LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA

“KROMATOGRAFI KOLOM”

DOSEN PEMBIMBING :

Dr. Aty Widyawaruyanti, Msi

KELAS AB

KELOMPOK 01/JUMAT PAGI

1. Indira Milenia Syafitri 051811133003

2. Nisa’ Musyafaatullah 051811133007

3. Nazila Dwi Kurnia 051811133011

4. Ilham Taufiqi 051811133016

5. Hanifah Yusuf Baraja 051811133019

6. Militan Raushan Fikr 051811133023

7. Devinta Julian Tupenalay 051811133026

8. Farly Avinda 051811133027

DEPARTEMEN FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS AIRLANGGA

2020/2021
A. PENDAHULUAN
Senyawa kimia yang terdapat dalam ekstrak tanaman sifatnya multi komponen
sehingga perlu dilakukan proses pemisahan/isolasi untuk mendapatkan fraksi atau senyawa
murni. Pemisahan senyawa dapat dilakukan dengan beberapa metode, pemilihan metode
tergantung pada sifat fisika kimia dari senyawa yang ingin dipisahkan. Secara umum
kromatografi adalah teknik yang paling banyak digunakan, terutama kromatografi kolom
(Zhang et al, 2018). Prinsip pemisahan senyawa pada kromatografi adalah migrasi senyawa
dari fase diam yang dipengaruhi oleh fase gerak. Pada kromatografi kolom fase diam
dimasukkan atau direkatkan pada kolom dan kemudian fase gerak yang dapat berupa
campuran dari beberapa pelarut organik dialirkan pada kolom dengan kecepatan tertentu.

Kromatografi kolom yang akan dilakukan menggunakan fase diam silica gel. Silica
gel adalah fasa diam polar dengan gugus silanol. Sebelum melakukan proses kromatografi,
perlu diketahui bahwa terdapat 2 metode dalam packing fase diam/silica gel ke dalam kolom,
yaitu (a). Metode basah : silica gel dicampur dengan fase gerak lalu campuran silica gel dan
fase gerak dimasukkan ke dalam kolom. Metode ini yang dipilih dalam praktikum. (b)
Metode kering : silica gel kering dimasukkan dalam ke dalam kolom kemudian fase gerak
dimasukkan ke dalam kolom diulangi berkali - kali hingga semua silica gel terbasahi.

Sampel yang digunakan pada kromatografi kolom adalah ekstrak etanol rimpang
kencur (Kaempferia galanga). Sebelum digunakan pada kromtaografi kolom, ada 2 metode
penyiapan ekstrak, yaitu: (1). Wet loading: sampel dilarutkan dengan sedikit fase gerak, baru
kemudian dimasukkan ke dalam kolom dengan bantuan pipet. (2) Dry loading : sampel
dicampur dengan silika gel dan dihomgenkan sehingga terbentuk ekstrak kering. Jumlah
silika gel yang ditambahkan umumnya 1-2 kali dari berat sampel. Metode dry loading yang
dipilih dalam praktikum.

B. TUJUAN
Tujuan dari praktikum ini adalah mampu menerapkan metode kromatografi kolom
dimulai dari pemilihan fase gerak, preparasi kolom, pelaksanaan kromatografi kolom, dan
monitoring hasil kromatografi kolom dengan KLT dari hasil fraksinasi yang diperoleh pada
proses isolasi senyawa etil para metoksi sinamat (EPMS) dari ekstrak etanol rimpang kencur
(Kaempferia galanga).
C. ALAT dan BAHAN
ALAT :

1. Kolom
2. Bejana KLT
3. Timbangan analitik
4. lampu UV λ 254 nm
5. Pipa kapiler 2 µL
6. Penggaris
7. Labu erlenmeyer
8. Vial
9. Batang pengaduk
10. Alumunium foil
11. Kertas saring
12. Corong
13. Statif dan klem
14. Cawan porselen
15. Karet gelang
16. Spatula
17. Beaker glass

BAHAN

1. Ekstrak etanol rimpang kencur (Kaempferia galanga) 0,5 gram

2. Standar etil para metoksi sinamat (EPMS) qs
3. Pelat KLT silica gel F254
4. Silica gel (70-230 mesh ASTM) 51 gram
5. n-heksana 790 ml
6. Kloroform 60 ml
7. Etil asetat 350 ml
 D. PROSEDUR KERJA
Pemilihan Fase Gerak Untuk Kromatografi Kolom

 Sebelum memasuki Lab, sudah menggunakan APD (Alat Pelindung Diri) yang
lengkap seperti jas lab berlengan panjang, gloves, masker, dan goggle

Siapkan 4 bejana KLT yang diisi dengan 4 Hitung indeks polaritas dari masing-masing
fase gerak yang berbeda, yaitu : campuran fase gerak. Dengan rumus :
𝑃𝑎𝑏= ∅𝑎 𝑥 𝑃𝑎+ ∅𝑏 𝑥 𝑃𝑏
*)
I. N-Heksana 100% Keterangan:
II. N-Heksana – Kloroform (4 : 1) Pab : Polaritas campuran pelarut a dan b
III. N-Heksana – Etil Asetat (5 : 1) ∅ : Rasio pelarut a
IV. Etil Asetat 100% ∅ : Rasio pelarut b
Pa : Polaritas pelarut a
Lalu jenuhkan bejana KLT Pb : Polaritas pelarut b

Totolkan larutan baku Siapkan 10 mL Siapkan 4 plat KLT

larutan baku EPMS dengan ukuran 3 x 10 cm.
EPMS sebanyak 2 dan
ektrak rimpang kencur dan 10 mLlarutan Lalu beri tanda batas
sampel ektrak bawah 1,5 cm dan batas
sebanyak 4 pada
rimpang kencur atas 0,5 cm
masing-masing plat KLT

Buat jarak antar noda 1,5 Monitoring hasil Masukkan plat Eluasi
cm. Usahakan diameter penotolan sampel KLT pada bejana hingga
noda yang terbentuk dengan lampu yang sudah batas atas
tidak lebih dari 0,3 cm UV 254 nm dijenuhkan plat KLT

Tentukan eluen terpilih untuk

kromatografi kolom dengan Amati posisi Visualisasi plat
memperhatikan harga separation standar dalam KLT di bawah
factor (α) dari noda yang sama dengan sampel dan noda- UV 254 nm
standar terhadap noda terdekat. noda lainnya
 Penyiapan Kolom

 Mencuci semua alat yang digunakan, lalu dikeringkan

 Menghubungkan timbangan analitik dengan sumber listrik. Membersihkan timbangan
sebelum digunakan dengan kuas yang sudah tersedia. Memastikan waterpass sudah
berada di tengah dan menekan tombol “on”.
 Fase gerak terpilih yaitu n-heksana – etil asetat (5:1) dibuat dalam 300 ml
n-heksana = 5/6 x 300 ml = 250 ml
etil asetat = 1/6 x 300 ml = 50 ml

Timbang silica gel

Masukkan silica gel ke
sebanyak 50 g pada Tambahkan fase gerak
dalam labu erlenmeyer
timbangan analitik dengan terpilih hingga semua
dengan menggunakan
wadah berupa cawan silica gel terbasahi
bantuan corong
porselen yang sudah ditara

Goyangkan labu erlemneyer Tutup erlenmeyer yang

berisi campuran silica Aduk dengan
untuk membantu supaya batang pengaduk
silica gel terbasahi secara gel dan fase gerak
merata dengan eluen dengan alumunium foil

Pastikan stopper kolom dalam keadaan

Pasangkan kolom pada statif yang dihubungkan tertutup sebelum dituangkan campuran
dengan klem. Pastikan stopper tidak tersumbat silica gel dan fase gerak
ataupun bocor dan mudah ketika diputar

Buka stoper pada bagian Membuka alumunium foil pada

Tepat dibawah kolom,
bawah kolom untuk labu erlenmeyer, tuangkan
letakkan gelas Beaker
mengeluarkan eluen campuran silica gel dan eluen ke
sebagai wadah
tampungan eluen. dalam kolom dengan bantuan
bawah kolom untuk corong gelas
mengeluarkan eluen
Bersihkan silica gel yang masih
Pastikan eluen pada
tertinggal di labu erlenmeyer dengan
Tutup stoper pada kolom terisi penuh,
cara menambahkan kembali eluen ke
bagian bawah kolom kemudian tutup kolom
dalam labu elenmeyer. Kemudian
dengan alumunium foil
kembali menuangkannya ke dalam
dan rekatkan dengan
kolom dengan bantuan corong gelas
karet gelang. Hal ini
untuk memastikan agar
Diamkan selama 1-2 jam. (Pada kolom tidak kering
praktikum, kolom didiamkan selama penyimpanan
selama 7 hari sebelum
digunakan)
 Penyipan Sampel

 Mencuci semua alat yang digunakan, lalu dikeringkan

 Menghubungkan timbangan analitik dengan sumber listrik. Membersihkan timbangan
sebelum digunakan dengan kuas yang sudah tersedia. Memastikan waterpass sudah
berada di tengah dan menekan tombol “on”.

Menimbang 500 mg Menimbang 500 mg silica

Tambahkan silica gel
ekstrak etanol rimpang gel pada timbangan
sedikit demi sedikit ke
kencur pada timbangan analitik dengan wadah
dalam ekstrak kencur
analitik dengan wadah cawan porselen yang
cawan porselen yang telah ditara
telah ditara
Aduk dengan spatula
hingga homogen dan
ekstrak menjadi kering
(seperti serbuk). Sampel
siap digunakan.
 Pelaksanaan Kromatografi Kolom

Membuka penutup Mengeluarkan eluen dari Mengeluarkan eluen hingga

aluminium foil batas 0,5 cm dari permukaan
c dari kolom, dengan stopper
kolom pada bagian bawah kolom atas fase diam

Menimbang silica gel 0,5 gram Memasukkan sampel

(pada timbangan analitik) dan kering ke dalam kolom
dimasukkan ke dalam kolom dan pastikan sampel
(untuk melindungi ekstrak terdistribusi merata di atas Menutup Stopper
supaya tetap rata saat ditambah kolom
eluen) selain silica gel dapat juga
menggunakan pasir atau kapas

Menampung beberapa ml eluen

Menambahkan eluen melaui yang keluar pertama dari kolom
dinding kolom dengan Mengalirkan eluen dan dan dibuang (karena belum
diteteskan menggunakan tampung dalam beaker glass mengandung senyawa kimia dari
pipet pasteur atau dapat ekstrak) ± 50% dari volume
menggunakan sistem dengan kolom
corong pisah yang diletakkan
pada bagian atas kolom

Jika penampungan pada vial

Mengatur kecepatan aliran Menampung fraksi pada vial
sudah penuh 10 ml, dapat
1 tetes / detik yang sudah ditara (10 ml) dan
diganti dengan vial
beri tanda dengan nomor
selanjutnya

Menutup vial dengan Dibiarkan hingga sebagian

Simpan semua vial, untuk
aluminium foil dan lubangi besar eluen menguap (hasil
selanjutnya dilakukan
atasnya dengan jarum tampungan dibiarkan
monitoring hasil dengan KLT
menguap ± 7 hari)
 Monitoring Hasil kromatografi kolom dengan KLT

Jika hasil tampungan Menotolkan tampungan dari Menjenuhkan Chamber

mengering makacperlu tiap vial pada pelat KLT (30 (bejana) dengan fase gerak
ditambahkan eluen vial pada 2 pelat KLT) dan terpilih yaitu n-heksanan : etil
beberapa tetes menotolkan standar EPMS asetat (4:1)

Jika hasil uji KLT

menghasilkan noda yang Mengamati hasil eluasi Memasukkan pelat KLT ke
sama maka fraksi dari kedua dibawah UV 254 nm dalam chamber dan dilakukan
vial tersebut digabungkan eluasi pelat KLT

Menotolkan fraksi pada pelat Memasukkan pelat KLT ke

KLT dengan rentang fraksi dalam chamber yang berisi
Mengamati hasil eluasi
dari vial nomor 1, 2, 3-4, 5- fase gerak n-heksanan : etil
dibawah UV 254 nm
10, 11-16, 17-24, 25-30 dan asetat (4:1) dan dilakukan
juga menotolkan standar eluasi pelat KLT

Mengamati fraksi yang Melaporkan hasil fraksinasi

mengandung senyawa yang sama yang dilakukan dan menentukan
dengan standar (fraksi yang sejajar apakah fraksinasi telah berhasil
dengan standar EPMS) memperoleh isolat yang
ditargetkan
 E. HASIL PENGAMATAN
a. Penentuan Fase Gerak
Komposisi Fase Gerak Hasil
I. n-Heksana 100%
II. n-Heksana – Kloroform (4:1)
III. n-Heksana – etil asetat (5:1)
IV. Etil asetat 100%

Keterangan: s: sampel; st: standar EPMS

b. Hasil Pemisahan Senyawa

c. Pengelompokan Fraksi

Fraksi Dari Nomor Vial

1 1
2 2
3 3-4
4 5-10
5 Standar
6 11-16
7 17-24
8 25-30
 F. ANALISIS DATA
a. Penentuan Fase Gerak
Fase Gerak Hasil Noda Pada Plat KLT Nilai Rf Indeks Polaritas

Noda 1 : Rf1 = = = 0,125

n-Heksana Noda 2 : Rf2 = = =0

Polaritas tunggal :
100% Derajat keterpisahan : = ∅𝑎 𝑥 𝑃𝑎
= x = 1/1 𝑥 0,1
= 0,1
= x
= 0 (fase gerak tidak memenuhi syarat)

Noda 1 : Rf1 = = = 0,125

Noda 2 : Rf2 = = =0
n-Heksana – Polaritas campuran
Kloroform (𝑃𝑎𝑏):
Derajad keterpisahan:
(4:1) = ∅𝑎 𝑥 𝑃𝑎 + ∅𝑏 𝑥 𝑃b
= x = 𝑥 0,1 + 𝑥 2,7
= x = 0,62
= 0 (fase gerak tidak memenuhi syarat)
 Noda 1 : Rf1 = = = 0,44
n-Heksana – Noda 2 : Rf2 = = = 0,06 Polaritas campuran
etil asetat (𝑃𝑎𝑏):
(5:1) Derajad keterpisahan: = ∅𝑎 𝑥 𝑃𝑎 + ∅𝑏 𝑥 𝑃b
= x = 𝑥 0,1 + 𝑥 4,4
= 0,82
= x
= 12,31 (fase gerak memenuhi syarat)

Noda 1 : Rf1 = = = 0,69

Noda 2 : Rf2 = = = 0,55
Polaritas tunggal :
Etil asetat
= ∅𝑎 𝑥 𝑃𝑎
Derajad keterpisahan: = 1 𝑥 4,4
100%
= x = 4,4
= x
= 1,82 (fase gerak memenuhi syarat)
 b. Pengelompokan fraksi
Fraksi Dari nomor vial
1 1
2 2
3 3-4
4 5-10
5 Standar
6 11-16
7 17-24
8 25-30

Berdasarkan hasil KLT dari pengelompokan fraksi dengan sampel nomor 5 berupa
standar, fraksinasi berhasil karena memperoleh senyawa sama dengan standar. Fraksinasi
yang sama dengan standar pada fraksi 4 dan 6.

G. PEMBAHASAN

Pada praktikum ini mahasiswa melakukan isolasi senyawa etil para metoksi sinamat
(EPMS) dari ekstrak etanol rimpang kencur dengan metode kromatografi kolom. Metode
kromatografi kolom yang diterapkan adalah kromatografi adsorpsi. Pemisahan senyawa pada
kromatografi kolom adsorpsi dipengaruhi oleh kekuatan adsorpsi senyawa pada fase diam.
Jenis fasa diam yang digunakan adalah Silica gel (70-230 mesh ASTM).

Sebelum plat dimasukkan chamber, chamber harus dijenuhkan lebih dulu dengan cara
fase gerak yang akan digunakan dimasukkan camber kemudian dimasukkan kertas saring
yang telah diberi batas atas dan batas bawah supaya kita tahu batas chamber jenuh. Tujuan
penjenuhan adalah agar elusi dapat berjalan cepat. Batas bawah harus ditentukan supaya
totolan sampel tidak langsung terendam fase gerak, yang dapat mempengaruhi proses
elusinya.

Pengisian silica ke dalam kolom bisa dilakukan dengan 2 metode, yaitu metode basah
maupun kering. Tetapi dalam praktikum kali ini menggunakan metode basah, yaitu dengan
cara silica gel dicampur dengan fase gerak kemudian campuran silica gel dan fase gerak
dimasukkan ke dalam kolom. Begitu pula dengan teknik loading sampel ke dalam kolom
dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu metode basah dan kering. Pada praktikum ini
menggunakan metode kering, dimana sampel dicampur dengan fase diam (silica gel) dengan
perbandingan 1 : 1, dihomogenkan sehingga diperoleh massa berupa serbuk. Sampel
kemudian dimasukkan ke dalam kolom.

Pada penentuan fase gerak, terdapat 4 pilihan komposisi fase gerak yaitu :

a. n-Heksana 100% dengan derajat keterpisahan 0 (tidak memenuhi syarat)

b. n-Heksana - Kloroform (4:1) dengan derajat keterpisahan 0 (tidak memenuhi syarat)
c. n-Heksana - Etil asetat (5:1) dengan derajat keterpisahan 12,31 (memenuhi syarat)
d. Etil asetat 100% dengan derajat keterpisahan 1,82 (memenuhi syarat)

Selain melihat dari nilai derajat keterpisahannya, penentuan fase gerak yang akan
dipilih juga mempertimbangkan dari nilai Rf yang dihasilkan dari masing-masing fase gerak.
Fase gerak yang baik untuk dipakai dalam kromatografi kolom adalah jika spot noda Rf
pertama tidak lebih dari 0,5. Karena jika Rf pertama memiliki nilai lebih dari 0,5 maka akan
sulit mengisolasi senyawa yang akan digunakan karena terlalu cepat untuk dapat ditampung.
Oleh sebab itu fase gerak n-Heksana – etil asetat (5:1) yang memiliki nilai Rf pertama 0,44
lebih dipilih dibandingkan fase gerak Etil asetat 100% yang memiliki nilai Rf pertama 0,69.

Jumlah fase diam yang digunakan bergantung pada tingkat kesulitan pemisahan dan
pada jumlah sampel yang akan dipisahkan. Berdasarkan analisis data, maka diperoleh nilai α
= 12,31, oleh karena itu membutuhkan silica gel sebanyak 50 gram untuk 0.5 gram ekstrak.

Pada praktikum kromatografi kolom ini, fase gerak yang dipilih adalah n-heksana dan
etil asetat dengan perbandingan rasio 5 : 1 yang bersifat nonpolar. Setelah fase diam telah
disiapkan, sampel dimasukkan kemudian ditambahkan fase gerak terpilih. Eluen atau fase
gerak yang dialirkan secara kontinu ke dalam kolom akan menyebabkan adanya peristiwa
adsorbsi dan desorpsi senyawa-senyawa pada sampel. Dengan adanya gravitasi, maka eluen
akan melewati kolom dan proses pemisahan akan terjadi. Sama hal nya pada KLT, pemisahan
dapat terjadi karena adanya perbedaan afinitas senyawa pada adsorben dan perbedaan
kelarutan senyawa pada eluen (Kristanti, Alfinda Novi : 2008).
Berdasarkan data yang diperoleh dari 30 vial, masing-masing vial dilakukan satu kali
penotolan sampel, maka dapat dikelompokkan menjadi 8 fraksi (1 fraksi standart EPMS dan
7 fraksi lainnya dari vial sampel). Berdasarkan nilai Rf dari noda yang muncul pada plat KLT
yang diamati pada sinar UV 254 nm, yaitu:
1. fraksi 1 dengan nomor vial 1
2. fraksi 2 dengan nomor vial 2
 3. fraksi 3 dengan nomor vial 3-4
4. fraksi 4 dengan nomor vial 5-10
5. fraksi 5 berisi standart EPMS
6. fraksi 6 dengan nomor vial 11-16
7. fraksi 7 dengan nomor vial 17-24
8. fraksi 8 dengan nomor vial 25-30
Tiap fraksi dilakukan penotolan pada plat KLT, lalu dielusi dengan fase gerak terpilih
dan diamati pada UV 254 nm. Hasilnya diperoleh bahwa fraksi 4 dan 6 mempunyai nilai Rf
yang sama dengan nilai Rf standart EPMS yaitu sebesar 0.55. Maka disimpulkan bahwa
isolasi senyawa EPMS berhasil dilakukan.
Pada kromatografi kolom, hal-hal yang paling berperan dalam kesuksesan pemisahan
diantaranya adalah pemilihan adsorben/fase diam dan eluen/fase gerak, dimensi kolom yang
digunakan serta kecepatan elusi yang digunakan (Kristanti, Alfinda Novi : 2008).

H. KESIMPULAN
Dari hasil pengamatan dan analisis data dapat disimpulkan fase gerak yang terpilih
untuk pemisahan ekstrak etanol rimpang kencur yaitu n Heksana - Etil Asetat (5:1) dengan
derajat keterpisahan yang baik sebesar 12,31 (syarat keterpisahan senyawa target dengan
noda terdekat α ≥ 1,5). Selain itu nilai Rf pada noda yang muncul yaitu 0,44 untuk Rf noda 1
dan 0,06 untuk Rf noda 2 telah sesuai dengan pustaka bahwa noda EPMS muncul pada nilai
Rf sekitar 0,4-0,5. Hasil eluasi dari kromatografi kolom ditampung ke dalam 30 vial,
kemudian dibagi menjadi 8 fraksi dengan standar EPMS tunggal digolongkan sebagai fraksi
ke-5. Hasil eluasi pada KLT diperoleh fraksi ke-4 dan ke-6 positif mengandung EPMS yakni
ditandai dengan munculnya noda dengan Rf yang sama dengan standart yaitu 0,55. Dengan
demikian, praktikum kali ini berhasil mengisolasi senyawa EPMS. Sehingga dapat
disimpulkan bahwa teknik pemisahan yang memenuhi persyaratan yaitu menggunakan
pelarut fase gerak n-Heksana – Etil Asetat (5:1) sebagai fase gerak kromatografi kolom yang
juga sesuai dengan senyawa yang akan diisolasi yaitu senyawa EPMS dalam ekstrak etanol
kencur.
 DAFTAR PUSTAKA

Hurbutise, RJ. Adsorption chromatography in Encyclopedia of Chromatography. Cases, J

(Ed). Third edition, 2010.CRC Press: New York. Pp. 10-13.

Kristanti, Alfinda Novi., dkk. 2008. “Buku Ajar Fitokimia”. Airlangga University Press.
Surabaya

Zhang, QW, Lin, LG, Ye, WC. Techniques for extraction and isolation of natural products: a
comprehensive review. Chin Med. 2018. 13: 20.