การโคลนโมเลกุล
Set of methods in molecular biology
แผนภาพการโคลนโมเลกุลโดยใช้แบคทีเรียและพลาสมิด

การโคลนโมเลกุลเป็นชุดวิธีการทดลองในชีววิทยาโมเลกุลที่ใช้ในการประกอบ โมเลกุล ดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์และเพื่อควบคุมการจำลองภายในสิ่งมีชีวิตโฮสต์ [ 1]การใช้คำว่าโคลนนิ่งหมายถึงความจริงที่ว่าวิธีการนี้เกี่ยวข้องกับการจำลองโมเลกุลหนึ่งโมเลกุลเพื่อสร้างประชากรเซลล์ที่มีโมเลกุลดีเอ็นเอเหมือนกัน การโคลนโมเลกุลโดยทั่วไปใช้ลำดับดีเอ็นเอจากสิ่งมีชีวิตสองชนิดที่แตกต่างกัน: สายพันธุ์ที่เป็นแหล่งที่มาของดีเอ็นเอที่จะโคลน และสายพันธุ์ที่จะทำหน้าที่เป็นโฮสต์ ที่มีชีวิต สำหรับการจำลองดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์ วิธีการโคลนโมเลกุลเป็นศูนย์กลางของสาขาชีววิทยาและการแพทย์สมัยใหม่หลายสาขา[2]

ในการทดลองโคลนโมเลกุลแบบธรรมดา DNA ที่จะโคลนนั้นจะได้มาจากสิ่งมีชีวิตที่สนใจ จากนั้นจึงนำไปผ่านกระบวนการบำบัดด้วยเอนไซม์ในหลอดทดลองเพื่อสร้างชิ้นส่วน DNA ที่มีขนาดเล็กลง จากนั้นชิ้นส่วนเหล่านี้จะถูกผสมกับเวกเตอร์ DNAเพื่อสร้างโมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์ จากนั้น DNA รีคอมบิแนนท์จะถูกนำเข้าสู่สิ่งมีชีวิตโฮสต์ (โดยทั่วไปคือ แบคทีเรีย E. coli สายพันธุ์ในห้องทดลองที่ไม่เป็นอันตรายและเติบโตง่าย ) ซึ่งจะทำให้เกิดประชากรของสิ่งมีชีวิตที่โมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์ถูกจำลองแบบพร้อมกับ DNA ของโฮสต์ เนื่องจากมีชิ้นส่วน DNA แปลกปลอม จึงเป็น จุลินทรีย์ ที่ถูกดัดแปลงพันธุกรรมหรือดัดแปลงพันธุกรรม ( GMO ) [3]กระบวนการนี้ใช้ประโยชน์จากข้อเท็จจริงที่ว่าเซลล์แบคทีเรียเพียงเซลล์เดียวสามารถถูกชักนำให้จับและจำลองโมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์เพียงโมเลกุลเดียวได้ จากนั้นเซลล์เดียวนี้สามารถขยายตัวแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลเพื่อสร้างแบคทีเรียจำนวนมาก ซึ่งแต่ละเซลล์จะมีสำเนาของโมเลกุลรีคอมบิแนนท์ดั้งเดิม ดังนั้น ทั้งประชากรแบคทีเรียที่เกิดขึ้นและโมเลกุลดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์จึงมักเรียกกันว่า "โคลน" หากพูดอย่างเคร่งครัดดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์หมายถึงโมเลกุลดีเอ็นเอ ในขณะที่โคลนโมเลกุลหมายถึงวิธีการทดลองที่ใช้ในการประกอบโมเลกุลดีเอ็นเอเหล่านี้ ความคิดที่เกิดขึ้นคือลำดับดีเอ็นเอที่แตกต่างกันสามารถแทรกเข้าไปในพลาสมิดได้ และลำดับแปลกปลอมเหล่านี้จะถูกส่งเข้าไปในแบคทีเรียและย่อยเป็นส่วนหนึ่งของพลาสมิด นั่นคือ พลาสมิดเหล่านี้สามารถทำหน้าที่เป็นเวกเตอร์โคลนเพื่อนำยีน[4]

ลำดับดีเอ็นเอแทบทุกลำดับสามารถโคลนและขยายได้ แต่มีปัจจัยบางอย่างที่อาจจำกัดความสำเร็จของกระบวนการ ตัวอย่างลำดับดีเอ็นเอที่โคลนได้ยาก ได้แก่ การทำซ้ำแบบกลับด้าน แหล่งกำเนิดการจำลอง เซนโทรเมียร์ และเทโลเมียร์ นอกจากนี้ โอกาสสำเร็จในการแทรกลำดับดีเอ็นเอขนาดใหญ่ยังมีน้อยกว่า การแทรกที่ใหญ่กว่า 10 กิโลเบสมีความสำเร็จจำกัดมาก แต่แบคทีเรียโฟจ เช่นแบคทีเรียโฟจ λสามารถดัดแปลงเพื่อแทรกลำดับได้สำเร็จถึง 40 กิโลเบส[5]

ประวัติศาสตร์

ก่อนปี 1970 ความเข้าใจเกี่ยวกับพันธุศาสตร์และชีววิทยาโมเลกุลถูกขัดขวางอย่างรุนแรงเนื่องจากไม่สามารถแยกและศึกษาแต่ละยีนจากสิ่งมีชีวิตที่ซับซ้อนได้ ซึ่งสิ่งนี้เปลี่ยนแปลงไปอย่างมากด้วยการถือกำเนิดของวิธีการโคลนโมเลกุล นักจุลชีววิทยาพยายามทำความเข้าใจกลไกของโมเลกุลที่แบคทีเรียใช้จำกัดการเติบโตของแบคทีเรียโฟจ เอนไซม์ตัดจำเพาะเอ็นโดนิวคลี เอสที่แยกออกมา เอนไซม์ที่สามารถตัดแบ่งโมเลกุล DNA ได้เฉพาะเมื่อพบลำดับ DNA เฉพาะเท่านั้น[6]พวกเขาแสดงให้เห็นว่าเอนไซม์ตัดจำเพาะตัดแบ่งโมเลกุล DNA ที่มีความยาวเท่ากับโครโมโซมที่ตำแหน่งเฉพาะ และส่วนเฉพาะของโมเลกุลขนาดใหญ่สามารถชำระได้โดยการแยกส่วนตามขนาด โดยใช้เอนไซม์ตัวที่สองDNA ligaseชิ้นส่วนที่สร้างขึ้นโดยเอนไซม์ตัดจำเพาะสามารถรวมเข้าด้วยกันในรูปแบบใหม่ที่เรียกว่าDNA รีคอมบิแนน ท์ การรวมกลุ่มของ DNA ที่สนใจกับ DNA เวกเตอร์ เช่น แบคทีเรียโฟจหรือพลาสมิด ซึ่งจำลองตัวเองภายในแบคทีเรียตามธรรมชาติ ทำให้สามารถผลิตโมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์ที่บริสุทธิ์จำนวนมากในแบคทีเรียได้ โมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์ตัวแรกถูกสร้างขึ้นและศึกษาวิจัยในปี 1972 [7] [8]

ภาพรวม

การโคลนโมเลกุลใช้ประโยชน์จากข้อเท็จจริงที่ว่าโครงสร้างทางเคมีของดีเอ็นเอนั้นเหมือนกันโดยพื้นฐานในสิ่งมีชีวิตทั้งหมด ดังนั้น หากส่วนใดส่วนหนึ่งของดีเอ็นเอจากสิ่งมีชีวิตใดๆ ถูกแทรกเข้าไปในส่วนดีเอ็นเอที่มีลำดับโมเลกุลที่จำเป็นสำหรับการจำลองดีเอ็นเอและดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์ ที่ได้ จะถูกนำเข้าไปในสิ่งมีชีวิตที่ได้รับลำดับการจำลองดีเอ็นเอมา จากนั้นดีเอ็นเอจากภายนอกจะถูกจำลองพร้อมกับดีเอ็นเอของเซลล์โฮสต์ในสิ่งมีชีวิต ดัดแปลงพันธุกรรม

การโคลนโมเลกุลนั้นคล้ายกับ PCR ตรงที่อนุญาตให้มีการจำลองลำดับดีเอ็นเอ ความแตกต่างพื้นฐานระหว่างสองวิธีนี้คือการโคลนโมเลกุลเกี่ยวข้องกับการจำลองดีเอ็นเอในจุลินทรีย์ที่มีชีวิต ในขณะที่ PCR จำลองดีเอ็นเอในสารละลายในหลอดทดลองที่ปราศจากเซลล์ที่มีชีวิต

ในซิลิโคนการโคลนและการจำลอง

ก่อนที่จะทำการทดลองโคลนนิ่งจริงในห้องปฏิบัติการ การทดลองโคลนนิ่งส่วนใหญ่จะถูกวางแผนในคอมพิวเตอร์โดยใช้ซอฟต์แวร์เฉพาะทาง แม้ว่าการวางแผนโดยละเอียดของการโคลนนิ่งสามารถทำได้ในโปรแกรมแก้ไขข้อความใดๆ ร่วมกับยูทิลิตี้ทางออนไลน์ เช่น การออกแบบไพรเมอร์ PCR แต่ก็มีซอฟต์แวร์เฉพาะสำหรับจุดประสงค์นี้ ซอฟต์แวร์สำหรับจุดประสงค์นี้ ได้แก่ ApE [1] (โอเพ่นซอร์ส), DNAStrider [2] (โอเพ่นซอร์ส), Serial Cloner [3] (ฟรี), Collagene [4] (โอเพ่นซอร์ส) และ SnapGene (เชิงพาณิชย์) โปรแกรมเหล่านี้ช่วยให้จำลองปฏิกิริยา PCR , การย่อยจำกัด , การผูกมัดฯลฯ นั่นคือขั้นตอนทั้งหมดที่อธิบายไว้ด้านล่าง

ขั้นตอน

เป้าหมายโดยรวมของการโคลนโมเลกุลคือการนำยีนที่สนใจจากพลาสมิดหนึ่งไปแทรกเข้าในพลาสมิดอื่น[9]ซึ่งทำได้โดยการทำ PCR ปฏิกิริยาการย่อย ปฏิกิริยาการผูก และการเปลี่ยนแปลง

ในการทดลองโคลนโมเลกุลแบบมาตรฐาน การโคลนชิ้นส่วน DNA ใดๆ ก็ตามโดยพื้นฐานแล้วเกี่ยวข้องกับ 7 ขั้นตอน: (1) การเลือกสิ่งมีชีวิตโฮสต์และเวกเตอร์โคลน (2) การเตรียม DNA เวกเตอร์ (3) การเตรียม DNA ที่จะโคลน (4) การสร้าง DNA รีคอมบิแนนท์ (5) การนำ DNA รีคอมบิแนนท์เข้าไปในสิ่งมีชีวิตโฮสต์ (6) การคัดเลือกสิ่งมีชีวิตที่มี DNA รีคอมบิแนนท์ (7) การคัดกรองโคลนที่มี DNA แทรกตามต้องการและคุณสมบัติทางชีวภาพ

ที่น่าสังเกตคือ ความจุที่เพิ่มขึ้นและความเที่ยงตรงของแพลตฟอร์มการสังเคราะห์ DNA ช่วยให้สามารถออกแบบทางวิศวกรรมโมเลกุลที่ซับซ้อนมากขึ้นได้ โปรเจ็กต์เหล่านี้อาจรวมถึงสายยาวมากของลำดับ DNA ใหม่ๆ และ/หรือทดสอบไลบรารีทั้งหมดพร้อมกัน แทนที่จะเป็นลำดับเดี่ยวๆ การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ทำให้เกิดความซับซ้อนซึ่งจำเป็นต้องให้การออกแบบเปลี่ยนจากการแสดงภาพแบบนิวคลีโอไทด์แบบแบนๆ ไปสู่ระดับการแยกส่วนที่สูงขึ้น ตัวอย่างของเครื่องมือดังกล่าว ได้แก่GenoCAD , Teselagen [5] (ฟรีสำหรับนักวิชาการ) หรือ GeneticConstructor [6] (ฟรีสำหรับนักวิชาการ)

การเลือกสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านและเวกเตอร์โคลน

ไดอะแกรมของพลาสมิดโคลนนิ่งที่ใช้กันทั่วไปpBR322เป็นชิ้นส่วนดีเอ็นเอรูปวงกลมยาว 4361 เบส มี ยีนต้านทานยาปฏิชีวนะ 2 ยีน ที่ทำให้เกิดความต้านทานต่อแอมพิซิลลินและเตตราไซคลินและเป็นแหล่งกำเนิดการจำลองแบบที่โฮสต์ใช้ในการจำลองดีเอ็นเอ

แม้ว่าจะมีการใช้สิ่งมีชีวิตโฮสต์และเวกเตอร์โคลนโมเลกุลเป็นจำนวนมาก แต่การทดลองโคลนโมเลกุลส่วนใหญ่เริ่มต้นด้วยแบคทีเรียสายพันธุ์ในห้องทดลองE. coli ( Escherichia coli ) และเวกเตอร์โคลนพลาสมิดE. coliและเวกเตอร์พลาสมิดเป็นที่นิยมใช้กันทั่วไปเนื่องจากมีความซับซ้อนทางเทคนิค อเนกประสงค์ หาได้ง่าย และช่วยให้สิ่งมีชีวิตที่สร้างใหม่เติบโตได้อย่างรวดเร็วด้วยอุปกรณ์เพียงเล็กน้อย[3]หาก DNA ที่จะโคลนมีขนาดใหญ่เป็นพิเศษ (หลายแสนถึงหลายล้านคู่เบส) ก็ มักจะเลือกใช้เวกเตอร์ โครโมโซมเทียมของแบคทีเรีย[10]หรือเวกเตอร์ โครโมโซมเทียมของยีสต์

การใช้งานเฉพาะทางอาจต้องใช้ระบบโฮสต์-เวกเตอร์เฉพาะทาง ตัวอย่างเช่น หากนักทดลองต้องการเก็บเกี่ยวโปรตีนชนิดหนึ่งจากสิ่งมีชีวิตที่สร้างใหม่ ก็จะ ต้องเลือก เวกเตอร์การแสดงออกที่มีสัญญาณที่เหมาะสมสำหรับการถอดรหัสและการแปลในสิ่งมีชีวิตโฮสต์ที่ต้องการ หรือหากต้องการการจำลองดีเอ็นเอในสปีชีส์ที่แตกต่างกัน (เช่น การถ่ายโอนดีเอ็นเอจากแบคทีเรียไปยังพืช) ก็สามารถเลือกเวกเตอร์ที่มีช่วงโฮสต์หลายช่วง (เรียกอีกอย่างว่าเวกเตอร์แบบกระสวยอวกาศ ) ได้ อย่างไรก็ตาม ในทางปฏิบัติ การทดลองโคลนโมเลกุลเฉพาะทางมักจะเริ่มต้นด้วยการโคลนเข้าไปในพลาสมิดแบคทีเรีย จากนั้นจึงโคลนซ้ำเข้าไปในเวกเตอร์เฉพาะทาง

ไม่ว่าจะใช้การรวมกันของโฮสต์และเวกเตอร์ เวกเตอร์แทบทุกครั้งจะมีสี่ส่วนของ DNA ที่มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการทำงานและยูทิลิตี้ในการทดลอง: [3]

  • ต้นกำเนิดของการจำลองดีเอ็นเอเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับเวกเตอร์ (และลำดับรีคอมบิแนนท์ที่เชื่อมโยงกัน) เพื่อจำลองภายในสิ่งมีชีวิตโฮสต์
  • ไซต์การจดจำเอ็นโดนิวคลีเอสจำกัดเฉพาะหนึ่งไซต์ขึ้นไปเพื่อใช้เป็นไซต์ที่สามารถนำ DNA จากภายนอกเข้ามาได้
  • ยีนมาร์กเกอร์ทางพันธุกรรมที่เลือกได้ซึ่งสามารถใช้เพื่อให้เซลล์ที่ยึดลำดับเวกเตอร์สามารถอยู่รอดได้
  • ยีนแท็กที่สามารถใช้คัดกรองเซลล์ที่มี DNA แปลกปลอม
การตัดลำดับดีเอ็นเอที่มีไซต์จำกัด ยีน BamHI ดีเอ็นเอจะถูกตัดที่ลำดับพาลินโดรมเพื่อสร้าง "ปลายเหนียว"

การเตรียมเวกเตอร์ดีเอ็นเอ

เวกเตอร์โคลนนิ่งได้รับการบำบัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะเอ็นโดนิวคลีเอสเพื่อตัด DNA ที่ตำแหน่งที่จะแทรก DNA แปลกปลอม เอ็นไซม์ตัดจำเพาะถูกเลือกเพื่อสร้างการกำหนดค่าที่ตำแหน่งตัดจำเพาะที่เข้ากันได้กับปลายของ DNA แปลกปลอม (ดูปลาย DNA ) โดยทั่วไป ทำได้โดยการตัด DNA เวกเตอร์และ DNA แปลกปลอมด้วยเอ็นไซม์ตัดจำเพาะหรือเอ็นโดนิวคลีเอสตัดจำเพาะตัวเดียวกัน เช่นEcoRIและเอ็นไซม์ตัดจำเพาะนี้ถูกแยกจาก E.coli [11]เวกเตอร์สมัยใหม่ส่วนใหญ่มีตำแหน่งตัดจำเพาะที่สะดวกหลากหลายซึ่งไม่ซ้ำกันภายในโมเลกุลของเวกเตอร์ (จึงสามารถตัดเวกเตอร์ได้เฉพาะที่ตำแหน่งเดียวเท่านั้น) และตั้งอยู่ในยีน (บ่อยครั้งคือเบตากาแลกโตซิเดส ) ซึ่งการทำให้ไม่ทำงานสามารถใช้เพื่อแยกแยะสิ่งมีชีวิตแบบรีคอมบิแนนท์จากสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่รีคอมบิแนนท์ในขั้นตอนต่อมาของกระบวนการ เพื่อปรับปรุงอัตราส่วนของสิ่งมีชีวิตที่แยกตัวออกจากกันกับสิ่งมีชีวิตที่ไม่ได้แยกตัวออกจากกัน เวกเตอร์ที่ถูกตัดอาจได้รับการบำบัดด้วยเอนไซม์ ( ฟอสฟาเตสด่าง ) ที่จะดีฟอสโฟรีเลตปลายเวกเตอร์ โมเลกุลเวกเตอร์ที่มีปลายดีฟอสโฟรีเลตจะไม่สามารถจำลองแบบได้ และการจำลองแบบสามารถฟื้นฟูได้ก็ต่อเมื่อมีการรวมดีเอ็นเอจากภายนอกเข้าไปในบริเวณที่แยกตัว[12]

การเตรียมดีเอ็นเอที่จะโคลน

DNA สำหรับการโคลนส่วนใหญ่ผลิตขึ้นโดยใช้PCR DNA แม่แบบจะถูกผสมกับเบส (ส่วนประกอบของ DNA) ไพรเมอร์ (ชิ้นส่วนสั้นๆ ของ DNA สายเดี่ยวที่เสริมกัน) และ เอนไซม์ โพลีเมอเรสของ DNAที่สร้างห่วงโซ่ DNA ส่วนผสมจะผ่านรอบการให้ความร้อนและการทำให้เย็นเพื่อผลิต DNA ที่ถูกคัดลอกจำนวนมาก

สำหรับการโคลน DNA จีโนม DNA ที่จะโคลนจะต้องสกัดมาจากสิ่งมีชีวิตที่ต้องการ โดยสามารถใช้เนื้อเยื่อจากแหล่งใดก็ได้ (แม้แต่เนื้อเยื่อจากสัตว์ที่สูญพันธุ์ ) [13]ตราบใดที่ DNA ไม่ถูกย่อยสลายมากเกินไป จากนั้น DNA จะถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้วิธีง่ายๆ เพื่อกำจัดโปรตีนที่ปนเปื้อน (การสกัดด้วยฟีนอล) RNA (ไรโบนิวคลีเอส) และโมเลกุลขนาดเล็กกว่า (การตกตะกอนและ/หรือโครมาโทกราฟี) วิธี การปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) มักใช้สำหรับการขยายลำดับ DNA หรือ RNA เฉพาะ ( RT-PCR ) ก่อนการโคลนโมเลกุล

DNA สำหรับการทดลองโคลนนิ่งอาจได้รับจาก RNA โดยใช้ reverse transcriptase ( การโคลนนิ่ง ดีเอ็นเอเสริมหรือการโคลนนิ่ง cDNA) หรือในรูปแบบของ DNA สังเคราะห์ ( การสังเคราะห์ยีนเทียม ) การโคลนนิ่ง cDNA มักใช้ในการโคลนนิ่งที่เป็นตัวแทนของประชากร mRNA ของเซลล์ที่สนใจ ในขณะที่ DNA สังเคราะห์ใช้ในการรับลำดับที่แม่นยำใดๆ ที่กำหนดโดยผู้ออกแบบ ลำดับที่ออกแบบดังกล่าวอาจจำเป็นเมื่อย้ายยีนข้ามรหัสพันธุกรรม (ตัวอย่างเช่น จากไมโตคอนเดรียไปยังนิวเคลียส) [14]หรือเพียงเพื่อเพิ่มการแสดงออกผ่านการเพิ่มประสิทธิภาพของโคดอน [ 15]

จากนั้น DNA ที่บริสุทธิ์จะถูกบำบัดด้วยเอนไซม์จำกัดเพื่อสร้างชิ้นส่วนที่มีปลายที่สามารถเชื่อมต่อกับปลายของเวกเตอร์ได้ หากจำเป็น อาจเพิ่มส่วน DNA สองสายสั้น ( ตัวเชื่อม ) ที่มีไซต์จำกัดตามต้องการเพื่อสร้างโครงสร้างปลายที่เข้ากันได้กับเวกเตอร์[3] [12]

การสร้างดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์ด้วยดีเอ็นเอไลเกส

การสร้างดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์เป็นขั้นตอนที่ง่ายที่สุดของกระบวนการโคลนโมเลกุลในหลายๆ ด้าน ดีเอ็นเอที่เตรียมจากเวกเตอร์และแหล่งภายนอกจะถูกผสมเข้าด้วยกันในความเข้มข้นที่เหมาะสม และสัมผัสกับเอนไซม์ ( ดีเอ็นเอไลเกส ) ที่เชื่อมปลายทั้งสองเข้าด้วยกันอย่างโคเวเลนต์ ปฏิกิริยาการเชื่อมนี้มักเรียกว่าการผูกมัดจากนั้นส่วนผสมของดีเอ็นเอที่ได้จะมีปลายทั้งสองที่เชื่อมกันแบบสุ่มก็พร้อมสำหรับการนำเข้าสู่สิ่งมีชีวิตโฮสต์

DNA ligase จะจดจำและทำงานเฉพาะที่ปลายของโมเลกุล DNA เชิงเส้นเท่านั้น โดยปกติแล้วจะส่งผลให้เกิดส่วนผสมที่ซับซ้อนของโมเลกุล DNA ที่มีปลายที่เชื่อมกันแบบสุ่ม ผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ (DNA เวกเตอร์ที่เชื่อมกับ DNA ต่างชนิดกันอย่างโควาเลนต์) จะปรากฏอยู่ แต่ลำดับอื่นๆ (เช่น DNA ต่างชนิดที่เชื่อมกับตัวมันเอง DNA เวกเตอร์ที่เชื่อมกับตัวมันเอง และชุดค่าผสมที่สูงกว่าของ DNA เวกเตอร์และ DNA ต่างชนิด) มักจะปรากฏอยู่ด้วย ส่วนผสมที่ซับซ้อนนี้จะถูกคัดแยกในขั้นตอนต่อไปของกระบวนการโคลนนิ่ง หลังจากที่ส่วนผสมของ DNA ถูกใส่เข้าไปในเซลล์[3] [12]

การนำดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์เข้าสู่สิ่งมีชีวิตโฮสต์

ส่วนผสมของดีเอ็นเอที่ผ่านการปรับแต่งในหลอดทดลองก่อนหน้านี้ จะถูกย้ายกลับเข้าไปในเซลล์ที่มีชีวิต ซึ่งเรียกว่าสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน วิธีการที่ใช้ในการนำดีเอ็นเอเข้าไปในเซลล์นั้นมีความหลากหลาย และชื่อที่ใช้กับขั้นตอนนี้ในกระบวนการโคลนโมเลกุลนั้นมักจะขึ้นอยู่กับวิธีการทดลองที่เลือก (เช่นการแปลงสภาพการถ่ายโอนยีนการถ่ายโอนยีนการนำไฟฟ้า ) [3] [12]

เมื่อจุลินทรีย์สามารถดูดซับและจำลองดีเอ็นเอจากสภาพแวดล้อมในท้องถิ่นได้ กระบวนการนี้เรียกว่าการเปลี่ยนแปลงและเซลล์ที่อยู่ในสถานะทางสรีรวิทยาที่สามารถดูดซับดีเอ็นเอได้จะถือว่า มี ความสามารถ[16]ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม กระบวนการที่คล้ายกันในการนำดีเอ็นเอเข้าไปในเซลล์มักเรียกว่าการถ่ายโอนยีน ทั้งการเปลี่ยนแปลงและการถ่ายโอนยีนมักต้องเตรียมเซลล์ผ่านระบบการเจริญเติบโตพิเศษและกระบวนการบำบัดทางเคมีซึ่งจะแตกต่างกันไปตามสายพันธุ์และประเภทของเซลล์ที่ใช้

การใช้ไฟฟ้ากระตุ้นจะใช้พัลส์ไฟฟ้าแรงสูงในการเคลื่อนย้ายดีเอ็นเอผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ (และผนังเซลล์ หากมี) [17]ในทางกลับกันการถ่ายโอนดีเอ็นเอเกี่ยวข้องกับการบรรจุดีเอ็นเอลงในอนุภาคที่ได้มาจากไวรัส และใช้อนุภาคที่คล้ายไวรัสเหล่านี้เพื่อนำดีเอ็นเอที่ห่อหุ้มไว้ในเซลล์ผ่านกระบวนการที่คล้ายกับการติดเชื้อไวรัส แม้ว่าการใช้ไฟฟ้ากระตุ้นและการถ่ายโอนดีเอ็นเอจะเป็นวิธีการเฉพาะทางอย่างมาก แต่ก็อาจเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพที่สุดในการเคลื่อนย้ายดีเอ็นเอเข้าไปในเซลล์

การคัดเลือกสิ่งมีชีวิตที่มีลำดับเวกเตอร์

ไม่ว่าจะใช้วิธีใดก็ตาม การนำดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์เข้าไปในสิ่งมีชีวิตโฮสต์ที่เลือกมักจะเป็นกระบวนการที่มีประสิทธิภาพต่ำ นั่นคือ เซลล์เพียงส่วนเล็กน้อยเท่านั้นที่จะดูดซับดีเอ็นเอเข้าไป นักวิทยาศาสตร์ทดลองจัดการกับปัญหานี้ผ่านขั้นตอนการคัดเลือกทางพันธุกรรมเทียม ซึ่งเซลล์ที่ไม่ได้ดูดซับดีเอ็นเอจะถูกฆ่าอย่างเลือกสรร และเฉพาะเซลล์ที่สามารถจำลองดีเอ็นเอที่มียีนมาร์กเกอร์ที่เลือกได้ซึ่งเข้ารหัสโดยเวกเตอร์เท่านั้นที่จะอยู่รอดได้[3] [12]

เมื่อเซลล์แบคทีเรียถูกใช้เป็นสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้านเครื่องหมายที่เลือกได้มักจะเป็นยีนที่ต้านทานยาปฏิชีวนะซึ่งมิฉะนั้นจะฆ่าเซลล์ โดยทั่วไปคือแอมพิซิลลินเซลล์ที่มีพลาสมิดจะอยู่รอดเมื่อสัมผัสกับยาปฏิชีวนะ ในขณะที่เซลล์ที่ไม่สามารถจับลำดับพลาสมิดได้จะตาย เมื่อใช้เซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (เช่น เซลล์ของมนุษย์หรือหนู) จะใช้กลยุทธ์ที่คล้ายคลึงกัน ยกเว้นยีนเครื่องหมาย (ในกรณีนี้โดยทั่วไปเข้ารหัสเป็นส่วนหนึ่งของ คาสเซ็ต kanMX ) จะให้ความต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ Geneticin

การคัดกรองโคลนที่มี DNA แทรกตามต้องการและคุณสมบัติทางชีวภาพ

เวกเตอร์โคลนแบคทีเรียสมัยใหม่ (เช่นpUC19และอนุพันธ์รุ่นหลัง รวมทั้งเวกเตอร์ pGEM) ใช้ระบบคัดกรองสีน้ำเงิน-ขาวเพื่อแยกแยะโคโลนี (โคลน) ของเซลล์ทรานสเจนิกจากโคโลนีที่มีเวกเตอร์ต้นกำเนิด (เช่น ดีเอ็นเอเวกเตอร์ที่ไม่มีลำดับรีคอมบิแนนท์แทรกอยู่) ในเวกเตอร์เหล่านี้ ดีเอ็นเอจากภายนอกจะถูกแทรกเข้าไปในลำดับที่เข้ารหัสส่วนสำคัญของเบตากาแลกโตซิเดส ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่มีกิจกรรมที่ส่งผลให้เกิดการสร้างโคโลนีสีน้ำเงินบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในงานนี้ การแทรกดีเอ็นเอจากภายนอกเข้าไปในลำดับการเข้ารหัสเบตากาแลกโตซิเดสจะทำให้เอนไซม์ทำงานไม่ได้ ดังนั้นโคโลนีที่มีดีเอ็นเอที่เปลี่ยนรูปจะยังคงไม่มีสี (สีขาว) ดังนั้น นักทดลองจึงสามารถระบุและดำเนินการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับโคลนแบคทีเรียทรานสเจนิกได้อย่างง่ายดาย ในขณะที่ละเลยโคลนที่ไม่มีดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์

ประชากรทั้งหมดของโคลนแต่ละตัวที่ได้จากการทดลองโคลนโมเลกุลมักเรียกว่าคลังดีเอ็นเอคลังดีเอ็นเออาจมีความซับซ้อนสูง (เช่น เมื่อโคลนดีเอ็นเอจีโนมที่สมบูรณ์จากสิ่งมีชีวิต) หรือค่อนข้างเรียบง่าย (เช่น เมื่อย้ายชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่โคลนไว้ก่อนหน้านี้ไปยังพลาสมิดอื่น) แต่เกือบจะต้องตรวจสอบโคลนต่างๆ หลายตัวเสมอเพื่อให้แน่ใจว่าได้โครงสร้างดีเอ็นเอที่ต้องการ ซึ่งอาจทำได้โดยใช้วิธีการทดลองที่หลากหลายมาก รวมถึงการใช้ไฮบริดิเซชันกรดนิวคลีอิก โพรบแอนติบอดีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสการวิเคราะห์ชิ้นส่วนจำกัดและ/หรือการจัดลำดับดีเอ็นเอ [ 3] [12]

แอปพลิเคชั่น

การโคลนโมเลกุลช่วยให้นักวิทยาศาสตร์มี DNA แต่ละส่วนที่ได้จากจีโนมในปริมาณที่ไม่จำกัด วัสดุนี้สามารถนำไปใช้ประโยชน์ได้หลากหลาย ทั้งในด้านวิทยาศาสตร์ชีวภาพพื้นฐานและประยุกต์ การประยุกต์ใช้ที่สำคัญบางส่วนสรุปไว้ที่นี่

โครงสร้างจีโนมและการแสดงออกของยีน

การโคลนระดับโมเลกุลนำไปสู่การไขความกระจ่างของลำดับดีเอ็นเอทั้งหมดของจีโนมของสิ่งมีชีวิตสายพันธุ์ต่างๆ จำนวนมาก และการสำรวจความหลากหลายทางพันธุกรรมภายในสิ่งมีชีวิตสายพันธุ์ต่างๆ ซึ่งงานนี้ได้ดำเนินการส่วนใหญ่ด้วยการกำหนดลำดับดีเอ็นเอของชิ้นส่วนจีโนมที่โคลนมาแบบสุ่มจำนวนมาก และการประกอบลำดับที่ทับซ้อนกัน

ในระดับยีนแต่ละตัว โคลนโมเลกุลจะถูกใช้เพื่อสร้างโพรบที่ใช้สำหรับตรวจสอบวิธีการแสดงออก ของยีน และการแสดงออกนั้นเกี่ยวข้องกับกระบวนการอื่นๆ ในทางชีววิทยาอย่างไร รวมถึงสภาพแวดล้อมของกระบวนการเผาผลาญ สัญญาณนอกเซลล์ การพัฒนา การเรียนรู้ การแก่ก่อนวัย และการตายของเซลล์ ยีนโคลนยังสามารถให้เครื่องมือในการตรวจสอบการทำงานทางชีววิทยาและความสำคัญของยีนแต่ละตัวได้ โดยให้ผู้วิจัยทำให้ ยีน ไม่ทำงานหรือทำการกลายพันธุ์ที่ละเอียดอ่อนมากขึ้นโดยใช้การกลายพันธุ์ตามภูมิภาคหรือการกลายพันธุ์ตามตำแหน่งยีนที่โคลนลงในเวกเตอร์การแสดงออกสำหรับการโคลนเชิงหน้าที่ให้วิธีการคัดกรองยีนตามหน้าที่ของโปรตีนที่แสดงออก

การผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์

การได้รับโคลนโมเลกุลของยีนสามารถนำไปสู่การพัฒนาของสิ่งมีชีวิตที่ผลิตผลิตภัณฑ์โปรตีนจากยีนที่โคลน ซึ่งเรียกว่าโปรตีนรีคอมบิแนนท์ ในทางปฏิบัติ มักจะยากกว่าในการพัฒนาสิ่งมีชีวิตที่ผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ในรูปแบบที่ใช้งานในปริมาณที่ต้องการมากกว่าการโคลนยีน นั่นเป็นเพราะสัญญาณโมเลกุลสำหรับการแสดงออกของยีนมีความซับซ้อนและแปรผัน และเพราะการพับ ความเสถียร และการขนส่งของโปรตีนอาจเป็นเรื่องท้าทายมาก

ปัจจุบันมีโปรตีนที่มีประโยชน์มากมายในรูปแบบผลิตภัณฑ์รีคอมบิแนนท์ได้แก่ (1) โปรตีนที่มีประโยชน์ทางการแพทย์ซึ่งการจัดการสามารถแก้ไขยีนที่บกพร่องหรือแสดงออกไม่ดีได้ (เช่นแฟกเตอร์รีคอมบิแนนท์ VIIIซึ่งเป็นแฟกเตอร์การแข็งตัวของเลือดที่ขาดหายไปในโรคฮีโมฟิเลียบาง ประเภท [18]และอินซูลิน รีคอมบิแนนท์ ซึ่งใช้ในการรักษาโรคเบาหวาน บางประเภท [19] ) (2) โปรตีนที่สามารถจัดการเพื่อช่วยเหลือในภาวะฉุกเฉินที่คุกคามชีวิตได้ (เช่นตัวกระตุ้นพลาสมินเจนของเนื้อเยื่อซึ่งใช้รักษาโรคหลอดเลือดสมอง[20] ) (3) วัคซีนซับยูนิตรีคอมบิแนนท์ ซึ่งสามารถใช้โปรตีนบริสุทธิ์เพื่อสร้างภูมิคุ้มกันให้กับผู้ป่วยจากโรคติดเชื้อโดยไม่ต้องสัมผัสกับตัวการที่ติดเชื้อโดยตรง (เช่นวัคซีนไวรัสตับอักเสบบี[21] ) และ (4) โปรตีนรีคอมบิแนนท์เป็นวัสดุมาตรฐานสำหรับการทดสอบในห้องปฏิบัติการเพื่อวินิจฉัย

สิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม

เมื่อกำหนดลักษณะและจัดการเพื่อให้สัญญาณสำหรับการแสดงออกที่เหมาะสมแล้ว ยีนโคลนอาจถูกแทรกเข้าไปในสิ่งมีชีวิต ทำให้เกิดสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม ซึ่งเรียกอีกอย่างว่าสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (GMO) แม้ว่า GMO ส่วนใหญ่จะเกิดขึ้นเพื่อวัตถุประสงค์ในการวิจัยทางชีววิทยาขั้นพื้นฐาน (ดูตัวอย่างเช่นหนูดัดแปลงพันธุกรรม ) GMO จำนวนหนึ่งได้รับการพัฒนาเพื่อใช้ในเชิงพาณิชย์ ตั้งแต่สัตว์และพืชที่ผลิตยาหรือสารประกอบอื่นๆ ( Pharming ) พืชผลที่ต้านทานสารกำจัดวัชพืชและปลาเขตร้อนเรืองแสง ( GloFish ) สำหรับความบันเทิงในบ้าน[1]

ยีนบำบัด

ยีนบำบัดเกี่ยวข้องกับการส่งยีนที่มีฟังก์ชันไปยังเซลล์ที่ขาดฟังก์ชันดังกล่าว โดยมีจุดมุ่งหมายเพื่อแก้ไขความผิดปกติทางพันธุกรรมหรือโรคที่เกิดขึ้น ยีนบำบัดสามารถแบ่งออกได้อย่างกว้างๆ เป็นสองประเภท ประเภทแรกคือการเปลี่ยนแปลงเซลล์สืบพันธุ์ นั่นคือ อสุจิหรือไข่ ซึ่งส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมอย่างถาวรสำหรับสิ่งมีชีวิตทั้งหมดและรุ่นต่อๆ มา หลายคนมองว่า "ยีนบำบัดเซลล์สืบพันธุ์" นี้ขัดต่อจริยธรรมของมนุษย์[22]ยีนบำบัดประเภทที่สองคือ "ยีนบำบัดเซลล์ร่างกาย" ซึ่งคล้ายคลึงกับการปลูกถ่ายอวัยวะ ในกรณีนี้ เนื้อเยื่อเฉพาะหนึ่งส่วนขึ้นไปจะถูกกำหนดเป้าหมายโดยการรักษาโดยตรงหรือโดยการนำเนื้อเยื่อออก การเพิ่มยีนบำบัดหรือยีนในห้องปฏิบัติการ และการนำเซลล์ที่ได้รับการรักษาคืนให้กับผู้ป่วย การทดลองทางคลินิกของยีนบำบัดเซลล์ร่างกายเริ่มขึ้นในช่วงปลายทศวรรษ 1990 ส่วนใหญ่ใช้เพื่อการรักษามะเร็งและความผิดปกติของเลือด ตับ และปอด[23]

แม้ว่าจะมีการประชาสัมพันธ์และคำมั่นสัญญาเป็นจำนวนมาก แต่ประวัติของการบำบัดด้วยยีนในมนุษย์นั้นประสบความสำเร็จได้ค่อนข้างจำกัด[23]ผลของการนำยีนเข้าไปในเซลล์มักจะส่งเสริมการบรรเทาอาการของโรคที่กำลังรักษาเพียงบางส่วนและ/หรือชั่วคราวเท่านั้น ผู้ป่วยบางรายที่ทดลองบำบัดด้วยยีนประสบกับผลข้างเคียงจากการรักษา รวมถึงเสียชีวิต ในบางกรณี ผลข้างเคียงเกิดจากการทำลายยีนที่จำเป็นภายในจีโนมของผู้ป่วยโดยการทำให้ไม่ทำงานโดยการแทรกเข้าไป ในบางกรณี เวกเตอร์ไวรัสที่ใช้ในการบำบัดด้วยยีนปนเปื้อนด้วยไวรัสที่ติดเชื้อ อย่างไรก็ตาม การบำบัดด้วยยีนยังคงถือเป็นสาขาการแพทย์ที่มีอนาคตที่สดใส และเป็นสาขาที่มีกิจกรรมการวิจัยและพัฒนาในระดับที่สำคัญ

อ้างอิง

  1. ^ ab Watson JD (2007). Recombinant DNA: genes and genomes: a short course . ซานฟรานซิสโก: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-2866-5-
  2. ^ Patten CL, Glick BR, Pasternak J (2009). เทคโนโลยีชีวภาพระดับโมเลกุล: หลักการและการประยุกต์ใช้ดีเอ็นเอแบบรีคอมบิแนนท์ . วอชิงตัน ดี.ซี.: สำนักพิมพ์ ASM ISBN 978-1-55581-498-4-
  3. ^ abcdefgh Brown T (2006). การโคลนยีนและการวิเคราะห์ DNA: บทนำ . Cambridge, MA: Blackwell Pub. ISBN 978-1-4051-1121-8-
  4. ^ Garrett RH, Grisham CM (2013). Biochemistry (ฉบับที่ 5). Brooks/Cole, Cengage Learning. ISBN 978-1-133-10629-6.OCLC 777722371  .
  5. ^ Garrett RH, Grisham CM (2010). Biochemistry (ฉบับที่สี่). Belmont, CA, Brooks/Cole: Cengage Learning. หน้า 380. ISBN 978-0-495-10935-8.OCLC 297392560  .
  6. ^ Nathans D, Smith HO (1975). "Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of dna molecular". Annual Review of Biochemistry . 44 : 273–93. doi :10.1146/annurev.bi.44.070175.001421. PMID  166604.
  7. ^ Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB (พ.ย. 1973). "การสร้างพลาสมิดแบคทีเรียที่มีฟังก์ชันทางชีวภาพในหลอดทดลอง" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 70 (11): 3240–4. Bibcode :1973PNAS...70.3240C. doi : 10.1073/pnas.70.11.3240 . PMC 427208 . PMID  4594039 
  8. ^ Jackson DA, Symons RH, Berg P (ตุลาคม 1972). "วิธีการทางชีวเคมีสำหรับการแทรกข้อมูลทางพันธุกรรมใหม่ลงใน DNA ของ Simian Virus 40: โมเลกุล DNA SV40 แบบวงกลมที่มียีนฟาจแลมบ์ดาและโอเปรอนกาแลกโตสของ Escherichia coli" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 69 (10): 2904–9. Bibcode :1972PNAS...69.2904J. doi : 10.1073/pnas.69.10.2904 . PMC 389671 . PMID  4342968. 
  9. ^ "plasmid / plasmids | เรียนรู้วิทยาศาสตร์ที่ Scitable". www.nature.com . สืบค้นเมื่อ2017-12-06 .
  10. ^ Shizuya H, Birren B, Kim UJ, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M (ก.ย. 1992). "การโคลนและการบำรุงรักษาที่เสถียรของชิ้นส่วนดีเอ็นเอของมนุษย์ที่มีขนาด 300 กิโลเบสคู่ใน Escherichia coli โดยใช้เวกเตอร์ที่ใช้แฟกเตอร์ F" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 89 (18): 8794–7. Bibcode :1992PNAS...89.8794S. doi : 10.1073/pnas.89.18.8794 . PMC 50007 . PMID  1528894 
  11. ^ Pingoud A, Jeltsch A (กันยายน 2001). "โครงสร้างและหน้าที่ของเอนไซม์ตัดจำเพาะชนิด II" Nucleic Acids Research . 29 (18): 3705–3727. doi :10.1093/nar/29.18.3705. PMC 55916 . PMID  11557805. 
  12. ^ abcdef Russell DW, Sambrook J (2001). การโคลนโมเลกุล: คู่มือห้องปฏิบัติการ Cold Spring Harbor, NY: ห้องปฏิบัติการ Cold Spring Harbor ISBN 978-0-87969-576-7-
  13. ^ Higuchi R, Bowman B, Freiberger M, Ryder OA, Wilson AC (1984). "ลำดับดีเอ็นเอจากควากก้า ซึ่งเป็นสมาชิกที่สูญพันธุ์ของตระกูลม้า" Nature . 312 (5991): 282–284. Bibcode :1984Natur.312..282H. doi :10.1038/312282a0. PMID  6504142. S2CID  4313241.
  14. ^ Boominathan A, Vanhoozer S, Basisty N, Powers K, Crampton AL, Wang X และคณะ (พฤศจิกายน 2016). "Stable nuclear expression of ATP8 and ATP6 genes rescues a mtDNA Complex V null mutant". Nucleic Acids Research . 44 (19): 9342–9357. doi :10.1093/nar/gkw756. PMC 5100594 . PMID  27596602. 
  15. ^ Plotkin JB, Kudla G (มกราคม 2011). "Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias". Nature Reviews. Genetics . 12 (1): 32–42. doi :10.1038/nrg2899. PMC 3074964 . PMID  21102527. 
  16. ^ Lederberg J (กุมภาพันธ์ 1994). "การเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมโดย DNA: การเฉลิมฉลองครบรอบของ Avery, MacLeod และ McCarty (1944)" Genetics . 136 (2): 423–6. doi :10.1093/genetics/136.2.423. PMC 1205797 . PMID  8150273. 
  17. ^ Wirth R, Friesenegger A, Fiedler S (มีนาคม 1989). "การเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรียแกรมลบชนิดต่างๆ ที่อยู่ในสกุลต่างๆ 11 สกุลโดยการใช้ไฟฟ้า" Molecular & General Genetics . 216 (1): 175–7. doi :10.1007/BF00332248. PMID  2659971. S2CID  25214157.
  18. ^ Oldenburg J, Dolan G, Lemm G (ม.ค. 2009). "การดูแลโรคฮีโมฟิเลียในตอนนั้น ตอนนี้ และในอนาคต" Haemophilia . 15 (ฉบับเพิ่มเติม 1): 2–7. doi : 10.1111/j.1365-2516.2008.01946.x ​​. PMID  19125934. S2CID  29118026.
  19. ^ The MJ (พ.ย. 1989). "อินซูลินของมนุษย์: ยาตัวแรกของเทคโนโลยี DNA". American Journal of Hospital Pharmacy . 46 (11 Suppl 2): ​​S9-11. PMID  2690608.
  20. ^ Lewandowski C, Barsan W (กุมภาพันธ์ 2001). "การรักษาโรคหลอดเลือดสมองตีบเฉียบพลัน". Annals of Emergency Medicine . 37 (2): 202–16. doi :10.1067/mem.2001.111573. PMID  11174240.
  21. ^ Chang MH , Chen CJ , Lai MS, Hsu HM, Wu TC, Kong MS, Liang DC, Shau WY, Chen DS (มิ.ย. 1997). "การฉีดวัคซีนป้องกันตับอักเสบบีแบบสากลในไต้หวันและอุบัติการณ์ของมะเร็งตับในเด็ก Taiwan Childhood Hepatoma Study Group". The New England Journal of Medicine . 336 (26): 1855–9. doi : 10.1056/NEJM199706263362602 . PMID  9197213.
  22. ^ August JT (1997). Gene Therapy. เล่ม 40. Academic Press. หน้า 508. ISBN 978-0-08-058132-3-
  23. ^ โดย Pfeifer A, Verma IM (2001). "ยีนบำบัด: ความหวังและปัญหา". Annual Review of Genomics and Human Genetics . 2 : 177–211. doi :10.1146/annurev.genom.2.1.177. PMID  11701648.

อ่านเพิ่มเติม

  • Matsumura I (กันยายน 2015) "ทำไม Johnny จึงโคลนไม่ได้: ข้อผิดพลาดทั่วไปและวิธีแก้ปัญหาที่ไม่ค่อยธรรมดา" BioTechniques . 59 (3): IV–XIII. doi : 10.2144/000114324 . PMID  26345511 เก็บถาวรจากแหล่งเดิมเมื่อ 2015-09-16 . สืบค้นเมื่อ 2 กุมภาพันธ์ 2016 .
ทรัพยากรห้องสมุดเกี่ยวกับ
การโคลนโมเลกุล
  • ทรัพยากรในห้องสมุดของคุณ
  • แหล่งข้อมูลในห้องสมุดอื่น ๆ
  • สื่อที่เกี่ยวข้องกับ การโคลนโมเลกุล ที่ Wikimedia Commons
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Molecular_cloning&oldid=1241351149"