Optimasi Teknik Ekstraksi Protein Daun Tanaman Padi

(Oryza sativa L.)

Susianti
Divisi Fisiologi Molekular, Aktivitas Biologi Laboratorium Sentral Universitas Padjadjaran,
Jl. Bandung – Sumedang Km. 21
[email protected]

ABSTRAK

Ekstraksi protein adalah salah satu teknik dasar dalam bidang biologi molekular untuk
mengisolasi protein dari berbagai jenis bahan biologi seperti sel, bakteri, jaringan hewan dan
tanaman. Teknik ini merupakan metode yang sederhana dalam pengerjaannya namun paling
penting sebagai titik awal untuk pemurnian protein atau tahapan analisis proteomik berikutnya.
Ekstraksi protein dari jaringan hewan atau sel cenderung lebih sederhana dan mudah karena
struktur dari membran sel yang tidak terlalu sulit untuk dihancurkan. Sedangkan, untuk
melakukan ekstraksi protein yang berasal dari tanaman lebih sulit dan membutuhkan
protocol/modifikasi khusus. Dalam implementasinya pada penelitian tertentu khususnya yang
berkaitan dalam bidang pertanian dan farmasi untuk mempelajari ekstraksi protein dari tanaman
belum ada standard baku optimal di Universitas Padjadjaran. Ada beberapa faktor seperti
temperatur, larutan dapar ekstraksi, khelat, dan detergen yang digunakan harus diperhatikan
ketika melakukan ekstraksi protein tumbuhan. Oleh karena itu, proses optimasi menjadi hal yang
penting untuk mendapatkan lysate protein yang terbaik. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan
optimasi proses ekstraksi protein dari tanaman. Daun tanaman padi (Oryza sativa L.) diekstraksi
menggunakan modifikasi larutan dapar ekstraksi dan dilakukan kuantifikasi protein serta
pemisahan protein menggunakan elekroforesis gel poliakrilamida sebagai tolak ukur keberhasilan
proses ekstraksi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa protein dari daun tanaman padi dapat
terekstraksi dengan baik terlihat dari hasil kuantifikasi protein yang didapatkan sebesar 2.472,5
mg/L, dan hasil elektroforesis gel poliakrilamida dimana protein terpisah sesuai dengan ukuran
proteinnya. Optimasi teknik ekstraksi protein dengan modifikasi larutan dapar ekstraksi menjadi
teknik yang sederhana, efisien dan efektif untuk mengekstrak protein total dari daun tanaman
padi.

Kata kunci: ekstraksi, protein, tanaman padi, elektroforesis

Pendahuluan karakterisasi dan menghitung tingkat

ekspresi protein oleh sel atau jaringan
Padi (Oryza sativa L.), salah satu
hewan maupun tanaman (Gulcicek, et al.
tanaman pangan terpenting di dunia yang
2005). Waruwu (2013) menyatakan
menjadi makanan pokok jutaan orang
bahwa identifikasi protein secara
khususnya di benua Asia dan Afrika
kuantitatif dapat diamati melalui analisis
(Wu, et al. 2014). Seiring dengan
profil protein yang didapat dari hasil
bertambahnya konsumsi untuk bahan
ekstrasi protein, yang merupakan aspek
pangan, peningkatan kualitas padi selalu
paling penting dalam menentukan
menjadi tantangan bagi para peneliti
keberhasilan analisis proteomik (Vilhena,
tanaman. Banyak penelitian telah
et al. 2015). Proses ekstraksi protein dari
dilakukan baik studi genomik maupun
sel atau jaringan hewan cenderung lebih
studi proteomik. (Zhang, et al. 2017).
sederhana dan mudah karena struktur dari
Dalam beberapa tahun terakhir, studi membran sel yang tidak terlalu sulit
proteomik telah mengalami untuk dihancurkan sedangkan untuk
perkembangan, baik untuk identifikasi, melakukan ekstraksi protein yang berasal

1
dari tanaman lebih sulit, karena tanaman dari 57 gram Urea, 4 mL Triton-X,
mengandung banyak protease dan 0,4844 gram Tris-Base, 0,2314 gram
senyawa pengganggu seperti DTT, dilarutkan dalam 100 mL akuades),
polisakarida, lipid, polifenol, dan Polivinilpirolidon (PVP), Protease
metabolit sekunder yang lainnya Inhibitor (PI), Bovine Serum Albumin
(Lledías, et al. 2017 & Rodrigues, et al. (BSA), Reagen Lowry, Folin Ciocalteu,
2012). Meskipun beberapa protokol Nitrogen Cair, Ladder Protein,
ekstraksi protein tercantum dalam banyak Poliakrilamida 30%, Running Buffer
literatur, namun tidak ada protokol (terdiri dari 1,5 gram Tris-Base, 7, 2
ekstraksi protein yang bersifat universal gram Glisina, dan 0,5 gram SDS),
untuk mengekstrak semua jenis protein, Sample Buffer, Sodium Dodecyl Sulfate
sehingga efektivitas teknik ekstraksi (SDS) 10%, Stacking Buffer, Resolving
protein sangat bergantung pada struktur Buffer, Amonium Persulfat, TEMED,
protein dan karakteristik kimianya Coomassie Blue, Metanol, Asam Asetat
(Abdullah, et al. 2017). Glasial.

Dalam implementasinya pada penelitian Metode Pengerjaan

tertentu khususnya yang berkaitan dalam
Pengambilan Sampel
bidang pertanian dan farmasi untuk
mempelajari ekstraksi protein dari Daun tanaman padi (Oryza sativa L.)
tanaman di Universitas Padjadjaran berumur 30 hari dibersihkan dan
belum terstandarisasi dengan optimal. dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil
Beberapa faktor seperti temperatur, sebelum digunakan (Islam, et al. 2004
larutan dapar lisis, khelat, dan detergen dan Wang, et al. 2008).
yang digunakan harus diperhatikan ketika
melakukan ekstraksi protein. Oleh karena Ekstraksi Protein
itu, proses optimasi ekstraksi menjadi hal Proses ekstraksi protein menggunakan
yang penting untuk mendapatkan kualitas metode Lin & Chang (2014) yang telah
lysate protein yang terbaik. Tujuan dari dimodifikasi. Daun tanaman padi
penelitian ini untuk melakukan optimasi sebanyak 1,5 gram dihaluskan dengan
proses ekstraksi protein dari daun mortar dan alu menggunakan nitrogen
tanaman padi (Oryza sativa L.) cair hingga halus merata. Ekstraksi
menggunakan modifikasi larutan dapar dilakukan pada suhu 4○C. Daun tanaman
ekstraksi dan dilakukan kuantifikasi padi yang telah halus ditambahkan 5 mL
protein serta pemisahan protein dapar ekstraksi, ditumbuk hingga
menggunakan elekroforesis gel berbuih. Kemudian ditambahkan 0,5 g
poliakrilamida sebagai tolak ukur PVP sambil ditumbuk, dan ditambahkan
keberhasilan proses ekstraksi. kembali 5 mL dapar ekstraksi, ditumbuk
hingga berbuih. Lalu ditambahkan 25 μL
Bahan dan Metode protease inhibitor dan 5 mL dapar
Bahan habis pakai ekstraksi. Campuran ditumbuk hingga
berbuih. Setelah itu, campuran
Bahan-bahan yang digunakan
dipindahkan kedalam tabung 1,5 mL dan
meliputi larutan Dapar Ekstraksi (terdiri
disentrifugasi 20 menit dengan kecepatan
dari 23,96 gram Sukrosa, 6,05 gram Tris-
15.000 rpm pada suhu 4○C. Filtrat yang
Base, 10 mL 0,5M EDTA pH 8,0, 0,75
diperoleh kemudian disaring dan
gram Kalium Klorida, 250 µL Asam
dipindahkan kedalam tabung 1,5 mL
Klorida, 2 mL 2-merkaptoetanol (2-ME),
baru, ditambahkan dapar pengendap
dilarutkan dalam 100 mL akuades),
dalam filtrat dengan perbandingan 3:1
larutan Dapar Pengendap (terdiri dari 1,4
dan diinkubasi pada -20○C selama 4 jam.
gram Amonium Asetat, 140 µL 2-
Setelah itu, campuran disentrifugasi pada
merkaptoetanol, dilarutkan dalam 200
15.000 x rpm 4○C selama 20 menit. Pelet
mL metanol), Larutan Dapar Lisis (terdiri

2
dicuci sebanyak 2 kali dengan 1,8 mL dipindahkan kedalam wadah, dicuci
dapar pengendap. Kemudian pelet dengan akuades 3x5 menit. Kemudian
diresuspensi menggunakan dapar lisis dilakukan pewarnaan dengan
secukupnya lalu ditambahkan protease menggunakan Coomassie Blue selama 1
inhibitor 1:1.000. Lysate protein jam. Setelah itu, dilakukan penghilangan
disimpan dalam freezer -80○C sebelum warna Coomassie Blue pada gel
digunakan untuk analisis protein menggunakan campuran metanol, asam
selanjutnya. asetat glasial dan akuades selama
semalam.
Kuantifikasi Protein
Hasil dan Pembahasan
Lysate protein sebanyak 0,5 mL
dimasukkan kedalam tabung reaksi, Ekstraksi Protein
ditambahkan 5 mL reagen Lowry,
Daun tanaman padi dihaluskan
dihomogenkan menggunakan vortex
menggunakan nitrogen cair hingga
kemudian diinkubasi selama 10 menit
menjadi serbuk dengan tujuan untuk
pada suhu 50○C. Setelah itu, campuran
memperluas permukaan, mengurangi
ditambahkan larutan Folin Ciocalteu 1:1
terjadinya proteolisis dan degradasi
sebanyak 0,5 mL, diinkubasi kembali
protein sehingga difusi sampel dengan
selama 10 menit pada suhu 50 ○C.
pelarut pada saat ekstraksi dapat berjalan
Absorbansi sampel diukur menggunakan
dengan optimal (Abdullah, et al. 2017).
spektrofotometer pada panjang
Proses ekstraksi protein dilakukan
gelombang 630 nm. Konsentrasi sampel
menggunakan metode Lin & Chang
dihitung dengan menggunakan kurva
(2014) yang telah dimodifikasi dengan
standar protein BSA.
penghilangan bahan kimia fenol dalam
larutan dapar ekstraksi, penghilangan
Elektroforesis Gel Poliakrilamida
tahapan pencucian pelet menggunakan
Lysate protein dimasukkan kedalam aseton dan pengeringan vakum. Fenol
tabung 1,5 mL, ditambahkan sample digunakan dalam larutan dapar ekstraksi
buffer dengan perbandingan 1:1. sebagai pengikat protein dan untuk
Campuran didenaturasi pada suhu 95○C, mengurangi degradasi protein yang
kemudian segera dinginkan (snap freeze) dihasilkan dari aktivitas proteolitik dan
sebelum dilakukan elektroforesis. Setelah kemudian fase fenol dimurnikan dengan
itu, gel disiapkan. Sisir yang menempel larutan dapar pengendap. Menurut
pada gel dilepas, kemudian gel Faurobert, et al. (2007) metode ekstraksi
dimasukkan kedalam alat elektroforesis protein menggunakan fenol memiliki
dan running buffer dituangkan hingga aktivitas yang baik untuk mengurangi
batas maksimal yang tertera pada alat interaksi molekuler antara protein dan
elektroforesis. Sampel (hasil denaturasi bahan lain, namun fenol memiliki sedikit
protein) dimasukkan 15 μL kedalam kecenderungan untuk melarutkan
sumur gel yang telah disiapkan. Voltase polisakarida dan asam nukleat
kontrol diatur selama 30 menit dengan (Chatterjee, et al. 2012). Selain itu, fenol
tegangan 80 V, diteruskan sampai semua termasuk kedalam bahan berbahaya yang
sampel terkumpul pada batas bawah bersifat racun karena sulit diuraikan oleh
stacking gel. Setelah sampel memasuki organisme sehingga dalam penelitian ini
batas separating gel, voltase dinaikkan larutan dapar ekstraksi dibuat tanpa
menjadi 100 V selama 1 jam sampai penambahan fenol. Sedangkan
sampel menyentuh dasar gel. penghilangan tahapan pencucian pelet
menggunakan aseton dan pengeringan
Pewarnaan Protein (Coomassie Blue) vakum bertujuan untuk mencengah
Untuk melihat keberhasilan pemisahan hilangnya protein yang lebih banyak pada
protein, gel hasil elektroforesis saat ekstraksi dan efisiensi waktu
ekstraksi protein. Pencucian dengan

3
aseton biasanya dilakukan untuk 0.6
membantu menghilangkan sisa garam,

Absorbansi
0.4 f(x) = 0.09 x − 0.15
polifenol, dan juga untuk mengurangi 0.2
R² = 0.86
terjadinya degradasi protein (Rodrigues,
0
et al. 2012). Pada dasarnya, larutan dapar 0 1 2 3 4 5 6 7 8
ekstraksi yang digunakan mengandung Konsentrasi BSA (mg/L)
Polivinilpirolidon (PVP) yang berfungsi
sebagai antioksidan, membentuk ikatan
hidrogen dengan polifenol untuk Gambar 1. Kurva Standar BSA menggunakan
Metode Lowry
menghilangkan senyawa polifenol dalam
sampel. Adapun tahap sentrifugasi Elektroforesis Gel Poliakrilamida
bertujuan untuk membantu proses
pemisahan antara protein (filtrat) dan Untuk melihat protein daun tanaman
senyawa non protein (endapan). padi, digunakan teknik elektroforesis gel
poliakrilamida. Teknik ini biasa
Selanjutnya, dapar pengendap digunakan untuk memisahkan protein
ditambahkan kedalam filtrat untuk berdasarkan ukuran molekulnya
mengendapkan semua protein. Pelet yang (Mittelmann, et al. 2013). Lysate protein
didapatkan biasanya tidak berwarna, yang diperoleh kemudian ditambahkan
yang menunjukkan bahwa tidak ada sample buffer lalu didenaturasi pada suhu
kontaminasi dari senyawa non protein 95○C. Sample buffer mengandung 2-
(Wang, et al. 2008). Setelah itu, merkaptoetanol yang berfungsi untuk
dilakukan pencucian menggunakan dapar memecah ikatan disulfida protein sampel.
pengendap untuk memastikan semua Pada saat elektroforesis berlangsung,
protein terendapkan dan untuk sampel akan bermigrasi melalui gel dari
menghilangkan sisa senyawa non protein. elektroda yang bermuatan negatif menuju
Selanjutnya, pelet diresuspensi positif. Protein yang memiliki berat
menggunakan dapar lisis dan molekul kecil akan bermigrasi lebih cepat
ditambahkan protease inhibitor untuk dibandingkan dengan protein dengan
menginaktivasi protease pada lysate berat molekul yang tinggi.
protein.
Pewarnaan Gel (Coomassie Blue)
Kuantifikasi Protein
Pemisahan protein hasil elektroforesis
Pengukuran jumlah protein dilakukan dapat dideteksi dengan metode
dengan metode Lowry. Prinsip metode pewarnaan gel. Pada penelitian ini, gel
ini berdasarkan reaksi biuret, dimana hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan
ikatan peptida protein bereaksi dengan menggunakan Coomassie Blue. Metode
tembaga (II) yang direduksi menjadi pewarnaan ini bekerja dalam pH asam
tembaga (I) dalam kondisi basa, dimana terjadi pembentukan daya tarik
kemudian bereaksi dengan larutan Folin- elektrostatik (bersamaan dengan gaya
Ciocalteau, menghasilkan yang warna van der Walls) antara kompleks molekul
biru yang diukur dengan pewarna dari Coomassie Blue dan
spektrofotometer menggunakan larutan kelompok asam amino protein (Nehete,
standar BSA (Waterborg, 2002). Hasil et al. 2013).
kuantifikasi protein dari ekstrak daun
tanaman padi yang didapat sebesar Kualitas protein dari daun tanaman padi
2.472,5 mg/L. secara keseluruhan baik, terlihat dari
hasil perwarnaan gel menggunakan
Coomassie Blue pada gambar 2.

4
 deltoidea. J Fundam Appl Sci, 9(2), 908-
924.
Chatterjee, M., Sumanti, G., Anirban, B.,
& Sampa, D. (2012). Optimization of an
Efficient Protein Extraction Protocol
Compatible with Two-Dimensional
Electrophoresis and Mass Spectrometry
M 1 2 3 4 5 6 7
from Recalcitrant Phenolic Rich Roots of
90 kDa - Chickpea (Cicer arietinum L.)
International Journal of Proteomics.
50 kDa -
Volume 2012, Article ID 536963.
34 kDa - Faurobert, M., Pelpoir E., & Chaïb, J.
(2007). Phenol Extraction of Proteins for
26 kDa -
Proteomic Studies of Recalcitrant Plant
20 kDa - Tissues. In: Thiellement H., Zivy M.,
Damerval C., Méchin V. (eds) Plant
Proteomics. Methods in Molecular
Biology, vol 355. Humana Press.
Gambar 2. Pemisahan protein daun tanaman padi pada Gulcicek, E. E., Christopher, M.,
Gel Poliakrilamida 12% (M:Marker DNA , 1-7:Lysate
protein daun tanaman padi) Colangelo, W. McMurray, Kathryn, S.,
Kenneth, W., Terence, W., & Hongyu, Z.
Kesimpulan (2005). Proteomics and the Analysis of
Proteomic Data: An Overview of Current
Optimasi teknik ekstraksi protein dengan Protein-Profiling Technologies Curr
modifikasi larutan dapar ekstraksi Protoc Bioinformatics. July; 0 13:1-40.
menjadi teknik yang sederhana, efisien
dan efektif untuk mengekstrak protein Islam, N., M. Lonsdale, N. M.
total dari daun tanaman padi. Dari hasil Upadhyaya, T. J. Higgins, H. Hirano &
penelitian menunjukkan bahwa protein R. Akhurst. (2014). Protein extraction
dari daun tanaman padi (Oryza sativa L.) from mature rice leaves for two-
dapat terekstraksi dengan baik terlihat dimensional gel electrophoresis and its
dari hasil kuantifikasi protein yang application in proteome analysis.
didapatkan sebesar 2.472,5 mg/L, dan Proteomics, 4, 1903–1908.
hasil elektroforesis gel poliakrilamida Lin, D. & Chang, S. (2014). Extraction of
dimana protein terpisah sesuai dengan Total Proteins from Rice Plant. Bio-
ukuran proteinnya. protocol. Vol 4, Iss 21, Nov 05.
Ucapan Terima Kasih Lledías, F., Felipe H., Viridiana R.,
Abisaí G.M., Gladys I. C., Jorge N.S.
Penelitian ini didanai oleh Hibah Internal (2017). A Rapid and Reliable Method for
Unpad dalam skema Hibah RTKU Total Protein Extraction from Succulent
Gelombang I Tahun 2018. Penulis ingin Plants for Proteomic Analysis. Springer
mengucapkan terima kasih kepada Ronny Science+Business Media New York.
Lesmana., dr., M.Kes., AIFO., PhD. atas
bimbingannya selama penelitian ini Mittelmann, N. Á., Eva, D. S., Eva,
berlangsung. M.G.C., Azahara, M. M., Juan, C. P. C.,
Sandra, P. L., Estefanía, S. C., Cristina,
Daftar Pustaka T. J., Carmelo, R., Francisco, J. C., &
José, M. P. (2013). Polyacrylamide gel
Abdullah, F. I., L. S., Chua & Z. Rahmat. electrophoresis: a powerful tool in the
(2017). Comparison of protein extraction food-processing sector. High School
methods for the leaves of Ficus

5
Students of Agricultural Science proteomics analysis. J. Sep. Sci., 31,
Research. Vol III. 2032 – 2039.
Nehete, J. Y., Rajendra, S. B., Minal, R. Waruwu, M. (2013). Analisis Profil
N., & Sonali, R. G. (2013). Natural Protein. Diakses 6 Agustus 2018, dari:
proteins: Sources, isolation, http://matiusnana.blogspot.com/2013/12/
characterization and applications. analisis-profil-protein.html.
Pharmacognosy Reviews, Vol 7, Issue
Waterborg, J. H. (2002). The Lowry
14.
Method for Protein Quantitation. In:
Rodrigues, E. P., Adalgisa, R. T., Jesiane, Walker J.M. (eds) The Protein Protocols
S. da Silva B., Luciano, H., & Handbook. Humana Press.
Mariangela, H. (2012). A simple,
Wu, J., Dong, Y. L., Yiming, W., S. T.
economical and reproducible protein
Kim, Seong-Bum Baek, S. G. Kim, & K.
extraction protocol for proteomics studies
Y. Kang. (2014). Protein profiles
of soybean roots. Genetics and Molecular
secreted from phylloplane of rice leaves
Biology, 35, 1 (suppl), 348-352.
free from cytosolic proteins: Application
Vilhena, M. B., Monica, R. F., Daiana, to study rice-Magnaporthe Oryzae
S., Giselle, C. & Ricardo, A. A. (2015). interactions. Physiological and Molecular
Evaluation of protein extraction methods Plant Pathology, 88, 28-35.
for enhanced proteomic analysis of
Zhang,Y., Liang T., Xiaojun L., Leilei L.,
tomato leaves and roots. Anais da
Weixing C., & Yan Z. (2017). Modeling
Academia Brasileira de Ciências, 87(3):
the leaf angle dynamics in rice plant.
1853-1863.
PLoS ONE 12(2): e0171890.
Wang, W., Fuju, T., & Shaoning, C.
(2008). Optimizing protein extraction
from plant tissues for enhanced