ISOLASI DAN

KARAKTERISASI ENZIM
PROTEASE DARI
TUMBUHAN
Praktikum Biokimia
Tahun Akademik 2014/2015

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Disusun oleh:
Kelompok IV
Rahma Joni
(1210412031)
Prayoga Wibhawa Nu Tursedhi (1210412032)
Amalya Ova
(1210412043)

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

I. PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Makhluk hidup termasuk tumbuhan membutuhkan reaksi
biokimia seluler yang melibatkan enzim untuk menjaga
kelangsungan hidupnya. Salah satu enzim yang terlibat adalah
protease. Pada tanaman protease tidak hanya diperlukan
untuk degradasi protein, tetapi juga untuk pertahanan tubuh,
perkembangan dan pematangan buah, aktivasi proenzim,
penguraian simpanan protein dalam biji yang sedang
berkecambah dan lain sebagainya.
Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Beberapa enzim dari tumbuhan, mikroba dan binatang seperti lipase,

karbohidrase dan protease sudah diisolasi, dimurnikan dan diaplikasikan
pada berbagai industri. Menurut Aehle (2007) enzim banyak
diaplikasikan untuk keperluan medis, industri pangan, industri
kosmetik, industri farmasi dan lain sebagainya.
Dalam industri pangan khususnya, enzim lipase, karbohidrase dan
protease merupakan enzim yang banyak digunakan. Pemanfaatan
protease
dalam
industri
pangan
diantaranya adalah
untuk
mengurangi kekeruhan dalam industri bir, mengurangi gluten pada
industri roti, dan untuk menggumpalkan susu pada industri keju.

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

1.2 TUJUAN
1. Mengetahui sumber dari enzim
2. Mampu mengisolasi enzim dari sumbernya
3. Dapat mengklasifikasikan enzim dari substrat yang
digunakan
4. Melakukan pemurnian sederhana enzim

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim
Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis
dalam sel hidup. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa
adalah:
(1) dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi
(2) bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif
rendah
(3) bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu.

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Enzim telah banyak digunakan dalam bidang industri

pangan, farmasi dan industri kimia lainnya. Dalam bidang
pangan misalnya amilase, invertase, glukosa-isomerase,
papain, dan bromelin, sedangkan dalam bidang kesehatan
contohnya amilase, lipase, dan protease. Enzim dapat
diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme (Boyer,
1971). Enzim juga masih mempunyai kemampuan
transformasi kimia meskipun telah terpisah dari sel
(Bakhtiar, A. 1991).

Perkembangan
ilmu
bioteknologi
telah
menempatkan
penggunaan enzim sebagai salah satu alternatif untuk
berbagai keperluan misalnya di bidang industri, pengobatan,
dan analisis. Keuntungan penggunaan enzim antara lain:
(1)enzim merupakan bahan alami yang tidak beracun
(2)enzim dapat mempercepat reaksi tanpa menyebabkan
terbentuknya hasil reaksi yang tidak diinginkan
(3)enzim aktif pada konsentrasi rendah
(4)kecepatan reaksi enzim dapat diatur dengan mengatur
suhu, pH, dan jumlah enzim yang digunakan
(5)enzim dapat diinaktifkan jika reaksi yang diinginkan sudah
diperoleh
(6)enzim merupakan senyawa alamiah yang ramah lingkungan
(Suhartono, 1993).
Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

2.2 Protease
Protease merupakan enzim proteolitik yang mengkatalisis pemutusan
ikatan peptida pada protein. Protease dibutuhkan secara fisiologi
untuk kehidupan organisme pada tumbuhan, hewan maupun
mikroorganisme (Rao et al., 1998). Penggunaan tumbuhan sebagai
sumber protease dibatasi oleh tersedianya tanah untuk penanaman
dan kondisi yang cocok untuk pertumbuhan. Di samping itu proses
produksi protease dari tumbuhan sangat memakan waktu. Protease
tumbuhan yang dikenal antara lain papain, bromelain, dan keratinase.
Protease hewan yang paling dikenal adalah tripsin, kimotripsin, pepsin
dan rennin. Enzim-enzim ini dapat diperoleh dalam keadaan murni
dengan jumlah besar (Boyer, 1971).

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

 Klasifikasi buah Nenas

Kingdom : Plantae
Divisio
: Spermatophyta
Sub divisio : Angiospermae
Kelas
: Monocotyledoneae
Ordo
: Ferinosae
Family
: Bromeliaceae
Genus
: Ananas
Spesies
: Ananas comosus (L) merr

 Klasifikasi buah pepaya

Kingdom : Plantae
Divisio
: Spermatophyta
Sub divisio : Angiospermae
Kelas
: Dicotyledoneae
Ordo
: Caricacea
Genus
: Carica
Spesies
: Carica papaya (L)

2.3 Papain
Papain adalah suatu zat (enzim) yang dapat diperoleh dari getah
tanaman pepaya dan buah pepaya muda. Getah pepaya tersebut
terdapat hampir di semua bagian tanaman pepaya, kecuali
bagian akar dan biji. Kandungan papain paling banyak terdapat
dalam buah pepaya yang masih muda. Getah pepaya (papain)
cukup banyak mengandung enzim yang bersifat proteolitik
(pengurai protein).
Aktivitas enzim papain cukup spesifik karena papain hanya dapat
mengkatalisis proses hidrolisis dengan baik pada kondisi pH
serta suhu dalam kisaran waktu tertentu.
Papain mempunyai pH optimum 7,2 pada substrat BAEE (benzoil
arginil etil ester), pH 6,5 pada substrat kasein. Suhu optimal
papain sendiri adalah 50-60. Papain relatif tahan terhadap suhu,
bila dibandingkan dengan enzim proteolitik lainnya seperti

2.4 Bromelin
Bromelin dapat diperoleh dari tanaman nanas baik dari tangkai, kulit,
daun, buah, maupun batang dalam jumlah yang berbeda. Dilaporkan
bahwa kandungan enzim bromelin lebih banyak terdapat pada batang
yang selama ini kurang dimanfaatkan. Distribusi bromelin pada
batang nanas tidak merata dan tergantung pada umur tanaman.
Kandungan bromelin pada jaringan yang umurnya belum tua terutama
yang bergetah sangat sedikit sekali bahkan kadang-kadang tidak ada
sama sekali. Sedangkan bagian tengah batang mengandung bromelin
lebih banyak dibandingkan dengan bagian tepinya (Hartadi, 1980).

2.5 Metode Anson

Uji aktivitas protease dilakukan dengan metode Anson
yaitu mengukur absorbansi spektrofotometri reaksi
hidrolisis kasein yang dikatalisis enzim bromelin hasil
isolasi.
Perbedaan hasil serapan antara enzim yang dimumikan
dengan variasi jenis pengendap dan blanko merupakan
derajat kemumiaan enzim tersebut yang diberikan dalam
bentuk aktivitas enzim dalam satuan nanokatal/mg
protein.

III. PROSEDUR PERCOBAAN

3.1 ALAT DAN FUNGSI
No.

Alat

Fungsi

1.

Gelas piala

wadah larutan

2.

Blender

untuk menghaluskan sampel

3.

Sentrifuge

untuk memisahkan endapan dengan supernatan

4.

Tabung reaksi

wadah sampel

5.

Spektrofotometer

untuk mengukur absorban

6.

Pipet gondok

untuk mengambil larutan dengan volume tertentu

7.

Gelas ukur

untuk mengukur volume larutan

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

3.2 BAHAN DAN FUNGSI

No
.

Bahan

Fungsi

1.

NaOH

pemberi suasana basa dan pengkhelat

2.

Casein

sebagai substrat

3.

Buffer fosfat 0,05 M pH 7

sebagai larutan penyangga

4.

Folin ciocalteu

sebagai pengompleks

5.

EDTA 0,1 M

sebagai aktivator enzim

6.

TCA 0,1 M

sebagai inhibitor

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

3.2 SKEMA KERJA

Isolasi papain
Isolasi bromelin
Pemurnian enzim

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

 Isolasi papain

Getah
Koloid

Ditambah buffer fosfat pH 7

Simpan di kulkas
Ambil 2 mL getah
Ditambahkan 0,6 mL aseton dingin

- Disentrifus selama 5 menit

Blanko

Sampel
- Ditambahkan TCA 2,5
- Ditambahkan kasein 2
mL
mL
- Diinkubasi 30 menit
- Diinkubasi 30 menit
- Ditambahkan kasein 2
- Ditambahkan TCA 2,5
SupernamL
Superna
mL
tan- Disentrifus 5 menit
tan
- Disentrifus 5 menit
- Ditambahkan 1 mL supernatan
- Ditambahkan 2 mL NaOH
- Ditambahkan 1 mL perealsi folin
- Diukur aktivitas dengan spektrofotometer 500 600 nm
(interval 10 nm)
Absorban
Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

 Isolasi bromelin

Nenas
- Ditambahkan akuades
- Diblender
- Disaring

Filtrat
- Dimasukkan masing masing 2 mL
ke dua tabung reaksi
- Ditambahkan 2 mL buffer fosfat PH
7
- Ditambahkan 0,5 mL EDTA 0,01 M
- Diinkubasi 5 menit
Blanko
-

Ditambahkan TCA 2,5 mL

Diinkubasi 30 menit
Ditambahkan casein 2 mL
Disentrifus 5 menit

Endapan
- Dimasukkan masing masing 2
mL kedua tabung reaksi
- Ditambahkan 2 mL buffer fosfat
PH 7
- Ditambahkan 0,5 mL EDTA 0,01
M
- Diinkubasi 5 menit
Sampel

- Ditambahkan casein 2
mL
- Diinkubasi 30 menit
- Ditambahkan TCA 2,5
mL
- Disentrifus 5 menit
Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Supernatan

Supernatan

Ditambahkan 1 mL supernatan
Ditambahkan 2 mL NaOH
Ditambahkan 1 mL pereaksi folin
Diukur aktivitas dengan spektrofotometer 500 600 nm
(interval 10 nm)

Absorban

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

 Pemurnian enzim

Getah
-

ditambahkan buffer fosfat pH 7

disimpan dikulkas
diambil 2 mL getah
ditambah 0,6 mL aseton dingin

Koloid
- disentrifus 5 menit
Filtrat
- ditambah aseton dingin 1
mL
- ditunggu sampai terbentuk
Filtrat koloid
- ditambah aseton dingin
1,4 mL
Filtrat

Endapan

Endapan
Endapan

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Endapan
- digabung dengan endapan
- dimasukkan ke tabung reaksi
- ditambahkan buffer fosfat

Blanko
Superna
tan

Enzim
- diambil 2 mL dimasukkan ke dalam
tabung reaksi
- ditambah EDTA 0,5 mL, diinkubasi 5
Sampel
menit
- Ditambahkan casein 2
Ditambahkan TCA 2,5 mL
Diinkubasi 30 menit
mL
- Diinkubasi 30 menit
Ditambahkan casein 2 mL
- Ditambahkan TCA 2,5
Disentrifus 5 menit
Superna
mL
tan Disentrifus 5 menit
- Ditambahkan 1 mL supernatan
- Ditambahkan 2 mL NaOH
- Ditambahkan 1 mL perealsi folin
- Diukur aktivitas dengan spektrofotometer 500 600 nm
(interval 10 nm)
Absorban
Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

IV. HASIL DAN

PEMBAHASAN
4.1 DATA DAN PERHITUNGAN
4.2 PEMBAHASAN

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

4.1

DATA DAN PERHITUNGAN

A. Data

Papain

Bromelin

No.

(nm)

blanko

sampel

blanko

sampel

500

0,116

-0,020

0,024

0,096

510

0,117

-0,005

0,044

0,103

520

0,119

-0,001

0,048

0,105

530

0,123

0,002

0,049

0,106

540

0,124

0,002

0,046

0,107

550

0,123

0,004

0,045

0,105

560

0,124

0,005

0,044

0,100

570

0,126

0,003

0,040

0,101

580

0,125

0,005

0,038

0,096

10

590

0,118

0,003

0,031

0,086

11

600

0,120

0,006

0,028

0,089

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Data percobaan pemurnian enzim bromelin

No.

(nm)

Absorban
Absorban
blanko
blanko

sampel

500

0,116
0,116

0,443

510

0,117
0,117

0,466

520

0,119
0,119

0,486

530

0,123
0,123

0,568

540

0,124
0,124

0,524

550

0,123
0,123

0,542

560

0,124
0,124

0,570

570

0,126
0,126

0,580

580

0,125
0,125

0,592

10

590

0,118
0,118

0,622

11

600

0,120
0,120

0,643

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

B. Perhitungan
Menghitung aktivitas enzim bromelin
Aktivitas blanko

=
= 0,082 U/menit

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

 Aktivitas sampel

= 0,178 U/menit

Aktivitas enzim

= 0,096 U/menit

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

 Menghitung aktivitas enzim papain

Aktivitas blanko

= 0,21 U/menit

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

 Aktivitas sampel

= 0,01 U/menit

Aktivitas enzim

= 0,2 U/menit

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

 Menghitung aktivitas enzim bromelin hasil pemurnian

Aktivitas blanko

= 0,21 U/menit

 Aktivitas sampel

= 1,072 U/menit

Aktivitas enzim

= 0,862 U/menit

4.2
Pembahasan
Pada percobaan isolasi dan karakterisasi enzim protease dari
tumbuhan, sampel tumbuhan yang digunakan adalah nenas dan pepaya.
Pada buah nenas terdapat enzim bromelin sedangkan pada getah
pepaya terdapat enzim papain. Pada kedua tumbuhan ini dilakukan 2
penentuan yang berbeda yaitu untuk sampel dan untuk blanko.
Pada isolasi papain, getah pepaya yang telah dikumpulkan ditambahkan
buffer fosfat secukupnya yang berfungsi untuk menetralkan getah
pepaya pada pH 7, pada pH ini aktivitas enzim papain dan bromelin
berada pada kondisi optimum. Pada keadaan terlalu basa atau asam
enzim akan mengalami denaturasi karena stabilitasnya terganggu.
Ditambahkan EDTA yang berfungsi sebagai aktivator enzim.

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

 Ditambahkan TCA yang berfungsi sebagai degradator substrat. Substrat

akan didegradasi oleh TCA (Pada tahap sampel) membentuk molekulmolekul yang lebih sederhana, sedangkan pada tabung blanko
ditambahkan casein sebagai substrat yang akan didegradasi oleh enzim.
Sentrifus dilakukan selama 5 menit agar endapan dan larutan terpisah
baik.
Ditambahkan NaOH berfungsi untuk mempertajam warna kompleks
Ditambahkan pereaski folin sebagai pengompleks. Jika folin
ditambahkan dengan NaOH akan terbentuk khelat.
Hal yang sama dilakukan pada penentuan aktivitas enzim bromelin.
Pada permurnian enzim papain dilakukan dengan menggunakan aseton .
Fungsi dari aseton adalah untuk mengendapkan enzim. digunakan
aseton karena dibandingkan pelarut organik lainnya aseton tidak akan
merusak aktivitas enzim.

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

V. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 KESIMPULAN
1. Enzim yang diisolasi pada percobaan ini adalah
enzim
bromelin dari buah nenas dan enzim papain dari getah pepaya.
2. Dari data percobaan diperoleh :
. Nilai aktivitas enzim papain
= 0,096 U/menit
. Nilai aktivitas enzim bromelin
= 0,2 U/menit
. Nilai aktivitas enzim bromelin hasil pemurnian = 0,862
U/menit
3. Nilai serapan berbanding lurus dengan aktivitas emzim dimana
semakin besar nilai absorban maka semakin besar juga nilai
aktivitas enzim yang didapatkan

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

5.2 SARAN
1. Teliti dalam pengukuran menggunakan
spektrofotometer.
2. Gunakan masker ketika menambahkan aseton
pada proses pemurnian.
3. Pahami prinsip dan cara kerja.

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

DAFTAR PUSTAKA
1. Lehninger . 1982. Dasar-dasar Biokimia .
Jakarta : Erlangga
2. Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia.
Jakarta : UI Press.
3. Wuryanti. 2004. Isolasi dan penentuan aktivitas
enzim bromelin dari buah nanas (Ananas
comosus L). Semarang : FMIPA UNDIP

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014