ไซทีโอเอฟ

ไซโตเมทรีตามเวลาบินหรือCyTOFเป็นการประยุกต์ใช้ไซโตเมทรีมวลที่ใช้ในการวัดปริมาณเป้าหมายที่ติดฉลากไว้บนพื้นผิวและภายในเซลล์แต่ละเซลล์ CyTOF ช่วยให้วัดปริมาณส่วนประกอบของเซลล์หลายส่วนพร้อมกันได้โดยใช้เครื่องตรวจจับ ICP-MS

CyTOF ใช้ประโยชน์จากการติดฉลากภูมิคุ้มกันเพื่อวัดปริมาณโปรตีนคาร์โบไฮเดรตหรือไขมันในเซลล์ เป้าหมายจะถูกเลือกเพื่อตอบคำถามการวิจัยเฉพาะ และจะถูกติดฉลากด้วย แอนติบอดี ที่ มีโลหะ แลนทาไนด์ เซลล์ที่ติดฉลากจะถูกพ่นละอองและผสมกับก๊าซอาร์กอนที่ได้รับความร้อนเพื่อทำให้เซลล์ที่มีอนุภาคแห้ง ส่วนผสมของก๊าซตัวอย่างจะถูกโฟกัสและจุดไฟด้วยคบเพลิงพลาสม่า อาร์กอน วิธีนี้จะทำให้เซลล์แตกออกเป็นอะตอมเดี่ยวๆ และสร้างกลุ่มไอออน ไอออนที่มีน้ำหนักต่ำจำนวนมากที่เกิดจากอากาศในสิ่งแวดล้อมและโมเลกุลทางชีวภาพจะถูกกำจัดออกโดยใช้ เครื่อง วิเคราะห์มวลควอดรูโพลไอออนที่มีน้ำหนักมากที่เหลือจากแท็กแอนติบอดีจะถูกวัดปริมาณด้วยสเปกโตรเมทรีมวลแบบ Time-of-flight [1]ความอุดมสมบูรณ์ของไอออนมีความสัมพันธ์กับปริมาณของเป้าหมายต่อเซลล์และสามารถใช้เพื่ออนุมานคุณภาพของเซลล์ได้[2]

ความไวในการตรวจจับไอออนต่าง ๆ ของการวัดมวลสารทำให้สามารถวัดเป้าหมายได้มากกว่า 50 เป้าหมายต่อเซลล์ในขณะที่หลีกเลี่ยงปัญหาการทับซ้อนของสเปกตรัมที่พบได้เมื่อใช้โพรบเรืองแสง[3] [4]อย่างไรก็ตาม ความไวนี้ยังหมายถึงการปนเปื้อนของโลหะหนักในปริมาณเล็กน้อยที่เป็นปัญหา[5]การใช้โพรบจำนวนมากก่อให้เกิดปัญหาใหม่ในการวิเคราะห์ข้อมูลที่มีมิติสูงที่สร้างขึ้น[6]

รูปที่ 1: ขั้นตอนหลักของขั้นตอน CyTOF การคีเลตไอโซโทป การติดแท็กแอนติบอดี การย้อมเซลล์ และการฉีดละอองเข้าไปใน ICP-MS และการวิเคราะห์ข้อมูล

ประวัติศาสตร์

ในปี 1994 Tsutomu Nomizu และเพื่อนร่วมงานที่มหาวิทยาลัยนาโกย่าได้ทำการทดลองแมสสเปกโตรเมทรีกับเซลล์เดี่ยวเป็นครั้งแรก Nomizu ค้นพบว่าเซลล์เดี่ยวสามารถพ่นละออง อบแห้ง และจุดไฟในพลาสมาเพื่อสร้างกลุ่มไอออนที่สามารถตรวจจับได้ด้วยสเปกโตรเมทรีการปล่อย[7]ในการทดลองประเภทนี้ ธาตุต่างๆ เช่น แคลเซียมภายในเซลล์สามารถวัดปริมาณได้ ได้รับแรงบันดาลใจจากโฟลว์ไซโตเมทรี ในปี 2007 Scott D. Tannerได้สร้าง ICP-MS นี้ขึ้นโดยใช้การทดสอบแบบมัลติเพล็กซ์ครั้งแรกโดยใช้โลหะแลนทาไนด์เพื่อติดฉลากบนดีเอ็นเอและเครื่องหมายบนพื้นผิวเซลล์[8]ในปี 2008 Tanner ได้อธิบายการต่อแบบเรียงซ้อนของโฟลว์ไซโตเมทรีกับเครื่องมือ ICP-MS เช่นเดียวกับแท็กแอนติบอดีใหม่ที่ช่วยให้วิเคราะห์เครื่องหมายเซลล์แบบมัลติเพล็กซ์จำนวนมากได้[9]พวกเขาได้สร้างเครื่องมือ CyTOF เครื่องแรกโดยการปรับปรุงความเร็วการตรวจจับและความไวของโฟลว์ไซโตเมทรีที่เชื่อมต่อกับ ICP-MS ให้เหมาะสมยิ่งขึ้น[1]

เดิมทีเครื่องมือ CyTOF นั้นเป็นของบริษัท DVS Sciences ของแคนาดา แต่ปัจจุบันเป็นผลิตภัณฑ์พิเศษเฉพาะของ Fluidigm หลังจากที่บริษัทได้เข้าซื้อกิจการของ DVS Sciences ในปี 2014 ในปี 2022 Fluidigm ได้รับเงินทุนและเปลี่ยนชื่อเป็น Standard BioTools [10]เครื่องมือ CyTOF ได้มีการผลิตออกมาทั้งหมด 4 รุ่น ได้แก่ CyTOF, CyTOF2, Helios™ [5]และ CyTOF XT [11]การปรับปรุงที่เกิดขึ้นตามมาส่วนใหญ่อยู่ที่ระยะการตรวจจับที่เพิ่มขึ้นและพารามิเตอร์ซอฟต์แวร์ โดยเครื่องมือ Helios สามารถตรวจจับโลหะได้ตั้งแต่อิตเทรียม-89 ไปจนถึงบิสมัท-209 และประมวลผลและวิเคราะห์เหตุการณ์ได้ 2,000 เหตุการณ์ต่อนาที

เวิร์กโฟลว์

กลุ่ม ธาตุ แลนทาไนด์ใช้สำหรับติดแท็กแอนติบอดีเนื่องจากพื้นหลังในตัวอย่างทางชีววิทยานั้นต่ำมาก[12]เมื่อเลือกไอโซโทป ที่เหมาะสม สำหรับไบโอมาร์กเกอร์ ไบโอมาร์กเกอร์ที่มีการแสดงออกต่ำควรจับคู่กับไอโซโทปที่มีความเข้มของสัญญาณสูง[13]หากจำเป็นต้องใช้ไอโซโทปที่มีความบริสุทธิ์น้อยกว่า ควรจับคู่กับไบโอมาร์กเกอร์ที่มีการแสดงออกต่ำ เพื่อลดการจับหรือพื้นหลังที่ไม่จำเพาะให้เหลือน้อยที่สุด

พอลิเมอร์ไอโซโทปถูกสร้างขึ้นโดยใช้ สาร คีเลตไดเอทิลีนไตรอะมีนเพนตา อะซิติกแอซิด (DTPA) เพื่อจับไอออนเข้าด้วยกัน[13] พอลิเมอร์จะ สิ้นสุดด้วยไทออลหรือมาเลอิไมด์ที่เชื่อมมันเข้ากับไดซัลไฟด์ ที่ลดลง ในบริเวณ Fc ของแอนติบอดี[14]พอลิเมอร์สี่ถึงห้าตัวจะจับกับแอนติบอดี ส่งผลให้มีอะตอมไอโซโทปประมาณ 100 อะตอมต่อแอนติบอดี[14]แอนติบอดีที่ติดแท็กอาจอยู่ในสารละลาย จับคู่กับลูกปัด หรือเคลื่อนที่บนพื้นผิว การย้อมเซลล์ทำตามขั้นตอนเดียวกันกับการย้อมเรืองแสงสำหรับไซโตเมทรีแบบไหล[14]

เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายแล้ว เซลล์สามารถถูกตรวจสอบด้วยโรเดียม ซึ่งเป็น อินเทอร์คาเลเตอร์ที่สามารถทะลุผ่านเซลล์ที่ตายแล้วเท่านั้น จากนั้นจึงตรึงเซลล์ทั้งหมดและย้อมด้วยอิริเดียมซึ่งทะลุผ่านเซลล์ทั้งหมด เพื่อให้สามารถมองเห็นเซลล์ที่ยังมีชีวิตอยู่ได้[14]

วิธีการนำเซลล์เข้าสู่เครื่องไซโตมิเตอร์มวลคือการฉีดสารแยกละออง[13]จากนั้นเซลล์จะถูกจับในกระแส ก๊าซ อาร์กอนจากนั้นจึงส่งไปยังพลาสมาซึ่งเซลล์จะถูกทำให้ระเหย กลายเป็นละออง และแตกตัวเป็นไอออน เซลล์จะกลายเป็นกลุ่มไอออนที่เคลื่อนเข้าสู่ศูนย์กลางออปติกไอออน จากนั้นจึงใช้เครื่องวิเคราะห์ระยะเวลาการบินเพื่อวัดมวลของไอออน

การวิเคราะห์ข้อมูล

ไอออนจะถูกเร่งความเร็วผ่านเครื่องสเปกโตรมิเตอร์เป็นพัลส์ กลุ่มอิเล็กตรอนที่สร้างจากเซลล์เดียวโดยทั่วไปจะมีพัลส์ 10-150 พัลส์ ผลลัพธ์ของการทำงาน Helios™ คือไฟล์ข้อมูลมวลรวมแบบไบนารี (IMD) ที่มีความเข้มของอิเล็กตรอนที่วัดจากไอออนสำหรับแต่ละช่องมวล พัลส์ต่อเนื่องจะต้องถูกแยกเป็นเหตุการณ์เซลล์แต่ละเซลล์ที่สอดคล้องกับกลุ่มไอออนที่สร้างจากเซลล์หนึ่งเซลล์ แต่ละช่องที่มีพัลส์ระหว่าง 10-150 พัลส์ที่ผ่านเกณฑ์การม้วนรวมที่ผู้ใช้กำหนดไว้ จะถือเป็นเหตุการณ์เซลล์โดยซอฟต์แวร์ Helios™ [1] [5]เกณฑ์การม้วนรวมที่ผู้ใช้กำหนดไว้คือจำนวนไอออนขั้นต่ำที่ต้องบรรลุในทุกช่องไอออนจึงจะถือว่าเป็นเหตุการณ์เซลล์ ค่าสำหรับพารามิเตอร์นี้จะเพิ่มขึ้นตามจำนวนไอออนที่วัดได้ ดังนั้นจึงต้องนับจำนวนเพิ่มเติมเพื่อกำหนดเหตุการณ์เซลล์เมื่อใช้ป้ายกำกับเพิ่มเติม[5]  

สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล ไฟล์ IMD จะถูกแปลงเป็น รูปแบบ มาตรฐานไซโตเมทรีแบบไหล (FCS) ไฟล์นี้มีจำนวนไอออนทั้งหมดสำหรับแต่ละช่องสำหรับทุกเซลล์ที่จัดเรียงในเมทริกซ์และเป็นไฟล์เดียวกันที่สร้างขึ้นระหว่างไซโตเมทรีแบบไหล [ 5]การจำกัดข้อมูลนี้ด้วยตนเองสามารถทำได้เช่นเดียวกับที่ทำกับไซโตเมทรีแบบไหล และเครื่องมือส่วนใหญ่ที่มีให้สำหรับการวิเคราะห์ไซโตเมทรีแบบไหลได้ถูกพอร์ตไปยัง CyTOF แล้ว (ดูไบโออินฟอร์มาติกส์ไซโตเมทรีแบบไหล ) [6]โดยทั่วไปแล้วข้อมูลของ CyTOF จะมีมิติสูง มักใช้อัลกอริทึม การลดมิติเพื่อกำหนดขอบเขตความสัมพันธ์ระหว่างประชากรเซลล์อัลกอริทึมคลัสเตอร์การวิเคราะห์หลายมิติหลายแบบเป็นเรื่องปกติ เครื่องมือยอดนิยมได้แก่tSNE , FlowSOM และ DPT (diffusion pseudo time) [6]วิธีการวิเคราะห์แบบดาวน์สตรีมขึ้นอยู่กับเป้าหมายการวิจัย

แอปพลิเคชั่น

CyTOF ให้ข้อมูลที่สำคัญในระดับเซลล์เดียวเกี่ยวกับการแสดงออกของโปรตีน ภูมิคุ้มกัน และลักษณะเฉพาะของการทำงาน เป็นเครื่องมือที่มีค่าในวิทยาภูมิคุ้มกันซึ่งพารามิเตอร์จำนวนมากช่วยให้เข้าใจการทำงานของระบบที่ซับซ้อนนี้ได้[15] [13]ตัวอย่างเช่นเซลล์นักฆ่าธรรมชาติมีคุณสมบัติหลากหลายที่ได้รับผลกระทบจากเครื่องหมายจำนวนมากในรูปแบบต่างๆ ซึ่งไม่สามารถวิเคราะห์ได้อย่างง่ายดายก่อนเทคโนโลยีนี้[16]การวัดไบโอมาร์กเกอร์หลายตัวพร้อมกันทำให้สามารถระบุชุดย่อยภูมิคุ้มกันที่แตกต่างกันมากกว่า 30 ชุดภายในกลุ่มเซลล์ที่ซับซ้อนกลุ่มหนึ่งได้[15]วิธีนี้ช่วยให้สามารถระบุลักษณะของการทำงานของภูมิคุ้มกัน โรคติดเชื้อ และมะเร็งได้ครบถ้วนยิ่งขึ้น และเข้าใจการตอบสนองของเซลล์ต่อการบำบัด

ข้อดีข้อเสีย

ข้อได้เปรียบหลักของ CYTOF คือความสามารถในการตรวจสอบจำนวนพารามิเตอร์ที่มากขึ้นต่อแผงเมื่อเทียบกับวิธีการไซโตเมทรีแบบอื่น ซึ่งช่วยให้เข้าใจประชากรเซลล์ที่ซับซ้อนและแตกต่างกันได้ดีขึ้น โดยไม่ต้องมีแผงที่ซับซ้อนและทับซ้อนกันจำนวนมาก แผงสามารถมีแอนติบอดีได้มากถึง 45 ตัว ซึ่งแตกต่างจาก 10 ตัวที่สามารถทำได้ในไซโตเมทรีแบบไหลทั่วไป แต่ต้องใช้ความเชี่ยวชาญในการออกแบบอย่างมาก[15]อย่างไรก็ตาม การพัฒนาไซโตเมทรีแบบไหลสเปกตรัมได้ปิดช่องว่างระหว่างไซโตเมทรีแบบไหลและแบบมวลในแง่ของจำนวนแอนติบอดีสูงสุดที่สามารถใช้ได้ แอนติบอดีที่มากขึ้นต่อแผงช่วยประหยัดเวลา ช่วยให้เข้าใจภาพรวมที่กว้างขึ้น และต้องการเซลล์จำนวนน้อยลงต่อการทดลองหนึ่งครั้ง ซึ่งเป็นประโยชน์อย่างยิ่งเมื่อตัวอย่างมีจำนวนจำกัด เช่น การศึกษาเนื้องอก[4]

การใช้ไอโซโทปโลหะหนักยังช่วยลดพื้นหลังเมื่อเปรียบเทียบกับการใช้แอนติบอดีเรืองแสง เซลล์บางประเภท เช่น เซลล์ไมอีลอยด์ มีอัตราการเรืองแสงอัตโนมัติสูง ซึ่งสร้างสัญญาณรบกวนพื้นหลังจำนวนมากในไซโตเมทรีแบบไหล[4]อย่างไรก็ตาม ไอโซโทปโลหะหนักที่หายากที่ใช้ไม่มีอยู่ในระบบชีวภาพ ดังนั้นจึงมองเห็นพื้นหลังได้น้อยมากหรือแทบไม่เห็นเลย และความไวโดยรวมก็เพิ่มขึ้น[4]การทับซ้อนของการตรวจจับระหว่างโลหะหนักที่แตกต่างกันนั้นยังต่ำมากเมื่อเทียบกับการทับซ้อนที่พบในไซโตเมทรีแบบเรืองแสง ซึ่งทำให้การออกแบบแผงของเครื่องหมายจำนวนมากง่ายขึ้นมาก

สีย้อมเรืองแสงสามารถฟอกสีได้ด้วยแสง ซึ่งต้องให้กระบวนการทั้งหมดเกิดขึ้นภายในไม่กี่ชั่วโมงหลังจากการย้อมสี อย่างไรก็ตาม แอนติบอดีที่มีแท็กโลหะสามารถคงอยู่ได้นานถึงสองสัปดาห์โดยไม่สูญเสียสัญญาณ ทำให้การทดลองมีความยืดหยุ่นมากขึ้น ตัวอย่างที่ย้อมสีสามารถแช่แข็งได้ ซึ่งอาจมีประโยชน์โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการทดลองทางคลินิกเมื่อเก็บตัวอย่างเป็นเวลานาน[4]

ต้นทุนของ CyTOF ค่อนข้างสูง เนื่องจากแอนติบอดีที่มีแท็กโลหะและชุดเชื่อมต่อแอนติบอดีมีราคาแพง ข้อเสียที่สำคัญประการหนึ่งของ CyTOF คือ อัตราการไหลของการเก็บตัวอย่างค่อนข้างช้าเมื่อเทียบกับการไหลของไซโตเมทรี ซึ่งเกือบจะถึงระดับหนึ่ง[13] [4]เนื่องจากโลหะหนักมักพบในรีเอเจนต์ในห้องปฏิบัติการ การหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนระหว่างการเตรียมตัวอย่างจึงมีความสำคัญมาก

อ้างอิง

  1. ^ abc Dmitry Bandura ; Vladimir Baranov ; Olga Ornatsky ; Scott D. Tanner ; Antonov A; Kinach R; Lou X; Pavlov S; Vorobiev S; Dick JE (สิงหาคม 2009). "Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry". Analytical Chemistry . 81 (16): 6813–22. doi :10.1021/ac901049w. PMID  19601617.
  2. ^ Wang W, Su B, Pang L, Qiao L, Feng Y, Ouyang Y และคณะ (มิถุนายน 2020) "การสร้างโปรไฟล์ภูมิคุ้มกันมิติสูงด้วยการตรวจด้วยแมสไซโตเมทรีเผยให้เห็นภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องและภูมิคุ้มกันผิดปกติในผู้ป่วย COVID-19" Cellular & Molecular Immunology . 17 (6): 650–652. doi :10.1038/s41423-020-0447-2. PMC 7186533 . PMID  32346099 
  3. ^ Spitzer MH, Nolan GP (พฤษภาคม 2016). "การวัดมวลเซลล์: เซลล์เดี่ยว คุณสมบัติมากมาย" Cell . 165 (4): 780–91. doi :10.1016/j.cell.2016.04.019. PMC 4860251 . PMID  27153492. 
  4. ^ abcdef Gadalla R, Noamani B, MacLeod BL, Dickson RJ, Guo M, Xu W และคณะ (2019). "การตรวจสอบความถูกต้องของ CyTOF เทียบกับการวัดการไหลเวียนของเซลล์สำหรับการศึกษาด้านภูมิคุ้มกันและการติดตามการทดลองทางคลินิกของมะเร็งในมนุษย์" Frontiers in Oncology . 9 : 415. doi : 10.3389/fonc.2019.00415 . PMC 6534060 . PMID  31165047 
  5. ^ abcde Olsen LR, Leipold MD, Pedersen CB, Maecker HT (กุมภาพันธ์ 2019). "กายวิภาคของข้อมูลไซโตเมทรีมวลเซลล์เดี่ยว" Cytometry. ส่วนที่ A . 95 (2): 156–172. doi : 10.1002/cyto.a.23621 . PMID  30277658.
  6. ^ abc Palit S, Heuser C, de Almeida GP, Theis FJ, Zielinski CE (2019). "การรับมือกับความท้าทายของการวิเคราะห์ข้อมูลเซลล์เดี่ยวมิติสูงในวิทยาภูมิคุ้มกัน" Frontiers in Immunology . 10 : 1515. doi : 10.3389/fimmu.2019.01515 . PMC 6634245 . PMID  31354705 
  7. ^ Nomizu T, Kaneco S, Tanaka T, Ito D, Kawaguchi H, Vallee BT (1994-10-01). "การกำหนดปริมาณแคลเซียมในเซลล์ชีวภาพแต่ละเซลล์ด้วยวิธี Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry". Analytical Chemistry . 66 (19): 3000–3004. doi :10.1021/ac00091a004.
  8. ^ Tanner SD, Ornatsky O, Bandura DR, Baranov VI (มีนาคม 2007). "การทดสอบทางชีวภาพแบบมัลติเพล็กซ์ด้วยสเปกโตรเมทรีมวลพลาสมาที่จับคู่แบบเหนี่ยวนำ: สู่เทคโนโลยีเซลล์เดียวแบบหลายตัวแปรอย่างมหาศาล" Spectrochimica Acta ส่วนที่ B: สเปกโตรสโคปีอะตอม . 62 (3): 188–195. Bibcode :2007AcSpe..62..188T. doi :10.1016/j.sab.2007.01.008.
  9. ^ Tanner SD, Bandura DR, Ornatsky O, Baranov VI, Nitz M, Winnik MA (2008-01-01). "Flow cytometer with mass spectrometer detection for massively multiplexed single-cell biomarker assay". Pure and Applied Chemistry . 80 (12): 2627–2641. doi : 10.1351/pac200880122627 . S2CID  53364129.
  10. ^ "Standard BioTools| Press Releases | Fluidigm Capital Infusion". www.globenewswire.com . สืบค้นเมื่อ22 ม.ค. 2022 .
  11. ^ "CyTOF XT เปิดตัวแล้ว" (21 พฤษภาคม 2021) . Fluidigm .
  12. ^ Ornatsky OI, Kinach R, Bandura DR, Lou X, Tanner SD, Baranov VI และคณะ (28 มีนาคม 2551). "การพัฒนาวิธีการวิเคราะห์สำหรับการวิเคราะห์ทางชีววิทยาแบบมัลติเพล็กซ์ด้วยแมสสเปกโตรมิเตอร์พลาสม่าแบบเหนี่ยวนำ" Journal of Analytical Atomic Spectrometry . 23 (4): 463–469. doi :10.1039/B710510J. PMC 2600572 . PMID  19122859 
  13. ^ abcde Chattopadhyay PK, Roederer M (กรกฎาคม 2012). "ไซโตเมทรี: เทคโนโลยีของวันนี้และขอบเขตของวันพรุ่งนี้" Methods . Flow Cytometry and Cell Sorting: the Next Generation. 57 (3): 251–8. doi :10.1016/j.ymeth.2012.02.009. PMC 3374038. PMID  22391486 . 
  14. ^ abcd Tanner SD, Baranov VI, Ornatsky OI, Bandura DR, George TC (พฤษภาคม 2013). "บทนำสู่การตรวจวัดมวลสาร: พื้นฐานและการประยุกต์ใช้" Cancer Immunology, Immunotherapy . 62 (5): 955–65. doi :10.1007/s00262-013-1416-8. PMC 11029414 . PMID  23564178. S2CID  8607382. 
  15. ^ abc Bjornson ZB, Nolan GP, ​​Fantl WJ (สิงหาคม 2013). "การวิเคราะห์มวลเซลล์เดี่ยวเพื่อวิเคราะห์สถานะการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน" Current Opinion in Immunology . Host pathogens / Immune senescence. 25 (4): 484–94. doi :10.1016/j.coi.2013.07.004. PMC 3835664 . PMID  23999316 
  16. ^ Leipold MD, Newell EW, Maecker HT (2015). "การสร้างภาพหลายพารามิเตอร์ของ PBMC ของมนุษย์โดยใช้ไซโตเมทรีมวล" ใน Shaw AC (ed.). Immunosenescence . Methods in Molecular Biology. เล่มที่ 1343. นครนิวยอร์ก: Springer. หน้า 81–95. doi :10.1007/978-1-4939-2963-4_7. ISBN 978-1-4939-2963-4. PMC  4748856 . PMID  26420710.
ดึงข้อมูลจาก "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=CyTOF&oldid=1221327220"