Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT)

I. Tujuan Percobaan
Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat :
- Menjelaskan teori Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
- Mengoperasikan alat Kromatografi Cair dengan baik dan benar
- Menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun
kuantitatif dengan menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi.

II. Alat dan Bahan yang digunakan

Alat yang digunakan
- Perangkat HPLC + Injector + Pencetak Kromatogram
- Kolom Licosphere C-18
- Syiringe
- Penyaringan milipone
Bahan yang digunakan
- Cafein 15 ppm
- Methanol

III. Dasar Teori

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga
disebut dengan Kromatografi pertama sekali diperkenalkan oleh TSWETT
pada tahun 1903 dan dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau
dalam sediaan farmasetik.

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut
diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair
atau gas). Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal
istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase
diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian
(partition chromatography).

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak,

pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau
integrator atau perekam.
 1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembap (inert). Wadah pelarut
kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase
gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai
2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk
pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan
metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan
fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase
normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang

mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap
fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja
tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif,
pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2
jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe
pompa dengan tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel

 Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam
fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop)
internal atau eksternal.

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor
mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional,
yakni: Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih
kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. Sensitivitas
kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:

detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

IV. Prosedur Kerja

Prosedur Operasional Instrument HPLC DIONEX :

1. Terlebih dahulu menyiapkan fase gerak yang akan digunakan untuk

analisa dan memasukkan kebotol fase gerak yang tersedia.
Gambar Alat HPLC
JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal
(jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau
fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan
fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase
terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan
pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi
solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan
kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi
dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.3)

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang
dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang
digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.
Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan
air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah
atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase
gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya
dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam
bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar
kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion
yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas
penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan
menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal
digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut
 organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi
puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta
oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan
kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus
penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk
pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang
melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion
yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel
dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa
dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara
partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang
mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu,
kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah
molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang
besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase
diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini
tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus
molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein
(enzim) dari campuran yang sangat kompleks.2)

DERIVATISASI PADA HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan
suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan
utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan
menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik

3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik

4. Menstabilkan analit yang sensitif.5)

Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :

Gugus Reagen untuk dapat Reagen untuk
fungsional dideteksi dengan UV- dapat dideteksi
Vis dengan
Fluoresen
Asam-asam p-nitrobenzil-N,N- 4-bromometil-7-
kaboksilat; diisopropilisourea asetoksikumarin;
asam-asam (PNBDI); 3,5- 4-bromometil-7-
lemak;asam- dinitrobenzil-N,N- metoksikumarin;
asam fosfat diisopropilisourea
(DNBDI); p-
bromofenasil bromida
(PBPB)
Alkohol 3,5-dinitrobenzil
klorida (DNBC); 4-
dimetilaminiazobenze
n-4-sulfinil (Dabsyl-
Cl); 1-naftilisosianat
(NIC-1).
Aldehid; p-nitrobenziloksiamin Dansil hidrazin
keton hidroklorida (PNBA);
3,5-
dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);
Amin primer Fluoresamin
o-ftalaldehid
 (OPA)
Amin primer 3,5-dinitrobenzil 7-kloro-4-
o
(1 ) dan klorida (DNBC); N- nitrobenzo-2-
sekunder suksinimidil-p- oksa-1,3-diazol
(2o) nitrofenilasetat (NBD-Cl); 7-
(SNPA); N- fluoro-4-
suksinimidil-3,5- nitrobenzo-2-
dinitrofenilasetat oksa-1,3-diazol
(SDNPA); 4- (NBD-F); Dansil
dimetilaminiazobenze klorida
n-4-sulfinil (Dabsyl-
Cl); 1-naftilisosianat
(NIC-1).
Asam-asam 4- Fluoresamin
amino dimetilaminiazobenze o-ftalaldehid
(peptida) n-4-sulfinil (Dabsil-Cl) (OPA)
7-kloro-4-
nitrobenzo-2-
oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl);
Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column
derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column
derivatization)