KROMATOGRAFI

Dra. Yetri Elisya, M.Farm, Apt

 Pendahuluan
Pengertian Kromatografi
Chromatos + graphos → Kromatografi
(warna) (menulis)
Komatografi adalah :
1.Teknik untuk memisahkan campuran menjadi
komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik
masing-masing komponen.
2.Metoda pemisahan senyawa kimia yang didasarkan pada
perbedaan distribusi senyawa tersebut diantara dua fasa
(fase gerak dan fase diam)

Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati

kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki
ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak
lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah
Jenis Kromatogarfi Berdasarkan fase
gerak

Gas chromatography Liquid chromatography.

HPLC LLC TLC

GLC GSC
Eksklusi Ion Exchange
Jenis-jenis Kromatografi Berdasarkan Teknik Kerja

Kromatografi Kromatografi Kromatografi

Kertas Kolom Kromatografi Gas
Lapis Tipis
 A. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas adalah kromatografi
yang menggunakan kertas selulosa murni
yang mempunyai afinitas besar terhadap air
atau pelarut polar lainnya.

Kromatografi kertas digunakan untuk

memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponennya.
Prinsip Kerja Kromatografi Kertas
Pelarut bergerak lambat pada
kertas, komponen-komponen
bergerak pada laju yang berbeda
dan campuran dipisahkan
berdasarkan pada perbedaan
bercak warna.
Cara penggunaan Kromatogarfi kertas
1. Kertas yang digunakan adalah Kertas Whatman No.1, Tebal
kertas 0,16 mm
2. Digunakan untuk pemisahan senyawa polar
3. Sampel diteteskan pada garis dasar kromatografi kertas.
4. Kertas digantungkan pada wadah yang berisi pelarut dan
terjenuhkan oleh uap pelarut.
5. Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan penguapan
pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada
kertas, penjenuhan selama 24 jam.
6. Waktu pengembangan : 30 menit – 12 jam
Gambar Kromatografi Lapis Tipis
Gambar Kromatografi
Kertas
B. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara
pemisahan campuran senyawa menjadi
senyawa murninya dan mengetahui
kuantitasnya yang digunakan.

Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk :

1. memisahkan senyawa – senyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan
hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan
kromatografi kertas.
2. memisahkan substansi campuran menjadi
komponen-komponennya
Kelebihan KLT
1. Lebih bebas memilih fase gerak, deteksinya lebih spesifik
2. Proses kromatografinya mudah diikuti dan dapat
dihentikan setiap saat, waktu lebih singkat
3. Pemisahan lebih tajam
4. Difusi lebih sempit penyebaran bercak lebih sempit
daripada KKT
5. Bisa menggunakan penampak bercak yang korosif
6. Bisa untuk orientasi sistem pelarut yang akan dipakai
dalam kromatografi kolom
7. Kapasitas lebih besar
8. Tanpa harus menggunakan listrik
11
Prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis

KLT menggunakan sebuah lapis tipis silika atau

alumina yang seragam pada sebuah lempeng
gelas atau logam atau plastik yang keras.
Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam.
Fase gerak merupakan pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai.
Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan
warna yang merupakan gabungan dari beberapa
zat pewarna.
Cara Penggunaan Kromatografi Lapis Tipis

Pada cara penggunaan KLT hampir

sama dengan penggunaan
Kromatografi kertas, hanya saja pada
KLT fase diamnya menggunakan plat
gelas/ logam/ Aluminium foil
sedangkan pada kromatografi kertas
menggunakan kertas saring.
Penggunaan KLT
Tujuannya yaitu untuk :
1. Menentukan banyaknya komponen dalam campuran,
2. Identifikasi senyawa,
3. Memantau berjalannya suatu reaksi,
4. Menentukan efektivitas pemurnian,
5. Menentukan dan memantau kondisi yang sesuai untuk
kromatografi kolom,
6. Melakukan screening sampel untuk obat.
Mekanisme KLT

1. Adsorbsi senyawa pada fase diam

2. Kompetisi fase gerak & solut untuk berikatan dengan
fase diam, dimana solut lepas dari permukaan fase
diam => desorbsi
3. Senyawa dielusi oleh fase gerak

15
Faktor retensi

16
 KLT untuk Identifikasi
➢Sebaiknya gunakan plat dengan fase diam yang lebih
tebal
➢Gunakan pipet kapiler terukur volumenya /
microsiringe
➢Totolkan, jika ada senyawa pembanding yang
diketahui kadarnya. Dapat menotolkan sampel secara
bergaris
➢Gunakan lebih dari satu sistem eluen / fase gerak,
gunakan fase diam yang berbeda
➢Jika mungkin gunakan penampak bercak yang khas
KLT untuk Identifikasi
➢Anda dapat gunakan data Rf dari pustaka
sebagai pembanding
➢Hitung luas zona, atau itensitas dari sampel dan
bandingkan dengan senyawa pembanding
➢Sebagai penampak bercak (gunakan UV atau
uap Iod)
➢ Setelah pengembangan, untuk menghitung
intensitas anda bisa gunakan KLT scanner atau
dikerok dan dilarutkan dengan pelarut yang
sesuai dan gunakan spektrofotometer
18
Pelaksanaan KLT
1. Fase Diam
2. Fase Gerak
3. Aplikasi (Penotolan) Sampel
4. Pengembangan
5. Deteksi Bercak
6. Perhitungan Nilai Rf
7. Alternatif Prosedur KLT
 1. Fase Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT
merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 μm.
Penjerap yang paling sering digunakan adalah
silica dan serbuk selulosa, sementara
mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah
adsorpsi dan partisi
Kromatografi yang fase diamnya berupa plat
(kaca, alumnium, plastik) yang dilapisi adsorben
dapat berupa silika, selulosa, alumina dan lain-
lain.
 Silika Gel
Silika gel merupakan silikon oksida Macam – macam Silika Gel :
Setiap atom Si dikelilingi oleh atom O. ▪ Silika gel G
▪ Silika gel S
▪ Silika gel GF254
O ▪ Silika gel H
▪ Silika gel F254

O ▪ Silika gel PF254 + 366

Si
O O
2. Fase Gerak
Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2
pelarut organik karena daya elusi campuran kedua
pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa
sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.
Petunjuk Pemilihan Fase gerak
1. Mempunyai kemurnian yang sangat tinggi
2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa
sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk
memaksimalkan pemisahan.
3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar
seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan
kecepatan migrasi solut yang berarti menentukan nilai Rf.
Penyiapan fase gerak

Fase gerak dimasukkan kedalam wadah fase

gerak (chamber) sebanyak 0,5 cm - 1 cm dari
bawah wadah.

23
3. Aplikasi (Penotolan) Sampel
Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume
sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 μl.
Jika sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-
10 μL maka penotolan harus dilakukan secara
bertahap dengan dilakukan pengeringan antar
totolan.
4. Pengembangan
Sampel yang telah ditotolkan
→ dikembangkan dalam
bejana kromatografi yang
sebelumnya telah dijenuhi
oleh uap fase gerak → Tepi
bagian bawah lempeng tipis
yang telah ditotoli sampel
dicelupkan kedalam fase gerak
kurang lebih 0,5-1 cm.
 5. Deteksi Bercak
Deteksi bercak pada KLt dapat dilakukan
secara kimia dan fisika.
a. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan
mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi
melalui cara penyemprotan sehingga bercak
menjadi jelas.
b. Cara fisika yang dapat digunakan untuk
menampakkan bercak adalah dengan dengan
cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar
ultraviolet
6. Perhitungan Nilai Rf
Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus :

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen

jarak yang ditempuh oleh pelarut

Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa

pustaka menyatakan nilai Rf yang baik yang
menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah
berkisar antara 0,2-0,8.
 7. Altertatif Prosedur KLT
Variasi prosedur pengembangan KLT ini
meliputi KLT 2 dimensi yaitu Pengembangan
kontinyu dan Pengembangan gradient.
PLAT TLC (20X20 cm)
VISUALISASI DENGAN CHARING
C. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah
kromatografi yang
menggunakan kolom sebagai
alat untuk memisahkan
komponen-komponen dalam
campuran.
Prinsip Kerja Kromatografi Kolom
Didasarkan pada absorbsi komponen2
campuran dengan afinitas berbeda terhadap
permukaan fase diam.
Absorben bertindak sebagai fase diam dan
fase geraknya adalah cairan yang mengalir
membawa komponen campuran sepanjang
kolom.
Sampel yang mempunyai afinitas besar
terhadap absorben akan secara selektif
tertahan dan afinitasnya paling kecil akan
mengikuti aliran pelarut.
 Cara Penggunaan Kromatografi Kolom
1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan
melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam
adsorben (bahan penyerap).
2. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara
kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
permukaan atas kolom.
3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus,
masing-masing komponen akan bergerak turun melalui
kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi satu
macam komponen.
4. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan
sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.
Gambar kromatogafi kolom
 D. Kromatografi Gas
Kromatografi gas adalah proses pemisahan
campuran menjadi komponen- komponennya
dengan menggunakan gas sebagai fase
bergerak yang melewati suatu lapisan serapan
(sorben) yang diam.
Prinsip Kerja Kromatografi Gas
Gas pembawa (biasanya menggunakan
helium, argon / nitrogen) dengan tekanan
tertentun dialirkan secara konstan melalui
kolom yang berisi fase diam.
Komponen sampel akan terabsorbsi oleh fase
diam dengan kecepatan berbeda.
 Cara Penggunaan Kromatografi Gas
1. Sampel diinjeksikan ke injektor yang suhunya telah
diatur.
2. Setelah sampel menjadi uap, akan dibawa oleh aliran
gas pembawa menuju kolom.
3. Sehingga komponen akan terabsorbsi oleh fase diam
sampai terjadi pemisahan.
4. Komponen yang terpisah menuju detektor akan
menghasilkan sinyal listrik yang besarnya proporsional.
5. Sinyal listrik tersebut akan diperkuat oleh amplifier.
6. Kromatogram akan dicatat oleh rekorder berupa
puncak.
Gambar Kromatografi gas
 Cara Memelihara Kromatografi
1. Pada kromatografi kertas & kromatografi lapis
tipis, fase diam harus disimpan dalam ruang
tertutup atau di tempat yang kering jauh dari
sumber uap.
2. Pada kromatografi kolom & kromatografi gas
sebelum dan sesudah dipakai harap dicuci
bersih kemudian dikeringkan, lalu disimpan
pada tempat yang aman.
 Referensi
Watson, D.G,2005, Pharmaceutical
analysis. Edisi ke-2, Churchill Livingstone,
Toronto.
Gandjar, IGG & A.Rohman, 2007, Kimia
Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta

39
TUGAS PPT
Kelompok :
1. Kromatografi kertas
2. KLT
3. HPLC
4. GCMS
5. LCMS
Tentang :
Teori, hal-hal penting/masalah,cara/metoda dengan
foto/gambar, dll