ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES.

INTRODUCTION ET BASES TECHNIQUES

• Il s’agit d’une discipline médicale qui étudie les
lésions provoquées par les maladies ou associées
à celles-ci, sur les organes, tissus ou cellules, en
utilisant des techniques principalement basées sur
la morphologie macroscopique et microscopique.
• Les lésions sont des altérations morphologiques
des organes, décelables par tout moyen
d'observation.
• Les lésions sont des signes des maladies, au
même titre que les symptômes cliniques.
• Les lésions peuvent être le résultat de
l’agression qui a déclenché la maladie ou celui
des réactions apparues au cours du déroulement
du processus morbide.
• La lésion élémentaire correspond à l'altération
morphologique d'une structure analysée
isolément.
• L'association de différentes lésions élémentaires
constitue un ensemble lésionnel.
• Il n'y a pas forcément une corrélation étroite entre
l'importance d'une lésion et son expression clinique
ou biologique.
• Les causes des lésions sont variées :
 anomalies génétiques constitutionnelles
 ou acquises:
 agents infectieux,
 agents chimiques
 agents physiques,
 déséquilibres circulatoires, nutritionnels ou hormonaux,
 roubles immunitaires innés ou acquis.
• La démarche de l’anatomie pathologique est
basée sur une analyse sémiologique qui
compare les tissus normaux et les tissus
pathologiques.
• Les lésions sont confrontées aux données
cliniques, biologiques et d'imagerie :
• c’est la corrélation anatomo-clinique qui est
indispensable pour permettre une interprétation
synthétique qui aboutit à un diagnostic.
• Les buts de l'anatomo-cytopathologie dans la
pratique médicale sont :
• 1 / de contribuer à l'élaboration du diagnostic
par la démarche anatomo-clinique : les lésions
sont analysées et décrites dans un compte-rendu
puis l’anatomo-pathologiste doit intégrer
l'ensemble des faits morphologiques et des
renseignements cliniques pour, en conclusion du
compte-rendu, affirmer un diagnostic ou
proposer une hypothèse diagnostique
• 2/ d’apporter des éléments utiles pour
préciser le pronostic, en particulier dans le
domaine de la pathologie tumorale.
• 3/ de contribuer à évaluer l'effet des
thérapeutiques : les examens anatomo-
cytopathologiques sont renouvelés au cours
d’un traitement afin de juger de la disparition,
de la persistance ou de l’aggravation des
lésions.
 Règles générales
• L'identification, le conditionnement et
l'acheminement du prélèvement sont sous la
responsabilité du prescripteur.
• La responsabilité du Laboratoire n'est engagée
qu'après l'étape de réception et d'enregistrement.
• Les prélèvements non conformes peuvent être
refusés, et font l'objet dans tous les cas de
l'établissement d'une fiche de non conformité
archivée, permettant de garder une trace de
l'irrégularité.
 Fiche de demande d'examen

• Elle accompagne chaque prélèvement ou série de

prélèvements pour un patient donné et comporte :
• le laboratoire destinataire, l'identité complète du
patient, résumée au mieux sur l'étiquette
d'hospitalisation.
• par défaut, la fiche est remplie manuellement et
comporte le nom, le prénom, le nom marital
éventuel, le sexe et la date de naissance.
• L’identité et la signature du prescripteur, avec l'unité
d'hospitalisation ou de consultation.
• la nature du prélèvement : pièce opératoire, biopsie,
cytologie... la date et l'heure du prélèvement,
l'organe prélevé avec la localisation anatomique
précise, et la latéralité en cas d'organe pair.
• Au cours d'un même geste technique endoscopique
ou chirurgical, plusieurs biopsies peuvent être
effectuées.
• Elles doivent être séparées et clairement identifiées
sur le bon de demande.
• Le conditionnement du prélèvement : état frais,
fixation, ou congélation.
 Note clinique

• La note clinique est indispensable à l'examen

anatomo-pathologique.
• Des fiches spécifiques sont à utiliser pour les
prélèvements très spécialisés comme les biopsies
ostéomédullaires ou hépatiques.
• Il est recommandé de noter les principaux
antécédents du patient, le traitement éventuel et
l'aspect macroscopique de la lésion.
• Les pièces opératoires doivent être orientées au
moyen de repères.
• Ces indications peuvent être rapportées sur un
schéma.
• Ces renseignements sont souvent essentiels
pour préciser la qualité d'une exérèse tumorale
chirurgicale.
• Les tumeurs osseuses doivent être
accompagnées de la radio ou du scanner.
• La notion d'infection ou de contagiosité
potentielle d'un prélèvement doit être
clairement signifiée
• Ces indications permettent la mise en oeuvre
rapide des techniques complémentaire de
recherche d'agent pathogène.
• Elles permettent la mise en décontamination
immédiate du matériel lourd utilisé pour les
techniques cytologiques ou sur tissu congelé.
• Enfin des mesures de décontaminations
spécifiques par acide formique du prélèvement
sont à mettre en oeuvre en cas de suspicion
d’infection.
 DIFFERENTS TYPES DE PRELEVEMENTS

• Elles sont différentes selon qu’on désire

obtenir des cellules ou des fragments de tissus.
 Prélèvements tissulaires

– Biopsie :
• Technique de prélèvement d’un fragment de tissus
chez un être vivant en vue d’un examen
microscopique. Elles sont réalisées sous anesthésie
(locale ou générale).
• Lorsque toute la lésion est prélevée ou parle du
biopsie- exérèse ou biopsie totale
• La biopsie peut se faire avec des instruments
spéciaux au niveau de certains organes particuliers :
colposcopie, horoscopie œsophage cœlioscopie…
• Autres techniques : biopsie à l’aveuglette au
niveau d’organes profonds (ex : foie, rein) à
l’aide d’aiguille ou tocards spéciaux : c’est la
ponction – biopsie. La biopsie peut être dirigée
sans échographie, ou scanner.
 – Pièces opératoires
• Ce sont les organes ou parties d’organes
enlevés au cours d’intervention chirurgicale.
Ex : pièce néphrectomie, hystérectomie.
– Prélèvements nécrosiques:
• Au cours de nécropsie ou autopsie (autopsie
médicale ou hospitalière, autopsie
médicolégale),
• des prélèvements d’organes peuvent être faits.
• Prélèvements cellulaires :
• destinés pour le dépistage, l’examen
diagnostique, le suivi d’un traitement.
• Les techniques diffèrent selon le site :
- par apposition sur lame de verre de la tranche
de section d’un organe, ex. : ganglion.
- par grattage d’une lésion accessible à l’aide
d’instruments, ex. : spatule d’Ayres, spatule en
bois pour frottis du col utérin.
 par cytoponction d’une tumeur, d’un ganglion
avec une séringue montée, ex. : ponction
thyroïdienne ; liquide d’ascite ; sein ; plèvre
- par recueil de produit de sécrétion, urine,
lavage bronchio-alvéolaire : après
centrifugation.
Elles sont différentes selon qu’on désire obtenir
des cellules ou des fragments de tissus.
 CH 2 : HYGIENE ET SECURITE

• Le personnel du laboratoire d’Anatomie

Pathologique doit être protégé vis-à-vis de trois
types de risque :
– biologiques, c’est-à-dire le risque infectieux, viral
et bactérien,
– toxiques et chimiques, nombreux mais dominés
par le formol,
– physiques, essentiellement le feu
• Risques biologiques
• Il faut abolir tout contact direct entre la peau
(ou la conjonctive de l’ oeil) et les
prélèvements, en se protégeant par des blouses
de travail, des gants, des lunettes pour la
macroscopie, des sacs de transport des
prélèvements, des flacons à bouchons vissés,
etc.
• Le risque biologique est :
maximum avec les prélèvements non fixés
« liquides, matériels de ponction pour examen
cytologique »,
moindre, mais pas nul, pour les prélèvements
en cours de fixation.
il persiste malgré la formolisation, pour
certains prélèvements comme ceux provenant
d’encéphalopathie à prion.
• à noter que le matériel congelé doit être
considéré, du point de vue biologique, comme
un matériel non fixé.
• Attention :
• Un prélèvement même fixé ne doit jamais
être manipulé à mains nues.
Tout prélèvement doit être supposé dangereux,
les gants salis doivent être jetés après son usage,
sous peine de contaminer les surfaces
manipulées ultérieurement avec ces gants.
• Il est impératif de procéder au nettoyage des
surfaces supposées contaminées (paillasses,
dispositifs de centrifugation, pipettes, matériels
de dissection etc.)
• qui doivent être lavées, dégraissées avec un
détergent, décontaminées avec un liquide
approprié.
• Certains produits actuels agissent sur ces trois
points, mais le moins coûteux et le plus efficace
reste l’eau de Javel.
• Mais : l’eau de Javel n’est efficace que
fraîchement diluée.
• Un berlingot d’eau de Javel concentrée (non
périmée), diluée dans deux litres d’eau, garde
son activité durant une semaine.
• La date de la préparation doit être inscrite sur la
bouteille.
 Risques toxiques et chimiques

• Les produits chimiques utilisés en ACP

peuvent être classés dans les catégories
suivantes:
– Fixateurs,
– Acides;
– Bases;
– Colorants;
– Produits d’inclusion et de montage
 Les risques toxicologiques
• Le risque toxicologique dans un labo ACP
résulte de deux modes d’exposition
principaux:
- l’inhalation de substances volatiles ou
d’aérosols;
- et le contact cutanéo-muqueux des produits
utilisés.
• Le risque d’ingestion de produits dangereux est
plus limité, il sera essentiellement la
conséquence de la déglutition des produits ou
de port de mains souillées à la bouche.
• Les produits chimiques sont définis selon dix
risques, pour lesquels il existe un étiquetage
spécifique :
Xi irritant (méthylmétacrylate)
Xn nocif (xylène, hydroquinone)
T toxique (formol)
T+ très toxique (cyanure)
F facilement inflammable (toluène)
F+ extrêmement inflammable (éther)
comburant (qui entretient
O (permanganate de K)
la combustion)
E explosif (acide picrique)
(acide chlorhydrique,
C corrosif
nitrique)

dangereux pour
N (ammoniaque)
l’environnement
• Des tableaux édités par l’industrie chimique,
indiquent la classification du produit et des
conseils en cas d’accident,
• mais chaque laboratoire doit avoir des
protocoles écrits, une conduite à tenir, en cas
d’accidents impliquant les produits utilisés dans
le laboratoire, surtout pour les plus graves
(projection d’acide, inhalation massive de
toxique) ou pour les plus courants (risques du
formol, du toluène, produits explosifs,
inflammables).
 La toxicité du Formol

• Le formol exerce une activité nécrosante directe sur

la peau et les muqueuses, directement liée à son
action de fixateur.
• Ce produit est connu pour provoquer des affections
respiratoires et cutanées, toxiques et allergiques.
• Par ailleurs il est suspecté de favoriser l’apparition
de cancer.
• Sa nocivité s’exerce déjà en dessous du seuil de
perception olfactive.
• Pour éviter la dispersion des vapeurs de formol,
celles-ci doivent être captées à la source.
• Une aspiration puissante, s’exerçant à dix à
vingt centimètres au dessus (ou en dessous pour
certaines tables spécialement équipées) doit
être branchée dès qu’un récipient contenant du
formol est ouvert.
• C’est en couche mince (formol répandu sur
une paillasse) qu’il se vaporise le plus
rapidement.
• Un laboratoire d’Anatomie Pathologique ne
doit pas sentir le formol. Il est toxique avant
qu’on ne le sente.
 Le risque d’incendie
• Partout présent dans un laboratoire d’Anatomie
Pathologique, il est surtout important autour de
la paraffine et des alcools .
• Il est à son maximum dans l’aire de l’automate
à inclusion, favorisé par les courts-circuits que
provoquent les coulures de paraffine qui
s’insinuent entre les contacts.
• Tout laboratoire doit posséder des dispositifs
d’étouffement du feu.
• Attention :
• couverture, bouteille de neige carbonique, etc.,
doivent être disponibles à proximité immédiate
des automates et être utilisés à la moindre
alerte .
• Ne jamais mélanger eau de Javel et formol
car risque d’explosion !
 CH 3 : FIXATION

• « La fixation est une opération destinée à tuer les

cellules en les conservant, autant que possible,
en l’état où elles se trouvaient pendant la vie.
• Faute de fixation, il y a risque d’autolyse...
• Les meilleurs fixateurs sont ceux qui, tout en
agissant rapidement, produisent le moins
possible de modifications secondaires ou
d’artifices susceptibles de donner une idée très
fausse de la morphologie interne des cellules. »
 BUT
– Immobilisation des structures
histologiques
– Conservation des structures
histologiques
– Prévention de l’autolyse cellulaire
(post-mortem)
– Prévention du développement
bactérien (post-mortem)
• Les fixateurs agissent généralement sur les
protéines en les coagulant ou en les précipitant.
• Il existe 2 variétés de fixateurs :
– ceux qui pénètrent rapidement et fixent lentement,
comme le Formol,
– ceux qui pénètrent lentement et fixent rapidement
comme le Bouin.
• Aussi, le Formol convient mieux aux grosses
pièces alors que le Bouin convient aux petites
pièces. Actuellement c’est l’Alcool-Formol
Acétique (AFA) qui est utilisé pour les petites
pièces.
• La « bonne » fixation doit éviter des écueils :
• pour les grosses pièces, la fixation sera
insuffisante si elles sont plongées dans une
quantité insuffisante de liquide, ou pendant trop
peu de temps, ou sans avoir été disséquées ou
recoupées en tranches de 1 ou 2 cm permettant
une mise en contact plus rapide du fixateur
avec les tissus profonds ;
• ou lorsqu’elles ont été plongées dans un
fixateur rapide et peu pénétrant, le centre
n’étant alors pas fixé alors que la surface l’est
trop.
 Curage

Mammectomie
 Couper la pièce en tranches
fines

Cancer

Encrer les limites

d’exérèse

Cancer
• Les biopsies de petite taille deviendront
surfixées si l’acheminement au laboratoire a
été trop long.
• Si le délai d’acheminement est supérieur à 24
heures, c’est le formol qui devra être utilisé
quelle que soit la taille du prélèvement.
•
• Pour les tissus fragiles, comme le foie, le
ganglion... une bonne fixation ne peut se faire
que sur des tranches fines (1 à 2 mm
d’épaisseur) qui souvent ne peuvent être
obtenues que sur des fragments durcis par
quelques heures de fixation.
• Ces problèmes ne se posent que s’il s’agit de
biopsies chirurgicales et non de biopsies à
l’aiguille !
• Règles générales
• En dehors des micro-biopsies, il est
indispensable, avant toute fixation, de mesurer
et, éventuellement, de peser et photographier la
pièce.
• Si la pièce est importante, il faut l’entailler
(selon une procédure liée au type de pièce) afin
que le fixateur pénètre mieux.
• La quantité de fixateur doit être suffisante,
au moins 2/3 de liquide fixateur pour 1/3 de
volume de pièce.
• Le fixateur doit être placé en premier dans le
récipient afin que la pièce ne « colle » pas à ses
parois.
• L’embouchure doit être suffisamment large
pour qu’on ne soit pas obligé de casser le
récipient pour sortir la pièce !
• Le flacon doit être immédiatement étiqueté
(n° et/ou nom du patient sur le flacon et non sur
le couvercle).
• Pour les micro-biopsies, il est souvent utile de
colorer légèrement le liquide fixateur (1
goutte d’éosine ou de bleu de toluidine à 0,1
%, par exemple) afin de mieux visualiser le
fragment.
• Celui-ci sera si possible placé sur le fond
mouillé d’une cassette, un seul fragment étant
posé dans chaque cassette (si 3 petits fragments
cylindriques : 3 cassettes !)
• Dans tous les cas où cela est possible, la pièce
doit être convenablement orientée avant toute
fixation avec des repères sous forme de fils
colorés, ou mieux, placée sur une planche de
polystyrène topographiée.
 Les différents fixateurs

• Fixateurs à base de formaldehyde

• A - Formol Neutre à 10% :
• Le « formol pur » correspond en fait à la solution
aqueuse de formaldehyde à 40%, vendue dans le
commerce sous la dénomination de « formol. » La
solution à utiliser doit être encore diluée à 10%
• Indications
Toute l’histologie de routine
Les grosses pièces en première intention (les entailler
auparavant)
Etude des lipides en histochimie
• Préparation
• Formol « pur » du commerce 10 ml
• Eau distillée 90 ml
• Carbonate de Calcium * 1g
• * Le carbonate de calcium sert à neutraliser le
formol, c’est-à-dire évite la formation d’acide
formique en en diminuant le pH.
• Conservation : plusieurs mois
• Temps réel de fixation : il est variable en
fonction de la quantité de matériel à fixer,
habituellement un à deux jours.
• Après fixation : on peut, si nécessaire, éliminer
le pigment formolique sur coupe par
immersion, pendant 5 min., dans un mélange
d’alcool ammoniacal (alcool ammoniacal à 28
% = 5 ml, alcool à 70° = 100 ml).
• A’ - Formol Nacl.
• De composition très simple
• Formol pur du comme 13 ml
• NaCl 0,9 gr
• Eau distillée 87 ml
• NB1 : la solution de formol utilisée comme
fixateur est donc obtenue par dilution à 10%
de la solution aqueuse de formaldehyde à
40% considérée comme formol « pur. »
• NB2 : beaucoup de défauts imputés au formol
proviennent le plus souvent de la trop grande
taille des pièces plongées dans le fixateur, d’où
l’impérieuse nécessité de recoupes préalables.
• Autre inconvénient de tout fixateur aqueux, la
lenteur de fixation des tissus adipeux (sein).
 B - Liquide de Bouin aqueux

• Indications
Toute l’histologie de routine (il convient
moins bien que le Formol pour certains
examens histochimiques ultérieurs).
Il est utilisé en première intention pour les
petits prélèvements (moins de 1 cm3) ou en
deuxième intention après une première
fixation formolée.
Liquide de Bouin fort faible

Formol « pur » du
25 ml 10 ml
commerce
Acide picrique à
saturation dans 75 ml 50 ml
l’eau *
Acide acétique 5 ml 5 ml
Eau distillé 0 ml 35 ml
• Il est bon d’avoir toujours au laboratoire une
réserve d’acide picrique à saturation dans l’eau
• Conservation : quelques mois
• Temps réel de fixation :
Fragment de moins de 2 mm3 : de 2 à 3
heures.
Fragment supérieur à 1 cm3 : habituellement
1 jusqu’à 3 jours.
• NB : Du fait de la présence d’un acide (acide
picrique) le liquide de Bouin a un léger
pouvoir décalcifiant.
• Après fixation : on déshydrate directement dans
les alcools.
 C - Liquide de Bouin Alcoolique

• Indications : il complète le Bouin par ses

qualités très pénétrantes.
• Préparation
• Alcool à 80° 150 ml
• Formol « pur » du commerce 60 ml
• Acide acétique glacial 15 ml
• Acide picrique 1g
• NB : Il peut être utile d’avoir une provision de
solution d’acide picrique dans l’alcool à 80° .
C’est un fixateur très pénétrant.
• Temps réel de fixation : De 1 à 3 jours, puis
plonger directement dans l’alcool à 90°. Les
très petites pièces (1mm d’épaisseur) peuvent
être fixées en 30 min.
 D - Liquide de Bouin Hollande

• Indications
Toute l’histologie de routine.
En première intention pour les organes
lymphoïdes et hématopoïétiques.
• Pour les petits prélèvements de moins de 1
cm3.
C’est un fixateur rapide excellent.
• Préparation
• Formol du commerce 10 ml
• Acide picrique 4g
• Acide acétique glacial 1,5 g
• Acétate neutre de cuivre 2,5 g
• Eau distillée 100 ml
 Protocole

• Dissoudre à froid au mortier l’acétate de cuivre

dans l’eau distillée.
• Ajouter l’acide picrique en remuant.
• Après dissolution ajouter le formol et l’acide
acétique glacial.
• Conservation : quelques mois.
• Temps réel de fixation : comme le Bouin.
• Après fixation : déshydrater directement dans les
alcools sans passer par la phase aqueuse.
 Autres Fixateurs

• Alcool-Formol-Acetique (A.F.A.)
• Indications : tous tissus, petits fragments
• Préparation
• Formol « pur » du commerce 20 ml
• Acide acétique glacial 50 ml
• Alcool éthylique absolu 750 ml
• Eau distillée 180 ml
• Conservation : excellente
• Temps réel de fixation : 24 heures
• Après fixation : passage direct dans les alcools.
• Alternative : la concentration de Formol pur
peut être augmentée de 20 à 100 ml/litre
• Remarque : Les fixateurs contenant de
l’acide acétique assurent une meilleure
coloration nucléaire.
 Fixateurs à base de Chlorure de Zinc
• Permettent à la fois une bonne morphologie et la
conservation d’une majorité d’épitopes nécessaires à
l’immunomarquage sur tissu inclus en parrafine
• Solution faible
• Formol « pur » du commerce 130 ml
• Acide acétique glacial 5 ml
• Chlorure de zinc 10 g
• Eau distillée 860 ml
• Conservation : excellente
• Temps réel de fixation : 24 heures au moins
• Après fixation : passage direct dans les alcools.
 Alternative : Formol NaCl Zinc

• Formol pur du commerce 130 ml

• NaCl 9 gr
• Chlorure de Zinc 10 gr
• Eau distillée 870 ml
 Formol alcool Zinc
• Formol pur du commerce 130 ml
• Acide acétique 50 ml
• Alcool absolu 750 ml
• Chlorure de Zinc 10 gr
• Eau distillée 150 ml
• La concentration de Chlorure de Zinc peut variée de 10 gr/litre
à 50 gr.litre.
• Les petits fragments peuvent être fixés rapidement (2 heures),
• les plus larges 24 heures et au-delà
CH 4 : GESTION DE PIECES CALCIFIEES

• Un tissu contenant du calcaire, l’os par exemple,

ne peut être coupé tel quel en technique
habituelle.
• Il devra donc être décalcifié.
• Technique
• A-Pour les petits prélèvements
• Emballer le petit fragment à décalcifier dans
une gaze fermée par un lien de ficelle.
• Fixer dans le Formol
• Immerger dans une solution décalcifiante (par
exemple de l’acide nitrique à 10%) si possible
avec agitation permanente (avec un agitateur
magnétique).
• La décalcification est interrompue après contrôle à
l’aiguille et chaque soir.
• Le prélèvement est remis chaque nuit à fixer,
après rinçage à l’eau courante.
• La solution doit être changée tous les jours.
• La décalcification terminée, remettre le
prélèvement à fixer pendant quelques heures.
• B-Pour les grosses pièces
• Etude macroscopique du prélèvement (taille,
consistance), éventuellement prélèvements
particuliers (bactério, empreintes,
cytogénétique... ), radio de la pièce,
badigeonnage des marges...
• Il peut s’agir d’un os entier, ou d’un fragment
d’os : après avoir prélevé la moelle si
nécessaire, une tranche osseuse d’environ 5
mm d’épaisseur est pratiquée avec une scie
adaptée *,
• selon un plan frontal ou sagittal suivant le plus
grand diamètre d’extension de la lésion.
• Après la décalcification, la pièce, si elle est
grande, est rincée dans l’eau, avant d’être, pour
les grandes pièces, découpée « en grille » sous
forme de carrés de 2 cm de côté, numérotés et
positionnés sur le schéma.
• Sinon elle est directement passée du
décalcificateur au fixateur.
• Les fragments numérotés sont mis en cassettes
et remis à fixer pendant 12 à 18 heures dans
du Formol.
• Ils suivent ensuite le cycle habituel de la
technique de déshydratation et d’enrobage.
 Remarques
• Pour la coupe au microtome après
décalcification, les blocs doivent être dégrossis
avec un rasoir réservé à cet usage, puis repris
avec un rasoir normal.
• La coloration de fragments décalcifiés
nécessite souvent des temps de coloration plus
longs que pour les pièces ordinaires.
• Il est important de contrôler au microscope
l’intensité de ces colorations en cours de
technique.
 Produits décalcifiants, matériels
• Les méthodes décalcifiantes sont variées :
• Acide nitrique à 10 % ou au 30 % : c’est le
procédé le plus simple.
• Mélange décalcifiant (2 acides)
• acide formique normapur 400 ml
• acide chlorhydrique normapur 400 ml
• H2O 5000 ml
• Acide acétique (1M) à 5 % ou 10 % en
solution aqueuse ou formolée (x 24 heures),
• biopsies médullaires en particulier, avec bonne
conservation d’une majorité d’épitopes pour
immunomarque
 Méthode électrolytique :
• Il s’agit d’une méthode plus complexe
nécessitant un appareillage particulier : le
mélange peut servir de bain d’électrolyse
dans un bac où plongent deux électrodes de
charbon* pur, fichées dans le tissu à
décalcifier et reliées à un voltmètre *
• Le bac lui-même est immergé dans un
récipient contenant de l’eau courante.
• Le temps de décalcification est fonction de la
taille et de la nature du fragment :
• rapide pour les petites biopsies (< 4 h)
• beaucoup plus long (jusqu’à 4 jours) pour une
tranche de fémur dont les corticales sont
souvent très denses.
 Les Matériels

• Scie à métaux
• Scie électrique :
• Chargeur de voiture : voltmètre (ddp de 6 à
8 volts) pour entretenir le bain d’électrolyse
• Electrodes en charbon :
 CH 5 : INCLUSION, IMPREGNATION, ENROBAGE

• Entre la fixation et l’enrobage en paraffine

plusieurs étapes sont nécessaires
• La déshydratation car l’eau et la paraffine ne
sont pas miscibles.
• Elle doit être progressive, par des alcools à 70,
80, 90, 95 , 100 et 100° alcool absolu, afin
que les fluides se substituent les uns aux autres
jusqu’à l’imprégnation dans la paraffine.
• L’alcool utilisé en technique courante est
l’alcool éthylique.
• Il peut être dénaturé par du méthanol ou de
l’alcool isopropylique afin de le rendre
impropre à la consommation et de réduire les
coûts de fonctionnement.
• Il est possible également pour les premiers
postes d’utiliser des alcools recyclés.
• Un éclaircissement doit être fait par du
Xylène, Toluène ou Méthylcyclohexane
(MCH), l’alcool et la paraffine n’étant pas
miscibles.
• Ce dernier est moins toxique que le Toluène
ou le Xylène.
• Le Benzène, plus toxique, doit être proscrit.
 L’imprégnation en paraffine

• Elle s’effectue dans une paraffine maintenue à

l’état liquide par un séjour dans une étuve dont
la température est réglée légèrement au-dessus
de son point de fusion.
• Lorsque l’imprégnation est complète, la pièce
est retirée et placée dans un bain de paraffine
que l’on fait durcir à la température du
laboratoire :
• on obtient ainsi un bloc prêt à être coupé.
• Le choix de la dureté de la paraffine dépend
souvent des conditions de la température
ambiante :
• en général, c’est une paraffine à point de
fusion de 56 à 58°C. qui est utilisée.
• Certains histologistes ajoutent à la paraffine
une certaine quantité (5 à 10% voire 20%) de
cire d’abeille, qui améliore la consistance du
bloc et permet aux sections de mieux adhérer
entre elles, d’où une confection plus aisée des
rubans.
• Le filtrage de la paraffine fraîche ou déjà utilisée
est extrêmement important car il permet de se
débarrasser définitivement de tous les dépôts
d’impuretés susceptibles d’entraîner à la coupe la
détérioration du rasoir ou l’altération du ruban.
• Certaines paraffines contenant du D.M.S.O.
(Diméthyl-sulfoxyde) ne doivent pas être
chauffées au dessus de 62°, afin de ne pas
dénaturer cet additif qui permet une meilleure
infiltration
• La qualité des coupes est en grande partie
fonction de l’absence de toute trace de
solvant dans la paraffine de la coupe :
• ce résultat est obtenu par la pratique des bains
multiples de paraffine, la pièce étant passée
dans au moins 3 bains successifs avant le
coulage du bloc.
• Ces bains doivent être fréquemment changés
car ils se chargent progressivement de
solvants ;
• le dernier bain doit toujours être constitué de
paraffine vierge.
• La persistance de toluène ou de tout autre agent
clarifiant abaisse le point de fusion de la
paraffine, rendant donc celle-ci plus molle et
moins propre à la coupe et entraîne une
dessiccation (par évaporation du solvant) et une
rétraction des structures, réalisant l’aspect « cuit »
caractéristique des inclusions défectueuses.
 CH 7 : EXAMEN EXTEMPORANE

• Définition : c’est une consultation anatomo-

pathologique rapide pratiquée pendant une
intervention et dont les résultats immédiats
permettent d’orienter les suites de cette
intervention.
• Cet examen engage la responsabilité du
pathologiste et ne doit pas être demandé pour
satisfaire la curiosité de l’opérateur.
• Il ne doit en effet être demandé que s’il a une
répercussion immédiate sur le traitement du
malade et/ou sur la "gestion" des prélèvements
à visée diagnostique ou pronostique parfois
nécessaires...
• Les buts :
• Fournir un diagnostic histologique immédiat
sur le tissu prélevé qui peut être du tissu
normal (exemple des parathyroïdes), une
lésion bénigne, une tumeur bénigne ou une
tumeur maligne.
• Dans ce dernier cas, il est nécessaire, dans la
mesure du possible, d’en détailler le type.
• Si cela n’est pas possible, le diagnostic doit
être différé, après en avoir expliqué les raisons
à l’opérateur.
• • Evaluer la qualité du matériel prélevé :
fragment trop altéré ou nécrotique, taille trop
petite pour faire un diagnostic définitif fiable.
Une reprise immédiate peut alors être faite par
l’opérateur.
• ou multiple, taille, composantes...
• Evaluer les caractéristiques macroscopiques et
microscopiques d’un nodule tumoral, car
l’étendue du geste chirurgical va souvent en
dépendre : nodule unique
• Evaluer l’intégrité des marges d’une pièce de
tumorectomie : cela demande une bonne
orientation des pièces par le chirurgien, un bon
repérage des fragments par le pathologiste
(tumeurs cutanées, mammaires, des tissus mous,
osseuses...).
• Evaluer l’extension ganglionnaire de
certaines tumeurs malignes épithéliales pour
guider immédiatement l’étendue d’un curage
(carcinomes thyroïdiens, prostatiques,
digestifs, ORL, mammaires...).
Cet examen n’est possible que dans le contexte
d’équipes très spécialisées.
• Préserver du matériel tumoral frais pour des
techniques spéciales, empreintes ou
étalements de tumeur, fixation en
glutaraldehyde (M.E.), en azote liquide ou
dans un congélateur à - 80°, dans des milieux
spéciaux, pour des techniques d’hybridation in
situ, de cytogénétique.
 Les méthodes :

• • Types d’appareils : ils sont fonction de l’environnement

et de l’organe concerné :
des appareils portables simples sous forme de "kit" en
mallette sont couramment utilisés en pratique "de ville."
• Ils permettent d’effectuer, avec un rasoir, des coupes de
quelques dizaines de microns sur le matériel congelé.
• Cette approche plus artisanale est cependant bien pratique
lorsque la clinique ne dispose pas d’appareil fixe.
• des loupes binoculaires, le dispositif Ultropak
de Leitz, sont utiles pour certaines pathologies.
• les appareils fixes à congélation (- 30°), type
"cryostat" ou "cryocut" (utilisés surtout en
milieu hospitalier) permettent une bonne
définition microscopique.
 Les colorations
La plus rapide est le :
• Bleu de Toluidine Phéniqué suivi d’une
différenciation à l’eau acétifiée et d’un rinçage à
l’eau du robinet : le stroma des cancers devient
pourpre, métachromatique et les cellules
tumorales bleues.
• Une coloration rapide avec de l’ Hématéine-
Eosine peut permettre en un second temps une
meilleure appréciation des détails histologiques
 Les règles

• Le pathologiste doit impérativement connaître

les antécédents du patient, les résultats des
examens pratiqués à l’occasion de
l’intervention en cours (cliniques, biologiques
et d’imagerie) et/ou avoir examiné lui-même le
patient.
• Ceci est en particulier recommandé pour toute
la pathologie mammaire.
• Une coopération étroite entre chirurgien et
pathologiste avec un respect mutuel de l’un
par l’autre est indispensable :
• le chirurgien doit connaître les limites de la
méthode et ses pièges,
• le pathologiste doit être au courant de tout le
dossier du malade afin de rendre sa réponse
aussi adéquate que possible aux problèmes
posés.
• Cet examen doit être pratiqué par un pathologiste
expérimenté, "physiquement et psychologiquement
disponible" dans une atmosphère sereine, en dehors de
la salle d’opération, mais à proximité d’elle,
• des échanges doivent pouvoir se faire.
• Un examen macroscopique est le préalable à l’examen
au microscope : réponse différée s’il existe une
discordance entre examen macro et microscopique.
• • L’examen histologique après inclusion en paraffine
fait partie intégrante de l’acte
 Les limites

• Cet examen n’est pas complètement fiable

(taille, représentativité, techniques
complémentaires).
• Les surestimations de malignité (faux positifs)
surtout liées à des réactions inflammatoires
(macrophages), impliquent de toujours
connaître les antécédents du patient, ou à
certains types histologiques particuliers de
lésions ou tumeurs.
• • Certains "types" tumoraux ne peuvent être
précisés lors de cet examen (faute de
colorations spéciales).
• • Les sous-estimations de malignité (faux
négatifs) peuvent être liées à la trop petite
taille de la tumeur (moins de 10mm),
• à un masquage d’une tumeur par des réactions
inflammatoires importantes...
• La cytologie fine ne peut être valablement appréciée
que sur coupes définitives après inclusion en
paraffine :
hyperplasie atypique versus carcinome in situ,
cicatrice fibreuse, Fibromatose versus
Fibrosarcome...
Pour les tumeurs déjà traitées (par chirurgie,
chimiothérapie ou radiothérapie) il faut, si possible,
comparer , au moment de l’analyse, les images
présentes à celles de la tumeur initiale .
• La fiabilité de l’examen extemporané par
rapport à l’examen définitif est liée à la fois
au type de la pathologie analysée et à l’organe
qui en est le siège.
CH 8 : PREAMBULE aux COLORATIONS

• La coloration des constituants cellulaires et

tissulaires est une réaction très complexe dans
laquelle entrent en jeu des mécanismes
physiques et chimiques.
• Définition d’un colorant :
solution aqueuse qui peut se charger
électriquement et qui peut colorer une
substance ou un ensemble de substances de
manière stable.
• Il est constitué:
- d'un groupement chromophore (couleur)
- et d'un groupement auxochrome (groupement
ionisé):
• assure la fixation permanente du colorant sur
des groupements acides ou basiques des
constituants cellulaires (à un pH donné)
• Caractéristiques de la coloration
topographique:
-Elle est non spécifique d'un type de molécule
-Elle donne une vue d'ensemble du tissu:
renseigne sur la répartition, l'architecture et la
structure des cellules
- Elle résulte de l'action conjuguée d'un colorant
acide (éosine) et d'un colorant basique
(hématoxyline, bleu de méthylène)
• Les substances acides de la cellule sont
colorées par un colorant basique
• Les substances basiques de la cellule par un
colorant acide.
• Cette coloration colore un type de charge.
• On peut voir la morphologie de la cellule
(forme), la position du noyau et sa forme.
• Ainsi, on peut déterminer le nombre de types
cellulaires dans le tissu et la structure de ce
tissu (cellules jointives ou non)
 Déparaffinage :

• La première étape de toute coloration d’une

coupe histologique est d’éliminer la paraffine
puis de la réhydrater.
• La galerie commence donc par :
• 2 bains de Toluène ou Xylène (pour éliminer la
paraffine),
• 3 bains d’Alcool à 100, 90 et 70° (pour
éliminer le Toluène
• et réhydrater progressivement),
• eau courante,
• eau lithinée (si fixation au Bouin),
• eau courante.
 Les colorants nucléaires

• Pour se fixer sur les acides nucléiques, les

colorants doivent être basiques (et donc avoir
une charge positive).
• L’hémalun, qui n’est pas un colorant, doit être
oxydé pour le devenir.
• Les colorations nucléaires sont progressives.
On les arrête au moment où les structures
nucléaires sont colorées de façon optimale. Ce
sont :
• Hématoxyline 1 g
• Eau distillée 1000 ml
• Alun de Potassium ou d’Alumine 50 g
• Iodate de Sodium 0,2 g
• Acide Citrique 1 g
• Hydrate de Chloral 50 g
• Dissoudre l’Hematoxyline, l’Alun et l’Iodate de
Sodium dans l’eau distillée.
• Laisser le mélange toute la nuit à la température du
laboratoire.
• Le lendemain ajouter l’Hydrate de Chloral et
l’Acide Citrique.
• Mélanger et faire bouillir pendant 5 minutes.
• Laisser refroidir.
• Filtrer. La solution est prête à l’emploi.
 L’HEMATOXYLINE DE MAYER

• Solution aqueuse saturée de :

• Alun de Potassium (environ 2%) 1000 ml
• Hémateïne 2 g
• Acide Acétique 20 ml
• Faire bouillir la solution d’Alun de Potassium.
• Ajouter à la solution bouillante l’Hématéine et laisser
bouillir pendant 5 minutes.
• Refroidir, Filtrer.
• Ajouter l’acide acétique. La solution est prête à
l’emploi.
 HEMATOXYLINE DE HARRIS

• Hématoxyline 5 g
• Ethanol absolu 2 ml
• Alun de Potassium ou d’Ammonium 100 g
• Eau distillée 1000 ml
• Oxyde rouge de mercure 2,5 g
• Dissoudre l’Hématoxyline dans l’Ethanol.
Dissoudre l’Alun dans l’eau en chauffant
légèrement et retirer la solution du feu.
• Mélanger les deux solutions, puis faire bouillir
le mélange.
• Le retirer du feu et ajouter avec précautions
par petites quantités l’oxyde mercurique.
• Chauffer jusqu’à ce que la solution acquière
une coloration pourpre foncé.
• Retirer du feu et refroidir aussitôt dans un
bain d’eau froide.
• L’Hematoxyline est prête à l’emploi dès
qu’elle est froide.
• Filtrer avant usage. (On peut ajouter 2 à 4%
d’acide acétique glacial pour augmenter la
coloration nucléaire.)
 Les colorants cytoplasmiques

• Les colorations cytoplasmiques sont

régressives : on surcolore puis on enlève
l’excès avec un alcool faible.
• Les principaux sont :
• L’EOSINE *
– Eosine B 10 g
– Eau distillée 1 000 ml
• La PHLOXINE *
– Phloxine B 30 g
– Eau distillée 1 000 ml
• L’ERYTHROSINE *
– Erythrosine B 10 g
– Eau distillée 1 000 ml
 HEMATOXYLINE- EOSINE

• Technique
• Déparaffinage
• Eau courante
• Colorer dans l’Hématoxyline ou Hemalun *
• Laver à l’eau courante
• Bleuir dans une solution d’Eau Lithinée *
• Rincer à l’eau courante
• Colorer dans une Solution aqueuse d’Eosine à 1%
(5 à 7 min.)
• Rincer rapidement à l’eau courante
• Différencier dans l’Alcool à 70°
• puis 95°
• Alcool absolu
• Xylènes
• Montage
 Résultats

• Noyaux bleus à bleus-noirs

• Cytoplasmes roses à rouges
• Hématies roses vifs
• Collagène rose très pâle
• Fibres élastiques roses vifs
• Réactifs
• Eau Lithinée Mettre du carbonate de Lithium
à saturation dans l’eau distillée, prêt à l’emploi
(ou solution ammoniacale faible sous forme de
quelques gouttes d’ammoniaque dans de
l’eau).
• A changer tous les jours avant chaque série.
• Eosine
• Hematoxyline de Harris
• Erythrosine ou Erythrosine
• A utiliser dissous à 0,5% dans de l’eau distillée.
 Remarques

• Les temps de coloration sont variables :

Selon la solution employée :
• Hematoxyline de Mayer 15 min,
• Hémalun de Mayer 5 min,
• Hématoxyline de Harris 5 min,
• Eosine aqueuse à 1% 5 à 7 min
• Phloxine aqueuse à 3% 2 à 3 min
• Erythrosine aqueuse à 1% 5 min
• Selon la « vieillesse » du colorant : augmenter
le temps de contact si le colorant est usagé et le
changer le plus souvent possible.
• Il n’est pas obligatoire de bleuir la lame dans
l’eau lithinée (l’eau courante suffit souvent).
 HEMATOXYLINE-ERYTHROSINE-SAFRAN (H.E.S.)

• Technique
• Déparaffinage (3 Xylènes successifs pendant 5
min
puis 2 Alcools à 95° et 100°)
• Eau courante (1 à 2 min)
• Colorer dans l’Hemalun * pendant 3 à 5 min.
(ou Hématoxyline de Harris pendant 4 min.)
• Laver à l’eau courante
• Bleuir dans une solution d’Eau Lithinée *
• Rincer à l’eau courante
• Colorer dans une Solution aqueuse d’Eosine
à 1% * pendant 5 à 7 min. (ou Erythrosine
pendant 30 sec., ou mélange Eosine-
Erythrosine * pendant 30 sec.)
• Rincer rapidement à l’eau courante
• Alcool à 70° puis 95°
• Alcool absolu
• Solution alcoolique de Safran * (de 1 à 8 min)
• Alcool absolu (très rapide)
• Xylènes ou Toluènes
• Montage
 Résultats

• Noyaux bleus à bleu-noir

• Cytoplasmes roses
• Fibres musculaires rouge vif
• Hématies rouge vif
• Collagène jaune orangé
• Fibres élastiques roses
 Réactifs

• Hematoxyline de Harris
• Erythrosine : A utiliser dissous à 1% dans de
l’eau distillée.
• Eosine à 1% : 1 g d’Eosine dans 100 ml d’eau.
Conservation à 37°C.
• Ajouter un grain de Thymol pour éviter la
prolifération des germes.
• Mélange Eosine-Erythrosine : Eosine à 1%
700 ml Erythrosine à 1% 10 ml Acide
Acétique à 1% 4 ml
• Solution alcoolique de Safran : Faire sécher
pendant 24h, en étuve à 56°, 20 gr de Safran.
• Pulvériser dans un mortier.
• Faire infuser la poudre de Safran dans 1000 ml
d’éthanol absolu pendant plusieurs jours.
• La solution est prête et doit être conservée à
l’étuve où elle se bonifie.
• Elle doit être diluée au 1/3 pour l’emploi
• Eau Lithinée Solution aqueuse saturée de
carbonate de lithium (ou solution
• ammoniacale faible sous forme de quelques
gouttes d’ammoniaque dans de l’eau) pour
bleuir.
• A changer tous les jours avant chaque série.
COLORATION de
Papanicolaou
 PRINCIPE DE LA METHODE

• La coloration de Papanicolaou est la plus

utilisée pour les prélèvements cytologiques.
• La première phase consiste à colorer les
noyaux avec l’hématoxyline, qui apparaissent
en bleus, violet foncé.
• La seconde phase de colorer le cytoplasme
avec une solution de coloration orange, les
structures cibles apparaissent en orange
d’intensités différentes.
• La troisième phase est la coloration à l’aide
d’un mélange d’éosine, vert lumière et de brun
Bismarck, permettant la différenciation de
l’épithélium pavimenteux.
• Les diagnostics ne peuvent être prononcés que
par des personnes autorisées et entraînées.
 PROTOCOLE

• 1. Placer en eau distillée (30’’ uniquement pour

les préparations fixées par un spray)
• 2. Placer en alcool 70° pendant 3 min
• 3. Rincer à l’eau courante pendant 2 min
• 4. Placer dans la solution d’ hématoxyline de
Harris pendant 6 min
• 5. Rincer à l’eau courante pendant 2 min
• 6. Passer en solution HCL 0,25% pendant 3 sec
• 7. Rincer à l’eau courante pendant 1 à 2 min
• 8. Placer en alcool 70° pendant 1 min
• 9. Placer en alcool 95° pendant 1 min
• 10. Placer dans la solution d’OG6 pendant 3
min
• 11. Placer en alcool 95° pendant 1 min
• 12. Placer en alcool 95° pendant 1 min
• 13. Placer dans la solution d’EA50 pendant 3 min
• 14. Placer en alcool 95° pendant 30 sec
• 15. Placer en alcool 95° pendant 30 sec
• 16. Placer en alcool 100° pendant 30 sec
• 17. Placer en alcool 100° pendant 1 min
• 18. Placer en xylène pendant 1 min
• 19. Sortir en xylène
• 20. Monter les lames avec la gamme Q Path
Coverquick.
 Résultats :
• La chromatine nucléaire doit être bleue.
• Le cytoplasme des cellules éosinophiles : rose,
parfois rose-rouge ou orange.
• Le cytoplasme des cellules cyanophyles : bleu,
parfois verdâtre.
• Le cytoplasme des cellules acidophiles : orangé, rose.
• Erythrocytes : Rouges.
• Noyaux cellulaires : bleus, noirs, parfois violet foncé.
• Les temps de colorations peuvent varier selon
les préférences de couleurs personnelles.
• Les temps indiqués dans cette notice sont
approximatifs. Les temps peuvent être ajustés.
• Certaines ressources d’eau du robinet sont
acides et ne peuvent être utilisées dans la
partie bleuissement de ce protocole, si l’eau du
robinet est trop acide, utiliser une solution
alcaline diluée.
 COLORATIONS SPECIALES
• Coloration spéciale = coloration réalisée pour
préciser des structures ou substances suspectées
par le pathologiste lors de son analyse initiale sur
les coupes de technique stendard.
• Elle est basée sur des réactions biochimiques qui
permettent de mettre en évidence dans les tissus ,
différents constituants (lipides, glucides,
protéines, acides nucléiques, métaux, Etc)
 BLEU ALCIAN
• Cette coloration révèle les mucines acides
• Technique
• Déparaffinage
• Eau courante
• Mordancer les lames dans l’Acide acétique à
3% (3 min)
• Passer les lames dans une solution de Bleu
Alcian filtrée avant l’emploi (30 à 45 min)
• Bien rincer à l’eau courante (10 min)
• Contre-coloration par le Rouge Nucléaire * à
0,2% (3 à 4 min)
• Eau courante
• Eau Distillée
• 2 bains d’Alcool absolu
• 2 bains de Xylène
• Montage
 Résultats

• Selon le pH de la solution utilisée :

• Si le pH est compris entre 3,1 et 2,5 les
mucopolysaccharides acides sont colorés en
bleu turquoise, sur fond rosé.
• Si le pH est inférieur à 2, le Bleu Alcian colore
les mucopolysaccharides sulfatés.
• Noyaux rouges
• Fond rose pâle
 Réactifs

• Bleu Alcian
• Bleu Alcian 0,1 g
• Acide acétique en solution aqueuse : à 3%
pour un pH à 2,5 à 0,5% pour un pH à 3,1,
100 ml
• Préparation : Dissolution simple. Modifier le
pH en ajoutant HCl
• Rouge Nucléaire
– Rouge Nucléaire solide (Nuclear fast red) 0,2 g
Sulfate d’Aluminium 5 g
– Eau distillée 100 ml
• Préparation :
– Agiter et chauffer jusqu’à dissolution.
– Refroidir et filtrer deux fois.
– Ajouter un cristal de Thymol.
 CARMIN de BEST

• Technique
• Déparaffinage
• Eau courante
• Colorer rapidement à l’Hemalun (2 min.)
• Rincer à l’eau courante
• Colorer pendant 5 min dans une solution A * + B * de
travail
• Sans laver, sans différencier, rincer la coupe rapidement
dans la solution C * jusqu’à l’arrêt de l’extraction du
rouge par la solution
• Rincer rapidement la coupe à l’alcool à 80°
• Alcools absolus
• Xylènes
• Montage
• Résultats
• Glycogène rouge carminé
• Noyaux bleus
• Fibrine et mucines rouges
• Préparation : Faire bouillir doucement pendant
10 min (fumées blanches) Refroidir Ajouter 20
ml d’ammoniaque
• Cette solution se conserve de 1 à 3 mois au
réfrigérateur.
 Réactifs

• Solution A :
– Carmin de Best Carmin 2 g
– Carbonate de Potassium 1 g
– Chlorure de Potassium 5 g
– Eau distillée 60 ml
• Préparation :
• Faire bouillir doucement pendant 10 min (fumées
blanches)
• Refroidir Ajouter 20 ml d’ammoniaque
• Cette solution se conserve de 1 à 3 mois au réfrigérateur.
• Solution B
– Ammoniaque 30 ml
– Alcool méthylique 30 ml
• Solution A + B de travail Solution A 1 vol
Solution B 2 vol
• Solution C
– Alcool méthylique 4 ml
– Alcool éthylique 8 ml
– Eau distillée 10 ml
 COLORATION de FITE
(détection du bacille de la lèpre)

• Technique
• Déparaffinage dans deux bains d’une solution
comportant 2 volumes d’huile de paraffine
pour 1 volume de xylène (au moins 7 min.
pour chaque bain).
• Essuyer l’excès d’huile et tamponner très
délicatement la coupe avec du papier filtre
(papier buvard fin).
• Laver à l’eau courante pendant 5 min.
• puis rincer dans l’eau distillée.
• Colorer par la Fuchsine phéniquée * de Ziehl
pendant 30 min. sur la paillasse sans chauffer.
• Lavage à l’eau courante (2 min.)
• Séchage au papier filtre
• Décolorer dans la solution d’alcool acide à
1% * (ou solution aqueuse d’acide sulfurique
pendant 20 sec.) jusqu’à l’obtention d’une
teinte rose légèrement soutenue.
• Rinçage à l’eau courante pour stopper la
différenciation (2 min.)
• Contre-coloration du fond en recouvrant la lame
quelques secondes par une solution de bleu de
méthylène * à 0,15% jusqu’à ce que le fond soit bleu
(5 ou 6 trempages).
• Rinçage à l’eau courante puis bien sécher au papier
filtre (à l’étuve à 60°) : 3 min. environ
• Alcool absolu (3 bains)
• Xylènes
• Montage de préférence au Baume du Canada plutôt
qu’à l’Eukitt
• Résultats
• Bacille de Hansen : rose sur fond bleu
• Réactifs
• Alcool Acide à 1% :
• Acide Chlorhydrique concentré 10 ml
• Alcool à 70° 990 ml
• Mettre la lame dans deux bains successifs, le
premier enlève l’excès de colorant et le second
doit donner une couleur saumon.
• Fuchsine Phéniquée de Ziehl
• ou préparer une solution de Phénol en
mélangeant : Cristaux fondus de Phénol pur 5
ml Eau distillée 95 ml
• Mélanger ensuite : Une solution saturée de
Fuchsine basique (environ 3%) dans de
l’éthanol absolu 10 ml et la Solution de Phénol
préparée plus haut 90 ml
• Filtrer avant utilisation et jeter après usage
• Bleu de Méthylène à 0,15%
• Bleu de Méthylène 1 g
• H2O
• Le bleu de méthylène peut être conservé en solution de
garde (1,5% dans l’alcool à 95%)
• et dilué de 1 à 10 avec de l’eau avant utilisation.
• Huile de paraffine :
Mélange à parts égales d’huile végétale et de xylène.
Elle peut être remplacée par de l’huile d’arachide ou de
l’huile d’olives, mais les résultats sont moins bons.
 FONTANA

• Mise en évidence des granulations argentines et de pigment

mélanique.
• Technique
• Déparaffinage
• Eau courante
• Puis eau distillée
• • Solution de Fontana * (nitrate d’argent ammoniacal) dans un
récipient couvert et mis à l’obscurité pendant 18 à 24 h.
• Rinçage à l’eau distillée
• •Chlorure d’or jaune à 1% en solution aqueuse (3 min.)
• Rinçage à l’eau distillée
• Hyposulfite de Sodium à 5% * (5 min.)
• Rinçage soigneux à l’eau courante puis
distillée (10 min)
• Contre-coloration des noyaux par le Rouge
Nucléaire (5 min.), plutôt que par le Jaune de
Méthanyl (2 min.)
• Eau courante
• Alcools
• Xylènes et Montage
• Résultats
• Granulations argentaffines et pigments
mélaniques noires
• Noyaux rouge
• Fond rouge
• Réactifs
• Solution de Fontana : Nitrate d’Argent
Ammoniacal (nécessite une verrerie très propre) :
• Nitrate d’Argent (Ag NO3) à 10% : 10 ml 
• ajouter de l’ammoniaque concentré au goutte à
goutte en remuant constamment jusqu’à ce que le
précipité formé soit juste dissous. (La réussite de
la coloration se fait à la goutte d’ammoniaque
prés !).
• ajouter quelques gouttes de la solution de
Nitrate d’Argent à 10% jusqu’à opalescence
persistante du liquide.
• compléter à 50 ml avec de l’eau distillée
• laisser reposer 24 heures la solution à
l’obscurité jusqu’à éclaircissement et décanter
dans un flacon en verre brun.
• filtrer avant chaque usage
• Hyposulfite de Sodium à 5% Sulfite de
Sodium anhydre 5 g Eau distillée 100 ml
• Jaune de Methanyl à 0,01% dans l’eau
distillée
• Sulfocyanure d’Ammonium à 6% dans l’eau
distillée
 GRAM (coloration de Brown et Brenn)

• Coloration effectuée en bactériologie et permet de colorer

les bactéries et de les distinguer par leur aptitude à fixer
le violet de gentiane (Gram +) ou la fuchsine (Gram -)
• Technique
• Déparaffinage
• Placer les coupes sur un portoir horizontal et verser 1 ml
d’une solution aqueuse à 1% de cristal violet,
• puis 5 gouttes d’une solution aqueuse à 5% de
bicarbonate de sodium.
• Laisser agir 1 minute en agitant doucement les lames.
• puis 5 gouttes d’une solution aqueuse à 5% de
bicarbonate de sodium.
• Laisser agir 1 minute en agitant doucement les lames.
• Laver à l’eau courante.
• Mettre sur la lame une solution de Lugol * et laisser
agir pendant 1 min.
• Rincer à l’eau courante et sécher les lames dans du
papier filtre.
• Différencier par un mélange Alcool-éther (ou
Acétone-Ether) à parties égales jusqu’à disparition de
la coloration bleue.
• Rincer à l’eau distillée.
• Colorer les lames avec une solution de Fuchsine
basique * pendant 1 minute
• Rincer à l’eau courante et sécher les lames dans
du papier filtre
• Plonger les lames dans l’Acétone • Différencier
par une solution d’acide picrique à 0,1% dans
l’acétone jusqu’à ce que les coupes prennent une
teinte rose jaunâtre (environ 30 secondes)
• Rincer rapidement dans de l’acétone puis
dans un mélange acétone-xylène à parties
égales
• Passer dans deux bains successifs de Toluène
• Montage
 Résultats

• Bactéries Gram positif : bleues, Bactéries

Gram négatif : rouges Noyaux : rouges
• Réactifs
• Solution de Lugol : dissoudre
• iodure de potassium 2 g eau distillée 200 ml
puis iode 1 g
• Solution de Fuchsine-basique
• Solution-mère : C’est une solution aqueuse
saturée (0,25 %) de Fuchsine-basique Solution
de travail : extemporanément diluée : solution-
mère 0,1 ml eau distillée 100 ml
 COLORATION DE GROCOTT

• Elle met en évidence les micro-organismes soit

les levures ou champignons (C. Albicans) et les
parasites. Les glucides de la paroi des
champignons sont transformés en aldéhydes par
oxydation.
• Technique
• (la fixation au formol à 10% est recommandée)
• Déparaffinage, puis eau distillée
• • Oxyder dans la solution d’oxyde chromique
* à 5% pendant 1 heure
• Laver à l’eau distillée Puis à l’eau courante (10
min) Laver à l’eau bidistillée (4 à 5 reprises)
dans une solution aqueuse de bisulfite de Na
(1%).
• • Placer les coupes à l’étuve à 56° dans la
solution de Méthénamine argent * pendant
40 min. (A surveiller).
• Au sortir du bain d’argent, rincer soigneusement à
l’eau bidistillée
• Virage au Chlorure d’or * (2 à 5 min.)
• Rincer à l’eau distillée
• Hyposulfite de soude à 2% (Wilder) * (2 à 5 min.)
• Colorer le fond au Vert Lumière * (en solution
acétique à 1%) pendant 2 min.
• Rincer à l’eau distillée
• Alcool absolu, Xylènes, Montage
• Résultats
• Champignons et Pneumocystis Carinii colorés
en noir , sur fond vert
• Réactifs
• Méthénamine
• Solution-mère du Grocott (solution d’argent
méthénamine) (à conserver au réfrigérateur)
:
• Solution aqueuse à 5% de Nitrate d’argent : 5
ml Solution aqueuse à 3% de Méthénamine :
100 ml Il se forme un précipité blanc qui se
dissout immédiatement par agitation. Cette
solution se conserve pendant quelques mois au
réfrigérateur à l’abri de la lumière .
• Solution de travail (à préparer extemporanément)
Solution de tétraborate de soude à 5% 2 ml Eau
bidistillée 25 ml Solution mère d’Ag 25 ml
• Les solutions suivantes sont faites dans l’eau
distillée : Acide chromique à 5%, Métabisulfite de
Sodium à 1%, Hyposulfite de Sodium à 2%.
Les autres sont faites dans l’eau bidistillée :
Chlorure d’or à 0,1%, Tétraborate de Sodium à 5%.
• • Vert Lumière - Solution mère : Acide
acétique glacial 0,2 ml Vert Lumière S F 0,2 g
Eau distillée qsp 100 ml
• Solution de travail : Solution mère 10 ml Eau
distillée 50 ml
• Remarques
• Prendre un témoin positif : truffe aspergillaire
par exemple
 P.A.S. (PERIODIC ACID SCHIFF)

• Cette coloration met en évidence les mucines,

membranes basales, le glycogène ainsi que les
filaments mycéliens.
• La réaction de PAS correspond à l’oxydation
de certains polysaccharides par l’acide
périodique, révélée par une coloration rouge.
• Technique
• Déparaffinage
• Laver les lames à l’eau courante
• Acide périodique en solution aqueuse à 1% (5
min.)
• Lavage à l’eau courante
• Rincer à l’eau distillée
• • Réactif de Schiff * (au moins 30 min.)
• Lavage à l’eau courante (au moins 5 min.)
• Hémalun (2 min.) (ou Hématoxyline pendant
15 sec.)
• Rincer à l’eau courante
• 2 bains successifs d’Alcool absolu
• 2 bains successifs de Xylène
• Montage
• Résultats
• Mucopolysaccharides acides : rouge-violacé
• Réactifs
• Solution d’acide sulfureux : Préparer au moment
de l’emploi :
10 ml d’une solution aqueuse de Métabisulfite de
sodium à 10% (ou métabisulfite de sodium ou de
potassium) avec :
10 ml d’acide chlorhydrique
200 ml d’eau distillée.
• NB : Elle permet de régénérer le réactif de Schiff
lorsqu’il commence à rosir.
• Acide périodique à 1% à diluer dans l’eau
distillée (Conserver au frais).
• Réactif de Schiff du commerce ou préparé
comme suit dans une verrerie très propre :
Dissoudre dans 200 ml d’eau distillée bouillante
1 g de Fuchsine basique (ou pararosaniline)
• Agiter fortement puis refroidir à environ 50°C et
filtrer
• Ajouter au filtrat 20 ml d’acide chlorhydrique et
refroidir à 25°C
• Ajouter 1 g de métabisulfite de sodium (ou de
potassium)
Laisser reposer la solution au frais à l’obscurité
dans un flacon bien bouché, parfaitement nettoyé et
sec.
• Ajouter 2 g de charbon activé, si besoin.
• Agiter et filtrer : La solution doit être limpide
et incolore.
• N’utiliser qu’après un délai de 24 h. Le
liquide peut se conserver plusieurs mois au
froid (4°) et en verre brun, à l’obscurité.
 COLORATION DE PERLS
(ou Bleu de Prusse)

• Elle étudie le métabolisme de fer, met en évidence les

complexes insolubles contenat du fer: hémosidérine,
mitochondries chargées en fer.
• Technique
• Déparaffinage, Eau courante
• Recouvrir la lame pendant 20 min. avec un mélange à
parties égales de Ferrocyanure de Potassium * à 2%
et d’Acide chlorhydrique à 2%.
• Recouvrir la lame du mélange pendant 20 min. (de 15 à
30 min.).
• Laver à l’alcool à 70°.
• Rinçage à l’eau distillée
• Coloration au Rouge nucléaire * pendant 5
min.
• Déshydratation
• Alcools
• Xylènes
• Montage
• Résultats
• Cette coloration met en évidence tous les ions
ferriques en milieu acide :
• Fer ferrique bleu foncé
• Noyaux rouges
 Réactifs

• Ferrocyanure de Potassium * à 2%. Solution à

saturation dans l’eau distillée préparée
extemporanément à l’abri de la lumière et qui doit
être jaunâtre. La rejeter si elle devient verdâtre.
• Solution d’acide chlorhydrique à 2% dans de
l’alcool à 70°
• Rouge Nucléaire à 0,1%
• Rouge Nucléaire 0,1 g - Sulfate d’Aluminium à
5% 100 ml (en solution aqueuse)
 COLORATION DE GORDON SWEET (RETICULINE)

• Technique
• Déparaffinage (xylène, alcool 5 min., collodion
* 5 min., alcool à 80° et eau courante 5 min.).
• • Oxyder dans le Permanganate de
Potassium * à 0,5% (5 min.).
• Laver à l’eau courante
• • Blanchir dans l’Acide oxalique * à 1 % (le
blanchiment doit être instantané et complet)
• Eau courante
• Eau distillée
• Mordancer dans l’Alun de fer * à 2,5% (15
min.)
• Rincer dans 2 ou 3 bains d’eau distillée
• Imprégner dans la solution de Nitrate
d’Argent ammoniacal * (Wilder) (2 à 3 min.)
• Rincer à l’eau distillée très rapidement
• • Réduire dans une Solution formolée à 10%
jusqu’à ce que la coupe devienne marron (2
min.).
• Différencier dans du chlorure d’or * à 0,2%
(1 à 3 min.) jusqu’à l’obtention d’une couleur
grise uniforme.
• • Fixer dans une solution d’hyposulfite de
sodium à 5% (5 min.).
• Rincer à l’eau courante
• Contre-coloration au Kernechtrot (3 min.) (ou
Rouge Nucléaire)
• Rincer à l’eau,
• puis alcool
• Montage
 Réactifs

• Solution de Nitrate d’argent ammoniacal

(c’est la difficulté de la coloration et le secret
de sa réussite. Sa fabrication est à une goutte
d’ammoniaque près !).
Prendre 5 ml de nitrate d’argent à 10%,
Dissoudre le précipité en ajoutant goutte à
goutte de l’ammoniaque pur en solution
aqueuse,
• Ajouter 5 ml de lessive de soude à 3%. Il se
forme un précipité que l’on redissout en
ajoutant goutte à goutte de l’ammoniaque,
Compléter à 50 ml avec de l’eau distillée. (A
conserver à l’abri de la lumière, quelque jours
seulement).
• Solution formolée à 10%
• Collodion
Colloïdine 1 gr à dissoudre dans
Alcool 150 ml
Ether à 65 ° 150 ml
• Permanganate de Potassium à 0,5% dans de
l’eau distillée
• Acide Oxalique à 1% dans de l’eau distillée
• Alun de fer à 2,5% dans de l’eau distillée
• Chlorure d’or à 0,2% dans de l’eau distillé
• Résultats
• Fibres de réticuline : noires , Noyaux : roses
 ROUGE CONGO (Amylose)
• Cette coloration marque en rouge les dépôts
d’amylose.
• Technique
• Déparaffinage Xylènes Alcools Eau distillée
• Solution A’ * pendant 20 min.
• •Solution B’ * sans rincer pendant 20 min.
• 3 bains d’Alcool absolu Eau distillée
• Hématoxyline : coloration légère
• Eau courante
• Déshydratation par les alcools
• Xylènes
• Montage
• Résultats
• Substance amyloïde rose, biréfringence en lumière
polarisée
• Noyaux bleus
• Fond jaune
• Réactifs
• •Solution-mère A
• Solution saturée de Chlorure de Sodium dans
l’alcool à 80°
• Solution de travail A’ (A utiliser dans les 15
min. après la confection)
• 10 ml de la solution A ajoutés à 0,1 ml d’une
solution aqueuse de soude à 1%
• Solution-mère B. Elle est constituée de :
• 1 volume de la solution A ajouté à 1 volume
d’une solution saturée de Rouge Congo dans
l’alcool à 80° (laisser reposer 24 heures avant
usage)
• •Solution de travail B’ (A utiliser dans les 15
min. après la confection)
• 10 ml de la solution B ajouté à 0,1 ml d’une
solution aqueuse de soude à 1%
• •Hématoxyline (commercialisée)
• Soude à 1% dans de l’eau distillée
• Rouge Congo à saturation dans de l’alcool à
80°
• Remarques
• Utiliser un témoin d’amylose positif.
• La coloration de l’amylose par le Rouge Sirius
est plus évidente .
 ROUGE SIRIUS
• Coloration qui permet de détecter les fibre de réticuline.
Elle peut détecter également l’amylose.
• Technique
• Déparaffinage Alcool absolu Eau
• Hématoxyline de Harris 1 à 2 min.
• Bleuir à l’eau du robinet Eau distillée
• Solution de Rouge Sirius * pendant 1 heure
• Laver à l’eau courante 10 min.
• Alcools
• Xylènes
• Montage
• Résultats
• Amylose rouge (biréfringence en lumière polarisée)
• Fibres rouges (équivalent d’une réticuline)
• Polynucléaires éosinophiles rouges
• Réactifs
• Solution de Rouge Sirius :
• Dissoudre 0,5 g de Rouge Sirius dans 45 cc d’eau
• Ajouter 50 cc d’alcool absolu et 1 cc d’une solution
de Soude à 1%
• Agiter
• Laisser reposer
• Ajouter lentement environ 4 cc de Chlorure de
Na à 20% jusqu’à l’obtention d’un léger
précipité
• Laisser reposer une nuit et filtrer
• La solution est stable
 TRICHROME DE MASSON

• Cette coloration met en évidence les fibres de

collagènes.
• Technique
• Déparaffinage
• Eau courante
• Mordancer dans le Bouin pendant 1 h. à 56°
• Rincer à l’eau
• Coloration à l’Hémalun (ou Hématoxyline de Harris)
(1 min. 30)
• Lavage à l’eau courante
• Différenciation rapide dans l’alcool
chlorhydrique
• Lavage à l’eau
• Bleuir à l’eau lithinée
• Lavage à l’eau
• Rinçage dans l’eau acétifiée à 1%
• Plonger les coupes dans un mélange de
Ponceau Fuchsine * dilué à 1 pour 5 dans de
l’eau acétifiée, pendant 5 min.
• Rinçage à l’eau acétifiée
• Plonger les coupes dans l’acide
phosphomolybdique à 1%
• dans l’eau distillée, pendant 10 min pour
différencier
• Rinçage à l’eau acétifiée
• Contre-coloration par Vert-Lumière * ou
Bleu d’Aniline * pendant 1 min. (maxi 2 min.)
et contrôle.
• Lavage à l’eau
• Deshydratation à l’alcool absolu
• Xylènes
• Montage
• Résultats
• Noyaux bleus-noirs
• Mucus bleu ou vert
• Cytoplasmes [roses à rouge Kératine rouge vif
• Hématies rouges vifs
• Collagène bleu ou vert
• Fibres élastiques roses (selon le colorant
utilisé)
• Réactifs
• Eau Acétifiée à 1%
• Mélange Ponceau-Fuchsine (se prépare à
l’avance et se conserve indéfiniment)
• a - Solution de Fuchsine * 1 partie
• b - Solution de Ponceau * 2 parties
• a - Fuchsine acide : 1 g
• b - Ponceau de Xylidine : 1 g
• - Eau distillée 100 ml
• - Acide acétique 0,5 ml
• Vert Lumière 1 ml –
• Eau distillée 100 ml
• - Acide acétique 0,5 ml
• Bleu d’Aniline 1 ml
• - Eau distillée 100 ml
• - Acide acétique glacial 0,5 ml
 IMMUNOHISTOCHIMIE (IHC) ET
IMMUNOCYTOCHIMIE.
• L'immunohistochimie (ou « IHC ») est le nom
d'une méthode de localisation de protéines
dans les cellules d'une coupe de tissu, par la
détection d'antigènes au moyen d'anticorps.
• L‘IHC exploite le fait qu'un anticorps se lie
spécifiquement à des antigènes dans les tissus
biologiques.
• Les anticorps peuvent être d'origine
polyclonale ou monoclonale
 Intérêt et définitions.
• L’intérêt de cette technique est de repérer des
antigènes (protéines le plus souvent) au niveau
cellulaire ou extracellulaire à l’aide d’anticorps
spécifiques.
• Un antigène est une molécule capable d’activer le
système immunitaire et de conduire à la
production d’anticorps.
• Un anticorps est une glycoprotéine, sécrétée par
les plasmocytes, capable de se lier spécifiquement
à l’antigène.
 Principes
- exploiter la réponse immunitaire de diverses
espèces pour produire des anticorps spécifiques.
- réaliser la liaison antigène-anticorps spécifique.
- détecter (visualiser) le complexe antigène-anticorps.
• Un antigène possède en général plusieurs
épitopes . En fonction de la configuration de
l’antigène, un épitope peut ne pas être accessible à
l’anticorps.
•
• Plusieurs anticorps peuvent se lier à un même épitope
avec des affinités différentes.
• Un même épitope peut parfois être présent sur plusieurs
antigènes.
• On distingue 2 types d’anticorps :
• les anticorps polyclonaux et les anticorps monoclonaux.
• Les anticorps spécifiques peuvent être fabriqués en
injectant à plusieurs reprises un échantillon de l'antigène
(protéine à détecter) à un animal (le plus souvent, lapin ou
chèvre), et en recueillant ensuite le sérum riche en
anticorps (antisérum).
• Cet antisérum contient différents anticorps
dits polyclonaux, produits par différents
plasmocytes, reconnaissant divers antigènes
de la protéine d'intérêt.
• Avantages : simple, peu couteux.
Inconvénients :
– - risques de réactions croisées (signal non
spécifique) ;
– - quantités limitées de sérum .
• Un anticorps monoclonal correspond à une
population d'anticorps identiques dirigés contre
le même site antigénique d'une protéine.
• Ces anticorps sont produits en grande quantité
en culture par un clone de lymphocytes B selon
la technique des hybridomes.
• Après avoir immunisé une souris contre un
antigène donné, on prélève dans sa rate des
lymphocytes B.
• Ceux-ci sont fusionnés avec des plasmocytes
tumoraux immortalisés.
• Après sélection, les hybridomes ainsi obtenus
sont une source permanente et stable d'un
seul type d'anticorps monoclonal.
• La spécificité des anticorps monoclonaux est
supérieure à celle des sérums polyclonaux,
mais leur sensibilité peut être inférieure.
• Avantages : un seul anticorps par clone (limite
les réactions croisées) ;
• Inconvénients : - long, coûteux, résultats
incertains