux de l’environnement et à l’écoute des besoins du marché, Syngenta Seeds a été l’un
des premiers semenciers à investir pour ce futur. En particulier, Syngenta Seeds investit dans
les oléo-protéagineux en tant que ressource naturelle pour créer une chimie de substitution des
par les Pouvoirs Publics, le potentiel des huiles végétales dans l’oléochimie est encore sous-
transformation des huiles, répondant aux exigences du développement durable. L’objectif est
des réactions chimiques, est considérée comme une technologie propre et respectueuse de
36
Introduction Générale
transformation chimique des huiles. Cependant, la mise en œuvre des enzymes et plus
particulièrement des lipases dans des procédés industriels reste rare et limitée. Le principal
obstacle à leur développement est le prix souvent élevé des biocatalyseurs disponibles sur le
marché. Cela impose donc de développer des procédés de type continu. Des procédés
hautement productifs et stables pendant des semaines voire des mois sans remplacement du
biocatalyseur permettront de réduire l’incidence du coût des enzymes sur le produit final.
Ainsi, le challenge est de déterminer le compromis optimal entre productivité et stabilité afin
biocatalyse peut offrir une valeur ajoutée plus importante qu’avec les procédés chimiques
conventionnels.
l’ensemble des différents enjeux, objectifs et problématiques liés aux travaux de cette thèse. Il
les huiles végétales, matières premières renouvelables utilisées dans cette étude. La troisième
partie aborde les esters d’acides gras, produits essentiellement ciblés lors de la transformation
mise en œuvre des lipases dans des réactions de synthèse et des limitations liées à leur
La partie suivante regroupe les résultats obtenus au cours de cette thèse, lesquels sont
présentés sous la forme de quatre publications. Le premier article évoque la mise au point
37
Introduction Générale
l’huile brute de tournesol hautement oléique. Dans cet article, le Novozyme 435, lipase B de
article estime les bénéfices de l’utilisation d’huiles vierges en tant que substrat, au niveau de
la qualité de résistance oxydative des esters obtenus à l’aide du réacteur développé dans
dépenses liées au biocatalyseur, est abordée dans le troisième article. Enfin, le dernier article
décrit une voie alternative de production d’esters intégrant une première étape d’hydrolyse
Bonne lecture !
38
I : ETAT DE L’ART.
I – Etat de l’art
Le concept de développement durable est une notion dont l’émergence a été lente. Les
club de Rome qui a pour but de cerner les limites de la croissance économique. En 1972, le
[1]
rapport intitulé “The limits to growth’’ publié par le Club de Rome prévoit à long terme
(fin du XXIème siècle) une chute brutale des populations due à la pollution, à
Les chocs pétroliers de 1973 et 1979 font prendre conscience aux pays développés que leur
prospérité matérielle n’est basée que sur l’utilisation intensive de ressources naturelles finies.
Le terme de développement durable ne fait son apparition qu’en 1980 dans un rapport intitulé
[2]
la “Stratégie mondiale pour la conservation“ pour montrer que le développement doit
amener des améliorations de la qualité de vie des hommes, et en même temps doit conserver
travers du rapport dit Brundtland du nom de sa présidente Gro Harlem Brundtland, intitulé
40
I – Etat de l’art
« Un développement qui répond aux besoins des générations du présent sans compromettre la
capacité des générations futures à répondre aux leurs. Deux concepts sont inhérents à cette
notion : le concept de « besoins », et plus particulièrement des besoins essentiels des plus
démunis à qui il convient d’accorder la plus grande priorité, et l’idée des limitations que l’état de
ressources naturelles non renouvelables. Il insiste sur la nécessité de protéger la diversité des
gènes, des espèces et de l'ensemble des écosystèmes naturels terrestres et aquatiques, et ce,
restauration, l'aménagement et le maintien des habitats essentiels aux espèces, ainsi que par
Il rappelle le propos prêté à Antoine de Saint-Exupéry : ‘’nous n’héritons pas de la Terre de nos
ancêtres, nous l’empruntons à nos enfants’’. Ce rapport place l’homme au centre de son propre
développement car l’environnement ne peut être isolé des actions de l’homme, de ses
Certains analystes perçoivent désormais le développement industriel comme étant non viable
sur le plan environnemental. Les points cruciaux en faveur de cette affirmation sont
changement climatique supposé dû aux émissions de gaz à effet de serre ainsi qu’à la
pollution due aux activités humaines. Les catastrophes naturelles, la fonte des glaciers,
41
I – Etat de l’art
associations.
Dans le même temps, le sommet de Rio modifie le principe de développement durable décrit
Figure I.1-1) devant être conciliés dans une perspective de développement durable : le progrès
Figure I.1-1: Schéma du développement durable : à la confluence des trois piliers du développement
durable [3].
Le développement durable n’est pas sans conséquence pour la communauté car il pose les
jalons de nouveaux concepts tels que l’écologie industrielle, la production propre ou encore
la chimie verte. Une idée commune à ces concepts est la minimisation des déchets : il est
préférable d’éviter la génération de déchets plutôt que les traiter en fin de procédé. Celle-ci est
42
I – Etat de l’art
Excepté ce but commun d’apporter un changement vers une industrie durable pour
l’environnement, les trois concepts se distinguent les uns des autres par leurs approches de la
problématique.
L’écologie industrielle.
englobe soient totalement interdépendants. Les liens et les échanges entre la société et
particulière d’écosystème. Elle donne une vision globale des interactions entre la société
industrielle et la biosphère. L'écologie industrielle ne considère plus les problèmes comme des
boîtes isolées, mais intègre l'économie, les sciences de l'ingénieur, l'écologie scientifique, la
43
I – Etat de l’art
ressources et des déchets dans les écosystèmes industriels, de sorte que tout résidu
devienne une ressource pour une autre entreprise ou un autre agent économique.
ou la consommation du produit.
- Dématérialiser l'économie : minimisation des flux totaux de matière (et d'énergie) tout
transition vers une diète énergétique moins riche en carbone fossile (énergies
La production propre.
Le principe de base d’une production plus propre est la réduction des déchets et des émissions
à leur source, l’économie des matières brutes, d’eau, d’énergie et des coûts qui y sont
associés. Le terme de ‘’production plus propre’’ fut défini la première fois par un groupe
appliquées aux procédés, produits et services pour augmenter l’éco-efficience et réduire les
44
I – Etat de l’art
La chimie verte.
La chimie verte sera abordée plus longuement dans la prochaine section I.1.2.
Les organiciens, Paul Anastas et John Warner, de la ‘’US Environmental Protection Agency
EPA’’ définissent pour la première fois dans les années 90 le concept de chimie verte qu’ils
[8]
caractérisent de serment d’Hippocrate des chimistes . Son but principal est d’aider le
chimiste dans sa démarche en orientant vers des produits, des voies de synthèse ou des
verte :
(1) Il est préférable de prévenir les déchets plutôt que de les traiter après formation
(2) La voie de synthèse doit être développée dans une optique d’optimisation de
(3) Dans la mesure du possible, les voies de synthèse doivent être conçues pour utiliser et
générer des substances présentant la plus faible (voire aucune) toxicité possible pour la
(4) Les produits chimiques doivent être conçus pour préserver l’efficacité de fonction tout
en réduisant la toxicité.
(5) L’utilisation de substances alternatives (ex: solvants, agents de séparation etc.) doit être
(6) Les besoins énergétiques doivent être minimisés pour leurs impacts économiques et
45
I – Etat de l’art
(7) Les sources de matières premières doivent être renouvelables quand cela est
(9) L’utilisation des procédés catalytiques est préférable aux procédés stoechiométriques,
celà implique la recherche de nouveaux réactifs plus efficaces et minimisant les risques
(10) Les produits chimiques doivent être conçus de manière qu’à la fin de leur fonction, ils ne
(11) Les méthodes analytiques nécessitent un développement accru pour permettre une
(12) Les substances utilisées dans le procédé et leurs formes (solide, liquide, gaz) doivent
être réfléchies afin de minimiser les risques d’accidents chimiques tels que des largages
Ce faisant, Anastas et Warner définissent un certain nombre d’outils de la chimie verte : les
matières premières alternatives, les réactifs alternatifs, les solvants alternatifs, les produits
alternatifs (molécules cible), la chimie analytique de procédé. Récemment Tang et coll., 2005
[9]
ont proposé un acronyme mnémotechnique des 12 principes de la chimie verte,
‘’PRODUCTIVELY’’, signifiant :
46
I – Etat de l’art
P – Prevent wastes
R – Renewable materials
C – Catalytic reagents.
I – In-Process Monitoring
Y – Yes, it is safe
Ces 12 principes ont dès lors inspiré de nombreux auteurs, pour qui le concept énoncé par
Anastas et Warner, pouvait être élargi et amélioré. Ainsi Neil Winterton énonce les ‘’12
(5) Examiner la thermochimie basique des réactions pour identifier de possibles processus
exothermes dangereux
47
I – Etat de l’art
(10) Quantifier et minimiser l’usage d’utilités (eau, gaz, électricité etc..) et autres entrants.
(11) Identifier où la sécurité de l’opérateur peut être incompatible avec la réduction des
déchets
(12) Contrôler, rapporter et minimiser tous les déchets émis dans l’air, dans l’eau ou sous
Anastas et Zimmerman, 2003[11], ont, quant à eux, prolongé le concept aux 12 principes de
l’ingénierie verte. Ces derniers représentent une structure permettant aux scientifiques et aux
humaine et l’environnement.
Cependant, les 12 principes de la chimie verte n’ont pas échappé aux critiques. Graedel,
1999[12], déplore que les principes de la chimie verte ne tiennent pas compte de la vie totale du
produit ou procédé, ‘’de la vie à la mort ou de la vie à la réincarnation’’. Il propose dès lors
d’ajouter la perspective de cycle de vie aux principes de chimie verte pour en élargir l’horizon
vie d’un produit : (1) la préfabrication, (2) la fabrication, (3) la livraison du produit, (4)
l’utilisation du produit, (5) la fin de vie du produit, chaque étape étant caractérisée par les
chimie verte.
48
I – Etat de l’art
plus particulièrement la maîtrise des énergies, des déchets et des produits ayant un impact sur
Celles-ci sont établies aussi bien à un niveau national avec l’entrée en vigueur en France des
Kyoto sous l’égide de l’ONU, ou encore l’entrée en vigueur du règlement européen REACH.
durable. Les discussions ont été organisées autour de six groupes de travail, permettant de
proposer des mesures appropriées aux problématiques abordées. Les groupes sont composés
salariés)[13] :
l’emploi et à la compétitivité.
49
I – Etat de l’art
Le Grenelle Environnement a fait l’objet d’une proposition de loi qui fut adoptée
définitivement en Juin 2009. Cette loi reprend l’ensemble des propositions établies par les
groupes. Très récemment, une loi Grenelle II a été ratifiée par le Sénat le 8 Octobre 2009, qui
renforce encore les engagements de l’état Français pour assurer sa mutation écologique.
Juin 2007, a pour but de connaître la toxicité et les conséquences sur la santé et
de repérer plus largement leurs utilisations. Dans cette optique, le règlement impose aux
producteurs et importateurs de produits chimiques d’apporter la preuve que les risques des
substances produites ou importées (de plus de 1 tonne/an) par fabricant ou importateur sont
la fois les substances nouvelles et anciennes sont intégrées dans un même système. Les
autorités n’ont pas la charge de l’ensemble des évaluations des risques mais il a été créé pour
cela une procédure d’autorisation. Une agence européenne des produits chimiques, la
Pour les autres substances susceptibles de présenter des risques élevés, il est prévu de mettre
50
I – Etat de l’art
[15]
Figure I.1-3 : Calendrier d’enregistrement du Règlement REACH . CMRs= Cancérigènes, Mutagènes,
REACH donne une plus grande part de responsabilité aux industries qui gèrent les risques que
leurs produits chimiques pourraient avoir sur la santé, en les identifiant clairement et en les
l’environnement vis à vis des risques liés aux substances chimiques mais aussi d’accroître la
alternatives pour l’évaluation des dangers liés aux produits chimiques et d’assurer une libre
circulation des substances au sein du marché interne[16]. Dans ce contexte, REACH représente
nouveaux procédés.
51
I – Etat de l’art
développement de ‘’clean technologies’’ qui sont une chance de progresser vers l’application
Le protocole de Kyoto découle de la Convention-cadre des Nations unies sur les changements
climatiques (CCNUCC)[17] adoptée à l'issue du Sommet de la Terre, qui s'est tenu en juin
1992 à Rio de Janeiro, au Brésil. Il est l'aboutissement de la conférence qui a réuni les
La ratification du protocole par 55 pays représentant 55% des émissions mondiales de gaz à
effet de serre en 2004 permet son application à compter de Février 2005. Les pays signataires
dits «de l'annexe» (soit 37 pays développés ou en transition vers une économie de marché
comme la Russie) ont accepté globalement de réduire de 5,5% leurs émissions de gaz à effet
52
I – Etat de l’art
- le méthane (CH4) qui a pour origine principale l'élevage des ruminants, la culture du
- les halocarbures (HFC et PFC) sont les gaz réfrigérants utilisés dans les systèmes de
- le protoxyde d'azote ou oxyde nitreux (N2O) provient de l'utilisation des engrais azotés
- l'hexafluorure de soufre (SF6) utilisé par exemple dans les transformateurs électriques.
Si les engagements de réduction sont ambitieux, les états signataires sont tenus de les
- les ‘’permis d’émission’’ : vente ou achat de droit à émettre entre pays industrialisés
développés visant à réduire les émissions de gaz à effet de serre en dehors de leur
obtenues.
dans des pays en développement pour la réduction des gaz à effet de serre.
L’analyse du cycle de vie est une méthode systématique d’évaluation des impacts
environnementaux d’un produit, d’un service ou d’un procédé. Son but fondamental est de
réduire la pression d'un produit sur les ressources et l'environnement tout au long de son cycle
de vie, depuis l'extraction des matières premières jusqu'à son traitement en fin de vie (mise en
53
I – Etat de l’art
décharge, incinération, recyclage, etc.). Ce cycle est souvent qualifié de ‘’du berceau au
tombeau’’. L’enjeu majeur de l’analyse du cycle de vie est d’identifier les principales sources
En pratique, les flux de matières et d’énergies entrant et sortant à chaque étape du cycle de
vie, sont inventoriés, puis on procède à une évaluation des impacts environnementaux. La
complexité des phénomènes mis en jeu et en interaction impose une incertitude quant aux
L’analyse du cycle de vie est un outil décisionnel qui se déroule en 4 étapes (Figure I.1-4 ci-
après). L’analyse du cycle de vie a fait l’objet d’une normalisation internationale en 1997 :
Norme ISO14040.
54
I – Etat de l’art
L’Eco-Efficacité ou Eco-Efficience est un terme qui est apparu dans le rapport "Changing
Course" ordonné par la World Business Council for Sustainable Development (WBCSD) et
" L'Eco-Efficacité consiste à offrir des biens et des services à des prix compétitifs qui
répondent aux besoins des hommes et leur apportent une qualité de vie, tout en réduisant
nécessaires tout au long du cycle de vie des produits pour atteindre finalement un niveau qui soit
Le programme ‘’Responsible Care’’ est une initiative volontaire des industries chimiques
organisée autour d’un code de conduite articulé autour de 9 principes, indépendants des
normes et des dispositions réglementaires qui s'imposent aux industries signataires[20, 21]. Les
compagnies unissent ainsi leurs forces grâce à des antennes associatives nationales, (en
France, il s’agit de l’Union des Industries Chimiques UIC), pour (i) améliorer continuellement
avec les acteurs de leur chaîne à propos de leurs produits et procédés et pour (iii) produire des
‘’Responsible Care’’ aide les industries à opérer sainement, profitablement et dans le respect
des générations futures au travers d’un partage d’informations, d’un système rigoureux de
care’’ incite les entreprises chimiques à être plus transparentes vis-à-vis de leur rapport à
55
I – Etat de l’art
chimique de consolider sa réputation dans un monde où les produits chimiques sont plus
considérés comme des dangers potentiels que comme des éléments contributifs au bien être de
chacun.
I.2.1 Généralités.
Les huiles végétales représentent une alternative prometteuse aux ressources fossiles car elles
sont renouvelables et présentent après transformation des propriétés très proches de celles des
ressources fossiles. L’utilisation des huiles végétales a démarré il y a fort longtemps avec la
production de savon à partir d’huile d’olive et de soude végétale qui désignait en ce temps le
carbonate de sodium. Les premières traces sont datées de la civilisation sumérienne, 3000 ans
avant notre ère. Plus récemment, en 1900, les premiers moteurs à compression/allumage
développés par Rudolf Diesel furent testés avec de l’huile d’arachide [22]. Par la suite, du fait,
d’une grande disponibilité de produits pétroliers à très faible prix, l’utilisation des huiles
végétales a été abandonnée. Les huiles végétales ne sont redevenues attractives que très
récemment, car permettent notamment de faire face à la diminution des stocks pétroliers.
tendance à ralentir au cours des dernières années. En 2007, elle représentait un volume de
130,4 Mtonnes, soit une croissance de plus de 210% par rapport à 1990. La production est
largement dominée par les pays asiatiques, qui fournissent en 2007 plus de la moitié de la
5% de la production mondiale.
56
I – Etat de l’art
140,0
Production d'huiles végétales (x 106 tonnes)
120,0
100,0
Océanie
Asie
80,0
Afrique
Amérique
60,0 Europe
40,0
20,0
0,0
1990 1995 2000 2005 2006 2007
Année
Figure I.2-1 : Production mondiale (x106 tonnes) d’huiles végétales selon les continents entre
1990 et 2007[23].
La majorité des huiles végétales est produite avec seulement 4 cultures spécifiques (le palme,
le soja, le colza et le tournesol) qui représentent environ 79% de la production totale. Seuls
14% des huiles et graisses sont estimés être utilisés dans des procédés industriels selon Dyer
57
I – Etat de l’art
Les huiles végétales représentent une importante ressource renouvelable de la nature. Les
acides gras les composants peuvent être présents dans les huiles sous forme libre, ou estérifiés
95% à 98% des huiles végétales, les 2 à 5% restants correspondant à des composés mineurs
Figure I.2-2 : Représentation schématique d’un triacylglycérol, portant un résidu d’acide oléique
(C18 :1∆9) en position 1, un résidu d’acide linoléique (C18 :2∆9,12) en position 2 et un résidu d’acide
naturels les plus représentés contiennent de 6 à 26 carbones. Les acides gras contenant
58
I – Etat de l’art
Une grande variabilité dans la composition en acides gras est constatée intra-espèce, inter-
espèce et même selon le cultivar. Néanmoins de grandes tendances peuvent être dégagées
(Table I.2-1).
Table I.2-1: Composition moyenne en acide gras (% mol) de quelques huiles végétales d’importance
industrielle.
Ac. gras Palmitique Palmitoléique Margarique Stéarique Oléique Linoléique Linolénique Gadoléique
Huile 16:0 16:1 17:0 18:0 18:1 18:2 18:3 20:1
Arachide 8-13 < 0,3 < 0,1 3-4 48-66 14-28 < 0,3 1-2
Colza 1-5 <1 -- 1-2 55-62 18-22 8-10 1-2
Maïs 8-13 <1 -- 1-4 24-32 55-62 <2 < 0,5
Noisette 5-9 < 0,3 -- 1-4 66-83 8-25 < 0,6 --
Noix 6-8 < 0,2 < 0,1 1-3 14-21 54-65 9-15 < 0,3
Olive 8-14 <1 < 0,2 3-6 61-80 3-14 <1 < 0,4
Pépin de raisin 7-10 < 0,5 -- 3-6 14-22 65-73 < 0,5 < 0,2
Soja 8-13 < 0,2 -- 2-5 17-26 50-62 4-10 < 0,4
Tournesol 5-7 < 0,4 <0,1 4-6 15-25 62-70 < 0,2 < 0,5
Tournesol Oléique 3-4 < 0,1 -- 3-4 75-83 10-21 < 0,3 0,1-0,5
[26]
Dubois et coll., 2007 ont réalisé l’analyse de 80 huiles végétales et ont proposé une
I.2-2), chacun pouvant être sous-divisé selon la prédominance de tel ou tel acide gras:
59
I – Etat de l’art
Table I.2-2: Classification des huiles selon leur teneur en acides gras majoritaires[26]. AC : Acide Caprique ;
ALR : Acide Laurique ; AM : Acide Myristique ; AS : Acide Stéarique ; AGS : Acides Gras Saturés ; AGMI :
Acide Gras Mono-Insaturés ; AGPI : Acides Gras Poly-Insaturés ; AL : Acide Linoléique ; AAL : Acide α-
Linolénique.
Une centaine d’acides gras naturels a été identifiée jusqu’à présent. Leurs combinaisons dans
les TAG, leurs positions stéréochimiques sn-1, sn-2 ou sn-3 sur le squelette de glycérol, la
configuration optique R/S du triglycéride estérifié en sn-1 et sn-3 par des acides gras
différents (isomères optiques) entraînent une complexité énorme des TAG. A titre, d’exemple,
60
I – Etat de l’art
Lisa et Holcapek, 2008[27] réalisent l’analyse des TAG issus de 26 huiles industriellement
importantes. Ils identifient 28 acides gras différents donnant lieu à 264 TAG différents.
Comme l’illustre la Table I.2-3 pour les acides gras majeurs[28], les acides gras saturés ont
l’exception de l’huile de soja dans laquelle l’acide linolénique se positionne en positions sn-1
et sn-3). Concernant les acides gras mono-insaturés, l’acide oléique ((C18 :1) est distribué
assez régulièrement, mais les acides gras plus longs tels que l’acide érucique (C22 :1) et
l’acide eicosènoïque (C20 :1) sont clairement plus abondants sur les positions externes.
Table I.2-3: Distribution positionnelle des acides gras majeurs dans les triglycérides de certaines huiles
végétales (%mol)[28].
Huile sn 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1 22:0 22:1 24:0
1 10,1 0,2 5,6 15,3 15,6 53,2
Lin 2 1,6 0,1 0,7 16,3 21,3 59,8
3 6 0,3 4 17 13,2 59,4
1 18,2 0,1 5,4 15,9 47,8 12,9
Soja 2 1,9 0 ,1 2,7 28,4 64,1 2,6
3 12 0,1 4, 5 25 48,3 10,3
1 17,9 0,3 3,2 27,5 49,8 1,2
Mais 2 2,3 0,1 0,2 26,5 70,3 0,7
3 13,5 0,1 2,8 30,6 51,6 1
1 13,6 0,3 4,6 59,2 18,5 0,7 1,1 1,3 0,7
Arachide 2 1,6 0,1 0,3 58,5 38,6 0,3 0,2 0,5
3 11 0,3 5,1 57,3 10 4 2,7 5,7 2,8
1 10,9 0,6 1,9 17,1 70
Tournesol 2 1,7 0 4,1 36,3 57,8
3 9 0,5 8,7 31,2 51,3
1 13,1 0,9 2,6 71,8 9,8 0,6
Olive 2 1,4 0,7 82,9 14 0,8
3 16,9 0,8 4,2 73,9 5,1 1,3
1 4,1 0,3 2,2 23,1 11,1 6,4 16,4 1,4 34,9
Colza 2 0,6 0,2 37,3 36,1 20,3 2 3,6
3 4,3 0,3 3 16,6 4 2,6 17,3 1,2 51
61
I – Etat de l’art
Selon leur mode d’obtention, les huiles sont disponibles sous trois formes différentes :
- Les huiles vierges répondent à des critères précis fixés par la réglementation:
extraction par des procédés exclusivement mécaniques, sans solvant ; clarification par
physique ou chimique.
- Les huiles brutes : le terme d’huile brute est utilisé pour toute huile obtenue en sortie
- Les huiles raffinées sont obtenues après un processus de raffinage qui sera abordé plus
Les composés phosphorylés sont représentés par des grands groupes de molécules différant
- les phosphoglycérides sont composés d’un acide phosphorique (un phosphate estérifié
en position sn-3 d’une molécule de glycérol) dont les positions sn-1 et sn-2 sont
Figure I.2-3 : Représentation schématique de la formule générale des phosphoglycérides. R1 et R2 sont des
62
I – Etat de l’art
phosphatidylinositol.
sphingophospholipides sont des composés très minoritaires dans les huiles végétales.
Les tocophérols sont des éléments abondants des huiles. Ils sont constitués d'un noyau
chromanol et d'une chaîne latérale saturée à 16 atomes de carbone (Figure I.2-5). Les
tocotriènols diffèrent des tocophérols par la présence de trois doubles liaisons (indiquées en
pointillés dans la Figure I.2-5) sur cette chaîne latérale. Les tocophérols et tocotriènols sont
présents sous trois formes, α, β, δ, et γ. La différence réside dans le nombre et la position des
groupements méthyles sur le noyau chromanol. Leur configuration est tout R. Ils forment le
groupe de la Vitamine E.
63
I – Etat de l’art
R1 R2 R3
α-tocophérol
-CH3 -CH3 -CH3
α-tocotriènol
β-tocophérol
-CH3 -H -CH3
β-tocotriènol
δ-tocophérol
-H -CH3 -CH3
δ-tocotriènol
γ-tocophérol
-H -H -CH3
γ-tocotriènol
Figure I.2-5 : Structure des Tocophérols et Tocotriènols. Les doubles liaisons indiquées en pointillé ne sont
Table I.2-4.
L’α-tocophérol est le plus représenté des tocophérols dans certaines huiles, en particulier chez
le tournesol, le carthame, le germe de blé et le canola. D’autres huiles contiennent une plus
grande quantité de γ-tocophérol (palme, soja, colza, maïs, arachide, sésame). Le germe de blé
tocotriènol, les tocotriènols étant peu représentés par ailleurs. Les huiles de coco et d’olive ne
64
I – Etat de l’art
Tocophérols Tocotriènols
α β γ δ α β
Canola 210 1 42 0,4 0,4 -
Coco 5 - - 6 5 1
Maïs 112 50 602 18 - -
Coton 389 - 387 - - -
Olive 119 - 7 - - -
Palm 256 - 316 70 146 32
Arachide 130 - 214 21 - -
Carthame 342 - 71 - - -
Sésame 136 - 290 - - -
Soja 75 15 797 266 2 -
Tournesol 487 - 51 8 - -
Germe de blé 1330 710 260 271 26 181
Colza 190 - 500 15 - -
Les stérols représentent la plus grande partie insaponifiable des huiles végétales. Leur
structure repose sur le noyau dit cyclopentanophénanthrène (encore appelé noyau stérane).
C’est une structure cyclique à 19 carbones et dont les carbones C5 C8 C9 C10 C13 C14 sont
65
I – Etat de l’art
Les stérols diffèrent les uns des autres par la nature et la position de groupement porté par ce
cycle et notamment la chaîne latérale portée par le carbone 17 et par la présence éventuelle et
le nombre de doubles liaisons. Plus de 250 stérols naturels ont été isolés du monde végétal [28].
brassicastérol comme étant les plus courants. Leur structure est présentée dans la Figure I.2-7.
66
I – Etat de l’art
Les stérols se trouvent dans les huiles sous forme libre ou sous forme estérifiée avec des
acides gras. La nature des acides gras est différente selon les huiles. La teneur, la composition
- le cultivar
- le procédé de raffinage.
Verleyen et coll, 2002[32] donnent la teneur en stérols d’une liste non exhaustive d’huiles
d’intérêt industriel. La Figure I.2-8 démontre la variabilité de teneur en stérols des huiles
pouvant aller de 65 mg/100g pour l’huile de palme jusqu’à 900 mg/100g dans l’huile de maïs.
maïs
colza
tournesol
soja
arachide
olive
noix
oléine de
palme
coco
palme
Figure I.2-8 : Teneur en stérols totaux (mg/100g) de quelques huiles d’intérêt industriel[32]. THO =
67
I – Etat de l’art
Le taux d’estérification des stérols est également très variable selon les huiles (Figure I.2-9).
Les stérols estérifiés peuvent représenter jusqu’à 84% dans l’huile d’olive tandis qu’ils ne
représentent que 41% dans l’huile de colza et 60% dans l’huile de tournesol.
colza
maïs
noix
tournesol
coco
arachide
oléine de
palme
palme
soja
olive
Figure I.2-9 : Comparaison entre la teneur en stérols libres (mg/100g) (violet) et la teneur en stérols
Phillips et coll, 2001[33] ont analysé les stérols de 45 huiles différentes. La Table I.2-5 donne
un résumé des teneurs des principaux phytostérols de certaines huiles d’intérêt industriel. On
observe une large variation dans la teneur et la composition des différentes huiles végétales.
La classe de stérols prédominante est celle du β-sitostérol qui représente 73% dans le
68
I – Etat de l’art
∆5-
sitostérol campestérol stigmastérol brassicastérol Avenastérol
Canola 381 164 16 51 18
Colza 393 275 3 69 36
Maïs 509 139 59 41 11
Soja 158 55 60 1 5
Carthame 121 28 15 0 18
Arachide 115 24 12 1 13
Sesame 331 75 33 0 51
Olive 129 4 2 17 3
Coton 256 20 5 0 8
Palme 40 15 9 0 2
Onagre 862 71 4 0 121
Bourrache 108 84 9 0 76
Tournesol 245 34 32 0 25
De nombreux composés phénoliques secondaires sont présents dans les huiles. Leur diversité
et leur nombre sont très importants. Ces derniers participent aux propriétés de stabilité
oxydative hors norme des huiles de sésame et des huiles d’olive. Les composés phénoliques
sont nombreux et de natures différentes[34]. Sont présentées dans la Figure I.2-10 les structures
- les lignanes sont des composés phénoliques formés de deux unités monolignols. Il
existe de très nombreux lignanes, qui diffèrent par le type de liaison entre les deux
unités et les modifications qui interviennent après la dimérisation (Figure I.2-10). les
69
I – Etat de l’art
- les acides phénoliques, tels que l’acide caféique, l’acide vanillique, les acides para- et
La pluralité des composés phénoliques dans les huiles résulte souvent en des mélanges très
complexes.
Les composés phénoliques ont été identifiés dans de nombreuses huiles. La teneur relative de
chaque composé phénolique est très dépendante de l’espèce végétale et du cultivar. La teneur
en composés phénoliques de l’huile d’olive est de l’ordre de 250 à 300 mg/kg[35] et sont
essentiellement des phénols simples (hydroxytyrosol and tyrosol). L’huile de sésame contient
constitués d’acide caféique[37], Cependant, ils ne sont retrouvés qu’à l’état de traces dans les
huiles[38].
70
I – Etat de l’art
Figure I.2-10 : Représentation schématique des structures de polyphénols présents dans les huiles
végétales. 1à4 : Lignanes ; 5&6 : Alcools phénoliques ; 7à10 : Acides phénoliques ; 11&12 : Flavones. 1 :
71
I – Etat de l’art
Un certain nombre de composés mineurs supplémentaires sont contenus dans les huiles
terpènoïde à 6 motifs d’isoprène. Il peut atteindre des quantités non négligeables dans
mg/kg)[25]. Le squalène est également présent en quantité dans les huiles d’argan,
rencontrées dans les huiles de tournesol (de l’ordre de 6 mg/100g)[39]. Des alcanes de
coloration verte des huiles de canola, colza et olive par exemple. L’absence de
caroténoïdes est souvent faible dans les huiles végétales mais leur présence est
cruciale dans le processus de stabilité oxydative (voir section I.2.4.3). Les huiles de
- Des cires, esters d’acides gras (de 20 à 28 atomes de carbone) et d’alcool gras à chaîne
longue (de 22 à 30 atomes de carbone) et des alcools gras[25]. La teneur en cire peut
être importante dans les huiles de maïs, de son de riz, de carthame, de sésame et de
- Des traces de métaux, provenant des sols et des fertilisants ou issus de contamination
sont Fer et Cuivre[34]. La Table I.2-6 donne des valeurs de leur présence dans les
72
I – Etat de l’art
huiles végétales. Cr, Mn, Sn, Ni et Pb peuvent être rencontrés mais à des
Teneur en métaux
Sésame 16 1,2
La plupart des huiles sont utilisées sous une forme dite raffinée dans laquelle nombre de
composés ‘’non TAG’’ sont éliminés au travers d’opération de raffinage. Ces composés
procédé d’extraction : les phospholipides, les cires, les composés soufrés (huile de colza),
éventuellement des traces de solvants résiduels et de l’eau. Cependant tous les composés
mineurs ne sont pas délétères. Par exemple, les tocophérols qui protègent les huiles contre
oxydant sont à conserver. Malheureusement, des étapes du processus de raffinage ne sont pas
parfaitement sélectives et éliminent certains des composés bénéfiques au même titre que les
indésirables ciblés[44].
73
I – Etat de l’art
De nombreux procédés de raffinage des huiles ont été développés au cours du temps. Le
raffinage chimique et le raffinage physique sont les deux types majeurs de raffinage des huiles
végétales. Des procédés impliquant des enzymes ou alors des membranes ont été également
La Figure I.2-11 présente l’organigramme général du raffinage chimique des huiles végétales
brutes[45].
La première étape du raffinage implique le retrait des phospholipides grâce à une étape dite de
‘’dégommage’’. Son principe est d’éliminer les phospholipides grâce à un lavage à l’eau.
L’hydratation des phospholipides les rend insolubles dans l’huile et facilement éliminables
par précipitation. Les gommes sont rendues insolubles dans l’huile avec un taux d’hydratation
de 1% à 3%. Une règle générale est que la quantité d’eau à utiliser doit être équivalente à la
Les phospholipides sont présents sous une forme hydratable et sous une forme non-hydratable
(i.e. combinés avec des cations calcium, magnésium ….). Ces derniers sont traités avec des
solutions acides (acide phosphorique de 0,02% à 0,5% à 60°C-90°C pendant 15-30 minutes)
74
I – Etat de l’art
Figure I.2-11 : Diagramme des opérations élémentaires du raffinage chimique des huiles végétales[45].
L’étape de neutralisation consiste en un apport de soude afin de saponifier les acides gras et
neutraliser le possible excès d’acide phosphorique utilisé lors de l’étape précédente. Les
savons sont alors éliminés de façon continue par centrifugation. La quantité et la force de la
soude utilisée sont dépendantes de la quantité d’acides gras libres présents dans les huiles. Les
rendements de raffinage. L’indice d’acide des huiles est donc déterminé avant neutralisation.
La neutralisation en présence d’hexane est connue sous le nom de raffinage sur miscella. Cela
permet une réduction de viscosité et une augmentation de la différence de densité entre les
75
I – Etat de l’art
deux phases huile/ solvant et eau/savon. Cela permet d’augmenter l’efficacité de séparation et
l’huile. Le principal inconvénient est le recyclage des solvants utilisés qui en font un procédé
relativement cher. Une étape de lavage à l’eau (10 à 20%) est effectuée pour retirer la grande
majorité des savons produits lors de l’étape de neutralisation. Les savons résiduels pouvant
La saturation en eau des huiles est en moyenne de 0,8%. Cependant, les huiles végétales
doivent être séchées pour éviter des hydrolyses parasites aboutissant à la formation d’acides
gras libres lors d’utilisation des huiles à hautes températures (désodorisation par exemple).
Pour ce faire, les huiles végétales sont traitées à chaud (90°C – 115°C) et sous vide poussé
(15mm Hg absolu). L’humidité relative des huiles dégommées et neutralisées est ainsi
Une étape de décirage peut être nécessaire pour les huiles fortement chargées en cire (maïs,
un refroidissement continu des huiles à 4-6°C pour cristalliser les cires. La durée de la
cristallisation est de 4h et peut être prolongée par une période de 6h pour développer les
cristaux de cires. L’huile est alors chauffée à 16°C avant d’être filtrée pour séparer les
cristaux de l’huile.
La décoloration a pour but d’optimiser la couleur des huiles en éliminant les pigments avec
des argiles neutres, des terres activées, des silicates synthétiques, du gel de silice ou encore du
l’élimination des dernières traces de savons formés dans les étapes précédentes. Le procédé
76
I – Etat de l’art
est généralement conduit sous vide car les décolorants usuels peuvent catalyser l’oxydation
des huiles en présence d’air. Les pigments sont adsorbés à la surface des terres ou argiles lors
de la mise en contact avec les huiles puis sont éliminés par filtration.
La dernière étape du raffinage chimique est la désodorisation. Son but est d’éliminer les
derniers contaminants des huiles tels que les acides gras volatils ou les aldéhydes
responsables des odeurs des huiles. Le principe de la désodorisation est un entraînement par la
effet secondaire de réduire les traces de solvants résiduels et les traces de pesticides. Elle
permet l’élimination de la plupart des péroxydes pouvant être contenus dans les huiles mais
ne permet pas de récupérer celles dont le stade d’oxydation est trop avancé (rancissement
complet).
Les huiles vierges et brutes possèdent généralement une stabilité oxydative plus importante
que les huiles raffinées (perte d’antioxydants). Ainsi, les huiles raffinées ne sont pas exposées
- la perte par saponification des triglycérides peut être élevée, spécialement pour les
Pour ces raisons, des voies alternatives de raffinage ont été développées.
77
I – Etat de l’art
Lors du raffinage physique des huiles, les acides gras libres contenus dans les huiles brutes
sont élimininés par des méthodes physiques, sans application de solution de soude.
Néanmoins, même dans les procédés de raffinage physique, sont inclues des étapes faisant
intervenir des produits chimiques nécessaires pour assurer les purifications non réalisées
La Table I.2-7 suivante propose une vue d’ensemble des procédés de raffinage physique. Le
raffinage par entraînement à la vapeur est le seul à être actuellement employé à un niveau
industriel.
Le raffinage physique sous flux de vapeur et sous basse pression permet le retrait des acides
gras libres et des substances insaponifiables tout en réduisant les pertes de triglycérides par
Cependant le principal inconvénient de la procédure est que toutes les huiles ne sont pas
raffinables par ce procédé. L’utilisation de hautes températures et d’un vide poussé entraîne la
78
I – Etat de l’art
Procédure Principe
Entraînement par gaz inerte Retrait des acides gras libres dans un flux de
gaz inerte (azote)
Distillation moléculaire Retrait des composés les plus volatils y
compris les acides gras libres des TAG
moins volatils à très basse pression sans
application de vapeur.
Raffinage sur membrane Traitement des huiles brutes sous pression
avec des membranes sélectives perméables
aux acides gras libres mais imperméables aux
TAG
Système hermétique Traitement de l’huile à haute température et
haute pression, suivi de la centrifugation des
précipitats puis d’un raffinage à la vapeur.
Raffinage avec CO2 supercritique Retrait des acides gras libres et autres
impuretés par CO2 supercritique
stockage des huiles et dérivés. La résistance à l’oxydation peut être exprimée comme la
période de temps nécessaire pour atteindre un point critique d’oxydation, représenté soit par
79
I – Etat de l’art
un changement des propriétés organoleptiques du produit, soit par une accélération soudaine
du procédé oxydatif.
l’origine de l’oxydation des huiles pendant leur traitement et leur stockage. Deux types
d’oxygènes peuvent réagir avec les huiles ; l’un est appelé '’oxygène atmosphérique à triplet’’
3
O2 et est impliqué dans le phénomène d’auto-oxydation, une réaction radicalaire en chaîne.
L'autre est appelé ‘’oxygène à singulet’’ 1O2 et intervient dans le processus d’oxydation
photosensible. La différence entre les deux oxygènes réside dans leurs orbitales moléculaires
(Figure I.2-12). La forme la plus abondante et la plus stable est 3O2 que l’on respire
quotidiennement. L’orbitale moléculaire de 1O2 diffère de celle de 3O2, par la présence d’une
Figure I.2-12 : Orbitales moléculaires des oxygènes à triplet 3O2 et à singulet 1O2 [34, 48]
80
I – Etat de l’art
L’auto-oxydation des huiles est une réaction radicalaire en chaîne. Elle se décompose en une
(R = chaîne alkyle)
L’auto-oxydation implique que les acides gras ou acylglycérols soient sous forme radicalaire.
Lors de l’étape d’initiation, un atome d’hydrogène est enlevé de la chaîne carbonée d’acide
gras ou d’acylglycérol créant ainsi un radical lipidique R● (réaction I-1). L’énergie nécessaire
varie selon la position de l’atome d’hydrogène dans la chaîne carbonée. L’atome d’hydrogène
adjacent d’une double liaison et, plus particulièrement celui lié au carbone présent entre deux
doubles liaisons, est facilement enlevé (Figure I.2-13). Le processus est accéléré par les
81
I – Etat de l’art
Figure I.2-13 : Energie nécessaire pour la formation d’un radical lipidique selon la position de
Le radical lipidique réagit avec 3O2 et forme des radicaux peroxy-lipidiques ROO● (réaction I-
2). Cette réaction est très rapide sous pression en oxygène normale et par conséquent la
concentration en radicaux lipidiques R● est très inférieure à celle des radicaux peroxy-
lipidiques ROO●. Ces derniers peuvent à leur tour soustraire l’hydrogène d’une nouvelle
Les hydropéroxydes sont des espèces peu stables qui peuvent se dissocier facilement pour
ROO●) se rencontrent, des espèces non radicalaires polymériques sont produites et la réaction
82
I – Etat de l’art
ambiante et en l’absence de métaux. Dans le cas contraire, ils sont décomposés en radicaux
alkoxy-, pour former des aldéhydes, cétones, esters, alcools et hydrocarbones à courtes
chaînes.
L’oxydation des huiles est accélérée par la lumière en présence de ‘’sensibilisateurs’’ tels que
les chlorophylles et dérivés. Ces derniers peuvent absorber l’énergie lumineuse et passer très
rapidement dans un état excité instable à singulet. Les sensibilisateurs excités peuvent
retourner à leur état initial par émission de lumière (fluorescence), par conversion interne
état excité à triplet. Le retour de ce dernier à un état énergétique basal peut se faire de
différentes façons :
83
I – Etat de l’art
- par production d’anions superoxydes O-2● par transfert d’électrons (Figure I.2-14)
- par acceptation d’un hydrogène ou d’un électron d’un substrat pour produire des
- par transfert de triplet sur un 3O2 adjacent pour former directement du 1O2 par
Figure I.2-15: formation du sensibilisateur excité à triplet (3sen*) et ses réactions avec les substrats selon
Les anions superoxydes sont à l’origine de la production de peroxyde d’hydrogène H2O2, une
d’hydrogène avec un anion superoxyde est génératrice de l’oxygène singulet 1O2 par réaction
de Haber Weiss en présence de métaux de transition (Fer, Cuivre) (réactions I-9 et I-10).
84
I – Etat de l’art
L’1O2, grandement nucléophile, réagit directement avec les doubles liaisons à haute densité en
électrons sans formation de radical alkyle pour former des hydropéroxydes. La réaction
d‘oxydation à oxygène singulet est très rapide dans les huiles, car une faible énergie
nombre de doubles liaisons portées par les chaînes d’acides gras, mais peu dépendante de leur
type (conjugué, non conjugué, diène ou triène). Les hydropéroxydes formés par cette voie se
rupture de chaîne) sont des accepteurs de radicaux libres, capables de retarder ou d’inhiber la
oxydation[34].
Les anti-oxydants primaires (AH) réagissent avec les radicaux libres lipidiques et peroxy-
lipidiques pour les convertir en produits non radicalaires plus stables (réactions I-11 à I-13).
Grâce à une structure résonante, le radical antioxydant produit (A●) possède une énergie plus
85
I – Etat de l’art
Enfin, les radicaux antioxydants sont susceptibles de participer à la terminaison des réactions
Les principaux agents donneurs d’hydrogène sont les composés phénoliques mono- ou poly-
hydroxylés avec des substitutions variées du cycle aromatique. Dans cette catégorie, les anti-
Ils sont capables de rentrer en compétition avec les huiles et les graisses vis-à-vis des radicaux
peroxy-lipidiques. Une molécule de tocophérol est capable de protéger de 103 à 108 molécules
d’acides gras polyinsaturés à faible valeur d’indice de peroxyde. Les tocophérols peuvent
86
I – Etat de l’art
pour produire des lipides hydroperoxydés stables et des radicaux tocophéroxy T● (réaction
17), plus stables que les radicaux peroxy-lipidiques par effet de résonance.
A faible taux d’oxydation des lipides, les radicaux tocophéroxy- sont susceptibles de réagir
entre eux pour produire des tocophéryl-quinones et régénérer des tocophérols (réaction I-18).
A fort taux d’oxydation des lipides, les radicaux tocophéroxy- (T●) peuvent réagir avec ROO●
- des isomères des tocophérols. La capacité de récupération des radicaux libres est plus
importante pour le δ-tocophérol, suivi par les γ−, β− et enfin les α-tocophérols.
qu’anti-oxydants dépend de leur stabilité oxydative. Plus leur stabilité oxydative est
faible, plus leur concentration optimale pour une activité antioxydante maximale est
faible. Ainsi, l’α−tocophérol, le moins stable des isomères, présente une concentration
87
I – Etat de l’art
En plus de leur capacité à réduire les radicaux libres, les tocophérols sont capables de
diminuer les phénomènes d’oxydation en réprimant l’action du 1O2 produit sous l’action de la
lumière selon :
charge avec don d’électrons à 1O2. La résultante est la production de 3O2 moins réactif.
Les composés phénoliques autres que les tocophérols (acides phénoliques, alcools
phénoliques, Lignanes etc… voir section 0) exercent également une activité d’anti-oxydant
primaire puissant[34].
préventifs) agissent selon plusieurs mécanismes. Ils sont capables de ralentir la vitesse
d’oxydation mais selon des processus n’impliquant pas la conversion des radicaux libres en
des espèces stables. Les processus protecteurs des anti-oxydants secondaires sont
- régénérer les hydrogènes labiles des antioxydants primaires et allonger leur durée de
88
I – Etat de l’art
- les phospholipides. De nombreux mécanismes antioxydants ont été démontrés pour les
forment une barrière contre l’O2 à l’interface Eau/Huile et jouent un rôle de protecteur
dispersion des autres antioxydants actifs et limitent la propagation des radicaux libres.
Judde et coll., 2003[51], ont démontré une action synergique importante des
prononcée avec les α-tocophérols. Ils ont attribué ces propriétés à la capacité des
huiles. Plusieurs processus sont décrits : filtration de l’énergie lumineuse surtout entre
400 et 500 nm, répression de l’1O2 par transfert d’énergie aux caroténoïdes sans
radicaux libres[34].
- Les stérols. L’action des stérols en tant qu’antioxydants est encore floue. Un certain
oxydative des acides gras insaturés à haute température[52, 53]. Au contraire, certains
stérols tels que le sitostérol, stigmastérol et le campestérol sont soit inactifs soit pro-
89
I – Etat de l’art
groupement éthylidène dans leur chaîne latérale. Les radicaux lipidiques sont
aux carburants pétroliers. L’utilisation directe des huiles dans les moteurs a été testée dès les
premiers essais de moteurs diesel. Malheureusement, elle s’accompagne d’un certain nombre
d’inconvénients. En effet, la structure même des triglycérides leur confère des viscosités
La transestérification des triglycérides avec des alcools pour former des esters permet
d’ajuster les propriétés des produits de transformation vers les caractéristiques des pétro-
diesels[55].
Table I.3-1 : Quelques propriétés physico-chimiques d’huiles végétales et des esters méthyliques issus de
ces mêmes huiles [55]. EM : Esters méthyliques issus de l’huile végétale considérée.
90
I – Etat de l’art
Les esters d’acides gras ont par ailleurs de nombreuses propriétés intéressantes qui permettent
de les utiliser dans plusieurs autres domaines d’application tels que celui des biolubrifiants[56-
58]
ou encore celui des biosolvants[59, 60].
Les biocarburants, liquides ou gazeux, sont considérés aujourd’hui comme une réelle
alternative aux carburants pétroliers. Deux types de biocarburants sont actuellement produits
et utilisés : l’éthanol dans les moteurs de type essence et les biodiesels (esters méthyliques
d’huiles végétales) dans les moteurs de type diesel. A l’échelle mondiale, c’est l’usage de
l’éthanol qui est largement majoritaire, la consommation de biodiesel étant environ 10 fois
90
80 Ethanol
Biodiesel
70
60
Biocarburant (MT)
50
40
30
20
10
0
1975
1977
1979
1981
1983
1985
1987
1989
1991
1993
1995
1997
1999
2001
2003
2005
2007
2009
2011
2013
2015
Figure I.3-1: Evolution de la production de biocarburants dans le monde (en millions de tonnes). [61]
91
I – Etat de l’art
Le marché mondial du biodiesel est dominé par l’Europe dans laquelle existe une domination
production européenne atteignait en 2008, 7,7 millions de tonnes (Figure I.3-2: Production
depuis 2002[62].
-A) assurant ainsi 70% de la production mondiale. Plus précisément, 2,8 millions de tonnes
ont été produites en Allemagne et 1,8 million en France[62]. Cependant, les capacités de
production sont encore peu exploitées puisqu’elles sont estimées à plus de 32,6 millions de
tonnes à un niveau mondial et à 20,9 millions de tonnes au niveau européen (Figure I.3-2:
-B). Le marché est néanmoins en constante progression puisqu’il a augmenté de près de 35%
35,0
30,0 A
Production de Biodiesel (MT)
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
92
I – Etat de l’art
35
20
(MT)
15
10
0
2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Figure I.3-2: Production (A) et Capacités de production (B) européennes (violet) et mondiales (vert) de
90% d’huiles ou dérivés, enrichi ou non d’additifs pour en modifier les propriétés. Les
lubrifiants assurent des fonctions variées telles que diminuer les frictions et l’usure, assurer
des transferts de chaleur, assurer une protection vis-à-vis de la corrosion, assurer les transferts
de forces etc …[63]. On parle de biolubrifiant lorsque tout ou partie du produit est d’origine
végétale. En Europe, le terme biolubrifiant désigne parfois l’ensemble des lubrifiants issus du
Le marché européen des lubrifiants représentait en 2005, 4,6 millions de tonnes. Le marché se
segmente en plusieurs domaines d’application (Figure I.3-3). Les huiles moteur représentent
la plus grande part de marché avec un volume de 1,8 million de tonnes (39% de parts de
marché). Les huiles de transmission (fluides hydrauliques) constituent le second marché avec
93
I – Etat de l’art
25% des parts de marché (1,2 millions de tonnes). Le reste du marché est partagé entre les
huiles utilisées en ferronnerie (0,7 million de tonnes) selon une étude Alcimed pour Syngenta
La part des produits biodégradables dans le marché européen des lubrifiants est de seulement
2% avec un volume de 100.000 tonnes. L'Allemagne fait figure de market leader avec une
plus spécifiquement à des applications telles que les fluides hydrauliques (51% du marché des
biolubrifiants), les huiles de chaînes de scies (29% du marché) ou les agents de décoffrage
94
I – Etat de l’art
lubrifiants d’origine végétale, moins de 1.000 tonnes (soit environ 0,1% du marché européen).
Un prix des biolubrifiants en Europe, de 2 à 5 fois plus élevé que celui des lubrifiants
Il est reconnu que 50% des lubrifiants vendus dans le monde terminent leur vie dans
l’environnement. Les causes les plus souvent identifiées sont des applications à perte
(application dans des engrenages en extérieur..), une volatilité importante des substances ou
encore des accidents (renversement etc.. )[65]. En 2006, plus de 95% de ces matières étaient de
lubrifiants minéraux représentent une réelle menace pour l’environnement. Il apparait donc
urgent de remplacer les produits non dégradables par des bioproduits. Ainsi, les biolubrifiants
95
I – Etat de l’art
Les prévisions estiment un taux de croissance du marché de l’ordre de 5 à 10% par an[65].
biomatériaux" publié en janvier 2007, les experts ont estimé que le marché français des
biolubrifiants pourrait s'établir autour de 20.000 tonnes en 2015 et, que sous l'action d'une
Les solvants sont considérés comme des substances capables de dissoudre, de diluer ou
d’extraire d’autres substances sans engendrer de modification chimique. Les biosolvants sont
solvants trouvent leurs applications en tant que diluants ou adjuvants dans le domaine des
revêtements (peintures, vernis, encres), des produits phytosanitaires (pesticides), des adhésifs
marché est présentée dans la Figure I.3-5. Le secteur des peintures et révêtements représente
le marché le plus volumineux avec 41% des parts. Suivent les secteurs de solvants de synthèse
En Europe, la consommation de solvants neufs est en baisse régulière : elle enregistre une
diminution estimée d'environ 15 % entre 1994 et 2007[66]. Cette tendance s'explique d'une part
par un recours important au recyclage des solvants et d'autre part, par une utilisation plus
96
I – Etat de l’art
Figure I.3-5 : Répartition des marchés des solvants en 2000 en Europe selon les secteurs d’application[67].
Le marché des solvants reste encore dominé par les solvants d’origine pétrochimique. Le taux
de pénétration des bioproduits en France est faible, de l’ordre de 1,3%. Ces biosolvants
Les prévisions de marché sont néanmoins positives pour les biosolvants, car le marché profite
Les esters d’acides gras utilisés en tant que biodiesel, biolubrifiant ou biosolvant sont
physicochimiques.
97
I – Etat de l’art
Le nombre de cétanes (NC) est l’indicateur premier de la qualité de combustion des biodiesels
combustion[55, 68]
. Un nombre de cétanes trop faible est responsable du ‘’coup de diesel’’
(accumulation de biodiesel dans la chambre de combustion d’un moteur provoquant une forte
L’échelle de cétane se base sur un hydrocarbone à longue chaîne auquel est attribué un NC de
100 (l’hexadécane) et sur un composé hautement ramifié en tant que référence basse avec un
Le point d’éclair des esters d’acides gras représente la température la plus basse à laquelle ils
esters, quelles que soient leurs utilisations. Le point d’éclair proprement dit est corrélé à la
volatilité des liquides. Comme le montre la Table I.3-1, les points d’éclair des esters d’alkyle
issus d’huiles végétales peuvent être bien supérieurs à ceux des produits issus de la
pétrochimie (trois fois plus élevés que le gazole par exemple) ce qui reflète une volatilité très
faible de ces esters. Cela permet d’ailleurs de souligner un avantage certain des esters
Le point d’éclair ne doit pas être confondu avec le point d’auto-ignition, qui reflète la
température à laquelle des esters d’acides gras s’enflamment spontanément sans présence de
98
I – Etat de l’art
Les propriétés d’écoulement à basse température sont des éléments essentiels des esters
d’acides gras en vue de leur utilisation en tant que biodiesel, biolubrifiant ou biosolvant. Elles
- Le point de trouble : température la plus basse à partir de laquelle les cires cristallisent
capable de s’écouler et d’être pompé. Ce sont les paraffines et cires qui sont
- Le point de fusion : température à laquelle les esters d’acides gras passent de l’état
solide à l’état liquide. Ce point de fusion est dépendant de la nature des acides gras et
De façon générale, les esters d’acides gras issus des huiles végétales, possèdent des points de
trouble et d’écoulement plus élevés que les produits issus de l’industrie pétrolière (Table I.3-1
page 90).
La viscosité représente également l’un des paramètres les plus importants des esters d’acides
gras. Elle est en effet l’une des causes majeures de la nécessité de transformer les triglycérides
des huiles en esters. La viscosité des esters est en effet d’un ordre de grandeur plus faible que
De plus, la viscosité influence de nombreux paramètres dans leurs applications. Par exemple,
lors de leur utilisation en tant que biodiesel, la viscosité va influencer la formation du spray de
99
I – Etat de l’art
Mais la viscosité est plus communément associée à la résistance à l’écoulement d’un ester ou
mélange d’esters. Si un ester est considéré comme une série de plans superposés les uns sur
les autres, la viscosité de l’huile mesure la résistance à l’écoulement entre les plans
inversement pour une faible viscosité. Cette mesure est appelée viscosité dynamique. Dans
viscosité dynamique par la masse volumique du fluide, est également très utilisée. Les
gammes de viscosité acceptables pour les biodiesels sont normalisées (Table I.3-2).
L’index de viscosité (IV) est également une grandeur souvent employée, essentiellement dans
l’industrie des lubrifiants. Cette valeur permet de rendre compte de l’effet de la température
sur la viscosité d’un lubrifiant. Une haute valeur de IV indique de faibles variations de
Les produits issus de la transformation des huiles végétales sont hautement exposés aux
processus oxydatifs notamment lors du stockage des produits et lors de leur utilisation (voir
100
I – Etat de l’art
section I.2.4). L’oxydation des esters est susceptible d’affecter la qualité des produits par
spécification de stabilité oxydative a été incluse dans les normes européennes concernant les
résistance à l’oxydation à 110°C sous 10 L.min-1 d’O2 par la méthode Rancimat. Un temps
d’induction minimum de 6h est requis pour les biodiesels (EN14213[70]) et de 4h pour les
biodiesels de chauffage (EN14214 [71]). La méthode OSI (Oxydative Stability Index)[72] est la
méthode recommandée par l’AOCS pour la mesure de la stabilité oxydative. Les deux
De nombreux autres paramètres sont également mesurés pour identifier les phénomènes
Bien souvent, les temps d’induction des esters issus d’huiles végétales ne sont pas suffisants
pour répondre aux normes. Dans ce cas, l’utilisation d’anti-oxydants est nécessaire. Ils
peuvent être d’origine naturelle (Tocophérols, cf. section I.2.4.3) ou d’origine synthétique
antioxydants sur les temps d’induction au rancimat est illustrée dans la Table I.3-3 suivante.
Par exemple, il est nécessaire d’ajouter des antioxydants naturels (tocophérols) ou artificiels
(BHT, TBHQ) aux esters méthyliques issus de l’huile de palme afin qu’ils soient conforme à
la norme de stabilité oxydative EN14213. Les esters méthyliques d’huile de colza distillée
présentent une stabilité oxydative inférieure à ceux issus d’huile non distillée. Les capacités
d’antioxydant (PY)
101
I – Etat de l’art
Table I.3-3 : Valeurs de résistance oxydative mesurée par la technique de Rancimat à 110°C, avec
I.3.3 Influence de la composition des esters sur les propriétés physico-chimiques des
esters d’alkyle.
De nombreux facteurs structurels peuvent influencer les propriétés des esters d’acides gras[74].
- Les ramifications
- La stéréochimie
L’alcool le plus utilisé pour la production d’esters à partir d’huiles végétales est le méthanol
du fait de son coût relativement bas. Cependant, à la fois la chaîne d’acide gras et la fonction
alcool des esters contribuent à leurs propriétés globales. Il est donc intéressant de considérer
102
I – Etat de l’art
Le nombre de cétanes dépend grandement des propriétés physico-chimiques des acides gras
entrant dans la composition du mélange d’esters. De fait, les esters issus d’huiles différentes
présentent des NC différents : les esters d’huile de soja et de tournesol présentent souvent des
NC plus faibles que les esters d’huiles saturées. Plusieurs auteurs proposent des corrélations
entre NC et les propriétés mesurables des acides gras. Par exemple, Klopfenstein, 1985[75],
établit une relation entre estimation du NC et nombre de carbone de l’acide gras de l’ester
méthylique. Freedman and Bagby, 1990[76], observent que le nombre de cétanes peut être relié
Lapuerta et coll, 2009[77], recensent l’ensemble des NC donnés dans la littérature pour les
esters purs de taille croissante. Les données sont illustrées dans la Figure I.3-6 suivante.
Figure I.3-6 : Corrélation entre nombre de cétane et nombre de carbone d’esters méthyliques. Influence
103
I – Etat de l’art
L’introduction de doubles liaisons dans la chaîne carbonée des esters diminue la valeur de
NC. En d’autres termes, plus la séquence d’éléments –CH2 dans la chaîne carbonée de l’ester
constitutifs dans l’ordre méthyle < éthyle < propyle < butyle (mais des exceptions existent
Récemment, Knothe et Dunn, 2009[74], recensent les points de fusion (PF), mesurés par
Ils confirment ainsi les observations de la littérature antérieure[78] : les PF des esters d’acides
gras linéaires saturés sont directement reliés au nombre de carbones composant leur chaîne.
Par exemple, la température de fusion augmente d’environ –44°C à environ -13°C (soit
(de C8 à C10) (Figure I.3-7). On note un effet de créneau dans l’augmentation des
températures de fusion, l’augmentation de température des esters d’acides gras impairs étant
104
I – Etat de l’art
80
Figure I.3-7: Points de fusion (°C) d’esters méthyliques d’acides gras saturés linéaires[74].
L’introduction d’une double liaison cis dans la chaîne carbonée s’accompagne d’une
I.3-8). Ce phénomène s’accentue avec la présence de plusieurs doubles liaisons dans la chaîne
carbonée. En effet, les PF des esters éthyliques d’acide stéarique (C18:0), de l’acide oléique
(C18 :1∆9), de l’acide linoléique (C18 :2∆9,12) et linolénique (C18 :3∆9,12,15) sont
105
I – Etat de l’art
80
40
20
-20
-40
-60
12 14 16 18 20 22 24
Nombre de Carbone de la chaine d'acide gras
Figure I.3-8: Températures de fusion (°C) d’esters méthyliques (□) cis mono-insaturés ω-9 de longueur de
chaîne carbonée croissante, comparées aux esters méthyliques saturés équivalents (◊)[74].
La configuration cis des doubles liaisons est importante dans cette réduction des points de
fusion des esters. En effet, cette configuration entraîne une cassure dans la chaîne carbonée
qui diminue les interactions entre chaînes. Au contraire, une configuration trans conserve une
moindre.
températures de fusion lorsque la chaîne carbonée des esters considérés est ramifiée. Par
Yao et coll., 2008[79] ont mesuré les points de fusion d’esters d’acide oléique avec des alcools
aliphatiques de 1 à 12 carbones. Les PF ainsi obtenus sont donnés dans la Figure I.3-9 et
106
I – Etat de l’art
montrent une diminution pour des alcools de 1C à 4C. Au delà, les PF augmentent de nouveau
10
-10
-20
-30
-40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figure I.3-9: Températures de fusion (°C) d’esters de l’acide oléique avec des alcools aliphatiques linéaires
de 1 carbone à 12 carbones[79].
Lee et coll., 1995[80], démontrent que l’introduction de ramification dans les résidus
d’huiles de différentes sources. Yao et coll, 2008[79], démontrent le même phénomène avec
l’ester isopropylique et 2-butylique de l’acide oléique. Les esters ont présenté une température
de cristallisation réduite respectivement de 5°C et de 4,5°C par rapport aux esters non
107
I – Etat de l’art
Figure I.3-10 : Températures de fusion (°C) d’esters linéaires et ramifiés d’huile de soja[79]. C3 linéaire :
esters de propyle ; C4 linéaire : esters de butyle ; C3 ramifié : esters de 2-propyle ; C4 ramifié : esters de 2-
butyle.
Allen et coll, 1999[81], ont testé la viscosité à 40°C d’esters méthyliques et éthyliques purs.
Leurs résultats sont fournis dans la Figure I.3-11. Ces travaux montrent nettement la
corrélation entre viscosité et longueur de la chaîne carbonée des esters. En effet, à 40°C, la
viscosité des esters méthyliques passe de environ 1 mPa.s pour un C8 saturé à environ 5
mPa.s pour un C18 saturé. Par ailleurs, l’introduction de doubles liaisons dans la chaîne
d’insaturation. Ainsi, Allen et coll, 1999[81], observent une réduction de viscosité de 21%
entre le C18 :0 et le C18 :1, de 18% entre le C18 :1 et le C18 :2 et de 13% entre C18 :2 et
108
I – Etat de l’art
Figure I.3-11 : Viscosité d’esters méthyliques (□) et éthyliques (○) purs à 40°C[81].
double liaison dans la chaîne carbonée sur l’effet de diminution de la viscosité cinématique :
les doubles liaisons situées en bout de chaîne carbonée entraînent une diminution de viscosité
plus discrète. De même, les viscosités obtenues avec les doubles liaisons de configuration
trans sont plus importantes que pour leurs homologues cis. Par ailleurs, Knothe et Steidley,
2005[82], constatent une viscosité bien plus élevée lorsque des fonctions hydroxyles sont
Yao et coll, 2008[79], se sont intéressés à l’effet de la partie alcool des esters d’acides gras en
mesurant la viscosité dynamique d’esters d’acide oléique. De la même manière qu’avec les
acides gras, la viscosité des esters augmente avec le nombre de carbones des alcools
constitutifs (Figure I.3-12). Cet effet apparaît d’autant plus marqué lorsque la température des
Par ailleurs, l’introduction de ramifications dans la partie alcool des esters ne s’accompagne
109
I – Etat de l’art
40
35 0°C
Viscosité dynamique (cP)
30
25
20
15 20°C
10
40°C
5 70°C
0
0 2 4 6 8 10 12
Nombre de Carbones de l'alcool d'estérification
Figure I.3-12 : Effet du nombre de carbone de l’alcool d’estérification sur la viscosité dynamique (cP)
Les esters d’acides gras sont utilisés en mélange (synthèse à partir d’huile végétale contenant
différents acides gras). Ainsi, la viscosité du mélange ne sera pas celle des esters purs mais
une résultante de leur mélange. Allen et coll, 1999[81] utilisent la relation de Grunberg-Nissan
(équation 20) pour établir des prédictions de viscosité des esters d’huiles végétales à partir de
leur composition.
n
Lnµ m = ∑ xi ln µ i +∑i ≠ j ∑ xi x j Gij
n
(Eq. I-20)
i
où µm est la viscosité d’un mélange d’ester (Pa.s), µi la viscosité du ième ester d’acide gras
(Pa.s), xi et xj, les fractions molaires des ième et jème esters, Gij un paramètre d’interaction entre
composés et n le nombre d’esters. Dans le cas d’esters d’acide gras, l’ensemble des
composants des mélanges sont très proches structurellement, ainsi le terme Gij peut être
110
I – Etat de l’art
L’oxydation des esters d’acides gras est très dépendante de la nature des acides gras qui
composent les mélanges. En effet, un facteur important de la stabilité des esters d’acides gras
Knothe et Dunn, 2003[83] et Moser, 2009[84] mesurent la stabilité oxydative de composés purs.
Les résultats de Knothe et Dunn, 2003[83] sont présentés dans la Table I.3-4. Ils remarquent
que :
nombre de doubles liaisons dans une série de composés (les C18 par exemple) est
élevé, plus leur stabilité oxydative est faible. Ainsi, le temps de résistance à
l’oxydation est nettement plus important pour l’oléate de méthyle (55,63h à 70°C) que
- La position des doubles liaisons dans la chaîne carbonée a également une importance.
formation de radical.
- La configuration trans des doubles liaisons potentiellement présentes dans les résidus
d’acides gras permet une stabilisation oxydative par rapport à la configuration cis.
- L’estérification des acides gras par un alcool (ou un glycérol) permet une stabilisation
de l’ester.
stabilité oxydative. Par exemple, la résistance oxydative de l’oléate de butyle est 2,4
111
I – Etat de l’art
Table I.3-4 : Mesure de l’index de stabilité oxydative (OSI) (h) de 5g de composés lipidiques purs à 70°C et
90°C [83].
OSI (h)
Composé
70°C 90°C
Palmitoléate de methyle C16:1 >90 22,06
Pétrosélinate de méthyle C18:1 ∆6 >90 14,86
Acide oléique C18:1 ∆9 38,82 6,63
Oléate de méthyle C18:1 ∆9 55,63 10,7
Oléate d'éthyle C18:1 ∆9 - 10,86
Oléate de propyle C18:1 ∆9 - 11,78
Oléate de butyle C18:1 ∆9 - 26,1
Trioléine >90 17,4
Vaccénate de méthyle C18:1 ∆11 >90 15,86
Acide linoléique C18:2 ∆9,12 1,82 0,75
Linoélate de méthyle C18:2 ∆9,12 4,56 1,2
Linolénate de méthyle C18:3 ∆9,12,15 5,48 -
11-Eicosanoate de méthyle C20:1 57,22 12,95
Erucate de méthyle C22:1 59,46 13,86
Globalement, la stabilité oxydative des mélanges d’esters est dépendante de leur composition
et donc de la matière première à partir de laquelle a été synthétisé le mélange. Ainsi, les huiles
et esters présentant un taux d’insaturation faible seront plus stables que ceux présentant un
taux plus élevé. Il est ainsi reconnu que les esters méthyliques d’huile de palme sont plus
stables vis à vis des phénomènes d’oxydation que les esters méthyliques d’huiles de soja[84, 85].
De plus, il est possible d’ajuster la stabilité oxydative par le mélange d’esters issus d’huiles de
différentes natures.
‘’Biotechnologie blanche’’ est le terme qui a été donné pour qualifier les productions
112
I – Etat de l’art
des enzymes. Micro-organismes et enzymes sont utilisés de nos jours dans de nombreux
procédés pour la manufacture de produits aussi différents que des produits destinés au marché
destinés à l’alimentation et les bioplastiques. D’une manière générale, les enzymes isolées
sont utilisées dans des réactions d’hydrolyse ou d’isomérisation, et les cellules entières dans
Même si cette régénération est possible in vitro, il est souvent préférable d’utiliser les voies
A titre d’exemple, peuvent être citées la production de sirop à haute teneur en fructose par
la chimie lourde. Un aperçu de la place grandissante des enzymes dans l’industrie est la
multiplication des brevets impliquant une enzyme dans une réaction d’intérêt. Panke et coll.,
2004[87] recensent dans ce sens plus de 250 brevets postérieurs à l’année 2000 pour les
Les hommes ont utilisé les enzymes sans même en avoir conscience depuis la nuit des temps
vinaigres, fromages, charcuterie) ou encore dans le traitement des cuirs et des lins. Les
procédés étaient alors essentiellement assurés par des micro-organismes ou des extraits
cellulaires bruts. Ce n’est que vers 1930 que la nature protéique des enzymes a été établie, et
113
I – Etat de l’art
dès lors, il a été possible de les purifier, les caractériser, les cloner et déterminer leur structure
tridimensionnelle.
Nombre de
Classe de composés Sous-division/Technologies identifiées
brevets
Alcools Réduction de cétones 35
Résolution cinétique 13
Condensation d'aldols 5
Oxygénases 3
Autres 1
Acides Aminés/Peptides Hydrolyse de Carbamoyle/Hydantoine 17
Hydrolyse d'amides 7
Transamination 3
Acides β−aminés 5
Synthèse de peptides par couplage cinétique 8
Autres 1
Acides Résolution d'esters 14
Hydrolyse de nitrile.cyanohydrine 5
Oxidation par oxygénases 4
Acides par réactions catalysées par des lyases 3
Résolution d'amides 2
Autres 1
Sucres Glycolsyltransférases/Oligosaccharides/Glycoconjugués 10
Remodelage de glycoprotéines 9
Monosaccharides activés 3
Monosaccharides 1
Autres 4
Produits naturels complexes Antibiotiques 9
Stéroïdes 5
Autres modifications de sturctures complexes 2
Autres Epoxydes/Péroxydes/Diols 9
Amines 9
Aldéhydes 6
Cyanohydrines 6
Autres 5
Les enzymes se sont dès lors révélées être un formidable outil pour l’industrie en devenant
des catalyseurs souvent supérieurs aux catalyseurs classiques, capables d’accepter un spectre
très étendu de substrats différents, de démontrer des spécificités accrues et même des
114
I – Etat de l’art
actives le plus souvent dans des solvants aqueux sous des conditions réactionnelles douces de
permettent également une réduction substantielle des produits de réactions secondaires par
développement durable qui ont été évoqués dans une section précédente (section I.1). Pour
une économie d’énergie de 60% et une émission de substances polluantes réduite de 90%.
Les procédés biocatalytiques diffèrent des procédés de chimie classique dans le sens où il est
conditions de travail ou encore les milieux qui peuvent être complètement différents des
biocatalyseurs doivent être identifiés et développés, un procédé doit être mis au point et la
bioconversion résultante doit être optimale pour être économiquement viable. Comme le
montre la figure I.4-1, cela peut faire appel à des spécialités très variées.
115
I – Etat de l’art
Le fait que le milieu naturel des enzymes soit un milieu aqueux a longtemps restreint leur
utilisation à quelques procédés peu nombreux. En effet, une grande partie des composés ne
sont pas ou peu solubles dans l’eau et de fait ne peuvent être envisagés en tant que substrats
potentiels. L’eau donne souvent lieu à des réactions parallèles indésirables ou dégrade les
réactifs organiques. L’équilibre thermodynamique des réactions est défavorisé par la présence
116
I – Etat de l’art
Des auteurs tels que Klibanov et coll., 1977[90] et Tarquis et coll., 1980[91] ont été des
pionniers, pour démontrer la possibilité d’effectuer des réactions de synthèse dans un système
contenant une phase eau et une phase organique non miscible. L’enzyme est localisée dans la
phase aqueuse, tandis que les réactifs sont présents dans la phase organique. Les auteurs ont
montré que la présence de solvant organique permettait de maintenir une faible activité du
L’optique d’une véritable utilisation des enzymes dans des milieux non aqueux s’est
[92, 93]
réellement démocratisée lorsque Zaks et Klibanov ont démontré la robustesse de
l’activité enzymatique dans des milieux purement organiques, qui peut être comparable aux
activités obtenues en milieux aqueux. Ils démontrent également que les enzymes gagnent en
stabilité, une fois placées dans un solvant organique. En effet, Zaks et Klibanov, 1984[92]
milieu constitué à 99% de solvants organiques, alors qu’elle n’est que de quelques secondes
en milieux aqueux.
Les triacylglycérols acyl hydrolases (E.C.3.1.1.3), plus communément appelées lipases, sont
des enzymes entrant dans le métabolisme des graisses. Elles sont très largement représentées
dans le monde vivant car retrouvées dans tous les organismes allant du virus (où les enzymes
végétaux). Elles catalysent dans leur milieu naturel aqueux l’hydrolyse des liaisons esters des
117
I – Etat de l’art
triglycérides reliant les résidus d’acides gras au squelette carboné de glycérol (Figure I.5-1),
dans le but de rendre disponibles les graisses en tant que source d’énergie pour les cellules.
préférentiellement des esters à longues chaînes carbonées (C>10) insolubles dans l’eau. Les
esters hydrolysés peuvent être simples (esters linéaires) ou multiples dans le cas des
triglycérides. La présence d’une interface formée entre les substrats hydrophobes et le milieu
réactionnel est déterminante pour l’action des lipases. De ce fait, les lipases entrent dans une
catégorie d’enzymes particulières capables d’agir en milieu biphasique, à l’interface entre les
linéaires) solubles dans l’eau dont les résidus d’acides gras ont des chaînes courtes (C<10). Si
l’inverse n’est pas vrai, les lipases sont également capables d’hydrolyser les substrats
Si les triglycérides sont leurs substrats naturels, les lipases sont capables d’accepter un large
spectre de substrats tels que des esters, des amides, des thioesters, des acides, des alcools, des
amines ou des thiols. Selon les conditions thermodynamiques, les lipases sont susceptibles de
118
I – Etat de l’art
catalyser deux grandes catégories de réactions selon les conditions thermodynamiques : les
Les réactions de synthèse correspondent à la formation d’une liaison ester entre un acide gras
et un alcool (estérification). La formation de liaisons esters n’est pas exclusive à cette seule
L’ensemble des réactions catalysées par les lipases est résumé dans la Figure I.5-2 suivante,
Les lipases ont la particularité d’accepter un grand nombre de nucléophiles et donc, outre les
119
I – Etat de l’art
Les travaux de résolution de structures tridimensionnelles des protéines sont très nombreux de
nos jours. De nombreuses structures de lipases sont aujourd’hui résolues et donnent accès à de
Les lipases de Rhizomucor miehei[97] et la lipase pancréatique humaine[98] font partie des
premières lipases de structure résolue. De nombreuses autres lipases ont ensuite suivi telles
lanuginosa[101]. A l’heure actuelle, la Protein Data Bank compte jusqu’à 73 entrées pour les
seules lipases[102]. L’analyse de ces structures indique que les lipases adoptent un même motif
Ollis et coll. ont identifié pour la première fois un repliement de type α/β chez les
dont les lipases. Ce repliement consiste en un feuillet β central, comportant 8 brins, dont seul
le second brin β est antiparallèle. Les brins sont connectés par 6 hélices α de part et d’autre du
120
I – Etat de l’art
Toutes les lipases, et plus globalement les enzymes adoptant un repliement de type α/β
présentent un site actif composé de trois résidus catalytiques, placés invariablement dans
- Un résidu histidine.
121
I – Etat de l’art
La sérine catalytique est située dans un motif pentapeptidique le plus hautement conservé
pour effectuer les attaques nucléophiles nécessaires à la catalyse. Récemment, il a été montré
une nouvelle classe d’enzymes présentant la sérine au sein d’un motif consensus particulier
L’acide catalytique (Asp ou Glu) est situé après le brin β7 du feuillet β (Figure I.5-3). Entre
ce résidu et l’histidine de la triade, se crée une liaison hydrogène. Des variations topologiques
Le troisième résidu de la triade catalytique (histidine) prend place dans une boucle située
après le brin β8 dans le repliement α/β de Ollis et coll, 1992[103]. La taille et la conformation
Dès les premières études structurales des lipases, a été identifiée une structure recouvrant le
site actif. Cette boucle amphiphile est appelée paupière ou volet amphiphile[97, 98]
. Cette
contact d’une interface ou d’un substrat, pour rendre accessible le site actif. Deux formes de
lipases peuvent donc co-exister : une forme fermée et une forme ouverte [101, 105].
spécifique des lipases. En effet, l’activité des lipases est fortement augmentée lorsqu’elle est
en présence d’une interface résultant de la présence d’un substrat insoluble sous forme
(Figure I.5-4). Ce phénomène d’activation interfaciale caractérise d’ailleurs les lipases d’après
Figure I.5-4 : Taux d’hydrolyse de la triactéine partiellement soluble dans l’eau par les estérases et les
forme fermée semble prédominer en milieu aqueux, Cygler and Schrag, 1997[107], montrent
que la forme ouverte serait la plus probable en milieu organique non aqueux.
Lors du cycle de catalyse (voir section I.5.3), les deux intermédiaires tétraédriques sont
stabilisés par la création de liaisons hydrogènes avec l’azote des groupes amides de deux
acides aminés. Les acides aminés impliqués sont dits ‘’du trou oxyanion’’. Le premier acide
123
I – Etat de l’art
Pleiss et coll., 2000[108] décrivent deux types de trou oxyanion chez les α/β hydrolases et plus
- Les trous oxyanion de type GX. Chez les enzymes présentant un type GX, est retrouvé
un résidu dit d’amarrage qui interagit avec la chaîne latérale du résidu du trou
Si la structure des résidus constituant le trou oxyanion est variable, la position des atomes
Il semblerait que le type de trou oxyanion soit impliqué dans le processus de spécificité de
substrats des lipases : les trous oxyanion de type GGGX seraient plutôt présents chez les
carboxylestérases et les lipases spécifiques des courtes chaînes carbonées alors que les lipases
de type GX auraient une spécificité marquée pour les substrats à longues chaînes carbonées.
Fischer et coll, 2006[109] ont introduit la notion d’un troisième type de trou oxyanion chez les
α/β hydrolases dans lequel n’est pas impliqué un groupement amide de résidu de la chaîne
protéique mais l’hydroxyle de la chaîne latérale d’une Tyrosine. On parle de trou oxyanion de
‘’type Y’’. Un tel trou oxyanion concerne essentiellement des peptidases et estérases et des
124
I – Etat de l’art
Cygler et coll. 1994[110]proposent un mécanisme catalytique pour les lipases, très proche de
celui des protéases à sérine. Comme exposé précédemment, le site actif des lipases se
- une sérine
- une histidine
Le pKa de la sérine est normalement de 13 ; elle ne peut être normalement déprotonée pour
assurer une attaque nucléophile (Figure I.5-5). La sérine se trouve positionnée dans le site
catalytique à proximité d’une histidine (pKa normal de 6) rendue très basique par l’interaction
de son second azote du groupe imidazole avec le dernier acide aminé de la triade, l’acide
aspartique (ou glutamique). Cette interaction permet une grande stabilisation de la charge de
l’histidine. Ainsi un proton de la sérine catalytique est accepté par l’histidine stabilisée. La
sérine déprotonée devient extrêmement réactive et peut assurer son rôle dans le cycle de
catalyse.
Figure I.5-5 : mécanisme d’activation de la sérine catalytique chez les α/β hydrolases.
125
I – Etat de l’art
Ce processus catalytique, présenté dans la Figure I.5-6, se décompose en deux grandes étapes
L’enzyme dans son état libre (étape 1) rencontre son ester substrat. La catalyse peut débuter
par l’attaque nucléophile de l’atome d’oxygène porté par le résidu Sérine de la triade
catalytique sur le carbonyle de la liaison ester substrat (étape 2). Se forme un ‘’premier
d’oxyanion.
L’intermédiaire est stabilisé par la création de 5 liaisons hydrogènes dont 2 au moins sont
établies avec les fonctions amides des résidus du trou oxyanion (étape 3). Le transfert d’un
proton depuis la sérine catalytique sur l’histidine catalytique renforce le caractère nucléophile
de la sérine. Ce transfert est facilité par la proximité de l’acide catalytique qui oriente
celui-ci. Par la suite, un proton est donné à l’oxygène de la liaison en cours de rupture qui est
ainsi clivée (étape 4). A ce stade, la partie acide du substrat est estérifiée sur la sérine
Cette étape de désacylation fait intervenir une attaque nucléophile, qui peut être exercée par
une molécule d’eau (hydrolyse), ou par un alcool (synthèse – estérification) sur le carbonyle
126
I – Etat de l’art
de la fonction –OH. L’ion RO- ainsi formé va attaquer le carbonyle du groupe acyle, lié de
façon covalente à la sérine catalytique (étape 6). Un second intermédiaire tétraédrique est
créé. Il est chargé négativement et est stabilisé par interactions avec le trou oxyanion (étape
7). Le transfert d’un proton de l’histidine catalytique sur l’atome d’oxygène de la sérine
les lipases végétales, les lipases fongiques et les lipases microbiennes. Cependant, une
127
I – Etat de l’art
telle classification des lipases masque les caractéristiques et similarités qui peuvent
tridimensionnelles.
Plusieurs classifications des lipases ont été proposées sur la base des structures des protéines :
définition de 8 familles distinctes dont la première dite des ‘’vraies lipases’’ est
- Pleiss et coll., 2000[108] ont développé une base de données regroupant les séquences
hydrolases α/β[109, 112, 113] et est de loin la classification la plus aboutie. Des critères de
analyser 6138 séquences représentant pas moins de 4322 protéines dont 594 structures
tri-dimensionnelles sont connues. Les auteurs ont regroupé ces protéines en familles
superfamilles ont ainsi été définies rassemblant 103 familles homologues (Figure
128
I – Etat de l’art
- Kang et coll, 2006[114] ont présenté une base de données regroupant 402
(MELDB = Microbial Esterase and Lipase DataBase). Les enzymes ont été classées
Les sélectivités et spécificités des lipases font l’objet de nombreux travaux pour leurs intérêts
ou sn3).
129
I – Etat de l’art
130
I – Etat de l’art
I.5.5.1 La typosélectivité
La typosélectivité des lipases est extrêmement étudiée du fait de ses implications industrielles
[116-126]
potentielles . Elle représente la capacité des lipases à différencier les acides gras selon
- du degré d’insaturation contenu dans la chaîne carbonée ou leurs positions dans celle-
ci.
Par exemple, Arsan et parkin, 2000[116] définissent que l’optimum réactionnel de la lipase de
Rhizomucor miehei est obtenu pour des substrats de longueurs de chaînes C8, C14 et C16. Fu
Pseudomonas cepacia pour les acides à chaînes moyennes (C8, C10 et C16). La lipase B de
Candida antarctica (Novozyme® 435) présente, quant à elle, une préférence pour les acides
qualifiée de véritable lipase car sa préférence est marquée pour les acides gras à chaînes
longues (C18)[127]. A ce jour, aucune lipase n’a été décrite comme possédant une spécificité
Au même titre que les acides gras, les lipases sont susceptibles de différencier les alcools co-
alcools[128].
D’un point de vue structural, la typosélectivité des lipases prend naissance dans la géométrie
de leur site actif (site de fixation de la partie alcool et acide d’esters). Dans ce sens, Pleiss et
131
I – Etat de l’art
coll, 1998[123] définissent trois catégories de lipases en fonction de la topologie de leur site
- les lipases présentant une cavité hydrophobe proche de la surface (lipase fongique de
- les lipases présentant un site actif au fond d’un entonnoir (lipases de Candida
mammifères).
Rhyzomucor miehei vis-à-vis de la longueur de chaîne des acides gras, par mutagénèse des
acides aminés intervenant dans les zones de contact entre la chaîne carbonée et l’enzyme. Ils
obtiennent ainsi une activité vis-à-vis des substrats à chaînes courtes (C4) augmentée d’un
acides aminés constituant le site actif du tunnel de la lipase Lip1 de Candida rugosa à des
la lipase de Candida rugosa varie des courtes aux longues chaînes (C18) avec une préférence
marquée pour les C4, C8, C10 et C12. La mutation des résidus 246 et 413 situés au cœur du
tunnel, modifie la préférence pour les seuls acides gras à chaînes courtes (< C8). De même, le
remplacement du résidu d’acide aminé 410 situé au fond du tunnel peut quasiment abolir
132
I – Etat de l’art
Figure I.5-8 : Représentation schématique des sites actifs des lipases de Candida antarctica (CALB), de
Burkholderia cepacia (BCL=PCL), de Rhizomucor miehei (RML), et de Candida rugosa (CRL)[123]. (a) la
direction des vues est indiquée par une flèche. D, Asp; H, His; S, Ser représentent les acides aminés de la triade
catalytique. (b-e) Représentations des sites actifs : vue de côté, de face et de dessus. Les nombres indiquent la
longueur des acides gras qui peuvent se lier complètement à l’intérieur du site actif.
133
I – Etat de l’art
D’après Vaysse et coll, 2002[125], les profils de spécificité vis-à-vis des acides gras peuvent
- la présence de substrats et co-substrats très variés dans les différentes réactions (esters
- des conditions thermodynamiques différentes selon les réactions. Par exemple, dans le
cas de l’hydrolyse, la solvatation des acides gras à chaînes courtes favorise leur
Cela rejoint les observations de Janssen et coll., 1993[129] qui démontrent que la spécificité de
synthèse d’acylglycérols avec des acides gras de longueurs de chaînes différentes est
I.5.5.2 La régiosélectivité
La régiosélectivité correspond à la capacité des lipases à différencier les acides gras, selon
I.5-9). Elle représente la capacité des lipases à distinguer les liaisons esters primaires (i.e. sn1
et sn3) et les liaisons esters secondaires (i.e. sn2) d’une molécule de triacylglycérol.
Figure I.5-9 : Représentation de Fisher d’une molécule de triacylglycérol. Identification des liaisons esters
134
I – Etat de l’art
Classiquement, les lipases sont classées du fait de leur stéréosélectivité en trois groupes :
dans la littérature. Seule la lipase A de Candida antarctica est reconnue comme étant
[131]
sn2-sélective . D’autres lipases ont été décrites comme étant sn2-sélectives mais
leur capacité est discutée. C’est le cas de la lipase de Candida parpsilopsis par
dans la littérature.
135
I – Etat de l’art
Table I.5-1 : Spécificité, support et producteur de lipases commerciales usuelles[135]. (NI : Non Immobilisé ;
Lipase PS-D
Célite 545 Amano Enzyme Inc. NS
(lipase de Bulkolderia cepacia)
Lipase AK
NI (poudre) Amano Enzyme Inc. NS
(lipase de P. fluorescens)
Lipase F-AB15
NI (poudre) Amano Enzyme Inc. 1,3S
(lipase de Rhizopus oryzae)
Novozyme 435
Lewatit VP OC 1600 Novozymes A/S NS
(lipase B de Candida antarctica)
Lipozyme TL IM
Granule de silice Novozymes A/S 1,3S
(lipase de Thermomyces lanuginosa)
Lipozyme RM IM
Duolite A568 Novozymes A/S 1,3S
(lipase de Rhizomucor miehei)
Lipozyme CalB L
NI (Liquide) Novozymes A/S NS
(lipase B de Candida antarctica)
Lipozyme MY
NI (poudre) Meïto Sangyo co., Ltd NS
(lipase de Candida rugosa)
Lipozyme PL
NI (poudre) Meïto Sangyo co., Ltd 1,3S
(lipase de Alcaligenes sp.)
Lipozyme UL
NI (poudre) Meïto Sangyo co., Ltd 1,3S
(lipase de Rhizopus sp.)
Lipozyme AL
NI (poudre) Meïto Sangyo co., Ltd 1,3S
(lipase de Acromobacter sp.)
La classification des lipases dans une catégorie sn1,3-sélective peut être réductrice car les
lipases sont susceptibles de différencier les positions sn1 et sn3 entre elles[136].
accueillir les chaînes carbonées des acides gras en position sn1, sn2 ou sn3[137] (Figure
I.5-10). La taille et l’hydrophobicité de ces sites d’ancrage sont des déterminants de l’affinité
pour les différentes positions des acides gras sur la molécule d’acylglycérol et apparaissent
136
I – Etat de l’art
la lipase.
Figure I.5-10 : Site actif de la lipase de Burkholderia cepacia[138]. Les poches de liaisons aux groupements
sn1, sn2 et sn3 sont indiquées ainsi que les acides aminés bordant ces poches.
L’importance de la position sn2 et de l’histidine catalytique est reprise par Pleiss et coll,
2000[139] à travers une étude portant sur 4 lipases (celles de Rhizopus oryzae, Rhizomucor
‘’fossé histidine’’ formé par l’histidine catalytique et un acide aminé différent selon la classe
histidine et entre en contact direct avec l’acide aminé. Plus les interactions stériques sont
intenses, plus la sélectivité se dirige vers la position sn3. Ainsi, la stéréosélectivité des lipases
sera affectée soit par la rigidité du substituant sn2, soit par la forme du fossé histidine.
Plusieurs cas de figures sont dès lors envisagés et résumés dans la Figure I.5-11.
137
I – Etat de l’art
138
I – Etat de l’art
- au niveau structurel, certaines boucles où la forme du site actif peuvent intervenir dans
lipases. Par exemple, la polarité (LogP) des solvants dans la synthèse de 1,3 DiOleyl-
I.5.5.3 L’énantiosélectivité
Une autre propriété intéressante des lipases est de pouvoir différencier des molécules chirales.
La chiralité est la propriété de tout objet qui n’est pas superposable à son image dans un
miroir plan. Les deux formes R et S (l’objet et son image) sont dites énantiomères, ou encore
139
I – Etat de l’art
Une faible différence structurale peut engendrer des propriétés biologiques différentes. En
effet, un énantiomère peut être doué d’une propriété d’intérêt tandis que son inverse est
inactif. Pire, le deuxième énantiomère peut être toxique. C’est par exemple le cas de la
thalidomide dont l’un des énantiomères possède des propriétés antiémétiques, l’autre un effet
pharmaceutique)[141]. Les lipases sont un outil de choix dans cette quête. En effet, plusieurs
auteurs décrivent la capacité des lipases à distinguer deux énantiomères. Les exemples de
140
I – Etat de l’art
Anti-inflammatoire non
Novozyme 435 (CalB) Flurbiprofene estérification [142]
stéroïdien
Baclofène
(Acide (RS)-b- Thérapie de la douleur
Candida rugosa -- [143]
(aminomethyl)-4- Relaxant musculaire
chlorobenzène propionique)
Une bonne illustration du mode d’action des lipases dans le processus d’énantiosélection est
proposée au travers des ‘’règles de Kazlauskas’’, pour la résolution des mélanges racémiques
d’alcools secondaires par les lipases[151]. Elle suppose que la base de l’énantiosélectivité
repose sur la différence de taille entre les deux substituants de l’alcool secondaire. Cette règle
suppose des poches de tailles différentes autour du site actif de l’enzyme où vont se loger les
de large taille a la priorité sur le substituant de taille moyenne ; c’est l’énantiomère R qui va
141
I – Etat de l’art
Enantiomère R Enantiomère S
favorisé défavorisé
Figure I.5-13 : Règles de Kazlaukas pour la résolution enzymatique des alcools secondaires[151]. M :
I.5.6 Mise en œuvre des lipases pour la synthèse d’esters d’acides gras.
I.5.6.1.1 Généralités.
Même si une enzyme est identifiée comme active et efficace pour une certaine réaction, son
utilisation industrielle est souvent restreinte par son manque de stabilité à long terme en
condition de procédé, par les difficultés rencontrées lors de sa récupération et son recyclage.
L’immobilisation est ainsi souvent la clé pour améliorer les performances d’une enzyme[152,
153]
. Le terme d’‘’enzymes immobilisées’’ fut recommandé lors de la 1ère conférence de
localisées dans une certaine région définie de l’espace avec rétention de leurs activités
Spécialement en milieu organique anhydre, il est très difficile d’utiliser les enzymes sans
immobilisation, car les molécules d’enzymes ont tendance à s’agréger et sont donc soumises à
142
I – Etat de l’art
sa thermostabilité.
réutilisable. De cette manière, elle est utilisable dans des systèmes de réacteurs
continus.
- une fonction non catalytique, qui doit être développée pour l’application. Elle doit
assurer une certaine résistance mécanique et une résistance aux agents biologiques.
approche par tâtonnement est utilisée jusqu’à ce qu’un système satisfaisant soit développé.
Comme le montre la Figure I.5-14, les techniques d’immobilisation les plus fréquemment
utilisées peuvent être regroupées en deux grandes catégories, selon leur mode de rétention
d’immobilisation.
143
I – Etat de l’art
nombreux supports organiques et minéraux peuvent être utilisés mais le support doit
groupements chimiques capables de réagir avec les chaînes latérales des protéines.
Différentes méthodes d’activation sont connues mais la plupart utilisent des agents
physique consiste en la créaction de ponts covalents entre les chaines latérales des
glutaraldéhyde.
- L’inclusion dans une matrice de polymère : l’enzyme, contenue dans une phase de
est retenue, substrats et produits sont capables de diffuser au sein du polymère. Les
matrices les plus communément utilisés sont les gels de polyacrylamide, les gels
- L’encapsulation dans une membrane poreuse. Cette technique consiste à créer des
cellules artificielles délimitées par une membrane. Les molécules de grande taille
144
I – Etat de l’art
La solubilité des enzymes dans les milieux non aqueux est relativement limitée. Cela implique
que les phénomènes de désorption des enzymes depuis les supports d’adsorption soient très
limités dans ces conditions. Associée au fait que les procédures impliquées dans les
immobilisations par adsorption non covalente font partie des plus simples, cette technique
d’immobilisation par adsorption fait partie des immobilisations les plus utilisées pour les
lipases[157]. L’immobilisation par adsorption non covalente est abordée plus en détail dans la
145
I – Etat de l’art
L’adsorption non covalente des enzymes sur des supports se fait par des forces de faible
énergie telles que les interactions de Van der Waals, les interactions hydrophobes, les liaisons
envisagée :
- Résistance mécanique.
- Caractère hydrophobe/hydrophile.
- Capacité d’adsorption.
- Coût.
La Table I.5-3 recense quelques uns des supports les plus fréquemment utilisés, des plus
Table I.5-3: Exemple de supports d’immobilisation des lipases commerciaux classiquement rencontrés
dans la littérature.
condensat de Phenol
Duolite A568 Rhom&Haas Hydrophile 28 [160]
formaldehyde
Celite 545 Lehmann&Voss & co. Cœur de Diatomée Hydrophile 26 [163, 164]
moyennement
Lewatit VP OC 1600 Lanxess DVB méthacrylate 27 [165, 166]
hydrophobe
146
I – Etat de l’art
adsorbée et au support, ce qui rend chaque immobilisation unique[157]. Ces paramètres sont les
suivants :
- la taille de la protéine
- l’aire spécifique du support : plus la surface spécifique du support est importante, plus
gammes de taille des pores des supports est la suivante : micropores (< 20Ǻ) ;
Rhizomucor miehei sur verre hydrophobe apparait optimale pour un diamètre de pore
d’au moins 350 Ǻ[171]. Les supports les plus efficaces se situent donc dans les gammes
de décrire qualitativement les adsorptions. Ceci permet une évaluation des capacités et des
affinités des supports pour les enzymes. Plusieurs modèles sont utilisés dans la littérature pour
Le modèle le plus couramment utilisé dans la description des isothermes est celui de
Langmuir[172]. Cette isotherme est obtenue lorsque l’enzyme forme une monocouche sur le
support. Le modèle est basé sur la supposition d’un adsorbant structurellement homogène, où
tous les sites d’adsorption sont identiques et énergétiquement équivalents. Ainsi, les supports
147
I – Etat de l’art
présentant ces caractéristiques portent un nombre égal de molécules, ce qui suppose une
capacité d’adsorption finie. L’isotherme de Langmuir est présentée dans l’équation I-21 :
K L Ce
Qe = (Eq. I-21)
1 + α L Ce
d’enzymes dans le milieu, KL et αL sont les constantes de Langmuir (L/g). KL/αL représente la
Le modèle de Langmuir a été par exemple utilisé par Akova et Ustun, 2000[173] pour décrire
l’adsorption de la lipase de la graine de Nivella sativa sur Célite ou par Al Duri et Yong,
2000[167] et Gitlesen et coll., 1996[174] pour l’étude de l’adsorption de différentes enzymes sur
Accurel MP.
Un autre modèle utilisé dans la description des immobilisations par adsorption est celui
hétérogène avec des sites d’adsorption non identiques et une distribution exponentielle de
l’énergie d’adsorption sur la surface du support. Son expression est donnée dans l’équation I-
22.
Qe = K F Ce 1 / n (Eq. I-22)
Mei et coll, 2003[176] montrent que la distribution des enzymes au sein des supports peut ne
pas être régulière au sein de la particule de support. En effet, ils observent que la lipase B de
148
I – Etat de l’art
taille de la couche de lipase est dépendante du temps de contact entre le support (et donc du
solution d’immobilisation.
Oliveira et coll, 2009[177] étendent ces observations et postulent que, pour des conditions
particule de support ; mais à l’inverse, le contenu spécifique en lipase est directement corrélé
à la taille de la particule de support, les particules de petite taille ayant une teneur spécifique
en protéine plus importante que les grandes. Il y a effet de dilution des lipases dans les
- L’une de ces phases est le milieu réactionnel non aqueux à proprement parler et sert de
Entre ces phases, existent une ou plusieurs interfaces dont les propriétés peuvent être très
importantes pour le comportement cinétique. Les réactifs et/ou produits vont avoir à franchir
cette interface entre la phase organique et le biocatalyseur. Si les interfaces ne contribuent pas
149
I – Etat de l’art
diffusionnelles.
Dans les systèmes mettant en oeuvre des enzymes immobilisées, des phénomènes de
1996[179], montrent que, outre les capacités catalytiques de la lipase mise en jeu, la cinétique
(cm.s-1).
La Figure I.5-15 schématise l’accès des substrats au site actif de la lipase immobilisée sur un
profils de concentrations, ici schématisés, montrent clairement les limitations aussi bien pour
Les limitations diffusionnelles externes sont particulièrement bien illustrées par les travaux de
glycérol, pour la synthèse de glycérides partiels, les auteurs montrent que plus la quantité de
lipase de Rhizopus arrhizus immobilisée sur un support de polypropylène est augmentée dans
le milieu réactionnel, plus l’activité spécifique (quantité de substrat tranformé par unité de
150
I – Etat de l’art
caprate d’éthyle vers le site actif et de la diffusion des produits de réaction vers la phase
organique, dus à la création d’une couche de glycérol autour des particules de lipase.
Figure I.5-15 : Schématisation des phénomènes de transfert rencontrés au cours des réactions mettant en
Les limitations internes sont très dépendantes du trio enzyme, support d’immobilisation et
réactants mis en jeu lors des réactions. Torres et coll., 2007[165] ont étudié l’activité de la
lipase B de Candida antarctica immobilisée sur Lewatit VP OC 1600 (Novozyme 435), sur
forte activité. Par contre, lors de l’acétylation de l’α tocophérol avec l’acétate de vinyle, c’est
151
I – Etat de l’art
la forme de la lipase B de Candida antarctica immobilisée sur Accurel qui fournit les
meilleures performances. Les auteurs expliquent ces différences par une structure poreuse
plus large de l’Accurel par rapport aux autres supports, facilitant la diffusion du substrat au
hydrophobe de porosité contrôlée, est dépendante de la taille des pores[171] : des pores
présentant un diamètre supérieur à 100nm sont nécessaires pour que l’activité soit
support dont les pores mesurent plus de 0,2µm, pour l’immobilisation de la lipase de
d’estérification de l’acide oléique avec l’octanol dans l’hexane. Enfin la diffusion au travers et
au sein des supports est en partie régie par les interactions entre molécules et support[165, 176].
multiphasiques, les différents composés impliqués dans la réaction (réactifs et produits) sont
Les états d’équilibre entre phases sont régis par quelques grandes règles :
- à l’équilibre, la composition des deux phases est indépendante des volumes des
phases.
- Si les concentrations de tous les composés sont connues dans une phase, à l’équilibre,
elles sont toutes fixées dans l’autre mais peuvent être très différentes les unes des
autres.
152
I – Etat de l’art
Halling, 1994[178] préconise l’utilisation des activités thermodynamiques pour l’analyse des
systèmes biphasiques. Leur principal avantage est, qu’à l’équilibre, les activités
thermodynamiques de chaque composé sont égales dans toutes les phases, même si leurs
le milieu et est définie par la relation I-23 suivante. L’activité du composé pur est considérée
µi − µiθ
RT
ai = e
(Eq. I-23)
où µi est le potentiel chimique du composé i dans les conditions considérées (J.mol-1), µio est
le potentiel chimique du composé i dans les conditions standards (J.mol-1), R est la constante
des gaz parfaits (J.mol-1.K-1) et T la température (K). Ainsi, l’activité thermodynamique est
influencée par tous les facteurs pouvant faire varier le potentiel chimique de la substance, à
Au sein de chaque phase, il est souvent plus utile de considérer les activités
ai = γ i ⋅ xi (Eq. I-24)
Dans les systèmes à l’équilibre constitué de deux phases A et B, il peut être écrit (équation I-
25):
ai = ai ⇔ γ i ⋅ xi = γ i ⋅ xi
A B A A B B
(Eq. I-25)
153
I – Etat de l’art
Les concentrations du composé i dans les deux phases pouvant être très différentes, les
coefficients d’activité γiA et γiB sont également très différents. Une forte concentration sera
associée à un faible coefficient d’activité et inversement. Par ailleurs, les équilibres entre la
phase organique du milieu réactionnel et le biocatalyseur sont totalement régis par les
Même si l’eau n’intervient pas en tant que telle dans la réaction de transestérification des
huiles, le contrôle de son activité (aw) est un paramètre crucial dans les milieux non
la fonction et donc de l’activité des lipases. De nombreux auteurs montrent par exemple que
le niveau d’eau est un facteur primordial dans l’optimisation des réactions catalysées par les
d’entre elles augmente de façon monotone au fur et à mesure que l’activité de l’eau augmente.
C’est par exemple le cas de la lipase de Pseudomonas sp[184]. D’autres présentent des optima
d’activité selon l’aw. C’est par exemple le cas de la lipase de Rhizopus arrhizus ou Candida.
rugosa qui présentent un maximum d’activité pour une aw de 0,35 et 0,52 respectivement[184].
Certaines lipases, au contraire, présentent une activité très importante à de très faibles valeurs
d’activité de l’eau et ne nécessitent pas d’apport d’eau extérieure (Figure I.5-16). C’est le cas,
par exemple, de la lipase de Candida antarctica qui possède une activité optimale pour des
activtés de l’eau très faibles. En effet, Bousquet-Dubouch et coll, 2001[185] décrivent des
154
I – Etat de l’art
Figure I.5-16 : Effet de la teneur en eau (aw) sur l’activité de synthèse de 2-monoglycérides lors de
l’éthanolyse de triglycérides catalysée par la lipase de Candida antarctica B (Novozyme 435) (○), de
Rhizomucor miehei (Lipozyme RM IM) (□), de Bulkorderia cepacia (Lipase PS C-I) (●) et Thermomyces
effet, Wetje et Aldercreutz, 1997[187], obtiennent des profils d’activité de l’eau semblables
quelle que soit la réaction (estérification, hydrolyse ou transestérification) avec les lipases de
- Le solvant. La quantité d’eau nécessaire pour obtenir une aw donnée est différente
d’esters éthyliques d’acide oléique dans l’hexane ou le CO2 super –critique (CO2sc),
hydraté à 10%, soit une aw de 0,5. Cependant, ce niveau d’hydratation est atteint dans
les deux solvants de polarité différente, avec un apport en eau plus important dans le
solvant le plus polaire (CO2sc). Dans le but de décrire les partages de l’eau entre
155
I – Etat de l’art
isothermes d’adsorption.
été proposé pour mesurer la capacité des supports à capter l’eau. Les auteurs estiment
cette capacité au travers du rapport quantité d’eau dans le support versus quantité
d’eau dans le milieu. L’hydratation des supports d’aquaphilicité importante peut entrer
Plusieurs méthodes ont été développées pour permettre le contrôle de l’aw dans les réactions
biochimiques. La plus simple reste, selon Halling, 1994[178], l’équilibration de l’ensemble des
de solutions saturées de sels dont l’activité est fixe et connue (Table I.5-4).
156
I – Etat de l’art
Le mécanisme réactionnel le plus communément accepté pour les lipases est le modèle de
Ping Pong Bi Bi avec inhibition compétitive de la part du co-substrat, que ce soit pour les
Figure I.6-1: Schéma du mécanisme réactionnel de type Ping-Pong Bi-Bi chez les lipases. E : Enzyme ; E*:
Enzyme dans son état transitoire ; S1 : Substrat 1 (acide ou ester); S2 : Substrat 2 (eau ou alcool); P1 : Produit
Le premier substrat de réaction S1 (acide ou ester) se lie à l’enzyme (ES1) pour former un
complexe actif (E*P1) qui va permettre la libération du premier produit de réaction P1 (eau ou
alcool). L’enzyme sous sa forme transitoire E* va fixer le second substrat réactionnel (E*S2)
(eau ou alcool) pour permettre la libération du second produit de réaction P2 (acide ou ester)
et régénérer l’enzyme. Une voie parallèle compétitive coexiste : la fixation d’une molécule co
(inhibition compétitive).
157
I – Etat de l’art
L’équation cinétique d’un tel système est donnée dans l’équation I-26 suivante établie par
Segel, 1975[198].
avec :
Certains auteurs proposent un modèle Ping Pong Bi Bi alternatif dans lequel les deux
substrats sont inhibiteurs[199-201]. Cela introduit un nouveau terme dans l’équation cinétique 26
K IS2 K IS1
avec :
158
I – Etat de l’art
Certains auteurs postulent que l’eau présente dans le milieu réactionnel initial a un effet sur la
cinétique enzymatique. Par exemple, Janssen et coll, 1999[202] proposent d’établir une
l’eau, qui par ailleurs est l’un des deux produits de la réaction d’estérification. Bousquet-
Dubouch et coll. 2001[185] identifient l’eau présente dans le milieu (controlée au travers de son
Van Tol et coll, 1995[203], proposent d’utiliser les activités thermodynamiques des composés
intervenant dans une réaction enzymatique, en lieu et place des concentrations dans les
équations cinétiques. Cette approche permet de tenir compte de la disponibilité des substrats
et des produits, en fonction du solvant utilisé. En effet, cette disponibilité constitue une partie
des paramètres cinétiques de l’enzyme et leur contribution va varier selon les solvants. De
façon théorique, la prise en compte des activités thermodynamiques des substrats, au lieu des
intrinsèques (constante d’affinité et vitesse maximale) en des paramètres égaux dans tous les
milieux. Van Tol et coll, 1995[203] déterminent néanmoins que seuls les paramètres d’affinité
(Thermodynamic Activity Based Enzyme Kinetics) présenté comme un outil rationnel pour le
choix optimal des solvants impliqués dans les réactions. Les auteurs obtiennent une bonne
159
I – Etat de l’art
d’inhibition) d’une réaction de type Ping-Pong Bi-Bi avec inhibition compétitive de l’alcool
auteurs n’ont pas pu dégager de corrélation complète entre ce dernier paramètre et les
est supposé être de 66%. Cependant, de nombreux auteurs, tels que Du et coll. 2005[204], ont
observé des rendements bien supérieurs, de l’ordre de 90%. Ces observations démontrent
l’isomérisation de :
Le processus fut proposé la première fois par Ficher et coll en 1920 et est illustré dans la
Figure I.6-2. Il met en jeu la formation d’un intermédiaire cyclique à 5 carbones initié par
de 2 sn1, 3-DAG pour 1 sn1, 2-DAG sont ainsi naturellement atteints. Ces équilibres sont
160
I – Etat de l’art
Figure I.6-2 : Processus d’isomérisation (migration d’aycle) des MAG ou DAG avec formation d’un
Les facteurs pouvant influencer le processus naturel de migration d’aycle sont nombreux.
Compton et coll., 2007[205] et Laslzlo et coll., 2008[207], évaluent le taux de migration d’acyle
respectivement des sn2-MAG et des sn1, 2 DAG en fonction de la température. Ils observent
161
I – Etat de l’art
des réactions du premier ordre (de même que Boswinkel et coll., 1996[209]) dont les cinétiques
Figure I.6-3: Influence de la température lors de l’isomérisation naturelle des sn2-MAG en sn1(3) MAG
(figure A) et des sn1, 2-DAG en sn1, 3-DAG (figure B)[205, 207]. Les températures respectives sont indiquées sur
les figures.
La détermination des paramètres cinétiques et notamment les temps de demi vie révèlent des
taux d’isomérisation similaires pour les sn2-MAG et les sn1 ,2 DAG (Table I.6-1). Si la
migration d’acyle est relativement discrète à faible température (t1/2 de l’ordre de 3.500 heures
à 25°C), elle est largement augmentée lorsque la température s’accroît (t1/2 diminué d’un
162
I – Etat de l’art
Table I.6-1: Comparaison des temps de demi-vie des sn1,2-DAG et des sn2-MAG lors du processus de
Température
(°C) sn1, 2-DAG sn2-MAG
t1/2 (h) t1/2 (h)
25°C 3425 3500
40°C 573 447
60°C 83,5 83,8
80°C 15,8 22,8
Millqvist Fureby et coll, 1996[206] référencent l’influence d’un certain nombre de paramètres
toluène, octane etc…) et les solvants protiques polaires (Méthanol, Ethanol …) ont
tendance à favoriser la migration d’acyle. Les sn2-MAGs sont plus stables dans les
- Activité de l’eau. D’une façon générale, la migration d’acyle est ralentie quand des
solvants saturés en eau sont utilisés plutôt que des solvants anhydres.
- Ajout d’alcool dans les solvants. L’alcool permet d’augmenter la polarité du solvant
de la même manière que l’eau et engendre une réduction du taux de migration d’acyle
polarité augmente, ce qui tend à réduire la migration d’acyle. Les MAG peuvent
163
I – Etat de l’art
- Présence d’additifs solides. Les supports enzymatiques peuvent avoir une influence
sur la migration d’acyle. Tous les supports portant des charges ioniques ou ayant une
cadre, les supports traditionnels tels que la Célite (support de la lipase PS Amano IM),
I.6.3.1 Généralités
L’alcoolyse des huiles pour la production d’esters est certainement, et de loin, la stratégie la
plus utilisée. Une image de la pluralité des travaux sur ce sujet est présentée dans les tables
Les corps gras les plus utilisés sont les huiles de soja, de tournesol, de colza, de palme et de
coton. D’autres sources d’huiles ont néanmoins été explorées pour la production d’esters :
huile de carthame, de ricin ou de jatropha et même des graisses animales (ard, suif ou encore
(graisses de restaurant, huiles acides, huiles alimentaires déchets etc…) dont la composition
est souvent mal maîtrisée et dans lesquelles des taux importants d’acides gras libres peuvent
empêcher une bonne catalyse chimique (formation de savon en présence de soude) est
immobilisée sur Lewatit VPOC 1600 sous le nom de Novozyme 435. Les lipases de
164
I – Etat de l’art
immobilisées sur granule de silice, sur Duolite et sur cœur de diatomées sont également
de Candida cylindracea (rugosa) ont démontré leur capacité à catalyser la réaction. Certains
auteurs proposent d’associer plusieurs lipases dans une même réaction, afin de profiter de
Du fait de son faible coût de production et de son grand niveau de pureté, le méthanol est de
loin l’alcool le plus utilisé. L’éthanol est également grandement utilisé. La possibilité de
possibilité d’utiliser les huiles de fusel comme alcool de transestérification[216]. Ces co-
produits de l’industrie de l’éthanol sont des mélanges d’alcools linéaires et ramifiés contenant
de 2 à 5 carbones.
Le comportement réactionnel des lipases vis à vis des alcools peut être extrêmement différent
d’une lipase à l’autre (effet de la typo-spécificité des lipases)[217]. D’une façon générale, les
alcools secondaires sont moins efficacement acceptés par les lipases que les alcools
165
I – Etat de l’art
Table I.6-2: Production d’esters d’acides gras par catalyse enzymatique à partir de différentes matières premières, alcools et type de réacteur. Nd : non déterminé.
Canola Méthanol T. lanuginosa 6 50°C Sans Solvant 97 ( c ) 10 cycles Aucune perte [219]
Méthanol T. lanuginosa 2 35°C tert-butanol 33,5 ( t ) >100 cycles Pertes négligeables [224]
Colza Méthanol T. lanuginosa 2 35°C Ether de pétrole 37,4 ( t ) ~10 cycles -65% [224]
T. lanuginosa +
Méthanol 4 35°C tert-Butanol 95 ( r ) 200cyles - de 10% [212]
C. antarctica B
Colza brut Méthanol C. sp 99-125 3 40°C Ether de pétrole 81 ( r ) nd nd [225]
166
I – Etat de l’art
Table I.6-2: Production d’esters d’acides gras par catalyse enzymatique à partir de différentes matières premières, alcools et type de réacteur. (Suite) Nd : non
déterminé.
Coton vierge Méthanol C. antarctica B 6 50°C tert-Butanol 95 ( r ) 500 h Aucune perte [226]
Distillat de T. lanuginosa +
Méthanol 3,6 40°C tert-Butanol 97 ( r ) 120cycles Aucune perte [214]
désodorisation de soja C. antartica B
C. antarctica B
graisse de canard huile de fusel 4 45°C Sans Solvant 90 nd nd [219]
+ T lanuginosa
C. antarctica B
huile de fusel 4 45°C tert-Butanol 70 nd nd [213]
+ T lanuginosa
Graisse de restaurant Ethanol P. cepacia 4 40°C Sans Solvant 95 ( c ) nd nd [228]
167
I – Etat de l’art
Table I.6-2: Production d’esters d’acides gras par catalyse enzymatique à partir de différentes matières premières, alcools et type de réacteur. (Suite) Nd : non
déterminé.
Noix de palme alcools Iaire et IIaire P. cepacia 4 40°C Sans Solvant 72 ( c) (Ethanol) nd nd [222]
Palme brut Méthanol C. antarctica B 6 40°C tert-Butanol 91-92 ( r ) 5 cycles Aucune perte [239]
Méthanol C. antarctica B 3 40°C Sans Solvant 91-92 ( r ) 5 cycles 29% de perte [239]
Méthanol C. antarctica B 3 40°C LiCl saturé 91-92 ( r ) 5 cycles 32% de perte [239]
168
I – Etat de l’art
Table I.6-2: Production d’esters d’acides gras par catalyse enzymatique à partir de différentes matières premières, alcools et type de réacteur. (Suite). Nd : non
déterminé.
Soja Méthanol T. lanuginosa 3 25°C Sans Solvant 84 ( c ) 9 cycles Perte totale [243]
R. oryzae + C.
Méthanol 4,5 45°C Sans Solvant 99 ( c ) 10 cycles -20% [211]
rugosa
Méthanol C. antarctica B 3 30°C Sans Solvant 70 ( c ) 70jours Pertes faibles [244]
Méthanol C. antarctica B 5 30-35°C Sans Solvant ~44 ( r ) 7 cycles 10% de perte [217]
Ethanol T. lanuginosa 7 30-35°C Sans Solvant ~53,5 ( r ) 7 cycles 20% de perte [217]
Butanol R. miehei 9 30-35°C Sans Solvant ~53,5 ( r ) 7 cycles 25% de perte [217]
Soja + Colza Méthanol C. antarctica B 3 30°C Sans Solvant > 96,1 ( c ) nd nd [247]
Méthanol C. antarctica B 3 30°C Sans Solvant 96,1 ( c ) 70 cycles Aucune perte [247]
Soja + Soja hydrogéné Méthanol T. lanuginosa 4 40°C Sans Solvant 92 ( r ) 10 cycles 5% de perte [249]
Soja brut Méthanol C. antarctica B 3 30°C Sans Solvant 93,8 ( c ) 8 cycles Perte totale [250]
Soja dégommé Méthanol C. antarctica B 3 30°C Sans Solvant 95,9 ( c ) 25 cycles Aucune perte [250]
Tournesol Méthanol C. antarctica B 1 40°C Sans Solvant 29,7 ( c ) 5 cycles Gain de 20% [252]
Pancréatique
Ethanol 3 45°C Sans Solvant 81 ( t ) 4 -90% [253]
porcine
169
I – Etat de l’art
Table I.6-2: Production d’esters d’acides gras par catalyse enzymatique à partir de différentes matières premières, alcools et type de réacteur. (Suite). Nd : non
déterminé.
Méthanol C. antarctica B 3 45°C Sans Solvant >99 ( c ) 5 cycles Perte totale [255]
2-Propanol C. antarctica B 3 45°C Sans Solvant 96,85 ( c ) 5 cycles 90% de perte [255]
Butanol C. antarctica B 3 45°C Sans Solvant 89,31 ( c ) 5 cycles 90% de perte [255]
Méthyl acétate C. antarctica B 12 45°C Sans Solvant 99,83 ( c ) 8 cycles 36% de perte [255]
Méthyl acétate C. antarctica B 12 45°C Sans Solvant 96,25 ( c ) 8 cycles 1% de perte [255]
Méthanol R. miehei 3 40°C Sans solvant >80 8 cycles 15% de perte [256]
Méthanol T. lanuginosa 3 40°C Sans solvant >60 8 cycles 70% de perte [256]
Tournesol Oléique Butanol R. miehei 4 40°C Sans Solvant 90jours Aucune perte [56]
170
I – Etat de l’art
La mise en œuvre de réaction sans solvant est souvent préconisée dans un contexte de
production industrielle. En effet, ces systèmes présentent entre autres avantages celui de
permettre une réduction des coûts (downstream, recyclage etc…), une réduction des risques
liés à la manipulation des solvants ou encore une diminution des risques écologiques…
Néanmoins, dans certains cas, leur utilisation est de premier intérêt au cours de réactions
mettant en jeu des substrats et produits pouvant être très différents (triglycérides vs alcool,
esters vs glycérol par exemple). Un choix judicieux du solvant apparaît souvent comme un
Laane et coll, 1987[258], en compilant les données de plus de 150 travaux, définissent les
modérément efficace
- Les solvants polaires (Log(P)<2), dans lesquels les vitesses de biocatalyse sont faibles.
Les solvants employés lors de la réaction enzymatique peuvent être directement inhibiteurs de
les cétones et les alcools tertiaires agissent comme des inhibiteurs de la réaction, là où aucun
171
I – Etat de l’art
phénomène d’inhibition n’est observé avec les alcanes. Cet effet d’inhibition pourrait faire
partie du processus par lequel les enzymes présentent de faibles activités dans les solvants
polaires.
transestérification des triglycérides en esters est décrite par sa propre constante d'équilibre
a DAG ⋅ a E
TAG + A ↔ DAG + E K eq 1 = (Eq. I-28)
aTAG ⋅ a A
a MAG ⋅ a E
DAG + A ↔ MAG + E K eq 2 = (Eq. I-29)
a DAG ⋅ a A
aG ⋅ a E
MAG + A ↔ G + E K eq 3 = (Eq. I-30)
a MAG ⋅ a A
molaire (xi) et du coefficient d’activité (γi) et les équations I-28 à I-30 peuvent être écrites
une adaptation des autres activités de façon à rétablir l’équilibre et maintenir Keqi constante.
Egalement, réduire l’activité d’un co-produit (glycérol par exemple) ou augmenter l’activité
d’un co-substrat (alcool par exemple) va induire une augmentation de l’activité du produit
172
I – Etat de l’art
x DAG ⋅ x E γ DAG ⋅ γ E
K eq 1 = × (Eq. I-31)
xTAG ⋅ x A γ TAG ⋅ γ A
x MAG ⋅ x E γ MAG ⋅ γ E
K eq 2 = × (Eq. I-32)
x DAG ⋅ x A γ DAG ⋅ γ A
xG ⋅ x E γ ⋅γ
K eq 3 = × G E (Eq. I-33)
x MAG ⋅ x A γ MAG ⋅ γ A
Les équations 31 à 33 montrent que l’ajout d’un solvant va agir sur la constante d’équilibre.
Premièrement, l’addition d’un solvant va affecter les activités des composés à l’équilibre, en
diminuant leur concentration (ce qui n’est pas forcément un effet souhaitable). Par ailleurs, le
solvant va faire varier les coefficients d’activité γi des composés impliqués dans la réaction.
Ces changements peuvent être à la fois positifs ou négatifs, le tout dépendant de la nature du
solvant.
Janssen et coll, 1993[260] étudient l’effet du solvant de réaction sur l’équilibre réactionnel de
Chromobacterium viscosum. Leurs résultats montrent clairement que le profil des produits
dépend du solvant employé. En effet pour des solvants de faible Log(P) (solvants polaires),
les produits polaires, tels que les monoglycérides, sont mieux solvatés. Les produits apolaires
tels que les triglycérides sont, eux, mieux solvatés par les solvants non-polaires de haute
fractions molaires de triesters dans les solvants polaires (Log(P)<1). L’addition de solvants de
Ces travaux rejoignent les observations de Bellot et coll., 2001[261] qui arrivent à contrôler la
173
I – Etat de l’art
(le n-hexane). Les auteurs en concluent que le produit de réaction qui a le plus d’affinité avec
le solvant, ou système de solvants, utilisé est favorisé. De même, Castillo et coll, 2003[262]
obtiennent des degrés différents d’estérification du xylitol par l’acide oléique, selon la nature
du solvant utilisé. En effet, ils observent 94% mol de di- et triesters contre 6% de monoesters
dans le n-hexane pur, alors que 73% de monoesters sont synthétisés dans un mélange de 2-
méthyl-2-butanol/diméthylsulfoxyde 80/20.
établissent que l’addition de solvants organiques permet d’augmenter la teneur finale en esters
87,2% (Ether de Pétrole) alors que le diéthyl-éther conduit à une teneur de 70,4% seulement.
De même, Soumanou et Bornscheuer, 2003[256] étudient l’effet des solvants sur la réaction de
pétrole. A l’exception de l’acétone, tous les solvants donnent de hauts rendements avec trois
conversion de 5 à 20% selon l’enzyme. Ils attribuent cela à la capacité de ce solvant polaire
d’altérer la conformation native des enzymes, en perturbant les liaisons hydrogènes et les
interactions hydrophobes, conduisant ainsi à de faible taux d’activité. Cela rejoint les
observations de Deng et coll, 2003[225] ou de Nie et coll, 2006[234] qui déterminent que le
degré d’estérification est diminué en même temps que le Log(P) du solvant employé (Figure
I.6-4).
174
I – Etat de l’art
Figure I.6-4 : Effet des solvants organiques sur les rendements de transestérification[225]. Les solvants listés
La gestion des composés polaires est un challenge important dans les réactions de trans-
estérification. Colombié et coll., 1998[182] montrent que la stabilité d’un réacteur continu est
assurée, si et seulement si le milieu réactionnel est capable d’évacuer l’eau produite lors de la
réaction d’estérification d’acide oléique par l’éthanol. Dans le cas contraire, l’eau produite
s’accumule dans le réacteur du fait de son adsorption sur le support enzymatique, donnant lieu
à des pertes de stabilité. Des phénomènes similaires sont rencontrés dans les réactions de
inférieur à 3)
- D’autres composés polaires pouvant être présents dans les huiles végétales,
175
I – Etat de l’art
équivalents molaires pour obtenir une réaction totale. Shimada et coll, 1999[248] effectuent la
catalysée par le Novozyme 435 à 30°C. Au-delà d’un ratio molaire entre méthanol et
triglycérides de 1,5, l’activité de méthanolyse décroît rapidement jusqu’à une inactivité totale
(Figure I.6-5). Cette inactivation du catalyseur parait même irréversible, des tentatives de
restauration d’activité par transfert de l’enzyme dans des milieux frais contenant moins de 1,5
Les auteurs attribuent cet effet dénaturant du méthanol au fait qu’au-delà du ratio
Figure I.6-5 : Taux de transestérification d’un mélange d’huile de soja et de colza par le méthanol catalysé
par Novozyme 435 : effet inhibiteur du méthanol à ratio molaire méthanol/huile supérieur à 1,5[248].
176
I – Etat de l’art
Dans une moindre mesure, le même phénomène a été observé avec l’éthanol qui, au-delà d’un
ratio molaire de 2, est également dénaturant pour des raisons identiques au méthanol[221, 243,
264]
. Ce phénomène d’inactivation parait dépendant de l’enzyme considérée et de la nature du
phénomène de dénaturation, par le méthanol ou l’éthanol, est plus marqué pour le Lipozyme
Pour s’affranchir de cet effet dénaturant, plusieurs stratégies ont été développées :
Shimada et coll, 1999[248] proposent une réaction de méthanolyse en 3 étapes (Figure I.6-6).
Chaque étape consécutive est réalisée en présence d’un unique équivalent molaire de
96% peuvent ainsi être atteintes. Par ailleurs, cette approche réactionnelle permet de réutiliser
l’enzyme immobilisée dans 50 nouvelles réactions consécutives, effectuées dans les mêmes
Figure I.6-6 : Cinétique de méthanolyse d’huile végétale par Novozyme 435[248]. Conditions initiales : ratio
molaire méthanol/huile, 1/1 ; 1 équivalent molaire de méthanol ajouté après 24h et 48h (indiqué par les flèches).
177
I – Etat de l’art
Cette stratégie de réaction avec apport successif d’alcool a été largement reprise dans les
travaux présentés dans la littérature[211, 218, 220, 232, 237, 239, 247]. Afin d’augmenter le rendement
de conversion, certains auteurs utilisent même des ratios molaires alcool /triglycérides plus
importants (de l’odre de 4 ou 5), tout en augmentant le nombre d’ajouts de fractions d’alcool
au cours de la réaction : 9 apports pour Samukawa et coll, 2000[245] et 10 apports pour Lee et
coll., 2002[211]. Ils obtiennent ainsi des conversions de 97% et de 99% respectivement.
D’autre part, il a été montré que l’inhibition due aux alcools de faible nombre de carbones
peut être contournée en élevant la température de réaction (pour induire une meilleure
solubilisation de l’alcool et/ou en augmentant les quantités d’enzymes). C’est ainsi que
Hernandez et Otero, 2008[243] arrivent à obtenir 97% de conversion en esters à 50°C avec 50%
(m/m d’huile) de Novozyme 435 avec un apport unique de méthanol à un ratio molaire de 3.
Un autre moyen de résoudre les problèmes liés à la miscibilité partielle des alcools est
d’utiliser un support hydrophile. Lee et coll., 2002[211] effectuent un apport de silice dans le
milieu réactionnel pour palier les effets néfastes du méthanol. Celui-ci permet l’adsorption du
L’utilisation d’un solvant polaire peut se révéler être une bonne stratégie pour solubiliser à la
fois triglycérides et alcools. Iso et coll., 2001[221] démontrent que l’utilisation de 1,4-Dioxane
178
I – Etat de l’art
Au contraire, les alcools contenant plus de 2 carbones sont complètement miscibles aux
huiles. L’effet dénaturant montré avec le méthanol et l’éthanol n’est pas rencontré. La
majorité des travaux utilisant des alcools de plus de 2 carbones se fait donc avec un apport
initial unique. Dans ces cas là, l’utilisation de solvants n’est pas une nécessité[59, 196, 221-222, 215-
217]
.
D’une manière générale, si les solvants apolaires (hexane, éther de pétrole etc …) permettent
lanuginosa est recyclée 10 fois, dans des réactions contenant du n-hexane et de l’éther de
pétrole respectivement. Nie et coll 2006[234], obtiennent une chute de 30% de l’activité de la
Cette instabilité catalytique est particulièrement bien illustrée par les travaux de Dossat et
coll, 1999[257] qui étudient la transestérification de l’huile de tournesol oléique par le butanol,
en présence de n-hexane en réacteur continu de Lipozyme RM IM. Les auteurs obtiennent une
décroissance très rapide de l’activité de la lipase jusqu’à une inactivation quasi totale. L’agent
responsable de cette instabilité a été identifié comme étant le glycérol, produit de la réaction,
adsorbé sur le support enzymatique. Dossat et coll, 1999[257] supposent que ce glycérol crée
une barrière hydrophile autour de la lipase entraînant des limitations dans le transfert des
substrats hydrophobes (triglycérides) vers l’enzyme. Les auteurs remarquent d’ailleurs que ce
glycérol peut être désorbé par lavage du catalyseur avec un solvant susceptible de le
solubiliser: eau, solvant polaire tel que le 2-méthyl-2-butanol. L’activité de la lipase est ainsi
179
I – Etat de l’art
Chen et Wu, 2003[244] utilisent le tert-butanol pour restaurer 75% de l’activité initiale de
Novozyme 435, après inactivation par le glycérol. Dizge et coll, 2008[220] arrivent à maintenir
s’imposent comme des solvants incontournables dans la synthèse d’esters d’acides gras à
partir d’huiles végétales. Ces solvants sont susceptibles de solubiliser à la fois triglycérides,
permet ainsi :
- d’éliminer l’effet d’inactivation causé par les alcools à miscibilité partielle dans les
huiles à ratios molaires élevés (voir section I.6.3.4.1) Il est ainsi possible d’augmenter
les ratios molaires entre alcool et triglycérides, pour améliorer les rendements sans
acceptables[226].
baisse d’activité après 200 réactions de transestérification de l’huile de colza catalysée par un
transestérification continue de l’huile de coton par le Novozyme 435 avec un ratio molaire
méthanol/huile de 6. La réaction est maintenue pendant 500 heures sans observer de perte
180
I – Etat de l’art
avec un ratio méthanol/huile de 3,6. Le mélange enzymatique est stable avec un rendement de
~97% pendant 150 réactions consécutives sans perte notable d’activité. Zheng et coll,
Le coût de la production d’esters d’acides gras est intimement lié au cours de la matière
première. Afin d’en réduire l’incidence, l’utilisation de sources d’huiles n’ayant pas subi de
processus de raffinage a été testée. La principale différence entre huile brute et huile raffinée
est la présence de molécules mineures non éliminées par le processus de raffinage. Il s’agit
Rhyzopus oryzae[266].
de trois formes d’huile de soja dans un milieu sans solvant : brute, dégommée et raffinée. Si
un haut degré de conversion et une activité équivalente de Novozyme 435 sont observées
lorsque l’huile est dégommée ou raffinée, une conversion trois fois inférieure est obtenue avec
une huile de soja brute. Par ailleurs, la transformation de cette forme d’huile s’accompagne
d’une instabilité de l’enzyme dans des réactions répétées. Les auteurs identifient cette baisse
d’activité et cette instabilité comme étant dues à la présence de phospholipides dans l’huile de
soja brute, capables de s’adsorber sur le catalyseur. Effectivement, ils déterminent que dès
181
I – Etat de l’art
une concentration de 0,2% de phospholipides dans l’huile, l’activité de la lipase est affectée et
peut même être totalement perdue à des concentrations supérieures. Néanmoins, l’effet
d’inactivation semble être lié à la forme des phospholipides, ces derniers ayant des pouvoirs
L’effet inhibiteur des phospholipides des huiles vierges est également constaté par Talukder et
palme brute et d’huile de soja brute par Novozyme 435. Ils obtiennent des taux d’activité
moindres avec des huiles brutes par rapport à des huiles raffinées. A l’inverse, Li et coll.,
cellule entière et une absence de perte de stabilité du catalyseur comme l’ont pu observer
lipase.
Talukder et coll, 2009[239] déterminent par ailleurs que les carotènes potentiellement présents
dans les huiles brutes ne sont pas susceptibles d’entraîner d’effets néfastes sur la réaction de
transestérification. Du et coll., 2004[265] estiment que la teneur élevée en acides gras libres
dans les huiles vierges n’a pas d’incidence sur la réaction de transestérification.
I.6.5 Autres stratégies de production enzymatique d’esters d’acides gras à partir des
huiles.
Afin de s’affranchir des problématiques de dénaturation des lipases par les alcools à faible
182
I – Etat de l’art
Figure I.6-7: Interestérification entre triglycérides et acétate de méthyle pour la production d’esters
En effet, il a été prouvé que les acétates d’alkyle (acétate de méthyle, acétate d’éthyle etc…)
présentent une miscibilité complète avec les triglycérides des huiles, et ne sont donc pas
susceptibles d’être à l’origine d’effets néfastes pour les lipases. Ils sont donc utilisables sans
apport extérieur de solvant. Par ailleurs, l’interestérification des triglycérides avec des acétates
d’alcoolyse. Cette forme tri-acétylée du glycérol n’est pas à même de s’adsorber sur les
forme libre. Cela permet donc d’assurer la pérennité du catalyseur. Par ailleurs, cela
représente une forme de valorisation du glycérol produit qui trouve ainsi des applications dans
méthyle catalysée par le Novozyme 435. Ils obtiennent une conversion de 92% en 10h à 40°C
pour un ratio molaire optimal acétate de méthyle/triglycérides de 12. Les auteurs n’observent
pas de perte d’activité de la lipase après une série de 10 réactions successives. Du et coll.,
2004[265] utilisent les mêmes conditions que les auteurs précédents et n’obtiennent pas de
perte significative d’activité après 100 cycles réactionnels. A des ratios élevés (au delà de 16),
183
I – Etat de l’art
une baisse des rendements peut être attribuée à une dilution excessive de l’huile dans le
milieu.
Modi et coll., 2006[270] utilisent l’acétate d’éthyle à un ratio molaire de 11 pour interestérifier
les huiles brutes de jatropha, karanja et tournesol. Dans les conditions optimales, ils
435. L’étude de la stabilité des lipases montre que l’utilisation de l’acétate de méthyle permet
une augmentation du temps de demi-vie de la lipase d’un facteur 20 par rapport au méthanol
sans solvant.
des diméthyl ou diéthyl carbonates a été décrite récemment[27341, 274]. L’avantage de la réaction
est qu’elle est irréversible car le co-produit (le mono-méthyl ou mono-éthyl ester de l’acide
et en CO2 (Figure I.6-8). Cela permet ainsi de déplacer les équilibres réactionnels et
184
I – Etat de l’art
Figure I.6-8: Transestérification de triglycérides par les dialkyl carbonate. (A) diméthyl-carbonate. (B)
diéthyl-carbonate.
réaction de transestérification avec un rendement approchant les 96% pour un ratio molaire de
4,5. Cependant, les auteurs observent une faible stabilité de l’enzyme au cours de réactions
cycles. Cette inactivation peut être limitée à une diminution de 20% seulement en cas de
lavage de l’enzyme par l’acétone, l’inactivation étant certainement liée à des phénomènes
Klaas et Warwel, 2001[275] et Su et coll., 2009[273] proposent de lier extraction par solvant et
transestérification, par les dialkyl-carbonates en une seule et même étape. Les deux travaux
aboutissent à des taux d’extraction similaires aux méthodes classiques d’extraction et des taux
185
I – Etat de l’art
La synthèse d’esters d’acides gras par voie enzymatique s’adresse en grande partie à des
domaines dont la valeur ajoutée est faible. Le prix souvent prohibitif des lipases
procédés mettant en jeu ces enzymes. Cela implique donc une optimisation de l’utilisation des
lipases et donc leur utilisation dans une optique continue dans le but de réduire l’impact de
leur coût sur le produit final. La Table I.6-2 (page 166) montre que la grande partie des
travaux présentés dans la littérature évoque des réactions de type discontinu. Des travaux
mettant en œuvre des lipases dans des systèmes de transestérification continue d’huiles sont
Cependant de grands niveaux de stabilité des lipases dans les réactions de transestérification
sont démontrés, dans des répétitions consécutives de réaction avec recyclage de l’enzyme [212,
224, 246-248, 250]
. Cette stabilité démontre la compatibilité des lipases avec une utilisation
continue.
Rao et coll., 2009[276] rappellent le principe des deux réacteurs types utilisés en tant que
- Le Réacteur Continu Agité (RCA) :: dans un RCA, la concentration est identique dans
RCA travaille dans les conditions de sortie, à savoir faibles concentrations en substrats
résidence.
- Le Réacteur à Lit Fixe (Plug Flow ou Packed bed reactor) : le RLF est un réacteur à
écoulement piston, constitué d’une colonne thermostatée ou non, dans laquelle est
186
I – Etat de l’art
varient tout au long du réacteur (en fonction de leur transformation), permettant des
vitesses réactionnelles plus élevées. Le ratio enzyme/susbtrat est maintenu élevé et les
Chen et Wu, 2003[244] testent l’activité de la lipase B de Candida antarctica dans un réacteur
continu agité de méthanolyse d’huile de soja sans solvant (Volume 5L, 250g de lipase
immobilisée). Le réacteur est alimenté par un mélange d’huile et de méthanol dans un rapport
molaire de 3, à un débit de 20ml/min. Les auteurs observent des chutes d’activité dans le
temps qui sont corrigées lorsque le taux de conversion diminue en deçà de 70%, par lavage du
catalyseur avec du tert-butanol. Une activité constante donnant lieu à une conversion
187
I – Etat de l’art
oléique avec le butanol dans le n-hexane à l’aide d’un réacteur à lit fixe unique de Lipozyme
RM IM. Les auteurs observent une chute très rapide des capacités de catalyse du réacteur due
semi-continu mettant en jeu une phase de transformation et une phase de rinçage avec un
réacteur a ainsi été alimenté par intermittence grâce à une électrovanne, avec un mélange
conversion de 80% est ainsi maintenue pendant 48h. L’intérêt connexe du système est
d’obtenir deux mélanges séparés, l’un contenant les esters produits et l’autre le glycérol
formé.
dernier prend en compte à la fois les effets néfastes du méthanol substrat et ceux du glycérol
produit. En effet, ils proposent de mettre en œuvre trois RLF en série (Figure I.6-10)
contenant chacun 3g, 3g et 4,5g de Novozyme 435. Un mélange d’huile et de 1/3 équivalent
L’éluat est réceptionné dans un bac de décantation permettant de retirer le glycérol formé au
sein du premier réacteur. La phase huile exempte de glycérol est additionnée de 1/3 équivalent
manière avec l’éluat du second réacteur. Un débit de 6ml/h est appliqué au système. Les
auteurs ont testé les capacités du procédé à 30°C pendant 100 jours sans perte d’activité de la
lipase. Ils obtiennent ainsi un mélange contenant près de 90% d’esters méthyliques. Ce
procédé a été repris pour la transestérification d’huile de soja et de colza par le Novozyme
435 par Watanabe et coll, 2000. Les auteurs ont tenté de réduire la série de RLF à 2 unités,
188
I – Etat de l’art
avec un apport de 2/3 équivalents de méthanol dans le 2nd réacteur, mais une faible stabilité
Figure I.6-10 : Procédé continu de production de biodiesel avec trois réacteurs à lit fixe en série[277]. 1 : Bac
d’alimentation du 1er réacteur (huile + 1/3 équivalent de méthanol) ; 2 : Bac d’alimentation du 2ème réacteur
(phase huile de l’éluat du 1er réacteur + 1/3 équivalent de méthanol) ; 3 : Bac d’alimentation du 3ème réacteur
(phase huile de l’éluat du 2nd réacteur + 1/3 équivalent de méthanol) ; 4 : Réacteur à lit fixe contenant 3g de
Novozyme 435 ; 5 : Réacteur à lit fixe contenant 4,5g de Novozyme 435 ; 6 : pompe péristaltique ; 7 : bac
d’huile de salade avec le méthanol. Chaque étape est réalisée à l’aide de trois RLF consécutif
contenant chacun 500g de lipase de Candida sp 99-125 immobilisée sur membrane de coton.
En fin de chaque étape, le glycérol formé est extrait du mélange d’ester et de glycérides à
Watanabe et coll., 2001[232] mettent en place un réacteur à lit fixe avec re-circulation. Un quart
des produits est soutiré en sortie de réacteur et trois quarts des produits sont recyclés en
189
I – Etat de l’art
entrée. Le mélange d’alimentation est enrichi avec un mélange huile/méthanol préparé dans
une proportion molaire équivalente. Aucun phénomène d’inhibition n’est observé du fait de la
pendant 100 jours sans perte significative d’activité et un taux de conversion en sortie de
butanol, catalysée dans un RLF unique sans entreprendre de re-circulation par le Lipozyme
RM IM, lipase sn1,3-spécifique. Les auteurs observent une période transitoire initiale de 6h
pendant laquelle les produits majoritaires sont des esters butyliques et du glycérol. Ce dernier
stoppée. Il est alors évacué du réacteur sous forme de glycérides. Un mélange contenant 65%
triglycérides résiduels est produit. L’activité du réacteur a néanmoins été conservée dans ces
Royon et coll., 2007[226] mettent en œuvre les potentialités du tert-butanol en tant que solvant,
dans un procédé continu de transestérification d’huile de coton par Novozyme 435. En effet,
ils utilisent un réacteur à lit fixe unique, contenant un mélange de lipase et de billes de verre
(1/1,5 m/m), alimenté par un mélange d’huile et de méthanol, avec un ratio molaire entre les
deux composants de 6 et solubilisé par 32% de tert-butanol. Les auteurs observent ainsi un
réacteur totalement stable pendant plus de 500h avec un taux de conversion de 95%.
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I – Etat de l’art
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II :PUBLICATION N°1 : Production continue d ’esters d ’acides gras à partir d’huile de tournesol hautement oléique cataly sée par les lipases
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
LES LIPASES.
Etienne Séveraca, Olivier Galya, Fabrice Turonb, Pierre Monsana and Alain Martya*.
a
1) Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077
Toulouse, France
2) INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse,
France
Procédés, Institut National des Sciences Appliquées, 135 Avenue de Rangueil, 31077
Toulouse Cedex4, France, Tel : +33 (0)5 61 55 94 39, Fax : +33 (0)5 61 55 94 00, Email :
Titre Abbrégé : Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu
215
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
II.1 Résumé
La mise en œuvre des lipases immobilisées nécessite leur optimisation dans des réacteurs de
type continu, afin d’en réduire l’impact économique sur le produit fini. Ainsi, il convient de
développer des réacteurs continus à lit fixe, extrêmement stables dans le temps, permettant
des taux de conversion importants et hautement productifs. Les huiles brutes ont la
stérols, tocophérols etc…), leur procurant des qualités de stabilité oxydative hors normes.
phospholipides, au même titre que le glycérol produit en cours de réaction, sont des molécules
polaires, qui, placées dans un milieu réactionnel apolaire défavorable, sont susceptibles de
biocatalyseur, et les transferts des triacylglycérols substrats vers l’enzyme ou des esters
produits de la lipase vers le milieu réactionnel sont limités. En réacteur continu, cela se traduit
par une accumulation des composés polaires dans le réacteur, pouvant entrainer la perte totale
etc..) permettent de solubiliser à la fois les composés polaires et les composés apolaires et
IM, Lipozyme TL IM et Lipase PS Amano IM) ont été testées en réacteur discontinu, sur des
216
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
deux lipases régio-spécifiques des positions sn1 et sn3 des triglycérides, présentent des
d’esters butyliques modestes ; leur régiospécificité ne leur permet pas (ou difficilement) de
s’accumulent dans le milieu, du fait d’une faible migration d’acyle observée dans les
conditions définies.
les positions des esters d’acides gras sur le squelette de glycérol. Ainsi, même si elle n’est pas
la lipase montrant les vitesses de réaction les plus importantes, elle permet une optimisation
pour le développement d’un réacteur à lit fixe, catalysant la réaction de butanolyse de l’huile
de tournesol hautement oléique non raffinée. Un ratio molaire entre butanol et triacylglycérols
de 5 s’est avéré être le meilleur compromis afin de réduire au maximum les taux de TAG, de
enzymatique. L’effet de la polarité du milieu sur les performances du réacteur a été démontré
d’éliminer les effets néfastes des phospholipides de l’huile sur la lipase en milieu sans
solvant. En contre partie, la faible polarité du milieu favorise une production résiduelle de
MAG dans le produit final malgré un fort excès d’alcool co-substrat (rendement en MAG
résiduels de 10,4%). Ces derniers ne sont plus produits dans des milieux plus hydrophobes
(milieu sans solvant) qui favorisent donc la production d’esters (rendement de production
d’esters de 99,6%).
217
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
jusqu’à une concentration initiale en huile de 450mM. Au-delà de cette concentration, le débit
à l’équilibre diminue de manière constante, jusqu’aux conditions de milieu sans solvant pour
Ainsi, une haute productivité s’accompagne de la présence de MAG résiduels dans une
proportion non négligeable et, inversement, une grande pureté en esters est synonyme d’une
constitue le meilleur compromis entre pureté d’esters (teneur résiduelle en MAG de 3,75 %
mol) et productivité.
Dans ces conditions, les phénomènes de partage des PLs et du glycérol entre le milieu
réactionnel et le support enzymatique sont contrôlés. Aucune perte de stabilité n’a été
observée sur une période de 50 jours de fonctionnement continu du réacteur. Une productivité
de 13,8 tonnes par an et par kg de Novozyme 435 est obtenue. Le coût ajouté par l’enzyme
Mots clés : Novozyme 435, transestérification, réacteur à lit fixe, esters d’acides gras, huiles
218
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
Etienne Séveraca, Olivier Galya, Fabrice Turonb, Pierre Monsana and Alain Martya*.
a
1) Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077
Toulouse, France
2) INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse,
France
Procédés, Institut National des Sciences Appliquées, 135 Avenue de Rangueil, 31077
Toulouse Cedex4, France, Tel : +33 (0)5 61 55 94 39, Fax : +33 (0)5 61 55 94 00, Email :
Abbreviated Title: Production of fatty acid alkyl esters by lipases in continuous reactor
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II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
II.2 Abstract
The objective was to develop an economically relevant enzymatic process of butyl ester
production using high oleic sunflower oil. A stable continuous reactor fed with crude oil was
optimized, even if phospholipids were described as detrimental for lipase activity. Novozyme
435 provided the best compromise between activity and butyl-ester yield. The polarity of the
medium was a key factor to insure the stability of the process. It enables the negative effects
optimization, a product containing 96.5 mol % butyl esters with a high productivity of 13.8
tons.year-1.kg Novozyme 435-1 was obtained over 50 days. A versatile continuous process for
ester production was thus optimized leading to great performances and low cost of enzyme
use. Moreover, the possibility to use crude oil would confer to the product high resistance to
Key words: Novozyme 435, transesterification, packed bed reactor, fatty acid alkyl esters,
220
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
II.3 Introduction
Faced with the shortage of reserve fossil resources and the climate disorder due to the
origin is urgent. The upgrading of plant oils through the production of fatty acid alkyl esters
(FAAE) is thus a subject of great interest in many industries (Schörken and Kempers 2009).
With various physico-chemical properties, which depend on both the nature of the feedstock
(fatty acids) and the alkyl moiety, fatty acid alkyl esters are involved in a wide range of
drilling fluids and cosmetics (Dossat et al. 2002; Knothe et al. 2005; Medina Gonzalez et al.
2007).
Among the natural fatty acids (FA) entering in the composition of oil triacylglycerols (TAG),
oleic acid has a prime position. With its unique double bond, it presents relevant industrial
properties such as good fluidity at low temperature, unlike saturated FA and good oxidative
stability unlike poly-unsaturated FA. Oleic acid is the main FA of high-oleic sunflower oils
(HOSO) reaching 75% and up to 90% of the total FA (Warner et al. 2003). Crude oils are
obtained directly after oilseed crushing and/or extraction without further purification. In
addition to triglycerides, crude oils contain several minor components like phospholipids (up
to 2% in sunflower oil), tocopherols (450 to 1200 mg/kg in sunflower oil, with a majority of
α-tocopherols) and sterols (2400 to 5000 mg/kg in sunflower oil) (Warner et al. 2003). These
minor components of oil are recognized as antioxidants (Jain and Sharma 2010). The direct
transesterification of crude HOSO would present the advantage of reducing costs due to
refining and mainly to preserve the natural antioxidant power of the resulting esters.
The transesterification of TAG with an alcohol produces 3 equivalents of ester molecules and
1 equivalent of glycerol through three successive reactions, with diacylglycerols (DAG) and
221
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
chemical approaches give high substrate conversion with high reaction rates, they do have
some disadvantages. This chemical synthesis route often presents poor reaction selectivity
leading to the synthesis of by-products (for instance if a mixture of esters and monoglycerides
is the target). The chemical processes often consume large amounts of energy. The recovery
of glycerol is often difficult and generates large amounts of alkaline waste water that has to be
treated (Parawira 2009; Szczesna Antczak et al. 2009). In the last few years, the research of
alternative routes for alkyl ester production has demonstrated the ability of lipases to catalyze
The efficiency and high operational stability of lipases (formally called, triacylglycerol
demonstrating the possibility to recycle the enzyme with the use of an organic solvent (Du et
al. 2007; Talukder et al. 2009) or in solvent-free systems (Shimada et al. 1999; Watanabe et
al. 2000). Plug flow reactors have been successfully developed (Watanabe et al. 2001; Dossat
et al. 2002; Shimada et al. 2002). In spite of the enormous possibilities and the great interest
in enzymatic catalysis, industrial alkyl ester production involving lipases is still very limited.
The main drawback of enzyme-catalyzed processes is the high cost of the lipases. To decrease
the operational costs of the biocatalyst, the process must be optimized using an immobilized
enzyme in a stable and highly productive continuous reactor. Ideally the reactor has to ensure
steady-state production with a high conversion yield for months at a time without changing
the enzyme. A packed-bed reactor (PBR) generally leads to higher performance than a
continuous stirred-tank reactor. In addition, the volumes are reduced, the technology is less
expensive (no mobile parts) and enzyme support attrition is avoided (Balcão et al. 1996; Rao
et al. 2009).
222
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
To insure the stability of a continuous packed-bed reactor for synthesis of FAAE, the crucial
point is the control of the partition of polar compounds between the reaction medium and the
supported enzyme (Marty et al. 1997; Colombie et al. 1998). For instance, glycerol creates a
substrates from the liquid phase to the enzyme which reduces the enzyme activity (Dossat et
al. 1999). To avoid this phenomenon, the reaction medium has to be able to rid the reactor of
the glycerol formed. Polar solvents like tert-butanol or 2-methyl-2-butanol have the ability to
dissolve both polar and non-polar compounds. Several works have demonstrated that these
solvents can eliminate the detrimental side-effects of glycerol production (Du et al. 2007;
Another way to reduce costs is to develop a continuous enzymatic process fed with crude oil.
However, the few trials in this sense led to a rapid inactivation of the lipase. During solvent-
free transesterification of crude soyabean oil (Watanabe et al. 2002; Du et al. 2004) and crude
palm oil (Talukder et al. 2009), phospholipids (PLs) were suspected of being at the origin of
the low yields and of the low operational stability of the catalyst during repeated batch
reactions. Watanabe et al (2002) was the first to report that the adsorption of PLs onto the
enzymatic support led to this loss in activity. Nevertheless, one can assume that glycerol and
PL adsorption must depend both on the solvent and the support polarity, and consequently, it
In this work, our objective was to develop an efficient enzymatic continuous reactor using
crude high oleic sunflower oil to produce fatty acid butyl-esters containing a majority of
butyl-oleate, presenting principally lubricant properties. The strategy was to select the best
commercial immobilized enzyme from the point of view of activity, selectivity and
conversion, and to manage the polarity of the solvent and of the support in order to insure a
223
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
stable continuous synthesis by avoiding both glycerol and phospholipid negative effect on the
enzyme.
Use of crude oils will decrease the price of the raw material. Development of a stable
continuous reactor would decrease the cost of the enzyme by producing tons of esters per kg
of enzyme. Finally, the higher resistance to oxidation of the final product will be greatly
appreciated by the market. It will thus be possible to obtain an economically relevant process
II.4.1 Materials
Four commercial immobilized lipases were obtained form different sources. Their
Table II.4-1Characteristics of the immobilized lipase tested for transesterification of high-oleic sunflower
oil.
High oleic sunflower oil was supplied by Syngenta Seeds (Toulouse, France) and contained
85.7% oleic acid, 5.1% linoleic acid, 3.6% stearic acid, and 3.5% palmitic acid and 2.1% of
minor fatty acids; the main triglyceride present in the oil was triolein. The average molecular
224
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
weight for HOSO was calculated at 881 g.mol-1. 99% trioleoyl-glycerol, 99% sn1,3 dioleoyl-
glycerol, 99% sn1(3) monooleoyl-glycerol and 3Å molecular sieve were purchased from
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). All other chemicals and solvents were of highest
Reactions were performed in glass tubes. The reaction involved using the correct amount of
crude or refined oil and butanol to fit the desired molar ratio in the presence or absence of
tert-butanol. The reaction mixture, previously dried with molecular sieve, was incubated at
40°C for catalysis by Lipozyme RM IM®, Lipozyme TL IM® and Lipase PS amino IM and
60°C with Novozyme 435®. Reactions were kept under magnetic stirring (250 rpm) and were
determined, in each case, by withdrawing samples from the medium. The sample was diluted
in acetone and concentrations of all the products and reactants were determined by HPLC.
The reactor was a fixed-bed type. It consisted of a column (10 mm diameter), maintained at
60°C and containing 10 g Novozyme 435 (bed length: 11 cm). The reaction medium
containing crude HOSO (concentration from 200 mM to 650 mM) and butanol (molar
alcohol/oil ratio from 3 to 7) in tert-butanol, previously dried with molecular sieve, was
pumped using an ISO-3100SD Isocratic Pump (Dionex, USA) percolating the packed bed of
enzyme. Solvent free medium, only containing the two substrates (molar ratio: 5), was treated
by the same system. At the outlet of the reaction vessel, samples were collected and analyzed.
225
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
The product and residual reactant concentrations were analyzed using a Dionex Ultimate 3000
HPLC equipped with a 380-LC Evaporative Light Scattering Detector, (Varian, USA) and a
reverse-phase analytical Prontosyl C30 column (ICS, France) (250 mm × 4 mm × 5 µm). The
nebulisation and evaporation temperatures were kept at 35°C and 40°C respectively. The
A 40-min ternary gradient with two linear gradient steps was employed: reservoir A contained
(5:4, v/v). Gradients were as follows: 30% A+70% B in 0 min, 100% B in 15min, 50%
B+50% C in 30 min, followed by isocratic elution with 50% B+50% C for the last 10min. The
flow rate was 1ml.min-1 and oven temperature set at 40°C. Elution order was:
monoacylglycerols, free fatty acids, butyl esters, diacylglycerols and triacylglycerols. The
TAG conversion and, DAG, MAG and ester yields were calculated according to equations II-
1 to II-4 respectively where [Esters]t is the Ester concentration at time t, [MAG]t is the MAG
concentration at time t, [DAG]t is the DAG concentration at time t and [TAG]t is the TAG
226
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
X TAG = 1 −
[TAG ]t (Eq. II-1)
[TAG ]0
X DAG =
[DAG]t (Eq. II-2)
[TAG]0
X MAG =
[MAG ]t (Eq. II-3)
[TAG ]0
X ester =
[Ester ]t (Eq. II-4)
3x[TAG ]0
The main objective of this work was to optimize an efficient continuous enzymatic packed
bed reactor (PBR) for the transesterification of crude high oleic sunflower oil (HOSO) with
enzymes commercially available on a large scale. The choice of the reaction medium is
selectivity, solubility of substrates and products and consequently the stability of the reactor.
Ideally, a solvent-free process should be used. However, in many cases, the presence of a
solvent is essential, to ensure catalysis (Iso et al. 2001), to control the partition of polar
compounds between the medium and the immobilized lipase (Halling 1990) and to orientate
In the present study, we proposed to explore both these options. The solvent we chose was
tert-butanol, a solvent of medium polarity, able to solubilize both glycerol and other polar
227
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
compounds (phospholipids, etc.) as well as apolar compounds (TAG, DAG, MAG and esters).
The choice of tert-butanol was motivated by its ability to preserve the activity of Novozyme
435 and to improve its stability (Du et al. 2007). 2-methyl-2-butanol was also tested and gave
similar results (data not shown) but tert-butanol presents additional advantages such as
relatively low cost and a low boiling point facilitating its evaporation and recovery during
down-stream processes.
Four commercial immobilized lipases, namely Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM, Lipase
PS Amano IM and Novozyme 435, were screened to select the one offering the best
triglyceride molar ratio of 4 was applied to shift the thermodynamic equilibrium towards ester
synthesis. In order to assess the effect of tert-butanol, initial TAG concentrations of 200 mM
in tert-butanol were used. In this condition, the proportion of the solvent represents 73% of
the reaction volume. For solvent-free systems, concentrations of 748 mM were obtained for a
molar ratio between substrates of 4. Working temperatures for each enzyme were optimized,
i.e. 60°C for Novozyme 435 and 40°C for the three other lipases. In order to observe the real
behavior of the lipases, refined HOSO was used as substrate in batch reactions to avoid
interference from minor components. The progression of TAG conversion and product yields
(DAG, MAG and esters) versus time are presented in Figure II.5-1 for medium containing
228
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
Figure II.5-1 Kinetics of transesterification of refined high-oleic sunflower oil with butanol in tert-butanol
catalyzed by Novozyme 435 (A) at 60°C, Lipozyme RM IM (B), Lipozyme TL IM (C) and Lipase PS
Amano IM (D) at 40°C. Symbols represent the conversion yields of TAG (◊), and DAG (□) MAG (∆) and
esters (●). Initial conditions: 200 mM refined oil, 800 mM butanol in tert-butanol as solvent, 20 mg
229
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
Figure II.5-2 : Kinetics of transesterification of refined high oleic sunflower oil with butanol in solvent free
medium catalyzed by Novozyme 435 (A) at 60°C, Lipozyme RM IM (B), Lipozyme TL IM (C) and Lipase
PS Amano IM (D) at 40°C. Symbols represent the conversion of TAG (◊) and DAG (□) MAG (∆) and
esters (●) yields. Initial conditions: 748 mM refined oil, 2930 mM butanol, 20 mg Novozyme 435, and
In both media, Lipozyme RM IM presented the lowest performance. The reaction rate of
230
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
The behaviours of Lipozyme TL IM and lipase PS Amano IM were similar. After 48 hours in
tert-butanol and after 10 hours in the solvent-free medium, it can be considered that reactant
concentrations were stable. These two enzymes presented a remarkable TAG consumption
activity with almost total conversion (99%) obtained after only 10 hours.
In both media, DAGs were rapidly produced in the first 2 hours of reaction to reach a
maximum and were re-consumed before equilibrium was reached (30 to 33% in solvent-free
medium and 17% in tert-butanol). MAG yields reached a maximum of 30-33% after 60 hours
in tert-butanol medium and ~43% after 10 hours in solvent-free medium. They were slowly
re-consumed in the solvent-free system. Butyl esters were more efficiently produced with
tert-butanol: a final yield of 79% was reached and only 63% in solvent-free conditions.
The DAGs and MAGs produced belonged to the sn1,2 and sn2 series. The high proportion of
these co-products is assumed to result from the stereospecificity of the two lipases. Indeed,
they were previously reported as sn1,3 regiospecific, as was the lipase from R. miehei,
equilibrium (Compton et al. 2007; Laszlo et al. 2008). It has been demonstrated that acid and
base impurities and enzymatic support carrying charges catalyze acyl-migration (Fureby et al.
alcohols. In our work, the sn2-MAG produced are not converted by this mechanism,
suggesting that the reaction media and enzymatic supports do not offer ideal conditions for
acyl migration (dry medium, non-water-miscible alcohols). Compton et al. (2007) and Lazslo
231
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
et al. (2008) demonstrated that at 40°C and in the absence of catalyzing agent, the acyl-
migration is relatively slow: only 20% conversion of sn2-MAG into sn1(3)-MAG and
sn1(3),2-DAG into sn1,3-DAG were reached in ~120 hours and ~200 hours respectively.
Acyl migration was accelerated at 60°C, and 20% conversion was attained in 24 hours for
The complete transesterification of HOSO into glycerol and esters catalyzed by Lipozyme TL
IM and Lipase PS amino IM at 40°C is highly limited by the sn1,3 regiospecificity of these
enzymes and by the slow migration rate of sn2-MAG and sn1,2-MAG at the considered
reaction temperature.
Novozyme 435 provided lower activity towards TAGs than the two previous lipases. 95%
conversion was only attained after 48h in solvent-free conditions, and in 58h with tert-
butanol. Novozyme 435, a non-regiospecific lipase, was able to catalyse the transesterification
of fatty acid both on sn1(3) and sn2 glycerol positions (Hernandez-Martin and Otero 2008).
Indeed, Novozyme 435 was, among the four lipases tested, the lipase which gave the highest
yield of butyl esters (around 87% in both media), minimizing DAG production (8% and 4%
for tert-butanol and solvent-free systems respectively) and MAG production 20% and 0% for
The analysis of the final reaction medium showed that MAGs were mainly produced in the
form of sn1-MAGs. This is thought to be the result of both the enzyme specificity and of acyl-
migration which is accelerated at 60°C and possibly enhanced by the enzyme support
(Lewatit VP OC).
232
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
An extra advantage of Novozyme 435 arises from the fact that it is immobilized on a support
that is medium hydrophobic compared to the hydrophilic ones used for the other lipases
(table1). It could limit adsorption of polar compounds present in the medium (glycerol, PLs)
in continuous transesterification conditions. Thus, this enzyme was selected for the following
experiments.
At this stage, the solvent-free system presents great advantages in terms of conversion and
selectivity. Moreover, it respects the principles of green chemistry (Anastas and Warner
1998). However, tert-butanol was not discarded to evaluate its role in phospholipid and
glycerol tolerance during the comparison between crude and refined oils.
Figure II.5-3 compares the yields of butyl ester production during butanolysis of crude and
conditions, the rate of butyl ester production was 2.3-fold lower with crude oil than with
refined oil as substrate: the initial rate of butyl ester synthesis was calculated at 198 µmol.min-
1
.g-1 for refined HOSO and 88 µmol.min-1.g-1 for crude HOSO. As a consequence, equilibrium
was reached in 28 hours for refined HOSO (97% yield) whereas it was not reached after 48
hours for crude HOSO (79% yield). Watanabe et al. (2002) demonstrated that crude soybean
oil did not undergo methanolysis with Novozyme 435 in a solvent-free system, but
degummed oil did. It was identified as the consequence of the presence of phospholipids in
crude oil.
In contrast, in tert-butanol, no difference in activity was obtained whether the HOSO was
refined or crude. The presence of tert-butanol was therefore thought to improve phospholipid
solubility and consequently enable its adsorption onto the biocatalyst to be restricted.
Talukder et al. (2009) obtained a 10% lower activity when crude palm oil was used instead of
233
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
refined oil during methanolysis in tert-butanol. They demonstrated that the higher the
phospholipid content, the lower the activity. The crude HOSO used in this study contained
385 mg/kg (i.e. 0.04 % wt) of PL. At similar levels, Talukder et al. (2009) observed a 5%
decrease in activity. However, they used higher substrate concentrations (500 mM of oil) and
consequently the effect of the medium polarity was less pronounced than in our study.
Figure II.5-3: butyl ester yields obtained during transesterification of refined (◊) and crude (□) high-oleic
sunflower oils for production of fatty acid butyl esters with tert-butanol (empty signs) or without solvent
(filled signs). Reaction conditions: (i) with tert-butanol: 250 mM refined or crude oil, 1000 mM butanol, 50
mg Novozyme 435, and reaction volume: 10 ml; (ii) without solvent: 702 mM refined or crude oil, 3510
Therefore, the use of tert-butanol appears to be a good strategy to eliminate the non-desirable
effects of PL when using crude oils. This would be even more crucial in a continuous PBR
234
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
II.5.3 Effect of the butanol/TAG molar ratio in continuous packed bed reactor.
The ratio between the quantities of alcohol and crude oil is an important factor that has to be
taken into account in a transesterification reaction. It has been demonstrated that the optimal
molar ratio is dependent on the type of lipase and the type of alcohol (Rodrigues et al. 2008).
(Dossat et al. 2002). Nevertheless, these authors obtained high levels of remaining DAG and
MAG, lowering the ester yield. Moreover, they identified butanol as a competitive inhibitor in
the reaction. The butanol/HOSO molar ratio should therefore be adapted to optimize the yield
The reaction medium composition was analyzed in the PBR outflow at the steady state during
tert-butanol. Figure II.5-4 presents the average yields of TAG, DAG, MAG and Esters,
calculated over a period of ten days. Whatever the ratio, no loss of activity was observed
during this period, enabling yields to remain constant. The polarity of the medium enables
Whatever the butanol/TAG molar ratio and the initial concentration, TAG were completely
consumed, with conversion levels of over 99% (data not shown). Nevertheless, the molar ratio
strongly influenced product composition at equilibrium. DAGs and MAGs were poorly
converted when butanol was present in stoichiometric proportions with yields of 15.3% and
64% respectively for an initial TAG concentration of 200 mM. Their consumption became
enhanced when the initial quantity of butanol was increased. Their respective average yield
235
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
fell to 1.9% and to 27.4% for a molar ratio of 4. As a consequence, the butyl ester yield
increased from 64.4% for a molar ratio of 3 to 88.1% for a molar ratio of 4.
Figure II.5-4 : DAG (∆), MAG (◊) and Ester (□) yields measured in the PBR outflow at equilibrium with
increasing butanol / oil ratio. Reaction conditions: (i) empty signs and black line: 200 mM crude high oleic
sunflower oil, 600 mM, 800 mM, 1000 mM butanol in tert-butanol, (ii) filled signs and dotted line: 500
mM crude high-oleic sunflower oil, 2000 mM, 2500 mM and 3500 mM butanol in tert-butanol; PBR
At an initial concentration of 200mM, the use of a molar ratio of 5 did not achieve a decrease
in the MAG yield (27.0%) whereas it was significantly decreased when a concentration of
500 mM was fed into the reactor. Under these conditions the MAG yield reached 12.9%
(initial oil concentration of 500 mM and molar ratio of 5). Consequently, the use of a molar
ratio of 5 enabled an increase in ester production, the yield being increased from 87.6% for a
236
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
Higher proportions of butanol did not greatly decrease MAG production, with a yield of
10.4% at a ratio 7 at an initial concentration of 500 mM. Moreover, the use of higher substrate
ratios would lead to higher inhibition phenomena due to the alcohol, causing losses in
productivity. For these reasons, a butanol/TAG molar ratio of 5 appears to be the best
The quantity of crude oil feeding the reactor determines the global reactor productivity and is
at the origin of the economic relevance of the entire process. However, it has a strong
influence on the polarity of the medium with numerous consequences such as a different
glycerol and PLs between the medium and the supported enzyme.
The effect of the crude oil concentration feeding the reactor was analyzed with a range of
system. The objective was to determine the maximum flow rate which enables
thermodynamic equilibrium to be reached in the continuous plug flow reactor. Above this
equilibrium flow rate, the quantities of residual TAG, DAG and MAG are significantly
increased. The equilibrium flow rate was determined by increasing the flow rate step by step.
The equivalent of five residence times was left between flow rate changes and analysis in
TAG conversion and the DAG yield were found constant, at a value of 0.8% and 0.08%
respectively, whatever the initial TAG concentration in the reactor feed (data not shown). As
presented in Figure II.5-5, the productions of MAG and butyl ester were, on the contrary,
237
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
found highly dependent on the initial TAG concentration. MAGs were produced with a stable
yield of 26% for initial TAG concentrations ranging from 200 mM to 400 mM. Above this
concentration, MAG production fell steadily and they were almost completely transformed
Figure II.5-5 MAG yield (♦ / left axis) and butyl ester yield (■ / right axis) measured in the PBR outflow at
equilibrium flow rate and at steady state versus the initial TAG concentration. Point labels represent the
mixture polarity Log(P). Operational conditions: butanol / crude high-oleic sunflower oil: 5/1 in tert-
As the residual DAGs and TAGs were constant whatever the initial concentrations, the
production of butyl esters was enhanced inversely to the decrease of MAG production. Butyl
ester yields of 91% were obtained for initial concentrations under 400mM. The increase of
238
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
initial TAG concentration parallels an enhancement of butyl ester production to reach 99% for
In brief, it can be argued that the higher the TAG concentration, the greater the purity of the
This shift in thermodynamic equilibrium observed through the conversion of MAG to esters is
thought to arise from the variation of medium polarity when the TAG concentration is
increased. This is in agreement with results obtained by Bellot et al. (2001) who described the
importance of the reaction medium on the equilibrium position: polar molecule synthesis is
LogPmedium, the polarity coefficient of the reaction medium, was computed by means of
equation II-5 (Du et al. 2007); the polarity coefficient of each individual component (LogPi)
was computed using Cosmotherm software (Cosmologic, Germany) (Klamt 2005). The LogP
The presence of MAG is constant up to a LogP coefficient of 2.4. Therefore, the MAGs are
favored in medium containing tert-butanol and presenting a polar character (LogP < 2.4). Up
production of MAGs.
TAG concentration greatly influenced the equilibrium flow rate, as presented in Figure II.5-6.
The equilibrium flow rate increased from 21 ml.h-1 for a TAG concentration of 200 mM to a
maximum of 30.6 ml.h-1 for a concentration of 450 mM. In contrast, up to 450 mM, the
equilibrium flow rate decreased drastically to 1.5 ml.h-1 for an initial TAG concentration of
702 mM. Analysis of these results is not trivial because the initial TAG concentration
influences (i) the quantity of substrate to be converted, (ii) the reaction rate as a function of
239
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
the reaction kinetics equation, (iii) the equilibrium and also (iv) the polarity of the reaction
medium which will influence the kinetic parameters (Sandoval et al. 2001).
Figure II.5-6 : Flow rates (ml.h-1) obtained at equilibrium versus initial TAG concentration (mM).
Operational conditions: butanol / crude high-oleic sunflower oil: 5/1 in tert-butanol as solvent, PBR
From a kinetic point of view, the problem is complex. To have a better insight, we considered
a simple reaction: one substrate gives one product with a reaction rate defined in equation II-
r = kS α (Eq. II-6)
This simple analysis demonstrates that considering a first reaction order, the equilibrium flow
rate does not depend on the initial substrate concentration. Up to this value, flow rate
240
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
decreased with high substrate concentrations while the opposite was observed for values
lower than 1. On the other hand, in general, an increase of polarity leads to a decrease in
enzyme activity.
Figure II.5-7 : Productivity of final mixture (♦) and productivity of purified butyl esters (□) versus initial
TAG concentrations (mM). Operational conditions: butanol / crude high oleic sunflower oil: 5/1 in tert-
The PBR productivity was calculated in terms of weight of final product mixture or in terms
of weight of pure esters (Figure II.5-7). Indeed, several production strategies can be
developed. The first consists in the conservation of the monoglycerides produced in the final
product without additional purification. In this case, MAG can confer lubricant and surfactant
properties to the mixture (Dossat et al. 2002; Knothe and Steidley 2005). The second strategy
consists in the production of pure butyl esters. In this way, a downstream process of ester
241
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
purification (distillation, etc.) can be necessary, representing a significant added cost to the
product.
The shape of the two productivity curves was found similar with an increase of productivity
when the initial TAG concentration was increased from 200 mM to 500 mM. The use of
higher TAG concentrations resulted in a drastic decrease in the production capacity due to the
decrease of the flow rate. As a consequence, a compromise between productivity and ester
purity had to be reached: high productivities correspond to low purity (mixture containing
95.9 mol % of butyl esters) and the highest purity (mixture containing 99.6% mol of butyl
between ester productivity (13.8 tons of product.year-1.kg Novozyme 435-1) and ester purity
(95.9% mol). In these conditions, tert-butanol represents 28% vol. of the reaction medium.
If ester purity higher than 96% is required, one solution could be the use of two plug-flow
reactors, separated by an operation unit for glycerol removal. We tested this strategy and
succeeded to obtain a butyl-ester yield of 98.8% (MAG yield decreased to 1.1%) and
by evaporation of the solvent and of the residual butanol, and by glycerol decantation.
The operational stability of the catalyst in the continuous process was tested in previously
optimized conditions ie. an initial TAG concentration of 500 mM, a butanol/TAG molar ratio
of 5 and a flow rate of 30.6 ml.h-1. After evaporation of solvent and residual butanol and
242
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
Novozyme 435-1. Finally, a glycerol productivity of 1.2 tons.year-1.kg Novozyme 435-1 was
The system was operated over a period of 50 days without any loss in enzyme activity, with
the same average composition in the outflow for the whole period. The results suggest that the
lipase can be stable for longer period of time and considering a life-time of one year, the
added cost due to lipase to the FAEE mixture is about 8 euro cents per kg, considering that
II.6 Conclusions
The use of Novozyme 435 in presence of tert-butanol offers a series of advantages for the
transesterification of crude HOSO: (i) high level of activity and high yields of conversion are
obtained; (ii) the system can be conducted in a continuous process without inhibition or
instability due to the presence of phospholipids in crude oils or due to the production of
glycerol; (iii) the catalyst does not require regeneration and long-term catalysis is possible.
Finally, the use of crude oil containing natural antioxidant will reduce the production price
and would confer to the product improved properties appreciated for end-users.
Acknowledgements
Work was financially supported by Syngenta Seeds SAS and the ‘Association Nationale de la
Recherche et de la Technologie’ (ANRT). The authors would like to thank Peter Winterton of
Toulouse University who helped to correct the English version of the manuscript .
243
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
II.7 References
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245
II - Production d’esters d’acides gras par les lipases en réacteur continu.
246
.
.
III : PUBLICATION N°2 : Transestérification continue des hu iles végétales brutes : une vo ie pou r ameliorer la stabilité oxy dative des esters.
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
DES ESTERS.
Etienne Séveraca, Julien Cescuta, Fabrice Turonb, Pierre Monsana and Alain Martya*.
a
1) Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077
Toulouse, France
2) INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse,
France
Procédés, Institut National des Sciences Appliquées, 135 Avenue de Rangueil, 31077
Toulouse Cedex4, France, Tel : +33 (0)5 61 55 94 39, Fax : +33 (0)5 61 55 94 00, Email :
249
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
III.1 Résumé
L’originalité du procédé optimisé au travers de cet article n°1 réside dans l’utilisation d’huiles
vierges comme matière première. Si cela permet d’éviter un processus de raffinage pouvant
être coûteux (environ 10% de coûts additionnels) et donc diminuer les coûts globaux de
production, le réel bénéfice de cette utilisation est la teneur élevée en composés mineurs des
huiles (stérols, tocophérols, phospholipides, autres composés phénoliques etc…). Ces derniers
confèrent aux huiles brutes des propriétés de stabilité oxydative naturelle accrues par rapport
aux huiles raffinées. Les gains en termes de résistance à l’oxydation dans les esters produits
L’emploi des enzymes, de part leur spécificité de substrats et des conditions douces de mise
en œuvre, permet d’envisager la préservation des composés mineurs dans un produit final
hautement résistant vis à vis du stress oxydatif. Le réacteur enzymatique à lit fixe optimisé
dans le chapitre II (Article n°1) a été utilisé pour effectuer la synthèse d’esters butyliques à
partir d’huiles brutes et raffinées de différentes sources dans le but d’évaluer l’effet du
procédé sur les composés mineurs présents dans ces huiles. Les huiles de tournesol hautement
oléique, de colza et d’olive ont été choisies pour leurs teneurs élevées, respectivement, en
réacteur employé est telle qu’il est susceptible d’accepter des huiles d’origine différente et
donc de compositions en acides gras différents sans différence notable de capacité catalytique.
Un mélange contenant 96% mol d’esters butyliques a été obtenu quelle que soit l’huile
triacylglycérols résiduels.
Le dosage des différents composés antioxydants dans les huiles de départ et les produits de
250
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
cours du procédé biocatalytique. Nous montrons que chacun est préservé, seul un effet de
dilution de l’ordre de 1,2 est obtenu. Cet effet de dilution est lié au processus réactionnel lui-
même. La première conséquence est que ces composés ne s’adsorbent pas sur le support
phospholipides, connus pour leurs propriétés d’antioxydants synergiques, est retrouvé dans les
esters issus d’huile de colza brute alors qu’ils sont absents lorsque l’huile de colza utilisée est
raffinée. La teneur de tocophérols et de stérols mesurée dans les esters issus d’huile de
tournesol hautement oléique vierge sont 10% et 9% supérieurs à la teneur obtenue dans les
esters issus d’huile raffinée. Il en est de même pour les composés phénoliques de l’huile
d’olive vierge qui sont conservés dans les esters alors qu’ils sont perdus lors du procédé de
raffinage.
La résistance aux stress oxydatifs est estimée par la mesure du temps d’induction sous haute
température et sous flux d’oxygène (technique du Rancimat) dans les huiles de départ et les
aux taux d’acides gras poly-insaturés présents dans les huiles et les mélanges d’esters. Les
temps de résistance obtenus avec les huiles vierges sont légèrement supérieurs à ceux obtenus
avec les huiles raffinées. Des temps d’induction des mélanges d’esters très similaires à ceux
obtenus avec les huiles de départ ont été mesurés. Cela montre qu’aucun stress oxydatif
particulier n’est engendré par le processus de transestérification continue ; les esters ainsi
synthétisés conservent les capacités de résistance de leurs huiles mères. Les esters issus
d’huiles vierges, présentant un taux de composés mineurs supérieurs à ceux des huiles
raffinées, développent des résistances à l’oxydation supérieures. Les esters synthétisés par
251
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
voie enzymatique possèdent ainsi des qualités de stabilité supérieures aux normes éditées pour
Mot clés : Novozyme 435, transestérification, réacteur à lit fixe, esters d’acides gras, huiles
252
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
STABILITY OF ESTERS.
Etienne Séveraca, Julien Cescuta, Fabrice Turonb, Pierre Monsana and Alain Martya*.
a
1) Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077
Toulouse, France
2) INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse,
France
Procédés, Institut National des Sciences Appliquées, 135 Avenue de Rangueil, 31077
Toulouse Cedex4, France, Tel : +33 (0)5 61 55 94 39, Fax : +33 (0)5 61 55 94 00, Email :
253
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
III.2 Abstract
Fatty acid alkyl esters are synthesized by transesterification of vegetable oils for various
main drawbacks to the use of fatty acid alkyl esters. One way to improve their resistance to
oxidation is to use an enzymatic approach converting crude oils (instead of refined oils)
containing higher levels of natural antioxidants. A continuous packed bed reactor (PBR) filled
with the lipase Novozyme 435 and using tert-butanol as solvent was able to produce mixtures
containing 96 mol% of butyl esters from crude and refined high-oleic sunflower oils, rapeseed
oils or olive oils with a high productivity of 11 tons of ester mixture produced per year and
per kg of Novozyme 435. Phospholipids as well as sterols, tocopherols and other phenolic
compounds were preserved with this enzymatic approach. These compounds were completely
evacuated from the reactor, avoiding their adsorption onto the biocatalyst. In consequence, the
transesterification at mild temperature did not generate oxidative stress. The esters obtained
from the crude oils presented a significantly higher stability to oxidation (about two times)
compared to esters obtained from refined oils. These fatty acid alkyl esters, which largely
Key words: Novozyme 435, transestérification, packed bed reactor, fatty acid alkyl esters,
254
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
III.3 Introduction.
It is now generally acknowledged that fossil resource reserves are finite. Moreover, the
intensive use of this non-renewable carbon is partly responsible for the global warming
correlated with the emission of greenhouse gases. The development of renewable substitution
resources and alternative methods of production has become a necessity. Fatty acid alkyl
esters (FAAE) present a low toxicity, a high biodegradability and are renewable, thus
reducing the carbon balance[1]. Their physico-chemical properties depend on both the nature
of the feedstock (fatty acids) and on the alkyl ester moiety. FAAE are involved in a wide
The susceptibility to oxidation due to ambient air exposure is one of the major technical
hurdles facing the use of FAAE. Fatty acid chain oxidation, which results in the production of
peroxides and hydroperoxides, harmful for FAAE applications, is a complex process that
extensively in the literature[4, 5]. Since oxidation affects the properties of FAAE, the issue has
ASTM (ASTM = American Society for Testing and Materials) D6751, both using the method
EN 14112 for measurement[2, 6]. Minimum induction times of 6 hours and 3 hours respectively
at 110°C in a Rancimat apparatus are required in the two standards[2, 6]. The oxidative stability
of fatty compounds is highly dependant in the degree of unsaturation of the fatty acids.
Nevertheless, many other factors can influence the oxidation of FAAE[6, 7]. While exposure to
high temperatures, the action of light or extraneous material (metals, etc.) can favour
oxidation, the presence of natural or synthetic antioxidants can prevent oxidation[2, 7, 8].
255
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
Crude vegetable oils, obtained directly by crushing and/or solvent extraction without refining,
exhibit higher oxidative stability than refined oils[9]. This is the consequence of a higher
content in minor components such as tocopherols, sterols or phenolic compounds, which are
physical refinings result in a decrease of tocopherol and sterol levels[10]. The phospholipids
present in crude oils and eliminated during the refining process are reported to have
oxidative stability of FAAE would be to use crude oils instead of refined oils as raw material,
from an economic point of view, avoiding the costly refining process (about 100 €.ton-1;
unpublished data, syngenta intelligence) is attractive, the price of oil sources directly affecting
transesterification leading to high reaction rates and high conversions. Nevertheless, these
chemical approaches have some unavoidable drawbacks[12]. The reaction temperatures are
often elevated and thus, the processes are energy costly[12]. The recovery of glycerol, the
reaction by-product is often unfeasible and a large amount of waste water from catalysts has
to be treated[12]. The presence of relatively high amounts of free fatty acids in the crude oils
can be problematic because alkaline catalysis then forms undesirable soaps[13]. Finally, the
In the last few years, transesterification of triacylglycerols from oils using lipase (formally
production has emerged[12]. The suitability of lipase catalysis in batch transesterification has
256
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
been widely reported, demonstrating the possibility of recycling the enzyme in a batch system
with or without solvent[12]. Plug flow reactors were also successfully developed[12].
lipase are relatively scarce and limited. The main drawback regarding enzymatic processes is
the relatively high cost of the biocatalyst: the development of stable continuous processes is
required in order to lower the influence the enzyme cost per kilogram of product[14, 15]. In this
framework, the enzyme has to remain very stable for several weeks or even months without
activity loss. One of the crucial points is the control of the partition of the polar compounds
between the reaction medium and the enzyme support[16, 17]. Several of these polar compounds
have been identified as potentially responsible for process instability during transesterification
glycerol has been found to be adsorbed onto the surface of the immobilized lipase shortening
their operational lifetime[18]; (ii) unrefined oil did not undergo methanolysis under solvent-
free conditions[19, 20]: this was identified as the consequence of the presence of phospholipids
Nevertheless, these adsorption phenomena depend on the polarity of both the solvent and the
support. Solvents with medium polarity like tert-butanol dissolve both polar and non-polar
compounds. Several works have shown that these solvents can eliminate the inhibition
brought about by glycerol production[22] and can reduce inhibition due to PLs[19, 21]
. In a
previous work[23], we described an efficient and stable process for the butanolysis of crude
high-oleic sunflower oil using Novozyme 435 as biocatalyst and tert-butanol as solvent. We
report here the effects of the continuous transesterification on the fate of some of the minor
components (PLs, tocopherols, sterols and other phenolic compounds) from several crude
vegetable oils: crude high-oleic sunflower oil (HOSO), crude rapeseed oils (RSO) and crude
257
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
olive oil (OO). The benefits of using crude oils in terms of oxidative stability was then
III.4.1 Materials
Crude high-oleic sunflower oil was supplied by Syngenta Seeds (Toulouse, France) High-
oleic sunflower oil aqueous refining was performed by ITERG (Pessac, France). Crude and
refined rapeseed oils were a generous gift from Lesieur (Asnières-sur-Seine, France) Crude
and refined olive oils were purchased from Olvea (Saint Léonard, France). The fatty acid
composition of the oils is given in Table I.2-1. Immobilized lipase B from Candida
antarctica, commercially called Novozyme 435, was a generous gift from Novozymes
(Bagsvaerd, Denmark). Folin Cicalteau reagent was purchased from Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO, USA). All other chemicals were of the highest purity and were purchased from
Table III.4-1: Fatty acid compositions of the oils used in this study. HOSO: High-Oleic Sunflower Oil,
HOSO RSO OO
Fatty Acids crude refined crude refined crude refined
C16:0 2.9% 2.8% 4.9% 4.8% 10.5% 10.5%
C16:1 2.9% 2.8% tr tr 0.6% 0.9%
C18:0 3.7% 3.7% 1.6% 1.6% 3.5% 3.2%
C18:1 76.7% 77.5% 61.3% 61.0% 80.3% 79.1%
C18:2 13.4% 12.8% 21.6% 22.0% 4.6% 5.7%
C18:3 0.4% 0.4% 9.4% 9.3% 0.4% 0.5%
C20:1 tr tr 1.2% 1.2% tr tr
Σ saturated 6.6% 6.4% 6.5% 6.4% 14.0% 13.7%
Σ mono-unsaturated 79.6% 80.3% 62.6% 67.4% 80.9% 80.0%
Σ poly-unsaturated 13.9% 13.3% 31.0% 31.4% 5.1% 6.2%
258
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
The fixed-bed reactor consisted in a thermostated (60°C) glass column (10 mm diameter)
containing 10 g of Novozyme 435 (bed length: 11 cm g−1). The reaction medium containing
500 mM oil and 2.5 M butanol (molar alcohol/oil ratio of 5) with tert-butanol as solvent was
continuously pumped using an ISO-3100SD Isocratic Pump (Dionex, USA) into the packed
bed of Novozyme 435 at a flow rate of 0.4 ml.min-1. At the outlet of the reaction vessel,
samples were collected and analyzed. FAAE was recovered after solvent removal in a Buchi
rotary evaporator under vacuum (15 mbar) and 60°C. The glycerol produced during the
The product and residual reactant concentrations were analyzed using a Dionex Ultimate 3000
HPLC equipped with a 380-LC Evaporative Light Scattering Detector, (Varian, USA) and a
reverse-phase analytical Prontosyl C30 column (ICS, France) (250 mm × 4 mm × 5 µm). The
nebulisation and evaporation temperatures were kept at 35°C and 40°C respectively. The
A 40-min ternary gradient with two linear gradient steps was employed: reservoir A contained
(5:4, v/v). Gradients were as follows: 30% A+70% B in 0 min, 100% B in 15 min, 50%
B+50% C in 30 min, followed by isocratic elution with 50% B+50% C for the last 10 min.
The flow rate was 1 ml.min-1 and oven temperature set at 40°C.
The fatty acids present in the oils were methylated into fatty acid methyl esters (FAME) using
259
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
analysis was carried out on a Hewlett-Packard 5890 gas chromatograph equipped with a 50 m
× 250 µm × 25 µm WCOT fused silica column with the polar bonded phase CP-Select CB for
FAME (Varian) and a flame ionization detector with Chromeleon® (Dionex) acquisition
software, under the following conditions: carrier gas N2 flow 50 mL.min-1 oven temperature
50-75 °C at 9 °C.min-1, 75-140 °C at 13 °C.min-1, 140-180 °C.min-1 at 1.5 °C.min-1 and finally
180-240 °C at 4.5 °C.min-1, injector temperature 140 °C, detector temperature 250 °C with 40
mL.min-1 H2 flow and 450 mL.min-1 air flow. Identification and quantification of methyl
esters were based on the comparison of retention times and peak areas of serial dilutions of
commercial standards. Internal standards were C9:0 for short carbon chain length fatty acids
Analysis of tocopherols, sterols and phospholipids in crude and refined oils, and in esters
synthesized from crude and refined oils were performed by ITERG (Pessac, France). The
tocopherol content was determined according to standard NF EN ISO 9936[24]. Sterol content
determined according to standard NF ISO 10540-1 for high contents[26] and standard NF ISO
The concentration of total polyphenol in refined and crude OO and FAAE were estimated
with 2 ml of methanol. Methanol was evaporated under a flow of nitrogen. Extracts were
washed twice with 3 ml of hexane and evaporated under a flow of nitrogen before dilution
with 1 ml of methanol. 0.1 ml of washed extract was diluted with 6 ml H2O and 0.5 ml of
Folin Cicalteau reagent. After 1 minute, 2 ml of Na2CO3 15% solution was added and the
solution made up to 10 ml with distilled water. Absorbance was measured at 700 nm using a
260
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
Calibration was done using caffeic acid standard solutions (0-1 mg.ml-1).
Oxidative stability analysis was performed by ITERG (Pessac, France) using a Rancimat
model 743 from Metrohm (Villebon Courtaboeuf, France). Measurements were according to
standards NF ISO 6886 (98°C, 20 l.h-1, 3 g samples) [29] and NF EN14112 (110°C, 10 l.h-1, 3
g samples) [30].
transesterification of crude and refined high-oleic sunflower oil with butanol in a plug flow
reactor. Novozyme 435 was chosen as catalyst for its non regio-specific characteristics, i.e.
the ability to completely convert the triglycerides of oil into FAAE. A molar ratio between
alcohol and oil of 5 was chosen in order to maximise the conversion into ester, thus
triacylglycerol (TAG). Tert-butanol was used as a solvent to obtain reactor stability week
after week thanks to minimization of the adsorption of phospholipids from crude high-oleic
sunflower and of the adsorption of the produced glycerol. The best ester purity (96%) and
productivity (13.8 tons of ester mixture produced per year and per kg of lipase) were obtained
with an initial oil concentration of 500 mM. Process stability was tested over a period of 50
days without encountering any loss of activity, proving the viability of the process.
Unrefined vegetable oils containing natural antioxidants are usually found to have improved
oxidative stability compared to refined oils[29]. Natural antioxidants have also been
deliberately added to FAAE to improve their oxidative stability[31]. The type and amount of
natural antioxidants in oil depend on the oil source and the cultivar. It is then of interest to
261
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
compare the properties of FAAE synthesised from crude and refined oils of different types
presenting different predominant sources of antioxidant. Therefore, FAAE from crude and
refined high oleic sunflower oils (HOSO), rapeseed oils (RSO) and olive oils (OO) were
The feeding flow rate was set at 24 ml.h-1 in order to reach the equilibrium whatever the oil
observed in the resulting mixtures of butyl esters with the different oil sources (data not
shown). Mixtures containing 96.0 mol % of FAAE, 0.03 mol % of TAG, 0.3 mol % of DAG
and 3.8 mol % of MAG, after solvent and butanol evaporation and glycerol separation, were
collected in the PBR outflow, irrespective of the oil used as substrate. Whatever the oils, no
decrease in activity was observed during the 72 hours of operation. It can be concluded that
the reaction is able to rid all the species out of the reactor. In other word no adsorption
detrimental to the enzyme activity was observed. In these conditions, high ester productivities
Phospholipids (PLs) are important components of crude oils and are almost completely
removed during refining. They represent the main species removed during refining. They
preservation of high levels of PLs in ester mixtures has a positive effect on oxidative
stabilisation. Moreover, the amphiphilic properties of PLs give to the FAAE, surfactant
262
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
Because crude RSO contains a higher quantity of PLs compared to the two other oils (HOSO
and OO), it was used to analyse the fate of PLs after continuous transesterification with
Novozyme 435. Phosphorus content was measured in oil and synthesized ester mixtures (after
alcohol evaporation and glycerol separation) according norm NF ISO 10540-1 for high
contents[26] and the norm NF ISO 10540-2 for low contents[27]. The PL concentrations were
deduced using the classical conversion factor of 30[33]. The results are presented in Table
III.5-1.
Table III.5-1: Phosphorus concentrations and calculated phospholipid concentrations in crude RSO
Phosphorus Phospholipid
content (mg/kg) content (mg/kg)
Crude RSO 122 3660
Crude RSO Esters 98 2940
The dilution factor brought about by the transesterification process was calculated at a value
of 1.18. The ratio between the PL concentrations in crude RSO and in ester mixtures obtained
from crude RSO was 1.24, i.e. close to the factor of dilution caused by the reaction. It was
concluded that PLs were preserved during the catalysis process. Nevertheless, the form under
which we recovered the phospholipids remained unknown. Novozyme 435 has already been
molecule would be produced. This last one would be, in this case, recovered in the glycerol
263
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
phase. In the present study, the phosphorus was entirely recovered in the ester mixtures (oily
phase). This would indicate that PLs remains esterified on position sn2 and/or sn1.
The chemical structure of PLs with their large polar head composed of a phosphate residue
esterified with a polar compound (choline, serine, ethanolamine, etc.) confers an amphilic and
polar character to the PLs. Therefore, in a non-polar medium (like free solvent system or
systems containing apolar organic solvent), they are able to adsorb to the Novozyme 435
support[19, 21] leading to a decrease of the lipase activity and even lowering stability during
repeated reactions. It can be assumed that the PLs create a polar layer around the biocatalyst
limiting the diffusion of non-polar compounds from the reaction medium to the enzyme. This
hypothesis has already been proposed for water in the esterification reaction in n-hexane[17]
The accumulation of polar compounds in the reactor can diminish the lipase activity, and their
evacuation from the reactor is needed in order to maintain a high-efficient catalysis[16, 18]. No
loss of activity was observed during transesterification of crude RSO during 3 days.
Moreover, a high PL concentration in the ester mixture, close to the value of dilution, would
suggest that no adsorption of PL occurred during the catalysis. The use of a solvent of
medium polarity (tert-butanol) would insure perfect evacuation of the PLs from the reactor.
The good stability of the transesterification reaction in the PBR is thus guaranteed.
The variation of the tocopherol and sterol concentrations during enzymatic transesterification
was estimated by the analysis of a number of samples from an aqueous HOSO refining plant
264
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
Tocopherols are the main natural antioxidants in FAAE mixtures synthesized from vegetable
[31, 37]
oils . Their antioxidant activity is related to their resonant structure and the antioxidant
efficiency is ordered as follows: δ- > γ- and > α-tocopherols. Their antioxidant efficiency is
dependent on their concentrations[31]. A number of plant sterols, especially ∆5- and ∆7-
sterols such as ergosterol are effective in the protection of oils against thermal
the presence of ethylene groups in the sterol side-chains and their degree of unsaturation[38, 39].
The processing of rich raw materials (crude oils vs refined oils) and the preservation of high
levels of tocopherols and sterols during transesterification reactions is thus a way to improve
The tocopherols in crude HOSO are mainly α-tocopherols with a concentration of 579 mg/kg
(94% of the total tocopherols) and β-tocopherol with a concentration of 31 mg/kg (5% of the
total tocopherols). The variation of total tocopherol concentrations in HOSO and FAAE at
different stages of a refining process was measured and is represented in Figure III.5-1. Total
tocopherols decreased slightly during the refining process as already reported[10]. A loss of
~20% in their total concentration was obtained between crude and refined HOSO during the
refining process.
265
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
Figure III.5-1: Total tocopherol concentration (mg/kg) in high-oleic sunflower oil (♦) and butyl ester
mixtures (□), at different stages of the aqueous refining process. Reaction conditions: Packed bed reactor
Taking into account the dilution factor of tocopherol due to the reaction (1.2), it can be
concluded that tocopherols are perfectly preserved during the transesterification process
Bostyn et al. (2008)[40] determined that α-tocopherol naturally are deteriorated at a rate of 0.6
to 36 ppm.h-1 at temperatures ranging from 50°C to 150°C. The mild temperature conditions
i.e. 60°C applied to the continuous enzymatic catalysis in the PBR and the residence time
defined for optimal conditions (about 0.4 hours) lead to low degradation of the tocopherols.
The individual tocopherols were measured in crude and refined HOSO and butyl-ester
mixtures produced from them. The concentrations are presented in Table III.5-2. Because the
contents were not differently affected by the refining process, it can be considered that all the
tocopherols are preserved during the enzymatic catalysis in the PBR. The tocopherol content
was 19.8% higher in the ester mixture synthesized from crude HOSO than the one produced
266
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
Table III.5-2: Individual tocopherol/tocotrienol concentrations (mg/kg) in crude and refined HOSO
The evolution of total sterol concentrations in HOSO and FAAE at different stages of the
refining process is represented in Figure III.5-2. The sterols were slightly decreased during
the refining process essentially in the first stage of refining. A 9% loss was attained after
whole refining process. No loss of total sterols was observed during the transesterification
process. The observed decrease is the result of the dilution caused by the reaction.
267
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
Figure III.5-2: Sterols (mg.100g-1) contained in high-oleic sunflower oil (♦) and butyl ester mixtures (□), at
different stages of the aqueous refining process. Reaction conditions: Packed bed reactor containing 10g
The individual sterols were identified in crude and refined HOSO and in ester mixtures
produced from these oils. The relative proportions are presented in Table III.5-3. Crude
HOSO contained mainly β-sitosterol (58.8% of the total sterols), campesterol (11.7%),
individual sterols remained unchanged in the ester mixtures. Consequently, it appears that the
sterols are preserved during the lipase-catalyzed transesterification process. The amount of
sterol in the ester mixture obtained from crude HOSO was 11.6% higher than in the mixture
268
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
Table III.5-3: Individual sterol proportions (%) in crude and refined HOSO (high-oleic sunflower oils)
Phenolic compounds, other than tocopherols, contained in vegetable oils such as lignans,
hydroxy-cinnamic acids, etc. are recognized as strong antioxidants. They are, for example,
responsible for the outstanding oxidative stability of sesame and olive oils[4]. Esters of
polyphenolic acids have been tested to improve the stability of methyl esters (biodiesel)[41].
The phenolic compounds are part of the polar fraction of oils. Consequently, like other polar
compounds (PLs and glycerol)[21], they are susceptible to be adsorbed onto the immobilized
lipase, leading to the above mentioned problems during catalysis, . Their evacuation from the
reactor thus helps ensure catalytic stability. It is therefore useful to estimate the variations in
the concentrations of these phenolic compounds during the continuous enzymatic process of
269
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
transesterification, either for reactor stability issues or in order to conserve their strong
Olive oil, one of the richest oils in phenolic compounds, was chosen for this estimation.
crude and refined OO and in the corresponding FAAE are presented in Table III.5-4.
Table III.5-4: Phenolic compound content in crude and refined olive oils (OO) and fatty acid alkyl esters
-1
g Eq. Caffeic Acid.l
Oil FAAE
Crude olive oil 0.48 0.43
Refined olive oil 0.19 0.19
The OO refining process significantly reduced the amount of phenolic compounds, with a
60.2% drop. It can be assumed that phenolic compounds were not lost during the enzymatic
The Rancimat method provides an accelerated estimation of resistance to oxidation of oils and
ester mixtures. The method is based on the fact that, at the end of the induction time, volatile
compounds are formed in oxidized oils or fats. The oxidation is induced by constant aeration
of a sample heated to a constant temperature. The volatile products are collected in water and
their levels are measured through the variation of electric conductivity induced by their
270
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
dissolution. During oxidation, the conductivity of the water drops indicating the end of the
induction period.
Standard NF EN 14112 specifies that 3g samples have to be analyzed at 110°C with an air
flow of 10 L.h-1. However, these parameters do not approximate the conditions likely to be
encountered during industrial applications or during typical storage of the FAAE. Under the
degradation in a relative short period of time[42]. Short induction periods can make it harder to
compare the oxidative stability of crude and refined oils and FAAE and can underestimate the
analysis with an air flow rate of 20 L.h-1 but a lower temperature (98°C) was used in addition
to standard NF EN 14112 (Table III.5-5). This assumption was observed in our experiments
where induction periods obtained with norm NF EN 14112 were between 2 and 4 time shorter
As expected, the oxidative stability of the oils investigated in this study was correlated to their
fatty acid composition[2, 6, 42]. The longest induction times were obtained for HOSO and OO
(crude or refined), which are mainly composed of monounsaturated oleic acid. RSO,
containing higher quantities of poly-unsaturated fatty acids, presented induction periods less
The differences between induction times obtained with crude and refined HOSO and RSO
were under the level of the method uncertainty (15%). Nevertheless, the tendencies would
suggest a higher stability with the unrefined oils. The difference was more pronounced for
271
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
OO where the induction period was two or three time longer for unrefined oil with standards
The induction times measured with FAAE followed the same profile as that of oils i.e. oils
HSO and OO oils showed greater resistance to oxidation than RSO. The differences of
induction time bteween FAAE obtained with crude and refined oil were significantly
different. With norm NF ISO 6886, the resistance to oxidation was 65%, 96% and 101%
higher when crude HOSO, crude RSO or crude OO were used in the process. Because
induction times were shorter with norm NF EN 14112, the difference between the induction
periods of FAAE produced from crude oils and from refined oils are less marked with this
method: 7% for HOSO, 82% for RSO and 26% for OO.
Table III.5-5: Induction periods (h) of oils and fatty acid alkyl esters (FAAE) from different sources,
obtained with the Rancimat method. The method uncertainty is 15%. HOSO: High-Oleic Sunflower Oil,
Oil FAAE
NF ISO 6886 NF EN 14112 NF ISO 6886 NF EN 14112
-1 -1 -1 -1
(98°C / 20L.h / 3g) (110°C / 10L.h / 3g) (98°C / 20L.h / 3g) (110°C / 10L.h / 3g)
Crude HOSO 65.7h 24.6h 50.7h 23.3h
Refined HOSO 56.8h 23.8h 30.8h 21.7h
Crude RSO 18.1h 7.5h 25.1h 10.4h
Refined RSO 17h 7.9h 12.8h 5.7h
Crude OO > 70h 37.1h > 70h 17.5h
Refined OO 36.1h 12.2h 34.8h 13.9h
The induction times obtained here were much higher than those reported in a number of
works with distilled and non-distilled methyl esters. For example, Knothe (2007)[7] listed
induction times of esters obtained via alkali-synthesis, reported in the literature. The oxidative
stability index (found using a method very similar to NF EN 14112) was about 2.9h for
272
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
distilled sunflower methyl esters. The induction time for undistilled FAAE synthesized from
rapeseed oil was about 6.9h in a Rancimat at 110°C. The lipase-catalyzed transesterification
process provided oxidative stabilities 2- to 10-fold higher according to the raw material.
Beyond the nature of the oils, where the degree of unsaturation has a very strong influence on
the oxidative resistance of the resulting FAAE, the enzymatic transesterification of crude oils
enhances the natural antioxidant content in the FAAE thus optimizing the oxidative stability.
It is remarkable that whatever the transesterified oil, induction times are widely above the
III.6 Conclusion
The butanolysis catalysed by Novozyme 435 in a continuous packed bed reactor with tert-
butanol as solvent enabled the efficient and stable production of FAAE from different
vegetable oils. The fate of the minor components present in the initial crude oils was
estimated in the final product. Except for an effect of dilution due to the reaction process
itself, phospholipids as well as tocopherols, sterols and phenolic compounds were preserved
in the final product mixture. This indicates that they were correctly evacuated from the
reactor, insuring a long operational stability for the process. Because the reaction conditions
were mild and no excessive exposure to ambient air occurred, no oxidative stress was
engendered by the biocatalytic process, preserving the oxidation state of the oils. The
presence of high amounts of natural antioxidants in the FAAE mixtures obtained from crude
oils confers particular properties of oxidative resistance, greater than standard requirements.
273
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
Acknowledgements
Work was financially supported by Syngenta Seeds SAS and the ‘Association Nationale de la
Recherche et de la Technologie’ (ANRT). The authors would like to thank Peter Winterton of
Toulouse University who helped to correct the English version of the manuscript
III.7 References
274
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
275
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
23. Séverac, E., O. Galy, F. Turon, C.A. Pantel, J.-S. Condoret, P. Monsan, and A.
Marty.Selection of CalB immobilization method to be used in continuous oil
transesterification: analysis of the economical impact. Enzyme. Microb. Technol.
doi:10.1016/j.enzmictec.2010.09.008.
24. International organization for standardization. Method NF EN ISO 9936 - Animal
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high-performance liquid chromatography; 2006.
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Colorimetric method 2003.
27. International Organization of Standardization. Method NF EN ISO 10540-2 -
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28. Gutfinger, T.Polyphenols in olive oils. J. Am. Oil Chem. Soc. (1981). 58: p. 966-968.
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30. European Committee for Standardization. Methods NF EN14112 - Determination
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31. Fröhlich, A. and S. Schober.The influence of tocopherols on the oxidation stability of
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32. Hamilton, R.J., C. Kalu, G.P. McNeill, F.B. Padley, and J.H. Pierce.Effects of
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structures and their catalytic ability to hydrolyse triglycerides and phospholipids.
Enzyme. Microb. Technol. (2007). 41: p. 35-43.
276
III. Transestérification des huiles vierges et stabilité oxydative
277
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
IV : PUBLICATION N°3 : Selection de la méthode d’immobilisatio n de CalB pour cataly sér la transestérification continue d’huiles végétales: analy se de l’impact économique.
278
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Etienne Séveracb, Olivier Galya, Fabrice Turonb, Catherine Azzaro Pantelc, Jean-Stéphane
Condoretc, Pierre Monsana and Alain Martya*.
a
1) Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077
Toulouse, France
Toulouse, France
ENSIACET/INP/UPS,
Procédés, Institut National des Sciences Appliquées, 135 Avenue de Rangueil, 31077
Toulouse Cedex4, France, Tel : +33 (0)5 61 55 94 39, Fax : +33 (0)5 61 55 94 00, Email :
279
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
IV.1 Résumé
Les outils enzymatiques de transestérification des huiles végétales sont nombreux et souvent
très performants. Néanmoins, leurs utilisations dans des procédés industriels sont encore
restreintes. Le facteur limitant de leur développement en est un prix souvent prohibitif. Aussi,
industrielles. Il est montré que la stabilité des réacteurs à lit fixe est obtenue lorsque les
produits polaires, capables de s’adsorber sur les supports enzymatiques (eau au cours des
d’une part du milieu réactionnel, et d’autre part, du support d’immobilisation. Ceux-ci doivent
La lipase B de Candida antarctica (CalB) est très appréciée pour son absence de spécificité
vis-à-vis des positions des résidus d’acides gras sur le squelette de glycérol des triglycérides.
métacrylate, le Lewatit VP OC 1600, dont la polarité moyenne peut être limitante. En effet, le
glycérol qui est produit lors de la réaction est capable de se fixer sur le support conduisant à
adsorbé (0,15 g.g-1), l’activité initiale relative est diminuée, pour être totalement perdue pour
des teneurs de 0,9 g.g-1. Cela se traduirait en conditions de catalyse continue par une stabilité
opérationnelle faible.
280
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
CalB est disponible dans le commerce sous une seconde forme, libre en solution (Lipozyme
CalB L). Son immobilisation sur le support le plus hydrophobe qui soit présenté dans la
littérature, l’Accurel MP (un polymère de polypropylène) est donc une solution pour assurer
OC 1600, ne permet pas l’adsorption du glycérol, que ce soit dans un milieu polaire, ou dans
un milieu apolaire.
performances ont été obtenues avec de l’Accurel MP 1001 (taille des particules < 1000µm).
ce nouveau biocatalyseur montre une grande dépendance de son prix de revient avec le ratio
entre la quantité d’enzyme utilisée et la quantité de support mise en contact : plus ce rapport
est grand (biocatalyseur le plus actif), plus le coût de production est élevée ; inversement, plus
le rapport est faible (biocatalyseur moins actif), plus le coût de revient est diminué.
développement d’un réacteur à lit fixe de taille industrielle. Les coûts d’investissement pour le
estimés grâce à des méthodes empruntées au domaine du génie chimique. La valeur nette
actualisée (VNA) est une fonction consistant à comparer les gains d'un procédé (projet) à son
investissement initial. Etant donné que la productivité est fixée, la maximisation de la VNA
appliquée sur le procédé enzymatique développé a été obtenue par la minimisation des coûts
relatifs à l’enzyme. Cela permet de déterminer que le principal centre de coût est largement
281
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
coûts globaux d’environ 50% par rapport au procédé utilisant Novozyme 435.
Mots clés : Lipase B de Candida antarctica, immobilisation, reacteur à lit fixe, trans-
282
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
ECONOMICAL IMPACT.
Etienne Séveracb, Olivier Galya, Fabrice Turonb, Catherine Azzaro Pantelc, Jean-
Stéphane Condoretc, Pierre Monsana and Alain Martya*.
a
1) Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077
Toulouse, France
Toulouse, France
ENSIACET/INP/UPS,
Procédés, Institut National des Sciences Appliquées, 135 Avenue de Rangueil, 31077
Toulouse Cedex4, France, Tel : +33 (0)5 61 55 94 39, Fax : +33 (0)5 61 55 94 00, Email :
283
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
IV.2 Abstract
Enzymatic transesterification of triglycerides in a continuous way is always a great challenge
The lipase B from Candida antarctica (CalB) is the most appreciated enzyme because of its
high activity and its non regio-selectivity toward positions of fatty acid residues on glycerol
demonstrated that the medium hydrophilic nature of the support used for its commercial form
decrease in enzyme activity. Glycerol would form a hydrophilic layer around the enzyme
resulting in diffusional limitations during triglyceride transfer to the enzyme. Accurel MP, a
very hydrophobic macroporous polymer of propylene, was found to not adsorb glycerol.
Immobilization conditions using this support were optimized. The best support was Accurel
MP1001 (particle size < 1000µm) and a pre-treatment of the support with acetone instead of
ethanol enables the adsorption rate and the immobilised enzyme quantity to be maximized.
An economical approach (maximisation of the process net present value) was expanded in
reactor. The crucial ratio between the quantity of lipase and the quantity of support, taking
into account enzyme, support and equipped packed-bed reactor costs was optimized in this
sense. The biocatalyst cost was found as largely the main cost centre (2 to 10 times higher
than the investments for the reactor vessel). In consequence, optimal conditions for
Keywords: Lipase B from Candida antarctica, immobilization, packed bed reactor, trans-
284
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
IV.3 Glossary.
2M2B: 2-méthyl-2-butanol
P: Pressure (bar)
285
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
α: coefficient of soldering
R$: average exchange rate between dollar and euro for 2009
C 0p : Procurement cost of equipment operating at ambient pressure and using carbon steel
286
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
IV.4 Introduction
Alkyl esters synthesized from vegetable oils are molecules used in a wide range of industrial
products which are finite resources and are known to accelerate climate disorders due to
greenhouse effect gas emissions. Fatty acid esters present a lower toxicity, a higher
Alkyl esters are the result of the reaction between a fatty acid either in its free form
product of the reaction is respectively water or glycerol. The alkyl ester industrial production
is usually performed by chemical alkaline or acidic processes. These chemical methods yield
[6, 7]
a high conversion ratio to alkyl esters in a short time (4-10h) . However, chemical
catalysis could have some unavoidable disadvantages. This chemical synthesis often presents
are often high energy consumers. The recovery of glycerol is often difficult and a large
[6, 7]
amount of alkaline waste water from catalysts is produced . The use of triacylglycerol
lipases (E.C. 3.1.1.3) as biocatalysts has been developed as an alternative route to the
Many studies have shown the ability of enzymes to catalyse either esterification of fatty acids
[6, 10, 11]
or trans-esterification of triacylglycerols from oils . In spite of the wide range of
possibilities and the great interest for enzymatic catalysis, industrial processes involving
lipase are relatively scarce and limited. The main issue regarding enzymatic processes is the
[12, 13]
relatively high cost of the catalyst . The first way to reduce economical impact of
[14]
enzyme costs is to be able to recover and reuse it thanks to immobilization process .A
287
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
proper immobilization strategy may improve enzyme thermostability and resistance towards
the environment (pH, solvents.) and to increase the observed synthesis activity compared with
[15, 17]
non immobilized enzyme by spreading the enzyme on a large surface area . The most
commonly used lipase is the lipase B from Candida antarctica (CalB), physically adsorbed on
number of industrial processes such as the synthesis of optically active compounds in the
pharmaceutical industry [18, 19], in the synthesis of polymers [20], in the synthesis of esters used
[21] [22, 23]
in the flavor industry or in production of FAEE for the biodiesel industry . The
enzyme has been developed for synthesis of high added value products where the high cost of
the catalyst has just a limited impact. Nevertheless, in many applications, the high costs of the
lipase represent the first limitation, especially in biodiesel industry where lack of stability due
to short alcohols [22] or to the production of hydrophilic glycerol [24] is observed. Development
Another way to decrease the operational enzyme cost is to increase the operational stability of
the biocatalyst. It is crucial for its industrial applicability because it will directly influence the
The use of immobilized lipase in continuous reactors significantly reduces the incidence of
the catalyst added cost on the product. Tubular packed bed reactors (PBR) lead to a higher
[23, 27, 28]
performance than stirred-tank reactors and avoid enzyme support attrition . However,
to develop an economically relevant process, operational stability of the enzyme has to remain
very high, for several weeks or even several months without significant activity loss. In this
field of heterogeneous catalysis, the crucial point is to be able to control the partition of the
produced polar compounds (water or glycerol) between the reaction medium and the enzyme
[24, 29, 30]
support . Adsorption of these polar compounds onto the enzyme support leads to a
288
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
hydrophilic hindrance around the enzyme resulting in diffusional limitations for hydrophobic
substrates to migrate from the liquid phase to the enzyme active site. As shown by Marty et al
[29] [30]
and Dossat et al adsorption of water or glycerol has a dramatic effect, in terms of
depends on both reaction medium and enzymatic support polarities. On the one hand, a
solubilize efficiently all the reactants [25]. On the other hand, enzymatic support polarity has to
In the present study, we are reporting the strategy of reasoned immobilisation in view of the
development of an economically viable process. This PBR is developed with the aim of the
We chose to use high oleic sunflower oil as a model substrate. It mainly contains triolein as
triglycerides ratio of 5. Tert-butanol, a non-toxic solvent of relative low cost, was selected for
[31]
its ability to preserve CalB (Novozyme 435) activity and to improve greatly its stability .
This solvent presents a low boiling point compared to other solvents of medium polarity,
which facilitates its separation and recovery during down stream process.
because it was demonstrated as very efficient for several lipase immobilizations. Batisda et al
[32]
suggested that hydrophobic supports mimic the interface created by natural substrates of
lipases, fixing the open form of these enzymes. This leads in general to a hyperactivation of
289
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
[33, 34]
lipases. CalB was reported to be prone to this interfacial adsorption process . A pre-
treatment of the support with ethanol is widely proposed in order to enhance the penetration
The main objective of this paper is to couple experimental results with an economical analysis
of the global process. The economical impact of the immobilisation process on the continuous
packed bed reactor cost is analyzed in order to define conditions offering the best process
cost-effectiveness.
IV.5.1 Materials
Commercial liquid form of lipase B from Candida antarctica, namely Lipozyme CalB L, was
a gift from Novozymes (Bagsvaerd, Denmark), Lewatit VP OC 1600 was kindly provided by
Lanxess (Leverkusen, Germany). Accurel MP1000 (particle size under 1500µm) and MP1001
(particle size under 1000µm) were purchased from Membrana GmbH (Wuppertal, Germany).
Pore radius are distributed in two groups varying from mesoporous to macroporous scales:
one, around 10nm and the second, around 8µm. The specific surface area was measured at
90% Oleic acid, 99.5% glycerol, pure p-nitrophenyl butyrate and molecular sieve 3Å were
purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). All other chemicals and solvents
(butanol, tert-butanol) were of the highest purity and were purchased from Acros Organics
(Geel, Belgium).
Batch glycerol and butanol sorption experiments were carried out in 15 ml conical flasks at
37°C on a rotational shaker for 24 h. Dried Lewatit VP OC 1600 and Accurel MP1001 (0.25,
290
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
0.5, 0.75 and 1 g) was thoroughly mixed with 10 ml of solutions containing 250mM of
glycerol and/or 1000mM of butanol and/or 1500mM of butyl-oleate. Tert-butanol was chosen
as a solvent. After shaking the flasks for 24 h, the reaction mixture was analyzed to measure
the residual glycerol and butanol concentrations. The solvent was evaporated under a flow of
nitrogen and diluted for analysis. With samples containing butyl-oleate, it was necessary to
glycerol in methanol with concentration ranging from 50g.l-1 to 0g.L-1 to 0.5g of Novozyme
435®. The methanol was slowly evaporated at room temperature using a flow of nitrogen.
The Accurel particles were first suspended in 10ml of Ethanol (Protocols A and B) or 10ml of
Acetone (Protocol C). The particles are mixed for 30minutes at room temperature. 10 ml
100mM phosphate buffer 100mM NaCl and 10ml Of Lipozyme CALB-L were directly
added. Protocol A requires a second pre-wash with 10ml 50% Ethanol - H2O (v/v). After
30minutes it was given a gentle stir at room temperature, the mixture was replaced with 10 ml
de-ionised water, decanted then washed with 10 ml fresh 100 mM phosphate buffer pH 7.2,
100 mM NaCl. 10ml of Lipozyme CalB-L were directly added to the support.
The Accurel MP in contact with enzyme was moderately shaken horizontally at room
temperature for 48 h. Then, the support particles loaded with lipase were filtered from
enzymatic solution, quickly washed 3 times with 20ml of 100 mM phosphate buffer pH 7.2,
The adsorbates were dried using a two-step procedure: the first step was done in a closed
chamber crossed by an air flow at room temperature until end of evaporation. In a second
291
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
step, water activity was adjusted in a closed chamber containing activated molecular sieve.
The immobilized lipase was stored at 4°C, ready for the assay of immobilised lipase activity.
containing the lipase, 175 µL of a 100 mM phosphate buffer pH 7.2, 100 mM NaCl and 5 µL
30°C for 10min using the VersaMax tunable microplate reader apparatus (Molecular Devices,
Rennes, France). One unit of free lipase activity was defined as the amount of enzyme
The enzymatic activity of Novozyme 435 with adsorbed glycerol was measured in a 500ml
glass bottle containing oleic acid (200mM), butanol (600mM), and the immobilized enzyme
(500mg) with n-decane previously dried with 3Ǻ molecular sieve as a solvent. The enzymatic
activity of immobilized CalB was measured in a 10ml glass tube containing oleic acid (200
mM), butanol (600mM), and the immobilized CalB (20mg) with tert-butanol previously dried
with 3Ǻ molecular sieve as a solvent. The reaction mixture was incubated at 60°C and
intervals for analysis. The reaction was stopped by centrifugation at 13500 rpm for 2minutes
292
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Butanol and butyl-oleate analysis were done using an Agilent 6890N gas–liquid
chromatograph equipped with an HP5 capillary column (230 m by 0.32 mm by 0.25 µm film
thickness), a split/splitless mode injector and a flame ionization detector. The split mode
injection was adopted with a split ratio of 200. The oven temperature was 200°C, maintained
for 3 min, raised to 280°C at rate of 10°C/min, and maintained at 280°C for 1 min, while the
injector and detector temperature were set at 250°C and 270°C, respectively. The sample size
Glycerol analysis was realized thanks to a Dionex Ultimate3000 HPLC system, equipped with
a Shodex RI-101 refractive index detector and a Biorad Aminex HPX-87K (300mmx7.8mm)
column. Elution was carried out at 65°C isocratically with deionised water as mobile phase
Novozyme 435® is the most efficient non regio-specific lipase, called CalB. This enzyme is
presents relative residual activity of this catalyst after adsorption of increasing glycerol
quantities. Effect of glycerol adsorption into enzymatic activity was estimated using a simple
model reaction, esterification of oleic acid with butan-1-ol in order to avoid the complexity of
293
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Low quantities of adsorbed glycerol (below 0.1g/g) do not affect the initial velocity. Up to
this value, a rapid decrease in activity is observed, leading to a nearly complete inactivity at
[30]
0.9 g/g of adsorbed glycerol. This phenomenon was already observed by Dossat et al.
immobilized on Duolite A568). These authors postulated that the glycerol forms a hydrophilic
layer around the enzyme impeding the mass transfer of hydrophobic substrates.
Figure IV.6-1: Relative initial reaction rates of esterification in presence of Novozyme 435® pre-treated
with glycerol. Reaction conditions: substrate concentrations: 200 mM oleic acid and 600 mM butanol in n-
drastic loss of reactor performances versus time is expected, due to produced glycerol
adsorption. To prevent this from happening, it would be of interest to adapt the enzymatic
294
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
support polarity to avoid glycerol adsorption. The first objective was consequently to
optimize support polarity for CalB immobilisation. In the literature the most used
hydrophobic support is Accurel MP. Its performances were then compared with ones
Figure IV.6-2 presents the residual glycerol concentration after contact with different
disappears linearly when the quantity of support is increased. If the conventional Langmuir
approach for adsorption isotherm is considered [42], the adsorption phenomenon is in the linear
zone of the isotherm, far from the saturation of the support. Interestingly enough, for Accurel
Figure IV.6-2 : Residual glycerol concentrations (mM) after contact of different quantities (g) of Accurel
(■) & Lewatit VP OC 1600 (♦). Initial conditions: Glycerol concentration: 260mM in tert-butanol
295
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
As the partition of glycerol is also function of the medium polarity, it appears necessary to
triglycerides (high oleic sunflower oil) with 2.5M of butan-1-ol (ratio 5) was chosen. The
reaction medium considered for the partition study was the final composition obtained at
Figure IV.6-3 : Residual glycerol concentrations (mM) after contact with different quantities (g) of
Accurel (□), Lewatit VP OC 1600 (◊) with a butyl-oleate and butanol containing solution of glycerol at
medium. This result is in accordance with the increase in Log(P) (partition coefficient
between octanol and water) calculated using Cosmotherm software (Cosmologic Germany)
[43]
. The Log(P) of pure tert-butanol was estimated at 1 whereas there is a 3-fold increase in
[42]
the considered reaction medium. According to the Langmuir equation , saturation of the
296
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Lewatit support is reached at a value of 1.9 g of adsorbed glycerol per g of support (Figure
IV.6-3).
On the most hydrophobic support tested, Accurel MP1001, no glycerol adsorption was
observed, and therefore, this support would enable perfect stability of a continuous reactor to
support.
solution into hydrophobic Accurel MP pores. In the literature, two protocols were described:
protocol A consists in wetting the support with, sequentially: ethanol, aqueous ethanol
[35, 36, 44]
solution and finally with water, with intermediary filtration ; protocol B consists in a
single wetting with ethanol and then a direct contact with the enzyme solution without
removing ethanol [12, 38, 39]. Ethanol improves the immobilization process by inducing a better
[37]
penetration of the enzyme solution inside the very hydrophobic Accurel and by reducing
the enzyme thermodynamic activity, thus forcing the adsorption process. CalB being well-
known for its strong tolerance to high solvent quantities, a third method (protocol C) is
acetone. It was checked that no loss of enzyme activity occurred when acetone or ethanol
were added to the lipase solution in the same conditions as during immobilisation process
The shapes of the experimental adsorption curves suggest a Langmuir type adsorption.
Justification and demonstration of this adsorption behaviour is out of the scope of this study
but, for the sake of convenience, we will use a Langmuir type equation to model our results.
297
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
A typical Langmuir behaviour for protein adsorption had been already observed by Gitlesen
[38] [36]
et al. and Al-Duri and Yong for the immobilisation of lipases from Candida rugosa,
Protein content determination methods are largely perturbed by salts, solvents… To get round
this problem, adsorption curves were represented by the plotting of immobilized lipase
activity (Vf, µmole.min-1.gsup-1) versus the residual free lipase activity in the supernatant (Af,
U.ml-1). This is based on the hypothesis that lipase activities are directly proportional to
protein concentrations in the bulk phase for the free lipase and to the quantity of lipase
adsorbed into the support for the immobilized lipase. In addition, this approach enables better
conditions for enzyme activity optimisation to be easily identified. So, in this case, the
Vsat . A f
Vf = (Eq. IV-2)
K lip + A f
with Vsat (µmol.min-1.gsup-1) the velocity at saturation and Klip (U.ml-1) a constant of
For practical reasons (higher reaction rates, analytical facilities…), the PBR development was
mimicked using a simpler reaction of esterification of oleic acid with butanol presented in
equation 3 considering that the reaction optima are likely to be very similar.
298
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Figure IV.6-4 presents the isotherm equilibrium of CalB on Accurel MP obtained for the three
immobilisation methods. Both the adsorption velocity and the maximal capacity of adsorption
Figure IV.6-4 : Comparison of adsorption curves for the adsorption of CalB on Accurel MP1000 with
protocol A (○), protocol B (∆) and protocol C (◊) at room temperature. The dashed, dotted and solid
curves are the Langmuir isotherms calculated with the parameters fitting the adsorption data obtained
with protocols A, B and C respectively. Reaction conditions: substrate concentrations: 200 mM oleic acid
and 600 mM butanol in tert-butanol; immobilised CalB: 20 mg; reaction temperature: 60°C
Protocols A and B led to similar maximal adsorption (Vsat of 140 mmol.min-1.g-1 and 176
mmol.min-1.g-1 respectively), whereas with protocol C the maximal adsorption was increased
to 231 mmol.min-1.g-1.
Mei et al. [45] have shown that for a Novozyme 435® with particle size of 600µm, CalB was
exclusively located in the external shell of the bead, with a thickness of 80-100µm. The same
kind of distribution of CalB in an external shell of the Accurel particle is indeed expected,
299
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
with a thickness depending on the method of immobilization. Compared to the two other
methods, the use of acetone was thought to induce a deeper penetration within the support,
giving access to a larger area for lipase adsorption and an extended potential maximal activity.
Moreover, the affinity between enzyme and support is favored by the presence of acetone
(5.2, 13.0 and 2.5 U.ml-1 for methods A, B and C respectively). Acetone, which is an aprotic
solvent, decreases the solubility and the thermodynamic activity of protein in solutions more
efficiently [46].
Finally, compared to the protocol A, the two protocols B and C, could be easily transposable
to an in situ immobilization process by a simple circulation of first, the solvent and then, the
lipase solution directly added to the solvent through a reactor packed with the support.
Figure IV.6-5 : Comparison of adsorption curves for the adsorption of CalB on Accurel MP1000 (◊) and
on Accurel MP1001 (□) pre-wetted with acetone (Protocol C) at room temperature. The solid and dotted
curves are the Langmuir isotherms calculated with the parameters fitting the adsorption data obtained
with Accurel MP1000 and MP1001 respectively. Reaction conditions: substrate concentrations: 200mM
oleic acid and 600mM butanol in tert-butanol; immobilised CalB: 20mg; reaction temperature: 60°C
300
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Different kinds of Accurel MP supports are available. Accurel MP1000 presents particle size
below 1500µm, Accurel MP1001 below 1000µm and Accurel MP1004 below 400µm. The
latest was discarded for practical reasons: it is a fine powder which can induce high pressure
drop in a continuous PBR and its low density induces difficulties for the contact between
phases. Figure IV.6-5 shows the adsorption curves of CalB on Accurel MP1000 and MP1001.
[47]
Oliveira et al. have shown that the layer thickness formed by CalB within a Novozyme
435® bead is constant whatever the particle size, when the immobilization conditions are
similar. As a matter of fact, they demonstrated that the smaller particle size have the highest
specific enzyme content. Our results are in accordance with this effect of dilution of CalB
[35]
within the support. This effect was also observed by Al-Duri and Yong who have
Accurel EP100 when the particle size was decreased from 2500µM to 750µm. Sabbani et al.
[48]
have also reported an improved activity rate of esterification of 2-methylhexanoic acid
when decreasing Accurel particle sizes were used to adsorb Candida rugosa lipase.
The maximal immobilized activity, calculated for the couple Accurel MP1001/protocol C, is
improved by 18.7%, 55.4% and 95.1%, compared to the ones obtained with the couples
The absence of glycerol adsorption onto Accurel support after immobilization was verified
(adsorption of glycerol was not feasible in presence of esters to avoid synthesis reactions). In
every case, no glycerol adsorption was measured whatever the level of protein loading onto
301
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
the Accurel support (data not shown). Therefore, it could be concluded that CalB
immobilization does not affect the positive effect of the high hydrophobicity of the support.
Moreover it would suggest that glycerol accumulation principally occurs onto the matrix of
hydrophilic supports.
of activity, i.e., the best immobilized enzyme presents the highest activity. This is generally
obtained with the highest enzyme loading on the support. It often corresponds to the use of a
high lipase / support quantity ratio which is often directly related to high cost [12].
The cost of the immobilized CalB on Accurel MP is dependent on four different factors: (i)
the cost of the support, (ii) the cost of the lipase, (iii) the cost of additive products (acetone,
ethanol...) and (iiii) the operating costs. In our procedure, volumes of lipase and additives
were kept constant. So the main factor influencing the cost calculation is the cost of the
support and by extension the ratio between support and lipase quantities. The general cost
(Eq. IV-4)
where the mx (kg) are the mass of the considered elements and the costx (€/kg) are the specific
costs of the considered elements. It was considered to carry out the adsorption of lipase
directly in the packed bed reactor. The unitary operation of CalB immobilisation can be
simplified to the circulation of the different components through the packed Accurel, using a
302
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
system in adequacy to the proportion of volume defined in the lab conditions and including a
loop for recycling of immobilization medium in order to approach the external mass transfer
identical whatever the immobilization conditions. The pumping costs to ensure the
immobilization directly in the PBR were thought to be negligible with respect to the costs of
support and lipase, and they were not included into the immobilized lipase production cost
calculation.
between the solid phase and the reaction medium. These phenomena are highly dependent on
the medium. So, reproducible immobilisations are only obtained when the reaction medium
and more precisely the proportions of each component are completely controlled.
In the cost calculation, it is important to discuss about the treatment of the quantity of non-
adsorbed enzyme after immobilisation. This quantity can be considered as lost, or can be
recycled in a new immobilization process. The main choice criterion is the percentage of
residual enzyme after immobilisation. The lower this percentage, the easier the residual
enzyme can be considered as lost. Moreover, the recycling of enzyme leads to problems in the
stabilisers (sorbitol and glycerol) and preservatives (sodium benzoate and potassium sorbate).
These compounds, as well as all components directly added to the enzyme for the
immobilisation process (acetone, ethanol or buffer) can play an important role in the
these components have inevitably varied: the lipase is adsorbed and its concentration is
reduced while glycerol and sorbitol are not and their concentrations are supposed to remain
identical (see section IV.6.1). The recycling of the unloaded lipase is thus synonymous of
restoration of initial proportions for all these components. If this adjustment were not done,
303
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
the recycling of the non-loaded lipase would lead to the production of non-homogeneous
the non-loaded lipase was considered as lost after immobilisation in our experiments. This
Figure IV.6-6 : Comparison between the yield of Candida Antarctica lipase B immobilization on Accurel
MP1001 using Protocol C (□ / right axis) and the resulting production cost of the immobilized lipase (◊ /
left axis) Dotted line represents the Novozyme 435® commercial price..
Figure IV.6-6 presents the calculated cost of immobilized CalB on Accurel MP1001. It
appears that the ratio between the support and the lipase quantities in contact has a drastic
effect on the resulting production cost. The higher the ratio between support and lipase, the
lower the production cost of immobilized enzyme. As expected, the least expensive enzyme is
obtained for the highest immobilisation yield with a minimal loss of enzyme. Compared to
Novozyme 435® commercial price, the production cost of CalB immobilized on Accurel
304
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Nevertheless, the immobilisation conditions which minimize the biocatalyst production cost
lead to a biocatalyst with the lowest relative specific activity. To obtain a given productivity,
higher enzyme quantity will be necessary and consequently, the reaction volume will be
The PBR is a column filled with a mass WENZ of enzymatic catalyst. The reactor is
characterized by its volume VPBR (L), diameter D (cm) and length L (cm). The PBR inner wall
The design was carried out according to the determination of the required quantity of each
immobilized lipase needed to reach a fixed productivity. These weights were calculated by
reference to the initial velocity obtained in batch reaction. In a batch reaction in a volume Vb
(L) with a mass Wb (g) of enzyme, the reaction rate r (mol.min-1.g-1) is defined as the
dS Wb
= r (Eq. IV-5)
dt Vb
integration of the equation IV-6 with So (M) the initial substrate concentration.
S
dS Wb
∫
S0
r
=
Vb
tb (Eq. IV-6)
The general equation of a PBR is given in equation IV-7 where ts (min) is the residence time
305
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
dS WENZ
= r (Eq. IV-7)
dt s VPBR
The mass of enzyme needed to transform S0 in S is given by equation IV-8 after integration of
equation 7, with Ts (min) the PBR residence time and with q the volumetric flow rate (L/min)
S S
V dS dS
WENZ = PBR
Ts ∫S r = q S∫ r (Eq. IV-8)
0 0
From equations IV-6 and VI-8, the general equation IV-9 for calculation of the required mass
in a PBR (Wenz) to ensure a fixed productivity and a fixed conversion rate is obtained. In our
calculation, a productivity of 10000 tons per year with a conversion rate X of 90% has been
Wb .tb
WENZ = q (Eq. IV-9)
Vb
The different corresponding volumes of PBR are computed from immobilized CalB apparent
density. The design of the PBR was achieved by adopting a ratio length to diameter equal to
8. Table IV.6-1 gives the characteristics of the PBR obtained for CalB immobilized on
Accurel MP1001 and the corresponding enzyme expenses Cenz (Cenz = Wenz x Costimmobilised
lipase). Because of the wide range of immobilized lipase production costs (see section IV.6.3),
the higher enzyme expenses correspond to the smaller reactors, which were obtained with the
smallest ratio between Accurel, and lipase quantities put in contact for immobilization.
306
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Table IV.6-1 : Characteristics of the PBR developed for different conditions of CalB immobilisation on
Accurel MP1001 using protocol C carrying out acetone for support pre-treatment.
The average investment costs for the PBR, assimilated to a tubular vessel, were
conventionally computed by using three different methods to make up for the low level of
Table IV.6-2 : Marshall and Swift Equipment Cost Index (MSECI) (1926 Index =100) and theChemical
Engineering Plant Cost Index (CEPCI) used in the reactor cost estimation.
307
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
All the computations have been updated by using the Marshall and Swift Equipment Cost
Index (MSECI) (1926 Index =100) and the Chemical Engineering Plant Cost Index (CEPCI)
presented in Table IV.6-2: a corrective factor corresponding to the ratio between index from
year of publication and index from present was used for update. AS304 stainless steel was
[52]
IV.6.5.1 General methodology of capital cost estimate : Chauvel et al. , Peters &
Timmerhaus [51].
The methods, proposed both by Chauvel et al. [52] and Peters & Timmerhaus [51]
are based on
the calculation of the reactor vessel weight. In order to cope with pressure forces applied on
reactor vessel inner wall, it is necessary to calculate the minimal thickness to be used for the
construction of the reactor vessel (equation IV-10) from the dimensions of the reactor and the
PD
t PBR = (Eq. IV-10)
2(αt − 0.6P )
where α is a coefficient of soldering (α equal to1 in our case) and t is the maximal acceptable
pressure for the chosen steel (t = 1195bar for AS304 stainless steel). P was estimated by the
calculation of pressure drops in the reactor according to Darcy’s Law (Reynolds number
calculation applied to the different reactors ranging between 9 and 15). Because support
particle size is large (1000µm), P appears to be very low (between 1,2 and 1,4bar).
Consequently, a traditional 8 mm thickness was adopted for design and it can be considered
The total weight of the PBR is calculated by determining the mass WPBR (kg) of the tubular
vessels and their two circular ends presenting a surface area equal to the reactor vessel section
and the same thickness (equation IV-11). ρs is the volumetric mass for the considered
material.
308
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
1
WPBR = π tPBR ρs ⋅ ( D + 2t PBR )2 + L( D + tPBR ) (Eq. IV-11)
2
Chauvel et al. [48] have established relations between the reactor vessel diameter and the price
(€/kg) of plant vessel. This abacus graph is given for ordinary steel materials and for a reactor
vessel thickness of 1 mm. We have converted the abacus graph for vessel diameter ranging
from 250mm and 1250mm with a correlation coefficient of 0.9828. The calculation of reactor
ff is a form corrective factor (2.8 for reactor diameter below 1m and 2.5 for diameter ranging
between 1m and 1.5m), ft is a corrective factor for thickness (1 in our case) and fm is a
[51]
Peters and Timmerhaus have directly described the costs of reactor vessels in US dollars
as a function of their mass. From this abacus, the following equation IV-13 has been deduced
with a correlation coefficient of 0.9968 over a range of weight from 250 kg to 1250kg.
577.6 × WPBR
0.67
CPBR = (Eq. IV-13)
R$
where an average exchange rate R$ of 1.471 [53] between dollar and euro for 2009 was used.
[50]
Turton et al. suggest a relation for the procurement cost C 0p of equipment operating at
ambient pressure and using carbon steel construction (equation IV-14), expressed as.
309
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
A is the capacity or size parameter for the equipment. In the case of PBR, A is equivalent to
the volume of the vessels (between 0,3 and 520 m3). K1, K2 and K3 are data given by abacus
and are equal to 3.4974, 0.448 and 0.1074 respectively, in the present case.
The cost of the desired equipment CPBR is obtained by giving a material factor and bare
B1 and B2 are constant depending on the type of vessels and are given in abacus graphs (equal
to 2.25 and 1.82 respectively in our case). FM is a material factor (FM=1.8 in our case). FP is a
The three methods provide similar trends, exhibiting a similar order of magnitude. The
variation between the three methods was found under the 25% of the method general
accuracy. Therefore, the three capital cost estimations can be averaged in Figure 7. Contrary
to the cost of immobilized enzyme which can vary greatly, the average PBR costs are slowly
increasing from 22k€ to 33.3k€. The reactor cost estimated for Novozyme 435® is about
17.8k€.
310
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Figure IV.6-7 : Comparison between the costs of packed bed reactor designed for different conditions of
immobilization of CalB on Accurel MP1001 (◊) and the cost of corresponding volumes of immobilized
enzyme (∆).
The costs presented in Figure IV.6-7 are the procurement costs of the developed PBR and of
the respective content of lipase. It does not take into account its use in production conditions
(reactor depreciation, lipase renewal …) which is dealt with in the next section 3.6.
Nevertheless, the difference between these unit costs has to be highlighted, the purchase costs
for the lipase being substantially higher than for the corresponding PBR. The difference can
vary to a great extent, from one immobilization condition to another. For instance, a factor 10
is observed when 20g of Accurel per L of immobilization medium were used and a factor 2 is
311
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
The adequate choice of the immobilized lipase is carried out by maximizing the process net
[50-52, 54, 55]
present value (NPV) . It represents the difference between the global incomes and
the global expenses (investments, maintenance and operating costs) (equation 16). The NPV
is generally calculated over the process lifetime. In our calculation, it was assimilated to the
process depreciation time (tD) which was commonly fixed to 10 years. The general calculation
is given in relation IV-16, considering the country tax rate a (33% for France) and a price
deflator i (fixed at 10% over 10 years) to cope with inflation over the process lifetime.
E (t d / t enz )
td
( Rprocess − E process − Dprocess).(1 − a) + Dprocess n.Cenz
NPV = − I process + ∑ − ∑ (1 + i ) (Eq.IV-16)
p =1 (1 + i) p
p=0
p.tenz
Iprocess represents the battery limits investment. It involves the costs of every process
component (reactor, pump, heat exchanger, process lagging up, upstream and downstream
process). Eprocess represents the process operating costs (raw materials, utilities, labour …).
The costs due to the catalyst Cenz have to be treated separately from others. As usual, these
costs have been taken into account at year 0 and are added to the operating costs, according to
the own enzyme lifetime tenz. Consequently, an additional term is considered only at the year
corresponding to enzyme replacement The number of replacement is defined by the entire part
of the ratio between the process and enzyme lifetimes E(td/tenz). If the immobilized lipase
stability is under 1 year, a factor n is necessary to increase the catalyst costs by the number of
change per year. For a lipase stability up to 1 year, the factor n is equal to 1.
Dprocess are the process depreciation charges and are considered as linear over the depreciation
312
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Rprocess represents the global incomes associated with the process operating. Rprocess directly
depends on the productivity and on the manufactured product selling price. Considering a
fixed production for the different PBR, Rprocess is constant whatever the considered
immobilized lipase. Thereby, the NPV is maximised when the global expenses Etotal are
E (t d / tenz )
td
( E process + D process ).(1 − a) − D process n.Cenz
Etotal = I process + ∑ + ∑ (1 + i ) (Eq. IV-17)
p =1 (1 + i) p
p =0
p.tenz
The process production being fixed, only the expenses directly dependent on the nominal
lipase activity are variable. All the other expenses (heat exchanger and pumping system
expenses, energy and labour costs etc…) are constant and are not involved in the
discrimination of the different immobilised lipases. Therefore, the minimisation of Etotal can
be simplified by the minimisation of the only investments made for PBR design and the only
E (t d / t enz )
n.Cenz td
− aDPBR
E = I PBR + ∑ (1 + i )
p =0
p.t enz
+∑
p =1 (1 + i )
p
(Eq. IV-18)
where IPBR are PBR investment costs and DPBR are the PBR depreciation charges.
The lipase total cost over the reactor lifetime is highly dependent on the stability of the lipase
(lifetime tenz) and thus on its renewal. For example, if a price deflator i of 10% and an enzyme
lifetime of one-year are considered, the lipase cost at termination (10 years) is increased by a
factor of 7.1 as compared to the unit cost of one packing load (Figure IV.6-7). This factor
313
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
Figure IV.6-8 : Total reactor and enzyme cost optimisation for a butyl-oleate production of 10000 tons per
year, for a process lifetime of 10 years with an enzyme renewal every 6 months (◊), 12 months (□) and 24
months (∆). Filled symbols represent the expenses calculated for Novozyme 435® considering a stability of
Figure IV.6-8 presents the global costs as calculated with equation 17 for every quantity of
Accurel used during immobilisation. Several scenarios in terms of enzyme stability were
sunflower oil at lab scale and pilot plant scale was perfectly stable during 3 months with no
[2]
change in conversion and no modification in product profiles . In view of such stability, a
biocatalyst replacement time of 6 months (and more) was considered as reasonable. In all
cases, the shape of the respective curves is identical: the expenses are drastically decreasing
314
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
when the quantity of Accurel used for immobilisation is increased from 8 to 60g of Accurel /L
of immobilisation medium, even if the corresponding volume of PBR is increased (see Table
IV.6-1). After this point (60g/L), the decrease of lipase activity is not compensated for any
longer by the price decrease and the high volume increase leads to an additional cost increase.
turns out to be the best option to be considered in an industrial context. According to Figure 6,
the corresponding immobilisation yield lies between 80 and 90%, which corresponds to a
Thereby, the costs involved in the PBR only represent between less than 0.15% and 7% of the
total costs. The design of an enzymatic process appears to depend almost only on the cost of
the catalyst and the reactor costs have thus a very limited impact whatever its volume.
Therefore, it is not necessary to develop the smallest reactor with the highest enzymatic
activity but on the contrary, to find the enzyme allowing the lowest price whatever the reactor
size.
If the principle of maximization of the process net present value is valid for any reactors, the
three methodologies of capital cost estimate which were used in this study refer to range of
reactor volumes developed for chemical industry i.e. large volumes. For smaller productions
IV.6.7 Conclusion
CalB, one of lipases the most used in the industry, is only commercially immobilized on a
medium hydrophobic support, the Lewatit VP OC 1600. For numerous applications, this
support can be source of polar compound adsorption leading to a loss of lipase activity.
315
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
MP®. An economic evaluation of the global costs enables the ratio between the quantity of
support and the quantity of enzyme used for immobilization to be optimized. From an
economic point of view, the protein adsorption yield has to be maximized, even if the catalyst
is less active and the reactor volume higher. The new immobilized enzyme enables to avoid
glycerol (and other polar compounds) adsorption and would permit long-lasting continuous
transesterification reactions.
Acknowledgements
Work was financially supported by Syngenta Seeds SAS and the ‘Association Nationale de la
Recherche et de la Technologie’ (ANRT). The authors wish to thank Blandine Cuny for
English corrections.
IV.6.8 References
316
IV-Immobilisation de CalB : une analyse économique
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321
.
V : PUBLICATION N°4: Production continue de bio- kerozene par esterification en zy matique des huiles produits par les microorganismes.
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
MICROORGANISMES.
Olivier Galya, Etienne Séveraca, Yohann Alloucheb, Pierre Monsana & Alain Martya*.
Toulouse, France
Toulouse, France
Procédés, Institut National des Sciences Appliquées, 135 Avenue de Rangueil, 31077
Toulouse Cedex4, France, Tel : +33 (0)5 61 55 94 39, Fax : +33 (0)5 61 55 94 00, Email :
En preparation.
(Impact factor:)
323
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
V.1 Résumé
Une seconde stratégie de production d’esters a été développée au cours d’un projet connexe
de production d’esters ramifiés pour une application bio-kerosene. Les matières premières
envisagées sont des huiles produites par microorganismes (Yarrowia lipolytica) qui
contiennent 50% de triacylglycérols et 50% d’acides gras libres. Le contrôle des phénomènes
de partition du glycérol et de l’eau conjoints est problématique. Ainsi, une stratégie en deux
étapes (hydrolyse suivie d’une estérification des acides gras) a été considérée comme
judicieuse.
d’un réacteur continu, il a été choisi de modéliser ces huiles en utilisant des huiles végétales.
Le procédé est donc totalement transposable et correspond à l’optique de ces travaux de thèse.
La première étape d’hydrolyse n’est pas abordée dans cet article, qui expose l’optimisation de
la réaction d’estérification en réacteur à lit fixe. L’hydrolyse peut être réalisée efficacement
par voie chimique ou par voie enzymatique. Plusieurs milieux réactionnels ont été envisagés
réaction : présence d’un solvant plus ou moins polaire (butanone, tert-butanol, 2-méthyl-
(100% de conversion) permet de déterminer les conditions limites dans lesquelles aucun
être problématique aux concentrations les plus élevées, tous les systèmes réactionnels
système sans solvant, un ratio molaire entre alcool et acides gras supérieur à 2,5 est
324
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
nécessaire. Les systèmes réactionnels envisagés sont donc performants pour une bonne
Le contrôle de l’activité de l’eau (aw) est également un paramètre essentiel à contrôler. L’aw
influe sur l’activité enzymatique et donc sur les quantités nécessaire d’enzyme pour assurer la
production. Quelque soit le système réactionnel envisagé, l’aw est apparue d’autant plus
importante que la concentration initiale en acide gras est élevée. Une concentration de 1 M
semble être le meilleur compromis entre productivité, vitesse réactionnelle et conversion ; une
telle concentration résulte en une aw finale comprise entre 0,37 et 0,4 selon le système
réactionnel.
composés entrant en jeu (substrats et produits). Les vitesses réactionnelles ont été mesurées en
réacteur batch et le quotient K (l’activité de l’ester a été calculée pour différentes valeurs de
conversion de 85% et 90%). De cette analyse, il ressort que le milieu sans solvant résulte en le
plus faible quotient K (et correspondrait aux meilleurs rendements) tout en permettant une
activité enzymatique raisonnable. Le milieu sans solvant a donc été retenu pour le
1ml.min-1 et un rapport molaire entre isobutanol et acides gras de 3 permettent d’obtenir une
conversion de 85% et une productivité de 129 tonnes par an et par kg de Novozyme 435. Cela
représente une augmentation de productivité d’un facteur 9,3 par rapport à la productivité
obtenue avec la réaction de transestérification. Ce réacteur a été stable pendant une période de
54 jours consécutifs.
réacteurs en série, l‘un contenant 2g de Novozyme 435, l’autre 1g et séparé par un système de
325
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
séparation de l’eau produite dans le 1er réacteur. Une conversion de 96% à 98% (selon la
matière première) est ainsi obtenue. Dans ce cas, la productivité fut calculée à 100 tonnes
d’ester par an et par kg de Novozyme 435. Une rapide analyse financière montre que les
par ce procédé.
Mots clés: Bio-kérosène, Novozyme 435, estérification, réacteur à lit fxe, thermodynamique,
326
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
Olivier Galya, Etienne Séveraca, Yohann Alloucheb, Pierre Monsana & Alain Martya*.
Toulouse, France
Toulouse, France
Procédés, Institut National des Sciences Appliquées, 135 Avenue de Rangueil, 31077
Toulouse Cedex4, France, Tel : +33 (0)5 61 55 94 39, Fax : +33 (0)5 61 55 94 00, Email :
In preparation.
(Impact factor:)
327
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
V.2 Abstract.
acids resulting from the hydrolysis of lipids produced by the oleaginous yeast Yarrowia
lipolytica was optimized for a biokerosene application. Different solvents and a solvent free
system (SFS) were tested as reaction medium, using Cosmotherm software to maximize the
rate, conversion at equilibrium, productivity, and reactor stability. The SFS was shown to be
the best medium and had the advantage of being green. This system was consequently used to
optimize a continuous process with a packed bed reactor of Novozyme 435, which was shown
efficient whatever the fatty acid used. Microbial fatty acids were efficiently (97%) converted
in esters, with a high productivity of 100 tons per year and per kg of enzyme. The reactor was
perfectly stable over a period of 54 days and enzyme represents only 1.4% of the cost of
Microbial oils.
328
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
V.3 Introduction
As petroleum resources dwindle, the renewable exploitation of carbon for the production of
energetic biomolecules is a great challenge. A further major challenge in the coming years is
reducing greenhouse gas emissions. The aerospace domain is particularly concerned by these
two issues. The kerosene produced for aviation represents about 5.9% of the oil refined
worldwide and 12% of the fuel used for transport [1]. As a result, kerosene is an increasingly
important target for biofuel. Although diesel can be replaced or supplemented by methyl or
ethyl esters from vegetable oils, kerosene is 100% the product of atmospheric distillation of
petroleum. So far, only a few studies have described molecules that could be used to replace
or complement kerosene, and the only molecules tested are produced by energy consuming
processes with a negative CO2 balance: GTL (the gas to liquid process from coal) or products
of the Fischer Tropsch reaction [2]. Among potential targets that can be prepared from
renewable feedstocks, fatty acid alkyl esters (FAAE) are promising molecules [3].
At present, the limitation of the traditional production of fatty acids from plant oils is
competition with the food industry [4]. Consequently, the production of fatty acids by
substrates is thus an attractive alternative [5]. It has major advantages such as the possibility
of controlling and modulating the fatty acid profile by combining fermentation strategies and
the construction of genetically modified strains [5]. The overall cost of the biofuel process
could be reduced by recycling the main by-products of the biodiesel industry (particularly
glycerol) as substrates for the microorganism [6]. Finally, the high quantitative and qualitative
329
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
Among micro-organisms such as yeasts, green algae and oleaginous prokaryotes, yeasts are
the best target for oil production as they provide the best performances in terms of biomass
production, maximum lipid content and volume productivity [5]. The good knowledge of
yeast physiology and genetics makes it possible to engineer strains to control the FA
Previous studies in our laboratory in collaboration with Airbus showed that the oleaginous
yeast Yarrowia lipolytica is a good candidate for biokerosene production [7]. In nutrient
lipid production rate of 0.31 kg.m-3.h-1 [7]. The specificity of the oil produced by Y. lipolytica
is the accumulation of an equimolar mixture of triglycerides and free fatty acids. The main
fatty acids are palmitic acid (11%), oleic acid (28%) and linoleic acid (51%) [7].
Aircraft fuels are much more specific and involve stricter technical constraints than fuels for
any other civilian transport device. Indeed, some fuel properties are mandatory (freezing point
below -47 °C to ensure high altitude flight capabilities, sufficiently high thermal stability to
ensure engine cooling capability). Consequently TAG needs to be transformed into esters to
lower the freezing point and decrease viscosity. The optimal freezing temperature of oleic
acid esters with a linear alcohol is obtained with a butyl ester (-35.7 °C) [8]. Branched esters,
obtained with secondary alcohols (2-propanol and 2-butanol) or ramified alcohols have lower
called triacylglycerol acylhydrolases EC.3.1.1.3) has been extensively studied in recent years
[9-12]. But despite the great potential of -and the great interest in- enzymatic catalysis,
industrial FAAE production processes involving lipases are still very limited. The main
330
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
challenge of such processes is minimising the cost of the lipase by developing long-lasting
continuous production processes, in which the lipase does not need to be replaced for weeks,
months or even longer [13-14 In biocatalysis, controlling the partition of the polar reaction
products and co-products between the reaction medium and the enzyme support is the most
important [15-16Adsorption of polar compounds like water or glycerol onto the enzyme
support limits diffusion, which, in turn seriously affects the stability of packed-bed reactors
by reducing the access of hydrophobic substrates to the enzyme active site [13, 15-16]. In the
case of Y. lipolytica oil comprising an equimolar mixture of triglycerides and free fatty acids,
it would be difficult to control both water and glycerol production. The best way would thus
be first to hydrolyze the oil, then to recover glycerol and free fatty acids and then, in the
The objective of the present study was to develop a continuous enzymatic process for the
esterification of free fatty acids to produce biokerosene. To minimise the freezing point of the
resulting esters, two branched alcohols were tested: isobutyl alcohol (2-methyl-1-propanol)
and isoamyl alcohol (3-methyl-1-butanol). At the same time, a mixture of oleic acid and
linoleic acid was used to mimic the composition of the hydrolysed oil produced by Y.
lipolytica. A second set of experiments was conducted to mimic the alkanes present in
kerosene, using short fatty acids (C10, C12 and C14). The production of these specific fatty
acids with Y. lipolytica is currently under development in our laboratory. The reaction
331
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
V.4.1 Material
Commercial immobilized lipase B from Candida antarctica, (Novozyme 435) was a gift from
Novozymes (Bagsvaerd, Denmark). Oleic acid (technical grade 90%), pure grade >99% fatty
acids, reactive alcohols (pure grade >99%): 2-methyl-propanol (isobutyl alcohol), 3-methyl
butanol (isoamyl alcohol), methanol and ethanol were purchased from Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA). All other chemicals and solvents were of the highest purity and were
purchased from Acros Organics (Geel, Belgium). All reactants were dehydrated and stored
with activated 3Å molecular sieves purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Batch reactions were carried out in 7 ml teflon capped glass tubes under magnetic stirring
(250 rpm) at controlled temperature (60 °C). The reaction mixture consisted in different
amounts of technical grade OA (from 100 mM to 1500 mM), and different amounts of
alcohols (alcohol:OA molar ratio from 1 to 20). Reactions were started by adding the
immobilized enzyme (10 mg.ml-1 of reaction). Reactions were performed with or without
solvent. At specified times, 100 µl samples were taken in the reaction medium. The reactions
were stopped by centrifugation at 13 500 rpm for 2 minutes using an Eppendorf 5415D
The reactor was a fixed-bed type. It consisted of a column (10 mm in diameter), maintained at
332
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
oleic acid (with concentrations ranging from 500 mM to 1500 mM) and isobutanol (at
different alcohol:OA molar ratios) previously dried with activated molecular sieve, was
pumped using an ISO-3100SD Isocratic Pump (Dionex, USA) thus percolating the enzyme
through the packed bed. At specified times, samples (1 ml) were recovered from the outflow
Water removal from the reaction medium was tested using several discontinuous approaches.
1. Water and alcohol were completely evaporated under vacuum (60 °C/10 mbar). Ester and
unreacted FA were then recovered and alcohol added in order to reconstitute the appropriate
amount of medium. 2. The reaction medium was incubated with an activated molecular sieve
Water was then continuously removed using a 150 ml glass column (3 cm in diameter)
scattered with about 30 glass deflectors. The column was connected in series between two
packed reactors. The first reactor (2 g of Novozyme 435) fed the dehydration system through
the side of the upper part of the column. The reaction mix was recovered from the lower part
of the column through a tap, and pumped into a second reactor (1 g of Novozyme 435) with
an isocratic pump (ISO-3100SD, Dionex, USA). Two sintered glass discs (1 cm in diameter)
formed the base of the two columns. The bases were connected to a gas tubing system
(nitrogen network with controlled flow). When the system was operating, gas was bubbled
into the column, where it circulated against the current of the reaction mix and was recovered
at the top of the column. The dehydrated medium was used to feed a second reactor
333
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
Analysis was performed using a Dionex Ultimate 3000 HPLC system, equipped with a
Shodex RI-101 Refractive Index Detector (Showa Denko Europe, GmbH, Munich, Germany)
and a Zorbax SB-C18 Column (4.6 mm x 250 mm x 5 µm) (Agilent technologies, Santa
Clara, USA). Elution was carried out at 40 °C isocratically with methanol + 1% v/v acetic
acid as mobile phase and a flow rate of 0.5 ml.min-1, and the 20 µL samples were then
analyzed. Detection was performed at 40 °C. Calibration was carried out with pure standards.
Before use, immobilised Novozyme 435 was equilibrated with activated molecular sieve to
reduce water activity at 0.1. Water activity was determined with Humidat IC II (Novosina,
Switzerland) calibrated with saturated salt solutions (LiCl aw=0.113; Mg(NO3)2 aw=0.529;
KCl aw=0.936) [17].Water concentration in the reaction media was determined using a Karl
The lack of a fully functional enzymatic industrial process is mainly due to the failure to
absorb the cost of the enzyme in the process, meaning this process cannot compete with
chemical catalysis. So to use an enzymatic process at industrial scale, the price of the enzyme
has to be reduced by optimisation of a continuous system which remains stable over a long
period of time.
334
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
The stability of the immobilised enzyme is a key factor in the economic feasibility of a
continuous process. It can be achieved by the correct control of the operating conditions
(temperature, pH, etc.) but also through the choice of a solvent system which can solubilise
and then evacuate the water generated by fatty acid esterification. In this case, it is necessary
to maintain water activity at the optimal value depending on the enzyme concerned
(Colombié et al., 1998). When selecting the solvent, hazardous solvents and solvents with a
boiling point (BP) that did not agree with our enzyme operating conditions were excluded. A
first set of solvents with logP values ranging from 0.29 to 1.52, was selected: butanone
BP =102 °C) and diisopropyl ether (logP=1.52, BP=69 °C). A solvent free system (SFS),
solely composed of the mixture of reactants, with Isobutanol (LogP=0.75, BP=108) playing
the role of reactant and solvent, was also considered. Upgrading an efficient solvent free
The COSMO-RS method has already been used to calculate the solubility of water, and the
model [19]. In contrast to group contribution methods, which are based on experimental data,
COSMO-RS calculates the thermodynamic data from the molecular surface polarity
complex mixtures [20]. Quantum calculations were performed using Turbomole software.
335
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
Esterification of oleic acid (OA) with isobutanol at 60 °C was chosen as a model reaction,
after checking that the enzyme, Novozyme 435, presents the same activity towards palmitic,
oleic, and linoleic acids (the main fatty acids present in Y. lipolytica oil) (data not shown).
Three molar ratios between alcohol and fatty acids (1, 2 and 3) were tested and two
concentrations of fatty acids were chosen (1 and 1.5 M) to ensure high productivity and to be
able to observe the influence of solvent polarity. Indeed, at an oleic acid concentration of 1 M,
the proportion of the solvent represented 59%, 50% and 40% of the reaction volume for
alcohol:acid ratios of 1, 2 and 3 respectively; and 39%, 25% and 11% for an initial oleic acid
Computing water solubility makes possible to quantify the risk of phase separation. For all the
media tested, water solubility decreased as the reaction advanced (from 6% to 20% between
0% and 100% conversion, depending on the ratio, OAi and the solvent used) (data not shown).
Its solubility is a consequence of the decrease in medium polarity due to alcohol consumption
and the replacement of fatty acid molecules by the more hydrophobic ester molecules.
Therefore the critical point is the reaction end point when the production of water reaches
maximum. For this reason, only 100% conversion was considered when presenting the
results. Figure V.5-1 shows calculated solubility calculations for the different solvents.
All the solvents were able to solubilize the water produced by the reaction. The only limit was
encountered with the use of diisopropyl ether with an OAi of 1.5 M and a ratio of 1. At an
OAi of 1.5 M, the difference between solvents was less marked due to the low volume of
solvent present in the system. Changes in water solubility in the different solvents were
correlated with the polarity of the solvents. For a given solvent, the effect of the molar ratio of
336
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
alcohol to fatty acids on water solubility was low. Increasing this ratio was not favourable for
the two more polar solvents, due to the replacement of the solvent by a more hydrophobic
molecule, alcohol. The opposite phenomenon was observed in the case of the two more
hydrophobic solvents. This is in agreement with the fact that the isobutanol LogP
(LogPisobutanol = 0.75) lies between the LopP of the two sets of solvents.
Figure V.5-1: Computed water solubility in the reaction media at 100% conversion at 60 °C with OAi = 1
M (A) or 1.5 M (B) and three initial IB:OA ratios, Ratio = 1 (black bar), R = 2 (gray bar) and R = 3 (light
gray bar). The black line represents the water concentration generated by the reaction. Solvents are
ranked based on their increasing polarity index. In solvent-free system (C), computed water solubility (□)
and theoretical water concentrations produced (▲) were represented in reaction media at 100%
337
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
In the solvent-free system, the concentrations of oleic acid and alcohol are interdependent.
Water solubility was calculated with an alcohol:acid ratio ranging from 1 to 10. Figure V.5-1-
C shows model results compared with the theoretical water concentration produced at 100%
conversion. The water produced was fully solubilised into the medium at ratios above 2.5. At
lower ratios, the phases are likely to separate at 100% conversion, which could be a problem
in a continuous reactor.
Water solubility is not sufficient to predict the performance of the reactor. Indeed, enzyme
activity and conversion at thermodynamic equilibrium are tightly linked to water activity in
the enzyme’s environment. The optimal water activity for Candida antartica Lipase B
immobilized on polypropylene is 0.1 [21]. Given that the nature of the support has only a
minor influence on optimal aw [22], Novozyme 435 can be assumed to have the same range of
optimal aw.
Figure V.5-2-A shows water activities in the different reaction media as a function of the
stage of advancement of the reaction at three different initial concentrations of oleic acid (OAi
0.5 M, 1 M and 1.5 M) and for an initial IB:OA molar ratio of 3 calculated at 60 °C. For the
SFS esterification reaction, three IB:OA molar ratios were used for the model to obtain
similar OAi concentrations as for the other solvent systems (Figure V.5-2-B). This implied
molar ratios of 18.3, 7.4 and 3.8 respectively and enabled the comparison of performances in
terms of volume productivity between SFS and other solvent systems. For an OAi of 0.5 M,
water activity did not exceed 0.2 at 100% conversion, except for the most hydrophobic
solvent, diisopropyl ether. At 1 M, water activity ranged between 0.37 and 0.43 depending on
338
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
the solvent (0.57 for diisopropyl ether). At 1.5 M, variation in aw between solvents was lower
(ranging from 0.71 to 0.8). Indeed, at this high OAi, the influence of the solvent was reduced
as it represented only 11% of the reaction volume. Surprisingly, tert-butanol reduced aw more
efficiently than butanone in contrast to the differences observed in logP. This could be due to
In a plug flow reactor, water is partitioned between the reaction medium and the enzymatic
support. aw values increase along the reactor length. At steady state, the water activity of the
enzymatic support is in equilibrium with the activity of the liquid phase. In other words,
From a kinetic point of view, it is thus necessary to find a compromise between productivity
and the activity of the enzyme and consequently between productivity and the quantity of the
enzyme.
339
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
Figure V.5-2: Variations in aw in the reaction medium as a function of the stage of advancement of the
reaction (with 10% of conversion increments) in solvent systems (A) or solvent free-system (B). For
solvent systems, aw values were modelled for butanone (◊), tert-butanol (▲), 2M2B (■) and diisopropyl
ether (∆) for OAi=0.5 M (dashed line), 1 M (black line) and 1.5 M (dot-dashed line) with a constant initial
IB/OA molar of 3. For solvent-free system aw values were modelled for three IB:OAi molar ratios: 3:8 (●
& dashed line), 7:4 (● & black line) and 18:3 (● & dot-dashed line) corresponding to OAi of 1.5 M, 1 M
The use of an OAi of 1.5 M was too high to maintain efficient enzyme activity (water activity
being between 0.71 and 0.8 at 100% conversion). At this value, enzyme activity was less than
with a final aw varying between 0.37 and 0.44 depending on the system (diisopropyl ether
being discarded), associated with a low aw and with good volume productivity. At this value,
enzyme activity was 50% of optimal activity. It should be noted that high volume
productivities are associated with high aw values. This phenomenon is a further justification
340
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
for the use of a plug flow reactor rather than a stirred tank reactor, in which aw will be at this
Water activities obtained in solvent-free systems were of the same order of magnitude as
those obtained in the presence of solvents (0.71, 0.4 and 0.17 for OAi of 1.5, 1 and 0.5 M
The activities of all the reactants in the reaction medium will influence the reaction
equilibrium. OA and isobutanol activities (aOA and aalc respectively) have to be as low as
possible, whereas water and ester activities (aester), have to be as high as possible to maintain
aester .a w
K= (Eq. V-2)
aOA .a alc
The value of K was calculated in the different solvents for different initial substrate
concentrations (0.5, 1 and 1.5 M), and as a function of the conversion (Figure V.5-3 In
presence of solvents, an IB:OAi ratio of 3 was selected, and for SFS the ratio differed
according to OAi (ratio of 18.3, 7.4 and 3.8 corresponding to OAi = 0.5, 1.0 and 1.5 M
respectively). This strategy was chosen so productivity could be compared. Whatever the ratio
and the conversion, butanone gave the highest K value, even if the polarity of this solvent
reduces water activity (3 times compared to the more hydrophobic solvent diisopropyl ether).
This positive effect is largely balanced by an increase in ester activity and a decrease in
alcohol activity (data not shown). Water and alcohol activities were the highest in diisopropyl
ether, while acid and ester activities were the lowest, the balance is consequently less positive.
2M2B and tert-butanol led to almost the same K value in all the conditions tested. Variations
in water and alcohol activity were balanced by variations in oleic acid and ester activity.
341
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
A solvent-free system appeared to be the best reaction medium to reduce the K value. A
solvent-free system makes it possible to maximise acid activity and to minimise ester activity.
From the point of view of water activity, only butanone and tert-butanol were shown to be
better than SFS. The main positive influence on K is the large positive increase in alcohol
Figure V.5-3: Comparison of K values calculated from modeled activities at hypothetical conversions of
85% (A), 90% (B) at 60 °C. For calculations in presence of solvent, OAi 0.5 M (◊), 1 M (□) and 1.5 M (∆)
and an IB:OAi molar ratio of 3 were selected. For the solvent-free system, OAi = 0.5 M, 1 M and 1.5 M,
corresponding respectively to IB:OAi molar ratios of 3.8, of 7.4, and of 18.3 were selected.
342
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
rates and the thermodynamic equilibrium in batch reactors with an initial oleic acid
concentration of OAi = 1 M and an IB/OA molar ratio of 3 in solvent systems and of 7.4 in
the solvent-free system (table 1). Initial water activities of both the enzymatic support and the
reaction media were adjusted using an activated molecular sieve to a value of 0.03. From the
point of view of kinetics, the higher the solvent polarity, the lower the activity. These results
are in agreement with data published by Sandoval et al. (2001) [24], who underlined the fact
that, apart from thermodynamic effects, the polarity of the solvent has a direct influence on
the activity of the enzyme. For instance, at the extremes, activity in butanone was only 19%
of activity in diisopropyl ether. In SFS, activity was the same that observed in 2M2B: 810
calculation of the K value, solvent free appeared to be the best system, as it led to 95.3%
conversion. Even if the polarity of Tert-butanol, 2M2B and di-isopropyl ether differed
considerably, they produced similar results, around 88% of conversion. Only the behaviour of
butanone was not very well predicted. K modelling showed it to be the worst solvent, whereas
concentrations, it does not depend on the reaction medium. The predicted Keq was relatively
constant (18.5 +/- 19%) except for butanone whose Keq was significantly higher than in other
solvents.
343
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
Table V.5-1: Initial rates and steady-state conversion of esterification batch reaction of OA by IB.
Reaction conditions: volume 3 ml, 1M OA; IB:OA molar ratio 3 (ratio 7.4 for SFS) at 25 °C, under
continuous stirring at 1000 rpm. Initial water activity of the enzyme and the solvent were fixed at 0.03. aw
and Keq activity values were calculated using the activities modelled for each reaction component at
Tert-
Initial rate
µ mole Ester/ min / g Novozyme 435 220 640 810 810 1150
At the end of the modelling study and of the experimental part, the solvent-free system
appeared to be the best compromise both from a kinetic and thermodynamic point of view. In
addition, the SFS will lead to the best volume productivity and the fact it is green is
undoubtedly a further advantage. For all these reasons, we decided to optimise a continuous
As underlined above, the ratio between the two substrates, oleic acid and isobutanol, has a
major influence on both the kinetics and the conversion obtained at equilibrium. This
parameter was then tested in a range from 3 to 7.8, corresponding to an initial oleic
concentration ranging from 1 to 1.7 M (Figure V.5-4). For each ratio, three flow rates were
tested, 0.1, 0.5 and 1 mL.min-1. This range was chosen based on the similarity between a
batch and a plug flow reactor (data not shown), which was obviously pertinent. For instance,
344
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
at a ratio of 7.8 (1 M oleic acid), the maximum conversion (95.2%) obtained in the batch
system (table 1) was achieved with a flow rate of 0.1 mL.min-1. A five-fold higher flow rate
made it possible to reach 99.4% of this maximum value. Finally, a flow rate of 1 mL.min-1 led
to 95% of this maximum value. To maximise productivity, the 1 mL.min-1 flow rate was
Figure V.5-4 : Influence of the IB:OA molar ratio on continuous conversion of OA in SFS at flow rates of
1 ml.min-1 (■), 0.5 ml.min-1(▲) and 0.1 ml.min-1(●). Operating conditions: packed bed reactor containing
Not surprisingly, an increase in the molar ratio led to an improvement in conversion. A shift
in the ratio from 3 to 7.8 increased conversion by approximately 5 points whatever the flow
rate used. The use of high IB:OA ratios, even if associated with higher conversion rates, had
the disadvantage of dramatically reducing volume productivity (Figure V.5-5). IB:OAi ratios
345
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
of between 2 and 3 led to the best volume productivity, exceeding the 129 tons of esters per
year and per Kg of enzyme. With this ratio, the performance of the reactor decreased
productivity (129.3 tons of ester produced per year and per Kg of enzyme) and the conversion
rate (85%).
Figure V.5-5 : Conversion measured in the reactor outflow (▲) and pure ester productivity (□) vs. IB:OAi
molar ratio. Operating conditions: packed bed reactor containing 2 g of Novozyme 435, flow rate: 1
In these operating conditions (1.7 M OAi, ratio 3, 1 mL.min-1 flow rate, 2 g of enzyme, 60
°C), no decrease in reactor performance was observed over a period of 54 days. Our
experiment, consolidated by previous studies [25], suggests that the lifetime of a packed-bed
reactor using a stable enzyme like Novozyme 435, operated in our optimized conditions, is at
least a year. In particular, this was possible due to perfect control of water activity inside the
346
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
reactor, a solvent-free system enabling the water produced by the reaction to be evacuated in
To improve the conversion of the fatty acid at the process outflow, and hence the purity of the
ester, we investigated the possibility of combining two plug flow reactors separated by a
system that made it possible to decrease water activity in the flow into the second reactor. The
first reactor corresponded to the previously optimised one containing 2 g of enzymes and fed
with a flow rate of 1 mL.min-1. In these conditions 85.4% conversion was achieved. The
explored the feasibility of this dehydration strategy using two discontinuous methods (i) using
a molecular sieve able to capture the water produced in the first reactor; (ii) complete
stripping was developed. The dehydrated medium obtained using these three methods was
sent to a second reactor filled with Novozyme 435, to conclude the esterification process.
The quantity of enzyme (1 g) in the second reactor was optimised (data not shown). A final
conversion rate of 98% was achieved whatever the method used for water removal.
To extend the application scope of the conversion process to the production of new FAAE
targets, new esters were produced using another source of FA (linoleic acid (C18:1), myristic
acid (C14), lauric acid (C12) and decanoic acid (C10)) with isobutanol or isoamyl alcohol as a
source of alcohol. These experiments confirmed that the FA originally present in microbial oil
347
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
could be entirely converted into FAAE, and that it was possible to produce a second
The previously used operating conditions (alcohol:FA molar ratio of 3, flow rate of 1 ml/min,
60 °C, dehydration using a molecular sieve or a dehydration column) were applied and
enabled the production of nine new combinations of FAAE. For the production of FAAE
from myristic acid, it should be noted that we had to pre-warm the input to 60 °C to prevent
solidification of the reaction medium at ambient temperature. Performances observed with the
new FAAE were the same as those obtained with isobutyl-oleate, confirming the versatility of
Finally, we used the enzymatic process we developed to esterify the oil produced by the yeast
Y. lipolytica, after its complete hydrolysis into fatty acids. The fatty acid mixture mainly
comprised palmitic acid (11%), oleic acid (28%) and linoleic acid (51%). The performances
were exactly the same as those observed with pure fatty acids, i.e. 97 tons of isobutyl esters
(100 tons of isoamyl esters) produced per year and per kg of enzyme with a conversion rate of
We made a cost projection for FAAE production at industrial scale based on the process
described in this paper. About 1 ton of enzyme would be required for the production of
100 000 tons of ester per year in 365 working days. Considering a sales price of about
0.75€/Kg for kerosene, the price of Novozyme 435 being 1100€/Kg (with a one-year
lifetime), the production of ester would generate 1.1 M€ and the price of enzyme would
348
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
Table V.5-2: Conversion obtained with the production of first and second generation FAAE. Operating
conditions: Conversion 1 - packed bed reactor containing 2 g of Novozyme 435, flow rate: 1 ml.min-1,
temperature: 60 °C. Conversion 2 - After complete de-hydration of the output of reactor 1 (using a
molecular sieve or a dehydration column) and re-injection (1 ml.min-1) of the reaction mixture into a
The freezing point of mixture of synthesized esters was compared with a promising
alternative fuel for aircraft, FT-SPK (Fischer-Tropsch Synthetic Paraffinic Kerosene), also
called GTL (gas to liquid). The freezing point of this fuel is -56.6°C. Iso-butyl and -amyl-
Decanoate / GTL blends (10/90 V/V) present freezing points lower than the one of GTL (-
62°C and -61°C respectively). At 20 and 30% of added esters, only Iso-amyl- Decanoate
enabled the freezing point specification for jet fuel to be attained. Even at 10%, esters with
349
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
carbon numbers higher than 10 present freezing point higher than the one necessary to be in
the specification.
V.6 Conclusion
The objective of this work was to synthesize esters from an oil produced by the oleaginous
yeast Y. lipolytica and ramified alcohols in order to lower the freezing point and the viscosity
for application as a substitute for kerosene. A remarkable productivity of 100 tons of esters
produced per year and per kg of enzymes was obtained in a continuous plug flow reactor.
We demonstrated that the proposed process is versatile, as it did not depend on the fatty acid
Acknowledgements
This work was supported by the French CALIN program and the European Alphabird
program. This work was financially supported by Aerospace Valley. The authors thank Laurie
Starck and Nicolas Jeuland from IFPEN for the determination of freezing point properties.
Finally, the authors are very grateful to Mrs. Daphnée Goodfellow for correcting the English
style.
350
V. Production de bio-kérosène par estérification continue.
V.7 References
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353
VI : CONCLUSION GÉNÉRALE
VI. Conclusion générale
L’amoindrissement des ressources pétrolières, les effets de l’émission intensive de gaz à effet
de serre, les catastrophes climatiques et écologiques en tout genre encouragent à modifier nos
développement durable s’installe dans les esprits et devient incontournable. Cette démarche
est de plus en plus soutenue par l’opinion publique et par les législations et réglementations
production propre, chimie verte) ont vu le jour pour atteindre ce but commun de
sociaux.
Les huiles végétales constituent une matière première renouvelable hautement disponible dans
le monde. Les caractéristiques physico-chimiques de ces huiles ne sont pas idéales pour les
taille. Les propriétés physico-chimiques des esters dépendant à la fois de la partie acide gras
et de la partie alcool d’estérification, la variété immense des huiles disponibles, leur richesse
de composition en acides gras et les différents alcools disponibles (linéaires, ramifiés etc…)
permettent d’adapter au mieux les propriétés des esters d’acides gras formés aux applications
ciblées.
L’huile de tournesol hautement oléique (teneur en acide oléique de 75% à 90%) a été choisie
comme référence dans cette étude. L’acide oléique, avec une double liaison unique, présente
été choisi comme alcool de référence pour la synthèse d’ester en raison de ces capacités à
diminuer efficacement les viscosités et les points de fusion des esters synthétisés. L’ester
355
VI. Conclusion générale
butylique d’acide oléique présente entre autre des propriétés biolubrifiantes grandement
valorisables.
immobilisées dans les réactions de transestérification des huiles, permet de pallier aux
permet, de plus, de répondre tout ou partie aux exigences de la chimie verte. Les limitations
principales de leur utilisation sont un prix pouvant être prohibitif, obligeant à les mettre en
œuvre dans des réacteurs continus, hautement productifs et durables dans le temps. Cela
représente le meilleur moyen de réduire l’incidence du coût des biocatalyseurs sur le produit
fini. Le réacteur à lit fixe est la géométrie de réacteur permettant une utilisation optimale du
biocatalyseur. Il permet des volumes de réacteur faibles, des productivités importantes tout en
Dans le but d’assurer la pérennité de tels réacteurs dans le temps, le point crucial est de
contrôler les phénomènes de partage des composés polaires (glycérol produit, phospholipides
présents dans les huiles vierges etc…) entre milieu réactionnel et support enzymatique.
facilement s’adsorber sur les supports enzymatiques. Une couche hydrophile de glycérol se
forme autour de l’enzyme, ce qui limite les transferts des substrats hydrophobes vers le site
réaction continue, cela se traduit par une diminution significative d’activité, pouvant aller
jusqu’à une perte totale d’activité. Le phénomène similaire a été observé avec les
phospholipides des huiles vierges dans des systèmes ne contenant pas de solvant. Au cours de
la présente étude, plusieurs stratégies permettant de maintenir la stabilité des réacteurs à lit
356
VI. Conclusion générale
glycérol hors du réacteur afin d’en assurer la stabilité. Pour se faire, l’utilisation de solvants
polaires tels que le tert-butanol permet de solubiliser à la fois les composés apolaires
(triglycérides substrats, esters produits et intermédiaires) ainsi que polaires (glycérol produit
ou phospholipides des huiles vierges etc…). Il est ainsi possible d’envisager la transformation
Les quatre lipases commerciales immobilisées les plus communément utilisées dans
l’industrie ont été testées sur la réaction discontinue de butanolyse de l’huile de tournesol
hautement oléique en présence ou non de solvants en réacteurs fermés. Parmi ces quatre, seul
le Novozyme 435 présente une absence de spécificité envers les positions sn1et sn3 des
DAGs et MAGs intermédiaires réactionnels. Cette lipase a donc été utilisée pour le
développement d’un réacteur à lit fixe à l’échelle du laboratoire contenant 10g de lipase
immobilisée. Si le milieu sans solvant présente des avantages certains notamment dans une
optique de haute productivité, l’utilisation d’un solvant tel que le tert-butanol parait
nécessaire pour le développement d’un procédé continu. En effet, nous montrons que
de l’huile vierge et donc réduit leur capacité à s’adsorber sur le support enzymatique.
L’effet de la polarité du milieu sur le procédé continu a été étudié en balayant une gamme de
concentration en huile allant de 200mM à 703 mM, correspondant à un milieu sans solvant.
La polarité du milieu réactionnel influence tous les aspects de la catalyse enzymatique. C’est
357
VI. Conclusion générale
elle qui (i) la vitesse réactionnelle (ii) contrôle les phénomènes de partage des composés
réacteur.
hautement oléique s’avère être un compromis entre stabilité, pureté du mélange d’esters
produit et des capacité de production du réacteur. Les meilleures conditions ont été obtenues
pour un mélange contenant 500 mM d’huile. Cela permet de définir des conditions de polarité
d’optimiser la stabilité du réacteur durant plus de 50 jours sans aucune perte d’activité, de
minimiser la présence de MAG résiduels dans une quantité acceptable et pouvant être
productivité à une valeur de 13,8 tonnes de mélange d’esters par an et par kg de novozyme
435. A la vue de cette grande stabilité, il peut être envisagé un procédé de catalyse
L’effet de la transestérification enzymatique en réacteur continu sur les composés mineurs des
huiles (vierges et raffinées) a été évalué. Différentes huiles vierges aux caractéristiques
différentes ont été utilisées : l’huile vierge de colza pour sa haute teneur en phospholipides,
l’huile de tournesol pour sa composition riche en tocophérols et l’huile d’olive qui contient
chapitre II a permis d’obtenir les esters butyliques correspondant aux huiles utilisées. Outre le
fait que l’utilisation d’huiles différentes montre l’adaptabilité du réacteur à tout type d’huiles,
les différents composés essentiels ont pu être dosés selon les normes en vigueur avant et après
358
VI. Conclusion générale
réaction. Tous les composés mineurs, présents dans les huiles vierges, sont préservés lors du
processus catalytique. Seul un effet de dilution lié à la réaction elle-même a été observé. La
transformation d’huile vierge permet donc d’obtenir des esters dont la teneur en antioxydants
naturels est supérieure. Par ailleurs, ces composés, qui sont susceptibles d’être responsable de
réacteur.
séjour dans le réacteur relativement faible et aucune exposition à l’air ambiant, n’induit pas ou
peu de stress oxydatif. Les esters synthétisés par son biais conservent les propriétés de
résistance à l’oxydation de l’huile dont ils sont issus. Les esters obtenus à partir d’huile vierge
contenant des taux importants de composés mineurs présentent des résistances oxydatives
supérieures aux esters synthétisés à partir d’huile raffinée. Le réacteur à lit fixe développé ici
permet donc l’obtention d’esters hautement résistants répondant largement aux spécifications
éditées dans les normes. Les mélanges d’esters issus des huiles vierges de tournesol
hautement oléique, de colza et d’olive ont présentés des temps d’induction respectifs, avec la
technique du rancimat (110°C, 10L d’O2.h-1), de 23,3 h ; 10,4 h et 17,5 h, soit 17,3h ; 4,4h et
11,5h de plus que les standards imposés par la norme relative au biodiesel (EN 14214 par
exemple).
Un catalogue d’une douzaine alcools allant des alcools linéaires primaires aux alcools
linéaires secondaires (2-propanol, 2-butanol) via les alcools primaires ramifiés, des amines
(butylamine etc..) ou encore des alcanolamines (éthanolamine, butanolamine) ont été testés
avec succès sur le réacteur mis au point dans cette étude. Chaque produit obtenu a ainsi des
359
VI. Conclusion générale
(selon la molécule) etc… qui leur sont propres. Ceci ouvre la porte à de très nombreuses
applications et voire même à la possibilité de productions sur mesure selon les applications
ciblées.
La valeur ajoutée due à l’utilisation de Novozyme 435 dans ce réacteur à lit fixe sur le coût du
produit final a été déterminée à 0,08 euros par kg de produits, en considérant un temps de
remplacement de l’enzyme de 1 an. Si cette valeur parait raisonnable, elle peut néanmoins
être limitante selon l’application vers laquelle s’adresse le mélange d’esters. Par exemple, la
tonne de biodiesel se négocie autour de 950 à 1150 euros en considérant un cours des huiles
entre à 800 à 1000 euros par tonne selon la source. Un surcoût de près de 1%, uniquement dû
opérationnel est maîtrisé et engendrant une stabilité sans faille, est une alternative
envisageable.
support extrêmement hydrophobe, l’Accurel MP (taille des particules < 1000µm). Ce support
ne permet en aucun cas, de part sa nature, la fixation des composés polaires (glycérol). La
phase aqueuse hydrophile contenant l’enzyme dans les pores extrêmement hydrophobes du
support. Les méthodes classiques présentées dans la littérature utilisent comme solvant
l’éthanol. CalB, étant réputée pour sa grande résistance aux solvants, a été immobilisée en
utilisant un solvant plus efficace : l’acétone. Ce solvant permet une pénétration accrue du
360
VI. Conclusion générale
thermodynamique de la lipase dans le milieu liquide et, par voie de fait, d’optimiser son
immobilisée est grandement dépendante du ratio entre quantité de lipase utilisée et quantité de
support mise en contact. Ainsi, plus le ratio est élevée (ce qui correspond à l’obtention du
biocatalyseur le plus actif), plus le coût est important et inversement. Les différents
biocatalyseurs générés, présentant des taux d’activité différents, ont été utilisées pour
développer un réacteur à lit fixe permettant une production annuelle identique. Par soucis de
simplification, une réaction de substitution permettant des analyses simplifiées et des temps
réactionnels plus court a été utilisée : l’estérification de l’acide oléique avec du butanol. Les
minimisant les différents centres de dépenses et d’investissements liés à son exploitation. Les
coûts d’investissement du réacteur ont été estimés en utilisant des techniques d’évaluation
empruntées à l’industrie chimique pour une production fixée à 10000 tonnes d’esters par an.
Nous montrons que les investissements nécessaires pour la construction d’un réacteur sont
nettement inférieurs aux dépenses liées à la lipase immobilisée nécessaires pour assurer la
contact), le coût d’enzyme nécessaire pour assurer la productivité ciblée peut être de 2 à 10
développement du réacteur le plus actif possible i.e. le moins volumineux n’est pas une
minimiser les coûts au maximum, même si le volume du réacteur est important. Un ratio entre
361
VI. Conclusion générale
quantités d’accurel (g) et volum de lipase (L) mis en contact de 40 g/L a ainsi été obtenu
comme optimal.
conditions identiques à celles utilisées avec le Novozyme 435. Aucune différence dans le
profil de produits n’a été détectée. Ainsi, l’immobilisation de la lipase sur Accurel MP
économique du procédé. Une réduction de l’ordre de 50% par rapport à Novozyme 435 a été
calculée.
Une seconde stratégie a été développée pour éviter l’effet indésirable du glycérol et consiste à
réaction de transestérification des résidus d’acides gras présents en position sn1 et sn3, mais
ne permettent pas de réaction au niveau du résidu positionné en sn2. La réaction produit ainsi
produit de ces réactions de production d’esters. En effet, produit avec pureté, il est un
medium). Ces triacylglycérols contiennent en position externe des acides gras de chaîne
longue chaîne en position sn2. Une fois ingérée, la lipase pancréatique hydrolyse plus
facilement les positions externes du triacylglycérol MLM du fait de la présence d’acide gras
362
VI. Conclusion générale
facilitée.
Les monoacylglycérols présentent des solubilités dans les huiles, esters ou mélanges huiles
esters bien plus élevés que le glycérol. Ils ne sont donc pas susceptibles de s’adsorber sur les
processus de migration d’acyles, entraînant l’isomérisation des formes sn2 vers les formes sn1
ou sn3, soit complètement maîtrisé voire interrompu, il est possible d’effectuer en continu la
transformation des huiles végétales sans subir les effets néfastes de la production de glycérol.
IM, Lipozyme TL IM, Lipase PS Amano IM) et dans le laboratoire (Yarrowia lipolytica Lip2
immobilisée sur support d’Accurel) ont été testées sur cette réaction de transestérification de
l’huile de tournesol hautement oléique avec le butanol. Les essais en réacteur fermé montrent
que la spécificité de la lipase Lip2 de Y. lipolytica est très supérieure à celle des autres lipases
testées et est donc très prometteuse pour cette réaction partielle. Elle permet l’obtention de
Cependant, la lipase Lip2 de Y. lipolytica n’a pu être mise en oeuvre en réacteur continu à lit
fixe dans un système sans solvant, la stabilité opératoire n’ayant pas été satisfaisante Deux
hypothèses ont été avancées pour expliquer ce phénomène. Les MAG produits en cours de
réactions sont des molécules amphiphiles qui seraient capables de s’insinuer entre l’enzyme
support. Le résultat en condition de catalyse continue est une perte des capacités catalytique
par fuite de l’enzyme dans le milieu réactionnel. La seconde hypothèse est que les MAGs
363
VI. Conclusion générale
réacteur. est assurée lorsqu’un solvant polaire (tert-butanol) est utilisé. Cela tendrait à dire
que la disponibilité des MAG produits est diminuée grâce au solvant et de fait le phénomène
Pour ces raisons, cette troisième stratégie de production partielle d’esters reste en essai dans le
La troisième stratégie de production d’esters a été développée au cours d’un projet connexe de
production d’esters ramifiés par réaction d’estérification catalysée par le Novozyme 435 pour
une application bio-kerosene. Cette approche a été réalisée en utilisant des huiles
en quantité suffisante. Le développement du procédé a donc été réalisé en utilisant une source
végétale permettant de modéliser le substrat envisagé. Cette approche est donc totalement
La stratégie a été envisagée en deux étapes : une première phase d’hydrolyse (non exposée
dans ce manuscrit) et une seconde d’estérification directe des acides gras libres. Le but de
cette approche est double. Cela permet en premier lieu de séparer le glycérol des
triacylglycérols au cours de l’étape d’hydrolyse pour ne gérer que de l’eau produite au cours
faisabilité de mise en œuvre de chacun de ces milieux dans une optique de haute productivité
364
VI. Conclusion générale
(concentrations élevées). La modélisation des solubilités de l’eau dans les milieux complexes
diisopropyl ether à une concentration initiale en acides gras de 1.5M, les solvants retenus et le
milieu sans solvant sont capables de solubiliser l’intégralité de l’eau produite en cours de
pérennité du réacteur.
de chacun des composants intervenant dans la réaction, en tout point du réacteur soit en
l’activité de l’eau entre 0% et 100% de conversion a été établi pour chaque système
réactionnel pour différentes concentrations initiales en acide gras à ratio molaire entre substrat
fixé. La variation de l’aw est fonction du système et de la concentration initiale en acide gras :
plus la celle-ci est importante plus l’aw finale en élevée. Etant donné que l’augmentation de
biocatalyseur a été déterminé. Une aw finale comprise entre 0,3 et 0,4 a été considérée comme
le meilleure compromis.
thermodynamique. Afin de modéliser cet effet, le quotient K (entre produit des activtés de
l’ester et de l’eau produite et produit des activités de l’acide gras et de l’alcool à l’équilibre) a
été modélisé pour chacun des systèmes réactionnels à différente conversion finale. Le système
sans solvant parait être le meilleur milieu pour réduire K. Ainsi, le milieu sans solvant offre
365
VI. Conclusion générale
expérimentalement en réaction batch. Il a donc été utilisé pour développer un procédé continu
de production d’esters.
conversion ont été obtenues avec un rapport molaire entre substrats de 3 (soit une
de 85,4% est obtenu en sortie de réacteur. Ainsi une productivité annuelle en esters purs de
129 tonnes par kg de Novozyme 435 a été atteinte dans ces conditions. Cela représente une
augmentation de productivité d’un rapport 9,3 par rapport à celle obtenue en conditions de
transestérification continue. Une production continue d’esters a été possible pendant 54 jours
La faisabilité d’un système à double réacteur séparé par un système permettant de retirer l’eau
générée par la réaction a été testée dans le but d’augmenter le taux de conversion obtenu avec
un réacteur unique. La conversion a ainsi été augmentée de 85% à 97%. Cette augmentation
Cette productivité reste toute fois remarquable et le taux de conversion obtenu implique un
considérablement les coûts. Sans tenir compte de ces étapes de purification, en considérant
une production de 100000 tonnes par an, les investissements liés à l’utilisation de Novozyme
435 dans ce procédé d’estérification continue ont été estimés à seulement 1,5% du chiffre
d’affaire généré par son exploitation. En comparaison, cela représente un coût ajouté au
366
VI. Conclusion générale
produit final de seulement 1,1 centime d’euro par kg soit 7,3 fois moins que le coût ajouté par
pertinence économique évidente qui le rend extrèmement compétitif avec les procédés
chimiques classiques.
Financée par un industriel, cette thèse a été fortement imprégnée par une approche
positif à cette problématique. Par une approche d’ingénerie des solvants, la mise en place de
été possible d’atteindre des productivités élevées de 11 à 100 tonnes de produits par an et par
kg d’enzyme, ce qui permet d’amortir le coût de l’enzyme. Ce qui pourrait être désormais
envisagée est l’évolution moléculaire des enzymes impliqués pour améliorer leur activité,
stabilité et spécificité.
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