A.

CARA MENGEKSTRAKSI ENZIM

Enzim adalah biokatalisator yang berfungsi sebagai katalis dalam proses biologis. Enzim
merupakan sekelompok protein yang mengatur dan menjalankan perubahan-perubahan kimia
dalam sistem biologi. Enzim dihasilkan oleh organ-organ pada hewan dan tanaman yang secara
katalitik menjalankan berbagai reaksi, seperti hidrolisis, isomerasi,adisi, transfer radikal,
pemutusan rantai karbon. Enzim berfungsi sebagai katalisator (meningkatkan kecepatan reaksi
kimia). Enzim juga dapat menurunkan atau memperkecil energi aktivasi atau reaksi kimia. Dalam
reaksi tersebut enzim mengubah senyawa yang selanjutnya disebut substrat menjadi suatu senyawa
yang baru yaitu produk, namun enzim tidak ikut berubah dalam reaksi tersebut. Setiap enzim
memiliki aktivitas maksimum pada suhu tertentu, aktivitas enzim akan semkain meningkat dengan
bertambahnya suhu hingga suhu optimum tercapai. Setelah kenaikan suhu lebih lanjut akan
menyebabkan aktivitas enzim menurun.
Ekstraksi merupakan suatu proses pemisahan zat berdasarkan perbedaan kelarutannya
terhadap dua cairan yang tidak saling melarutkan, biasanya air dan yang lainnya pelarut organik.
Ekstraksi merupakan metode pemisahan dengan melarutkan bahan campuran dalam pelarut yang
sesuai. Dasar metode pemisahan ini adalah kelarutan bahan dalam pelarut tertentu.
Ekstraksi enzimatik menggunakan enzim untuk mendegradasi dinding sel dengan air
berfungsi sebagai pelarut, ini membuat fraksinasi minyak jauh lebih mudah.
Enzim protease merupakan enzim golongan hidrolase yang akan memecah protein menjadi
molekul yang sederhana. Enzim protease memiliki dua proteasw yang menngandung proteinase
dan peptidase. Enzim protease berfungsi mengkatalisis hidrolisis ikatan peptida pada protein.
Metode ekstraksi enzim merupakan salah satu faktor penting yang perlu diperhatikan
dalam memproduksi enzim. Ekstraksi enzim dapat dilakukan dengan prinsip bahwa protein enzim
dapat diendapkan degan penambahan aseton, etanol, sodium sulfat, atau ammonium sulfat.
Ekstraksi enzim biasanya dengan menggunakan pelarut organik, namun terkadang juga bisa
menggunakan pelarut organik sebagai pemurni dengan prinsip sama dengan ekstraksi.
Dalam jurnal teknologi pertanian vol.15 No.3 2014 yang berjudul “Ekstraksi Dan Karakterisasi
Enzim Protease Dari Daun Kelor (Moringa oliefera Lamk.):, dijelaskan proses ekstraksi enzim
dari daun kelor adalah sebagai berikut :

1
Bahan : Alat :
 Daun kelor (Moringa oliefera  Timbangan digital (adventure pro
Lamk) yang berada di tengah- av412
tengah tangkai dan warnanya  Blender (signora), glassware
masih hijau berumur lebih dari 4 (pyrex)
bulan.  Sentrifuse dingin (thermo
 KH2PO4 scientifis/ sl40).
 Akuades

Prosedur ekstraksi :

Daun kelor ditimbang sebanyak 100 gram (dipisahkan

dari tangkainya dan dicuci)

Dimasukkan ke dalam blender dan ditambahkan 200 ml

buffer kalium fosfat 100 mM pH 7.0 yang mengandung

10 stabilisator

Homogenisasi

Homogenat disaring melalui sepotong kain tipis dan

diambil filtratnya

Filtrat disentrifugasi pada 10000 rpm suhu 4°C selama

30 menit

2
 Aktivitas proteolitik supernatan diukur dan dibandingkan

dengan kontrol (tanpa stabilisator ) untuk menentukan

stabilisator yang paling efektif

Stabilisator yang terkandung pada buffer kalsium fosfat:
A1 = Asam Askorbat 0.1% E3 = EDTA 15 mM
A2 = Asam Askorbat 0.2% A1E1 = Asam Askorbat 0.1 % dan EDTA 5 mM
A3 = Asam Askorbat 0.3% A2E2 = Asam Askorbat 0.2 % dan EDTA 10 mM
E1 = EDTA 5 mM A3E3 = Asam Askorbat 0.3 % dan EDTA 15 mM
E2 = EDTA 10 mM

Pemurnian parsial enzim protease dari daun kelor dilakukan menggunakan garam ammonium
sulfat dengan tingkat kejenuhan 60%. Setelah didapatkan pengendapan protein dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan yang
didapatkan didialisis menggunakan kantong dialisis yang memiliki MWCO (Molecular Weight
Cut Off) 12 – 14 kDa.

Tujuan dilakukannya sentrifugasi yaitu untuk memisahkan ekstrak murni dari serat-serat kasar.

B. FUNGSI ENZIM
Fungsi enzim protease dalam bidang kesehatan antara lain:
 Pembekuan darah  Pembentukan tulang
 Kekebalan tubuh  Daur ulang protein seluler yang tidak
 Pematangan prohormone lagi diperlukan.

C. CARA MENGIDENTIFIKASI SENYAWA

Pengukuran aktivasi protease ini menggunakan metode Bregmeyer dan Gasal
(1983). Prinsip kerja dari metode ini yaitu kesein yang berfungsi sebagai substrat akan dihidrolisis
oleh protease dengan bantuan air menjadi peptida dan asam amino. Enzim protease merupakan
enzim yang berperan dalam reaksi pemecahan protein. Enzim protease sangat mudah enzim yang
kompleks dan hanya dapat mengkatalisis zat ynag mengandung
protein;misalnya:kasein,albumin,dan lain-lain (Ward,1983).

3
 Laju pembentukan peptida dan asam amino tersebut dapat dijadikan tolak ukur
aktivitas katalis protease.Asam amino yang terbentuk harus dipisahkan ini dilakukan dengan
penambahan TCA. Penambahan TCA ini sekaligus menginaktifkan enzim protease. Asam amino
tirosin dan triptopan yang larut dalam TCA akan bereaksi dalam reagen folin menghasilkan warna
biru. Warna yang terbentuk diukur absorbansinya pada daerah sinar nampak 578 nm dengan alat
spektrofotometer. Besarnya serapan berbanding lurus dengan konsentrasi protein yang
terhidrolisis (Sumarlin,2010).Asam amino yang dihasilkan dari hidrolisis oleh protease,
dipisahkan dari protein yang belum terhidrolisis menggunakan TCA (Tricloro Acetic Acid). Asam
amino dan peptida akan di larutkan dengan TCA, sedangkan protein yang memiliki bobot molekul
yang besar akan mengendap.
Pengukuran aktivitas enzim protease diperlukan dengan membuat larutan standar
tirosin yang digunakan untuk pembuatan linier yang nantinya akan diinterpolasikan dengan nlai
absorbansinya yang diperoleh .Torosin merupakan asam amino aromatik yang dapat menyerap
pamjang gelombang 275 nm. Sebagai larutan standar dalam uji aktivitas protease untuk mengukur
aktivitas protease dalam memecah protein menjadi asam amino.
Uji aktivitasi protease dilakukan menurut Baehaki (2011) yaitu dengan cara bakteri
yang memiliki nilai positif dari uji kualitatif ditumbuhkan pada media pertumbuhan yaitu Nuriebt
Broth (NB).Kemudian dilihat kemampuan bakteri proteolitik dalam membenntuk zona bening di
sekitar isolat yang ditumbuhkan dalam media agar skin susu.
Menurut Pakpahan (2009),Susu merupakan media yang sesuai untuk pertumbuhan
bakteri karena mengandung banyak nutrient. Kasein merupakan protein susu yang terdiri dari
fosfoprotein yang berikatan dengan kalsium membentuk garam kalsium yang disebut kalsium
kalsenat. Molekul ini sangat besar dan tidak larut dalam air serta membntuk koloid. Suspensi ini
berwarna putih serta mampu diamati secara langsung saat disuspensikan dalam kultur media
padat. Zona bening yang terbentuk di sekitar koloni merupakan tanda hilangnya partikel kasein di
media susu. Adanya enzim proteolitik ekstraseluler bakteri,kasein akan terhidrolisis menjadi
peptida-peptida dan asam amino larut. Enzim ekstraseluler ini ( diantaranya berasal dari Bacillus
sp) sangat efisien dalam memecah berbagai karbohidrat, lipid, dan protein rantai panjang menjadi
unit-unit rantai pendek atau senyawa-senyawa yang lebih sederhana.

4
 D. JENIS SENYAWA
Berdasarkan komponen sisi aktifnya protease dipiih menjadi empat grup (Whitaker,1994 dan
Rao, dkk, 1998).
A. Grup pertama protease serin (E.C.3.4.16 dan E.C.3.4.22) yang
o Memiliki residu serin pada sisi aktifnya.
o Golongan protease serin memiliki asam amino serin pada sisi katalitiknya,
golongan ini terdiri dari dua kelompok yang berbeda.
o Kelompok kimotripsin yang meliputi ezim-enzim mamalia dan kelompok subtilisin
yang meliputi enzim bakteri.
o Contoh protease serin adalah tripsin, kimotripsin dan elastase (Fersht, 1985).
B. Grup kedua adalah protease sistein (E.C.3.4.18 dan E.C.3.4.22)
o Mempunyai gugus SH pada sisi aktifnya
o Sifat katalitik kelompok enzim ini ditentukan oleh asam amino sistein.
o Mempunyai aktivitas optimal pada pH netral.
o Sangat dipengaruhi oleh logam pengkelat.
o Contoh enzim ini adalah bromelin, papain dan katerpin(Sadikin, 2002).
C. Golongan ketiga adalah protase asam (E.C.3.4.23)
o Memiliki residu asam aspartat pada sisi aktifnya.
o Memiliki urutan asam amino yang kaya akan aspartat dan glutamat. Asam aspartat
diperlukan keberadaannya ditempat interaksi dengan molekul.
o Protease aspartat sering disebut juga protease karboksil, karena memerlukan gugus
karboksil bebas dalam residu asam amino tertentu yang ada di bagian enzim
tersebut berinteraksi dengan protein substrat dan memecahnya.
o Enzim ini bekerja pada pH rendah kisaran 2-6 dan memiliki isolitik pada selang pH
3-5.
o Contoh enzim ini adalah enzim-enzim pencernaan seperti pepsin, kimosin dan
renin.
D. Golongan keempat adalah protease metal (E.C.3.4.17 dan E.C.3.4.2)
o Aktivitasnya bergantung pada ikatan yang kuat pada kation divalen.
o Enzim ini berperan penting dalam perusakan rawan sendi dalam penyakit-penyakit
sendi(Sadikin, 2002).

5
 o Kelompok metaloprotase Zn, merupakan salah satu kelompok yang sering
ditemukan pada bakteri dan jamur (Ferdian, 2006).

E. STRUKTUR SENYAWA

Struktur Protease
Protease disebut juga
peptidase atau proteinase, merupakan
enzim golongan hidrolase yang akan
memecah protein menjadi molekul
yang lebih sederhana, seperti menjadi
oligopeptida pendek atau asam amino,
dengan reaksi hidrolisis pada ikatan
peptide. Enzim ini diperlukan oleh
semua mahkluk hidup karena bersifat
esensial dalam metabolism protein.
Protein ini memiliki banyak struktur
sekunder beta-sheet dan alpha-helix yang sangat pendek (Poliana, 2007).