Desain dan Pengembangan Obat:

Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Isolat

Dr. Ade Zuhrotun, M.Si., Apt.

Fakultas Farmasi Unpad
 Materi dan Tujuan Pembelajaran
Identifikasi Senyawa Pemandu 2: Isolasi dan
Karakterisasi Senyawa Isolat (Fraksinasi, UV,
FTIR, MS)
Mengetahui dan memilih metode mana yang
tepat dalam menemukan senyawa pemandu
ISOLASI SENYAWA BAHAN ALAM
Proses atau protokol untuk memperoleh
senyawa
mempertimbangkan karakter bahan awal
(organisme atau ekstrak) dan atau senyawa
target (jika sudah sudah diketahui senyawa
yang akan di isolasinya)
Pengerjaannya menggabungkan teknik-teknik
kromatografi
 Ekstraksi
Proses pelarutan atau penarikan metabolit
sekunder dari bahan alam
Fraksinasi
ekstrak perlu difraksinasi terlebih dahulu
menjadi fraksi-fraksi yang mengandung
senyawa dengan kepolaran atau ukuran
molekul yang mirip
Metode yang dapat digunakan yaitu ekstraksi
cair-cair (ECC) dan metode kromatografi
 Pemisahan dan pemisahan lanjut
Proses suatu campuran senyawa terbagi menjadi minimal dua
komponen dengan komposisi berbeda atau menjadi dua
molekul yang sama komposisi tapi berbeda struktur
stereokimianya
Kromatografi komponen yang dipisahkan akan terdistribusi
dalam dua fase, fase diam (tidak bergerak) dan fase gerak
(yang bergerak)
Teknik-teknik klasik meliputi flash chromatography (FC),
kromatografi kolom (KK), size exclusion chromatography (SEC),
KLT, KLT preparatif, dan ion-exchange chromatography
Teknik-teknik modern meliputi kromatotron, droplet counter-
current chromatography (DCC), high performance thin layer
chromatography (HPTLC), multi-FC, KCKT, solid-phase
extraction (SPE), kromatografi cair vakum (KCV), dan teknik
hifenasi (misalnya: LCMS, LCNMR, LCMSNMR)
Hasil-hasil pemisahan dipantau dengan KLT atau KCKT dengan
detektor sinar ultraviolet
 Pemurnian
Proses pemisahan senyawa target dari
pengotor-pengotor yang mungkin masih ada
dalam isolat
Metode pemurnian yang dapat digunakan yaitu
rekristalisasi, destilasi, sublimasi dan
kromatografi
Uji kemurnian dapat dilakukan dengan
penetapan jarak lebur, KLT atau kromatografi
kertas (KKt) dua dimensi dan KCKT
 KARAKTERISASI DAN ELUSIDASI STRUKTUR
Identifikasi senyawa bahan alam pertama kali perlu
diketahui golongan senyawa
Uji yang dapat dilakukan: uji reaksi warna, uji kelarutan,
melihat profil KLT atau KKt dan karakter spektrum
ultraviolet isolat
Identifikasi lengkap senyawa dilakukan melalui pengukuran
karakter isolat dengan berbagai metode dan
membandingkan datanya dengan pustaka.
Karakter yang diukur meliputi titik lebur (untuk senyawa
padat), titik didih (untuk senyawa berbentuk cairan),
putaran optik (untuk senyawa optik aktif) dan nilai Rf atau
RRf (pada kondisi standar).
informasi data senyawa juga harus dilengkapi dengan hasil
pengukuran karakter spektrum ultraviolet-sinar tampak,
inframerah, resonansi magnet inti dan spektrum massa
Peran teknik spektroskopi untuk identifikasi isolat:
Spektrofotometri Ultravioletvisible (UVvis), menyediakan
informasi adanya kromofor dalam molekul. Beberapa senyawa
bahan alam seperti kumarin, flavonoid dan alkaloid isokuinolin
dapat dikarakterisasi dari karakteristik puncak-puncak serapan.
Spektrofotometri inframerah (IM), digunakan untuk menentukan
gugus fungsi yang berbeda yang terdapat pada suatu molekul
senyawa. Misalnya C=O, OH, NH2, atau gugus aromatik.
Spektrometri massa (SM), menyediakan informasi tentang massa
molekul, rumus molekul, dan pola fragmentasi.
Spektroskopi resonansi magnet inti (RMI), menyediakan informasi
mengenai jumlah dan posisi proton (H) dan karbon (C) yang
terdapat dalam molekul senyawa, serta hubungan antara kedua
atom ini. Pengujian RMI yang rutin dilakukan meliputi teknik RMI
satu dimensi (misalnya: 1H-RMI, 13C-RMI, 13C DEPT) dan dua dimensi
(misalnya: 1H-13C-HMBC dan 1H-13C-HSQC).
X-ray crystallography menyediakan informasi mengenai struktur
kristal dari suatu molekul, dan polarimetri menyediakan informasi
aktivitas optik dari senyawa kiral. Kedua teknik ini penting untuk
molekul senyawa dengan pusat-pusat kiral dan isomer optik
TAHAPAN ISOLASI SENYAWA
ALPHA MANGOSTIN
 METHODS

Collection and Determination of

identification of Extraction parameters of the
plants extract

Isolation with
Phytochemical Coloumn
Fractination
screening Chromatography
and Preparative TLC

Identification of
Purity Test Cytotoxicity Test
Isolates
Steps of isolation

Liquid extract was

Maseration with ethanol heated up with the Extract
evaporator at 40o 60oC

coloumn Fractination using liquid-

Each accumulated
chromatography using liquid extraction with n-
fractions were
n-hexane and ethyl hexane, water and ethyl
evaporated at 40o 60oC
acetate as the eluent acetate

checked by TLC with n- the targeted compound

hexane : ethyl acetate : Isolation continued with was scraped and
methyl chloride (6 : 2,5 : preparative TLC strained with suitable
1,5) solvent.

Purity test by two-

dimensional TLC
Phytochemical screening
Secondary Metabolite Type Result
Alkaloid -
Polifenol +
Tanin -
Flavonoid +
Monoterpen dan
-
Seskuiterpen
Steroid -
Triterpen +
Kuinon +
Ket: Saponin +
- : undetected
+ : detected
 Extraction

9,8 kg
Maseration with
mangosteen
ethanol 96%
pericarp simplicia

Crude extract
Rendemen 5,99%
580,09 grams
 Fractionation
MASS %
FRACTION
(GRAM) RENDEMEN
Water 14,68 14,68%
n-hexane 16,78 16,78%
Ethyl acetate 44,45 44,45%

Collecting 44
fractions of
ethyl acetate
and
24 fractions of
Coloumn Fraction TLC spot n-hexane
checking
 Isolation with Coloumn
Chromatography and Preparative TLC

Preparative TLC
IA isolate
 Purity Test
Under UV 254 Under UV 366
nm nm

Isolat Isolate Isolat Isolate

e I-A II-5B e I-A II-5B
Fase gerak 1 n-heksan : etil asetat (7:3)
Fase gerak 2 kloroform : metanol (95:5)
Identification of Isolates
UV-Visible Spectrum of I-A isolate

263
nm
270
nm

323
nm
UV-Visible Spectrum of II-5B isolate

244
nm
222
nm
261
nm 285
nm

353
nm
Infrared spectrum of I-A isolate
Infrared spectrum of II-5B isolate

C-H
C-H
O-H

C=C C-O
Mass spectrum of I-A isolate
Mass spectrum of II-5B isolate
ISOLASI SENYAWA LIRIODENIN
DARI Michelia champaca L.
 Ekstraksi
Serbuk simplisia kulit batang M. champaca
(5,9 kg)

dimaserasi dengan
metanol selama 24 jam

Maserat (23 L)

dipekatkan dengan
penguap vakum putar

Ekstrak kental
{343,39 g (5,82 %)}
24
 Fraksinasi Ekstrak dan Uji Aktivitas Fraksi

Ekstrak Kental
Bagan Proses (201,43 g)
Fraksinasi
Ditambah air suling, dihomogenkan
ECC dengan n-heksana

Fase air Fase n-heksana

ECC dengan etil asetat Dipekatkan

Fase air Fase etil asetat Fraksi n-heksana

(12,32%)
Dikeringkan Dipekatkan

Fraksi air Fraksi etil asetat

(54,13%) (15,86%) 25
 Hasil Uji Aktivitas Inhibitor Topoisomerase Fraksi

Hasil uji aktivitas IC12 (g/mL)

inhibitor topoisomerase Sampel
SC 1140 SC 1353 SC 1138
dan Profil KLT Fraksi n-heksana 1386226 11143 13630
Fraksi etil asetat >8000 542102 279163
Fraksi air >8000 401107 24230
Keterangan: SC : Saccharomyces cereviceae

Profil KLT ekstrak dan fraksi-fraksi hasil ECC

Keterangan: Fasa diam: silika gel GF 254 pralapis; Fasa gerak: campuran
kloroform-metanol (9:1); Sampel: 1. Ektrak, 2.Fraksi n-heksana, 3.Fraksi Etil
asetat, 4. Fraksi air; Pengamatan: a. sinar tampak, b. sinar UV366 nm, c. sinar UV
254 nm
26
 Pencarian senyawa aktif dengan
II
metode bioautografi (contact I
bioautography)
3 4
5
7 2 3 4 1
7 7 7 2
6 6 6 6
5 5 5 5 3 3
4 4 4 NH EA
4 3
3 3
2 3 2 NH EA
1 2 1 2 2
1 1
2
Ax Bx
1 1
1 1
I II

6 3
5 5
4
2
1 1
Hasil KLT fraksi n-heksana dan etil asetat NH EA
Keterangan: Fasa diam silika gel GF 254 pralapis; Fasa NH EA
gerak: I. kloroform-metanol (9:1), II. etil asetat; sampel
1. Fraksi n-heksana, 2. Fraksi etil asetat; Pengamatan a Ay By
dan c pada sinar UV 366 nm, b dan d pada sinar UV 254
nm II I

3
Hasil KLT bioautografi 6 6
Keterangan: Pelat media agar: A. pelat kontrol, B. pelat 1 5 5
1 4
uji. Inokulasi S. cerevisiae: x. galur 1140, y. galur 1353,
z. galur 1138. Sampel: NH. Fraksi n-heksana, EA.
Fraksi etil asetat. Template profil KLT dengan NH EA
NH EA
pengembang: I. campuran kloroform-metanol (9:1), II.
etil asetat. No pita: 1, 2, 4, 5, 6 Az 27Bz
Hasil KLT 7 7
2 2
preparatif
6 1 3 6 1
bioautografi 3

5 4 5 4

Bercak teraktif Ax Bx Cx
bercak ke-5 (Rf 0,68) 2
2
7 3
3
Pengembang: 1
7
1
campuran kloroform- 6
4 4
metanol (9:1) 6
5 5

Fraksi etil asetat Ay By Cy

2 2
7 3 7
3
1 1
6 6
4 4
5 5

Az Bz Cz
Keterangan: Pelat media agar: A. pelat kontrol, B. pelat uji sampel pita fraksi n-heksana, C. pelat uji
sampel pita fraksi etil asetat. Inokulasi S. cerevisiae: x. galur 1140, y. galur 1353, z. galur 1138. 28
 Pemisahan

Fraksi etil asetat

(10,21 g)

Kromatografi Cair Vakum:

Eluen: n-heksana:etil asetat (1:9)
Fase diam: silika Gel H

Sub fraksi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ..15 16 . . . 31 32 33 34

I II III IV V VI VII VIII IX

Fraksi VII
(0,98 g)

29
 Pemisahan Lanjut Fraksi VII
(0,98 g)

Kromatografi Kolom Klasik I:

Eluen: etil asetat-etanol (10:1)
Fase diam: silika Gel 60

Sub fraksi
1...5 6 7 8 9 10 11 12 13 . . . 17 18 . . . 26 27 34 35. . .44 45. . .58 59. . .65 66. . . 72
VII.2
VII.3
VII.1

VII.4

VII.5

VII.7
VII.6

VII.9
VII.8

VII.10

VII.11

VII.12
Kromatografi Kolom Klasik II:
Eluen: etil asetat-etanol (10:1)
Fase diam: silika Gel 60

Sub fraksi
1...3 4 5 6 7 . . . 18 19 . . . 29 30 . . .43 44 . . . 53
VII.7.a

VII.7.g
VII.7.b

VII.7.e
VII.7.d

VII.7.f
VII.7.c

30
 Pemurnian dan uji kemurnian

Fraksi VII.7.d

Rekristalisasi:
Pelarut:kloroform

Isolat MCET51
(30,2 mg)

Profil KLT isolat

Keterangan: A. KLT dengan berbagai pengembang: I.
rentang jarak lebur: kloroform-toluen (0,75:2), II. etil asetat-etanol (10:1), III.
271,5-272,6 C kloroform-metanol (9:1), IV. kloroform-etil asetat (4:6). B.
KLT dua dimensi dengan pengembang arah 1.
kloroform-etil asetat (4:6), 2. kloroform-metanol (9:1).
Fase diam pelat pralapis silika gel GF254. Pengamatan
Isolat MCET51 bercak pada: a. sinar tampak, b. sinar UV 366 nm, c.
sudah murni sinar UV 254 nm
31
 Uji Aktivitas Inhibitor Topoisomerase Isolat
Pengujian dengan metode mechanism-based yeast
bioassay
Hasil Pengujian Aktivitas Inhibitor Topoisomerase dengan Metode
Mechanism-Based Yeast Bioassay

Jamur IC12 (g/mL)

Saccharomyces cerevisiae galur murni 147,2137,79
Saccharomyces cerevisiae 1140 22,151,72
Saccharomyces cerevisiae 1353 24,760,56
Saccharomyces cerevisiae 1138 7,021,85

Saccharomyces
cerevisiae

32
galur murni galur 1140 galur 1353 galur 1138
 Pengujian dengan metode enzimatik human topoisomerase I (TG1015)
Komponen bahan (kit assay)
Komponen bahan Kelompok
Bufer 10x DNA
Human
Larutan
Pelarut
DNA
pengujian topoisomeras Air suling campuran
TGS supercoiled sampel relaxed
eI
Kontrol negatif
Pencampuran diatas es bath Kontrol positif
Inkubasi suhu 37 C, 30 menit Kontrol pelarut
Ditambah stop buffer terhadap
substrat
Kontrol pelarut
terhadap
Hasil reaksi enzimatik enzim
sampel

Elektroforesis
Pengamatan hasil dalam gel doc
Analisis data (Biodoc Analyze 2.1)

% inhibitor topoisomerase
7
I

Konsentrasi Aktivitas Inhibitor

(g/mL) Topoisomerase I (%)
Visualisasi pita-pita DNA hasil elektroforesis
Isolat Kamptotesin Keterangan: a. pita hasil pada kelompok kontrol : 1. kontrol negatif, 2. kontrol positif
100 17, 40 28, 09 3. kontrol pelarut terhadap substrat, 4. kontrol pelarut terhadap enzimm\. b. pita
hasil pada sampel isolat MCET51dengan konsentrasi: 5. 100 g/mL, 6. 50 g/mL, 7.
50 18, 41 27, 19 25 g/mL. c. pita hasil pada sampel kamptotesin dengan konsentrasi: 8. 100 g/mL,
9. 50 g/mL, 10. 25 g/mL. Elektroforesis gel agarose 1% dalam bufer 1x TAE pada
25 13, 56 21, 27 33 sinar
tegangan 60 volt selama 2,5 jam sampai migrasi sekitar 80%, diamati dibawah
UV 312 nm
Karakterisasi dan Elusidasi Struktur Isolat MCET51
Penentuan golongan senyawa isolat MCET51

Hasil Penapisan Fitokimia:

Michelia champaca L.
mengandung alkaloid

Hasil uji reaksi warna

Keterangan: a. larutan isolat MCET51 dalam
kloroform-metanol (4:1), b. larutan isolat Diduga isolat MCET51:
MCET51 setelah ditambah pereaksi senyawa golongan alkaloid
Dragendorf

34
 Hasil pengukuran isolat MCET51 dengan spektrofotometer UV-Vis

Menunjukkan puncak serapan pada 205, 248, 268, 309 dan 414 nm
Isolat MCET51 memiliki gugus kromofor dan ikatan rangkap
terkonjugasi pada strukturnya
(Skoog dkk., 1998)

35
 Hasil pengukuran isolat MCET51 dengan spektrofotometer inframerah

Interpretasi sinyal pada bilangan gelombang: dugaan isolat MCET51

3421,1 cm amin/amida (N-H)
-1
sebagai senyawa golongan
3039,26 cm-1 dan 2919,7 cm-1 regang C-H alkaloid lebih dikuatkan
1658,48 cm gugus karbonil (C=O)
-1

1573,63; 1473,35 dan 1419,35 cm-1 C=C aromatik

1307,5; 1261,22; 1226,5 dan 1049,09 cm-1 daerah sidik jari, kemungkinan
C-O atau C-N
36
(Skoog dkk., 1998)
 Hasil pengukuran isolat MCET51 dengan spektrometer 1H-RMI

(1H, m)
(1H, dd, J=2,50 Hz, J=7,30 Hz)

(1H, d, J=6,17 Hz)

(1H, t
(1H, d, J=8 Hz) J=7,30 Hz, J=7,40 Hz)

Struktur isolat MCET51

memiliki 9 atom H

H-Aromatik

(1H, d) (1H, s) (2H, s)

J=5,15 Hz

37
 Hasil pengukuran isolat MCET51 dengan spektrometer 13C-RMI

Struktur isolat MCET51

memiliki 17 atom H

-C=C-
Aromatik/ Alkena

C=O
(keton/aldehid)
131, 28
135, 69

123, 20

38
 Spektrum HSQC isolat MCET51

Interpretasi Sinyal Spektrum HSQC

(ppm) C (ppm) H Interpretasi
102,44 6,36 CH2
103,23 7,16 CH
124,21 7,73 CH
127,32 8,60 CH
128,55 7,56 CH
128,78 8,56 CH
133,88 7,72 CH
144,90 8,86 CH

struktur isolat MCET51 ada 8 atom

C yang terikat H: 7 gugus -CH dan 1
gugus -CH2

39
 Spektrum HMBC isolat MCET51

(ppm) C (ppm) H (ppm) C (ppm) H

103,23* 7,73 132,85 7,72; 8,86 struktur isolat MCET51
108,10 8,60 133,88* 8,56 ada 9 atom C tidak terikat H
123,20 7,16 dan 7,73 135,69 8,86
(C-kwarterner)
124,21* 7,16 dan 8,86 145,39 8,86
127,32* 7,56 147,90 6,36 dan 7,16
128,55* 7,72 dan 8,60 151,71 6,36 dan 7,16 Keterangan: * atom karbon
131,28 7,56 dan 8,60 182,42 8,56 yang terikat dengan atom40H
 Hasil pengukuran isolat MCET51 dengan spektrometer massa

Ion puncak 100% [M+1]+ 276,1426 (m/z)

berat molekul isolat MCET51 yaitu 275,14
Sesuai dengan Liriodenin

41
 Hasil Elusidasi struktur isolat MCET51
Berdasarkan data karakterisasi dan pustaka disimpulkan bahwa:
isolat MCET51 adalah liriodenin (C17H9NO3)

Liriodenin ditemukan pertama kali pada Liriodendron tulipifera L

(Magnoliaceae) (Buchanan dan Dickey, 1960).

Struktur liriodenin 42
 Sumber Tulisan
Ahuja, S. (2003): Separation science and technology:
chromatography and separation science, Academic Press, California,
4, 1-27
Harborne, J. B. (1984): Phytochemical methods: guide to modern
techniques of plant analysis, Chapman and Hall, New York, 2, 1-36
Muchtaridi, dkk, Hasil Penelitian Isolasi Senyawa Mangostin dari G.
mangostana
Sarker, S. D. dan Nahar, L. (2012): Natural product isolation,
Humana Press, New York, 3, 1-33, 177-186
Zuhrotun, A. 2017. Aktivitas Inhibitor Topoisomerase Beberapa
Tumbuhan Indonesia Anggota Suku Apocynaceae, Simaroubaceae,
Dan Magnoliaceae Dengan Metode Mechanism-Based Yeast
Bioassay Serta Isolasi Senyawa Aktif Tumbuhan Terpilih. Disertasi
Doktor Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung