m. k.

DASAR TEKNOLOGI MIKROBIAL

TIN 232/1 (2-0)

PROSES HILIR
(Downstream Process)

DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN

FATETA IPB
2015

RANAH PROSES HILIR

PROSES HULU
PROSES HILIR

Bahan baku
residu
Persiapan bahan
broth

Fermentasi

Sterilisasi

Penanganan/pembuangan
Residu
filtrat
Pemisahan
Isolasi produk
biomassa
Penanganan/
pembuangan
biomassa
Pembuangan/daur
ulang (recycle)

Downstream after the fermentation process

DIAGRAM ALIR BIOPROSES

Substrat
Pengaturan pH
Penambahan garam
mineral, Sumber C
dan N dll

Agitasi
Aerasi
Pengukuran
& pengontrolan

Persiapan media
fermentasi

Sterilisasi

Fermentasi

Inokulum

CO2 dan gas lain

Panas

Pemisahan Biomassa dan

cairan kultur

Biomassa

Isolasi Produk

Residu Fermentasi

Purifikasi Produk &

Formulasi

Residu Fermentasi

Produk Akhir

Pembuangan Residu

Proses hilir : sulit perlu teknik yang tepat dan biaya tinggi

20 60 % total biaya produksi

Cara menurunkan biaya :

1.
Meningkatkan konsentrasi produk yg dihasilkan
- teknologi kultivasi
- rekayasa genetika
2. Proses hilir dibuat lebih efisien

KRITERIA PEMILIHAN
METODE PROSES HILIR

Lokasi produk (intra/ekstraseluler)

Konsentrasi produk dalam cairan kultivasi (broth)
Sifat-sifat kimia dan fisik produk (ukuran partikel,
kelarutan, densitas, difusifitas, muatan dll)
Penggunaan produk pangan, farmasi dll
Standar tingkat kemurnian minimal yang ditentukan
Adanya senyawa pengotor (mis. pigmen) dalam cairan
kultivasi
Harga jual produk

KARAKTERISTIK BIO-PRODUK
1.Konsentrasi rendah dan campuran kompleks
(sel mikroba, sisa komponen medium & produk
metabolik)
Konsentrasi (g/l)
- PST
30-50
- Etanol
70-120
- Camp.aseton/butil alkohol/etanol
18-20
- Asam organik
40-100
- Antibiotika (Penisilin G)
10-30
- Enzim
2 -5
- Vitamin B-12
0.02
- Riboflavin
10-15
2. Lokasi Produk (intraseluler/ekstraseluler)

3. Tidak stabil
pH, suhu, kekuatan ion, jenis pelarut yang digunakan,
dirusak mikroba kontaminan dll
dapat dihindari dengan pendinginan
tinggi

5oC tapi biayanya

4. Densitas partikel hampir sama / kental

menyulitkan sentrifugasi / presipitasi
5. Sel m.o compressible (dapat dimampatkan & lengket)
menyulitkan filtrasi karena terbentuk kerak

PROSES HILIR IDEAL

Diperoleh produk berkualitas tinggi (sesuai

kebutuhan)
Proses cepat & efisien
Investasi peralatan tidak mahal
Biaya operasi rendah

Pemilihan proses hilir harus tepat

KLASIFIKASI METODE PEMISAHAN

Prinsip pemisahan
Ukuran partikel
Ukuran molekul

Suhu

Metode
pemisahan
Fiberfiltrasi
Mikrofiltrasi
Ultrafiltrasi
Hiperfiltrasi
Gel Khromatografi
Dialisis

- Kristalisasi

Ukuran partikel
(m)
> 200 10
20 0.5
2 0.005
0.008 0.00025
2 0.0003
0.002 0.00025
< 0.0002

KLASIFIKASI METODE PEMISAHAN

Prinsip pemisahan

Metode pemisahan

Ukuran partikel
(m)

Kelarutan

-Adsorbsi
-Ekstraksi

< 0.002

Muatan listrik

-Elektroforesis
-Elektrodialisis
-Pertukaran ion

2 0.02
0.02 0.00025
0.02 0.00025

Bobot jenis
(densitas)

-Sedimentasi
-Dekantasi
-Sentrifugasi
-Ultra sentrifugasi

> 1000
1000 5
1000 0.5
2 0.02

TAHAPAN UMUM PROSES HILIR

Cairan Kultivasi/Fermentasi
Pemisahan sel m.o/ partikel tidak larut
(filtrasi, sentrifugasi, sedimentasi)
2. Isolasi primer
isolasi produk dari cairan kultivasi
pemekatan, namun belum murni
(ekstraksi dengan pelarut, presipitasi, ultrafiltrasi)
3. Purifikasi
penghilangan kontaminan/pengotor
(fractional presipitation, khromatografi, elektroforesis)
4. Isolasi produk tahap akhir
sesuai formulasi/
aplikasi akhir atau distribusi/transportasi
= Polishing

drum/spray drying, pengeringan

beku (freeze drying), kristalisasi
1.

FILTRASI
Pemisahan partikel tersuspensi /sel m.o dari cairan/gas
Menggunakan medium filter berpori yang menahan
partikel (=retentat), tetapi melewatkan cairan/gas (=filtrat)
Proses umum untuk semua skala operasi

Filter cake

.
slurry
.
-- - - - - - - -

filtrat

filter

Filter aid :
mencegah
penyumbatan kerak
& meningkatkan
laju filrtrasi
e.g tanah
diatomeae,
Perlit dll

- Menggunakan tekanan atau vakum

- Laju filtrasi tergantung : luas filter, viskositas cairan dan
tahanan oleh kerak

PERALATAN FILTRASI
1.

Rotary Vacuum Drum Filter

- drum bersekat yang dilapisi filter kain/logam

dimasukkan ke tangki cairan kultivasi (bagian yg

terendam 35%)
- filter dilapisi filter aid
(contoh : tanah diatomeae)
Produk
- kecepatan berputar
Umpan
0.1-10 rotasi/menit
- vakum dijalankan
melalui pipa drainase
filtrat terkumpul melalui pipa
di bag dalam drum
Filtrat

PERALATAN FILTRASI
1.

Rotary Vacuum Drum Filter

- filter cake (kerak) dipotong dengan pisau produk
- Penggunaan :
* enzim ekstraseluler
* sel khamir (ragi roti) & kapang dll

untuk volume besar &

proses sinambung

Continuous and automatic operation, so the operating

cost is low

2. Leaf Filter
- dapat dioperasikan seperti vacuum/presure filter
- selama filtrasi alat tidak diputar akhir filtrasi diputar
untuk pembuangan padatan
- Filter aid (tanah diatomeae dll) ditambah pada umpan
- dapat digunakan secara tertutup

Leaf Filter

Application : bir, antobiotik enzim, asam amino

3. Filter Press
- plate & frame berseri tiap plate dilapisi filter
sederhana dan murah
- Broth ditekan dg tekanan ( 20 bar) padatan
tertahan di bag dlm bejana & filtrat dikeluarkan melalui
saluran pada permukaan plate
- digunakan untuk suspensi yang sulit di-filter (kental)
- tidak memerlukan filter aid
- operasi batch (curah)
- waktu penghilangan cake pembersihan & pemasangan
alat lebih lama

Filter Plate

Filter Press

Filter Press

Solid/liquid separation using the principle of pressure

drive, provided by a slurry pump

SENTRIFUGASI
Diperlukan bila :
1) Pemisahan dgn filtrasi sulit (perbedaan densitas sel &
produk kecil) dan mahal contoh untuk pemisahan
sel bakteri pada cairan fermentasi
2) Sel dan bahan tersuspensi lain harus bebas dari filter
aid
3) Diperlukan pemisahan dgn standar higiene tinggi
Pemisahan berdasarkan perbedaan densitas antara
padatan dan cairan & ukuran partikel dan viskositas cairan
medium yang dipercepat dgn gaya sentrifugal
Bahan diputar dengan kecepatan tertentu (rpm) dan
selang waktu tertentu

-Prinsip kerja alat : sedimentasi (Hukum Stokes)

pemisahan partikel bahan berdasarkan perbedaan

densitas
- Faktor yg mempengaruhi laju sedimentasi :
* perbedaan densitas antara sel dgn cairan
* diameter sel
* viskositas cairan
- Sentrifus batch kapasitasnya terbatas tidak cocok untuk
skala besar
- Sentrifus yg digunakan untuk pemisahan sel biasanya
dioperasikan secara sinambung atau semi sinambung

Centrifugation properties of different cell types

Bacteria
Small cell size
Resilient
Yeast cells
Large cells
Resilient
Filamentous fungi
Mycelial
Resilient
Cultured animal cells
Large cells
Very fragile

High speed required

Low cell damage
Lower speed required
Low cell damage
Lower speed required
High water retention in
pellet

Very susceptible to
damage

Industrial centrifuges
bowls, motor drives, cooling jackets
& sludge collection vessels

Tubular bowl

Chamber
Disc
Faktor akselerasi
Tubular centrifuge
13000 17000 g
Chamber centrifuge
6000 11000 g
Disc-stack centrifuge
5000 15000 g

ISOLASI PRODUK
ekstraseluler langsung diekstraksi
Produk
intraseluler pemecahan sel
Pemecahan
Dinding Sel

Metode Pemecahan
Dinding Sel

Treatment with alcali

Pemecahan Dinding Sel Mikroba

Metode Kimia Lisis Sel
Alkali
- Untuk enzim yg tahan thd alkali (NaOH) dapat
menginaktivasi protease
Contoh : L-asparaginase diisolasi dari bakteri pada
pH 11.0-12.5
Enzimatis
- Lisozim mengkatalisis hidrolisis ikatan -1,4-glikosidik
peptidoglikan pada dinding sel bakteri Gram (+)
- Jarang diterapkan pd skala besar, karena biayanya mahal
- Contoh : aryl acyl amidase diisolasi dari Pseudomonas
fluorescens
- Enzim lain untuk memecah dinding sel : selulase, papain dll

Deterjen
- Merusak lapisan lemak pada dinding sel
- Contoh deterjen ionik (sodium lauril sulfat), kationik
(setildietil ammonium bromida) atau non-ionik (Tween &
Triton)
Deterjen ionik lbh reaktif & dpt menyebabkan
terdisosiasinya lipoprotein
Adanya deterjen berpengaruh thp .pemurnian
selanjutnya, e.g presipitasi enzim dgn garam diatasi
dgn khromatografi pertukaran ion atau ultrafiltrasi
- Aplikasi pada skala besar : Triton X-100 untuk isolasi
kholesterol oksidase dari Nocardia sp.

Metode Fisik Lisis Sel

Sonikasi (sonication)
- Ultrasonik : frekuensi di atas selang pendengaran
manusia (20 kHz)
- Bakteri Gram (-) & bentuk batang lebih sensitif
- Skala lab, untuk skala industri kesulitan dlm transimisi
tenaga ke volume suspensi yg besar & penghilangan
panas

Kejutan Osmotik (Osmotik Shock)

- Metode : pencucian sel dgn larutan bufer untuk
menghilangkan sisa media, lalu diresuspensi dlm larutan
sukrosa 20 % (hipertonik)sehingga sel pecah akibat
terjadi kehilangan air, kemudian disentrifugasi
- Contoh : - isolasi kanamisin asetil transferase dari E. coli.
- isolasi luciferase dari Photobacterium fisheri

Sonicator

Sonication is the process of converting an electrical signal

into a physical vibration that can be directed toward a
substance.
Read more: How Does Sonication Work? | eHow.com http://www.ehow.com/how-does_5171302_sonicationwork_.html#ixzz1tOBt3Ijl

Freezing & Thawing

- Kristal es sbg pemecah sel (volume es > air)
- Proses sederhana & dgn suhu rendah, tetapi prosesnya lama.
- Banyak mikroba yg tahan dan banyak enzim menjadi inaktif tidak
diaplikasikan secara ekstensif

Solid Shear
- Pasta sel beku -200C ditekan melalui lubang kecil dgn tekanan tinggi
sel rusak akibat gaya geser (shear) dgn bantuan kristal es
- X-Press dapat memproses 100 g S.cerevisiae per menit
- Merupakan cara yg baik untuk pemecahan dinding sel , tetapi repot
untuk penggunaan rutin

Penggilingan (grinding) atau Agitasi dgn Abrasif

- Dyno Mill, efisien memecah dinding sel bakteri yg sulit
(Streptococcus haemolyticus, Staphylococcus aureus &
Micrococcus lysodiekticus)

Dyno Mill

Bead

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032591099001424

Liquid Shear (high-pressure Homogenizer)

- Metode utama untuk skala besar
- Cara : suspensi bakteri ditekan melalui orifis dgn tekanan
tinggi terjadi tekanan secara mendadak saat sel
melewati outlet
Manton-Gaulin Homogenizer
- Digunakan untuk a.l Saccharomyces, E. coli,
Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megatherium ( tidak
cocok untuk kapang yang berfilamen, karena katup (valve)
bisa tersumbat)

Isolasi primer
Ekstraksi Cairan-cairan
Pemisahan komponen suatu cairan dengan
penggunaan pelarut yang dapat melarutkan
komponen tersebut
Penentuan jenis pelarut nilai koefisien partisi atau
distribusi (K)
K=

Konsentrasi solut dalam ekstrak

Konsentrasi solut dalam rafinat

K > 0.5 pemisahan lebih mudah ekstraksi 1 tahap

K < 0.1 Ekstraksi bertahap :
- Concurrent (aliran searah)
- Counter Current (aliran berlawanan arah)

Jenis Pelarut
Pemilihan jenis pelarut tergantung polaritasnya
senyawa yang memiliki kepolaran yang sama
akan lebih mudah terlarut pada pelarut yang
memiliki tingkat kepolaran yang sama.
Pelarut polar (air, etanol, metanol, asam asetat)
Memiliki tingkat kepolaran yang tinggi
Pelarut Semi Polar ((aseton, etil asetat, kloroform)
memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah
Pelarut Non Polar (heksan, eter)
Sesuai untuk mengekstrak berbagai jenis minyak.
Pelarut yang masih terdapat pada filtrat diupakan dengan
evaporator (e.g rotary vacuum evaporator)

Peralatan Ekstraksi dgn Pelarut :

Skala Kecil (Lab) :
separating funnel

Skala Industri :
centrifugal contactors,
spray columns,
pulsed columns
dan mixer-settlers.

Mixer-settler

PRESIPITASI
ENZIM Kelarutan Protein/Enzim dipengaruhi oleh :
Konsentrasi garam
pH
Kandungan pelarut organik
Suhu

- Suhu media biasanya dipertahankan < 40C untuk

meminimumkan penurunan aktivitas enzim
- e.g alkalinfosfatase lbh larut dgn adanya -gliserofosfat

- Stabilizer e.g dithiothreitol atau merkaptoetanol dapat

ditambahkan saat ekstraksi untuk mencegah oksidasi
gugus sulfuhidril, sehingga mencegah kehilangan
aktivitas enzim

 Presipitasi = penambahan senyawa, sehingga terjadi pengendapan yg

dpt memurnikan enzim Tujuan : purifikasi & pemekatan . Caranya :

1. Penambahan Pelarut Organik

-

Menurunkan konstanta dielektrik media, sehingga kelarutan protein

menurun, karena tak cocok untuk enzim yg bersifat polar
Untuk mencegah denaturasi, gunakan suhu < 00C
kelemahan : pelarut mudah terbakar, harganya mahal & unt.skala kecil
Presipitan : metanol, etanol, isopropanol pd gum xanthan, aseton

2. Penambahan Garam
-

Konsentrasi garam yang tinggi akan menghilangkan mantel air dari

koloid protein mengurangi kelarutan protein = salting out
Proses pemisahan yg sederhana & murah
Garam : ammoniumsulfat umum diaplikasikan

3. Polimer Berbobot Molekul Tinggi

- Polietilen glikol (PEG,) penggunaan tdk luas

Enzim yg telah mengendap dipisahkan dari supernatan dgn

sentrifugasi/filtrasi dimurnikan

ISOLASI PRODUK

Destilasi
Pemisahan berdasarkan berpedaan titik didih bahan.
Untuk pengambilan cairan/pelarut (produk kultivasi,
e.g etanol, aseton, butanol dll )

Tahapan :
a.
Evaporasi pemisahan pelarut dari cairan kultivasi
b.
Pemisahan uap cairan untuk memisahkan pelarut
yang lebih volatil dan kurang volatil
c.
Kondensasi uap untuk mendapatkan pelarut kembali

PEMURNIAN PRODUK
Khromatografi

Pemisahan berdasarkan perbedaan interaksi antara

komponen-komponen yang akan dipisahkan dengan fasa
diam dan fasa gerak dalam kolom kromatografi
Isolasi & pemurnian metabolit dengan konsentrasi
rendah
Khromatografi Adsorbsi
contoh : untuk antibiotika streptomisin
Adsorbsi senyawa oleh fase padat (adsorban).
Pemisahan terjadi karena setiap senyawa diadsorbsi
dengan kekuatan berbeda-beda
senyawa yang diikat paling kuat akan dielusi paling
akhir
Contoh abdorban : karbon aktif, Mg oksida, Al oksida,
Al (OH)3, silika gel

Khromatografi Pertukaran Ion

- Prinsip : interaksi muatan positif dan negatif antara
senyawa (produk) dengan matriks/resin yang berada di
dalam kolom kromatografi. senyawa akan terikat resin
beradasarkan interaksi elektrostatik
- Cocok untuk purifikasi skala besar
Khromatografi Filtrasi Gel
- Jarang digunakan untuk skala besar
- Pemisahan berdasarkan ukuran molekul
- Contoh : * endonuclease restriksi (kolom Sephacryl)
* fosfatase alkalin (kolom Ultrogel)

Khromatografi Interaksi Hidrofobik

- Pemurnian berdasarkan polaritas Pada kondisi
kekuatan ion tinggi, dapat mengikat banyak
senyawa
- Senyawa yg teradsorbsi pada matriks dapat dielusi
a.l dgn eluen (pelarut) berdasarkan perubahan pH,
menurunkan kekuatan ion,
- Contoh : enzim aryl acyl amidase dari P. fluorescene
(kolom phenyl-Spharose, dielusi dgn Tris HCl

d. Khromatografi Afinitas
- Berdasarkan afinitas biologis terjadi adsorbsi
biospesifik antara komponen-komponen kimia dgn
matriks dalam kolom kromatografi.
- Ligan (molekul yg memp afinitas spesifik thd molekul
yg akan dimurnikan) dilekatkan pada matriks/
penyangga dgn ikatan kovalen & dimasukkan kolom
khromatografi. makromolekul (senyawa) yg
mempunyai afinitas spesifik dgn ligan yg akan
tertangkap

ELEKTROFORESIS
teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasi protein dalam
suatu medan listrik
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan
gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekulmolekul.
Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari
muatan dan berat molekul senyawa , contohnya protein.
Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat
berpindah.

Protein Gel Electrophoresis

POLISHING
(Penyelesaian)
KRISTALISASI
pemisahan padatan dari larutan (teknik pemurnian
senyawa padatan)
- Prinsip : pembentukan padatan kristal dari larutan lewat
jenuh (supersaturated)

Contoh : Produksi asam sitrat

Produksi asam amino ( asam glutamat, lisin)
Produksi asam MSG

Widely used
crystallizer type
(Swenson Draft tube)

http://www.tkk.f i/Units/ChemEng/research/Crystallization/SwenDTB.gif

PENGERINGAN
Agar memudahkan penanganan dan pengangkutan
harus dijaga viabilitas, aktivitas & nilai gizi produk

Sebelum pengeringan dapat disentrifugasi/filtrasi

kadar air produk berkurang, sehingga pengeringan lebih
cepat
Spray drying
Cara pengeringan cairan menggunakan udara panas
cairan dipompa melalui atomizer, sehingga dihasilkan
tetesan halus ke dalam bejana pengering powder

Spray drying

:http://class.fst.ohio-state.edu/.../14Spraydrying.htm

Freeze drying
Pengeringan beku bekerja dengan membekukan bahan, lalu
tekanan dikurangai untuk memudahkan air yang beku
menyublim angsung menjadi gas.
Cocok untuk senyawa yang sensitif terhadappanas

Contoh : Proses Hilir Ragi Roti

Cairan kultivasi S. cerevisiae
Centrifugasi

Filtrat

Pasta Ragi
Rotary Drum Vacuum Filter
(pengeringan)
Tepung Ragi Roti

Rotary Drum Vacuum Filter Press

Proses Hilir Bioetanol :

Persiapan substrat : hidrolisis pati menjadi glukosa
Fermentasi, konversi gula menjadi etanol dan CO2
Proses Hilir
Pemurnian dengan proses destilasi menjadi etanol
berkadar 95-96%
Dehidrasi (molecular sieve : bentonit dll) adalah proses
penghilangan air dari 96% menjadi 99,5% (fuel grade
ethanol) atau dengan metode destilasi azeotrop
menggunakan benzen diperoleh etanol anhidrat (99,5%100%)
(

Proses Hilir Asam Sitrat

A
Cairan kultivasi A. niger
Rotary Filter

Evaporasi
miselium mo

Kristalisasi

Filtrat + Ca(OH)2
Sentrifugasi
Rotary Filter

Kalsium sitrat
Pengeringan
(+) H2SO4
Rotary Filter

Asam sitrat
A

CaSO4

Asam Sitrat

Proses Hilir Penisilin

Cairan kultivasi
Rotary vacuum Filter

Miselia mo

Ekstraksi dg centrifugal extractor

(pelarut : amil asetat/butil asetat)

Evaporasi & Kristalisasi

Re-ekstraksi dg air
(+buffer)
Pengeringan
(vacuum Drier)

Penisilin

The crystals of l-glutamic acid

hydrochloride separated from the liquid
by filtration and redissolved in water.

MSG Production

With sodium / potassium hydroxide this

solution was stored to allow l-glutamic
acid to crystallize out MSG

Preservatives or stabilizers :
for example, calcium salts, proteins, starch, sugar, alcohols, sodium
chloride (18-20 %), sodium benzoate, etc.

Contoh : Formulasi Enzim Deterjen

Protease alkalin dari Bacillus sp

Bentuk awal : dry powder pekerja alergi & gangguan kulit

Formulasi : enkapsulasi :
- debu tak beterbangan
- partikel larut cepat
- tak menghasilkan bau & warna
- daya simpan lebih baik, melindungi thd komponen lain
contoh pemutih (bleaching agent )

Proses Enkapsulasi Protease

Cairan fermentasi (broth) filtrasi presipitasi enzim

filtrasi pengeringan disaring powder

Formulasi :
enzim powder dicampur aditif penstabil etoxylated-C18-fatty
alcohol terbentuk bola lalu dilapis (minyak parafin atau
PEG) agar tidak berdebu selama penanganan

TUGAS KULIAH DTM 2015

Bahaslah proses hilir yang dilakukan untuk
menghasilkan enzim intraseluler seperti
diagram alir berikut ini.
Berdasarkan karakteristik produk enzim dan
tipe produk yang dihasilkan, bahaslah alasan
mengapa diterapkan tahapan proses hilir tsb.
Tulisan tangan maksimum 2 halaman A4
Dikumpulkan Rabu, 6 Mei 2015

PRODUKSI ENZIM INTRASELULER

sentrifus

Pemecahan
dinding sel

Pendinginan

Product

Thank You