i

PEDOMAN UMUM PRAKTIKUM

A. Peraturan dasar di laboratorium

1. Sebelum memasuki ruangan laboratorium, anda harus
memakai jas praktikum / lab coat
2. Praktikan dilarang memakai sandal dan sejenisnya
3. Tidak diperbolehkan makan, minum dan meludah di
laboratorium
4. Bagi yang tidak berkepentingan, dilarang masuk ke
laboratorium
5. Buanglah sampah pada tempat yang sudah disediakan
6. Dilarang membuang sampah di saluran air
7. Pahami semua aturan penggunaan alat dan bahan sebelum
digunakan
8. Setelah bekerja, ruangan dan alat harus dibersihkan
9. Hati-hati menggunakan zat
10. Selalu berhati-hati ketika membawa dan bekerja dengan zat
11. Tidak dibenarkan bekerja sendirian di laboratorium
12. Tidak masuk praktikum 3 kali berturut-turut, dianggap
mengundurkan diri
13. Datang 15 menit sebelum praktikum dimulai
14. Memakai masker, jaga jarak, bicara seperlunya

B. Kewajiban praktikan
1. Mempelajari penuntun praktikum dan bersiap untuk di tes
2. Tidak diperkenankan masuk laboratorium sebelum ada izin
dari pembimbing praktikum atau asisten praktikum
3. Membuat catatan prakt ikum pada logbook
prakt ikum untuk setiap kali praktikum dengan urutan
sebagai berikut:
• Judul praktikum
• Tujuan praktikum
• Teori dasar
• Alat dan bahan yang diperlukan
• Prosedur praktikum dalam bentuk skema atau
dagram alir
ii
 • Pengamatan dalam bentuk tabel
• Jawaban pertanyaan (jika ada)
• Daftar Pustaka
4. Membawa lap atau tisu
5. Mengganti alat yang hilang atau rusak
6. Melaporkan setiap terjadi kecelakaan di laboratorium pada
asisten atau pembimbing praktikum
7. Menyerahkan surat keterangan dari dokter jika sakit
8. Menyerahkan laporan lengkap (tulisan tangan) pada waktu
praktikum berikutnya pada asisten atau pembimbing
praktikum dengan isi laporan praktikum sebagai berikut:
• Judul praktikum
• Tujuan praktikum
• Teori dasar
• Alat dan bahan
• Prosedur kerja dalam bentuk diagram alir atau
skema
• Pengamatan
• Pembahasan
• Kesimpulan
• Daftar Pustaka
• Jawaban pertanyaan
9. Menyerahkan tugas pendahuluan

iii
 DAFTAR ISI

Hal

Cover…………………………………………………………….... i
Pedoman Umum Praktikum Biokimia ……………….............. ii
Daftar Isi ………………………………………….…..………........... iv
1. Pengenalan Teknik Dasar Mikrobiologi…… .………….... 1
2. Penentuan Kadar Vitamin C …………………………….... 9
3. Penentuan Aktivitas Enzim Lipase……….……………..... 12
4. Penentuan Kadar Protein secara Lowry........................... 15
5. Ekstraksi DNA dari Buah......................................................... 19
6. Penentuan Kadar Gula Pereduksi pada Makanan
secara Spektofotometri............................................................. 23

iv
 Praktikum Biokimia
Percobaan 01

PENGENALAN TEKNIK DASAR MIKROBIOLOGI

(METODA ASEPTIK)

A. Standar Kompetensi
Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan mikro-
organisme dan membiakkannya secara aseptik

B. Tujuan
Mahasiswa dapat
1. menggunakan autoclave yang benar
2. bekerja aseptik
3. menyiapkan media padat pada cawan petri dan tabung
reaksi
4. menanam mikroorganisme pada media padat menggunakan
teknik streak-plate
5. menanam mikroorganisme pada media cair

C. Teori
Sekarang, banyak vitamin dan protein penting telah diproduksi
di dalam sel mikroorganisme. Dengan kata lain, mikroorganisme
telah dijadikan “pabrik hidup” untuk memproduksi vitamin dan
senyawa-senyawa yang penting bagi manusia. Protein penting yang
pertama diproduksi pada mikroorganisme adalah insulin manusia.
Tahukan anda apakah fungi insulin bagi tubuh kita? Oleh sebab itu,
pengetahuan teknik dasar mikrobiologi adalah bagian penting pula
pada pelajaran biokimia.
Metoda aseptik merupakan suatu keharusan jika bekerja dengan
mikroorganisme. Tujuan aseptik adalah agar mikroorganisme
tersebut tidak terkontaminasi oleh jenis mikroorganisme lain.
Mikroorganisme merupakan kontaminan tertinggi yang hanya dapat
dicegah dengan teknik aseptik yang benar. Pada prinsipnya bekerja
aseptik adalah bekerja dengan teknik steril. Setiap langkah
pekerjaan diusahakan tidak membawa

1
mikroorganisme jenis lain selain mikroorganisme yang diinginkan.
Untuk mencapai tujuan ini semua peralatan, bahan-bahan, termasuk
media pertumbuhan dan air, meja kerja dan tangan kita harus disuci-
hamakan terlebih dahulu.
Beberapa metoda untuk mensuci-hamakan antara lain adalah
sterilisasi. Pada percobaan ini, semua peralatan dan bahan-bahan
yang tidak rusak sampai suhu 121ºC disucihamakan dengan
pengukusan pada suhu 121ºC selama 15-20 menit menggunakan
autoclave. Sterilisasi dapat juga dilakukan secara kering yang
dinamakan dry-heat sterilized yang dilakukan dalam oven pada
suhu 160-170ºC. Meja kerja, tangan dan beberapa peralatan tertentu
disucihamakan dengan alkohol teknis 70%.
Selama bekerja aseptik, pekerjaan selalu dilakukan di dekat api
(jarak sekitar 10 cm). Jika harus memindahkan suatu media kultur
dari satu wadah ke wadah lain, diusakan agar penutup masing-
masing wadah dibuka dalam waktu sesingkat mungkin di dekat api.
Penutup wadah tersebut tetap dipegang dan tidak ditaruh di meja.
Media untuk tumbuhnya mikroorgansime dinamakan media
kultur. Media kultur dapat dibuat padat atau cair. Keduanya hanya
dibedakan oleh agar yang ditambahkan pada media tersebut. Media
kultur dapat ditempatkan pada tabung reaksi (tube) atau petri plate
(petri disk). Berdasarkan wadah dan wujud media dikenal brothtube,
agar miring, agar dalam dan agar plate (Gambar 1).
Teknik yang dapat digunakan untuk memperoleh kultur murni
suatu bakteri adalah gabungan streak-plate technique dan spread-
plate technique. Spread-plate technique digunakan juga untuk
menghitung jumlah bakteri pada volume tertentu kultur murni.
Penyediaan kultur murni suatu bakteri/mikroorganisme, tanpa
terkontaminasi dengan mikroba lain dengan streak-plate technique.
Streak-plate technique adalah langkah awal yang sangat penting
dalam pekerjaan molekuler seperti perbanyakan fragmen DNA
tertentu secara in vitro (secara PCR) dengan template DNA genom
mikroorganisme. Kedua teknik ini akan menghasikan koloni bakteri
pada permukaan media padat. Koloni bakteri merupakan onggokan
bakteri yang pada awalnya berasal dari satu sel bakteri.

2
Onggokan bakteri tersebut demikian besarnya sehingga dengan mata
telanjang (tanpa alat bantu penglihatan) kita dapat melihatnya. Satu
koloni dapat mengandung lebih dari 10 juta (107) sel bakteri. Setiap
koloni bakteri menunjukkan karakteristik tertentu.

Gambar 1. Media Kultur

D. Alat dan Bahan

1. Alat
Cawan petri 2 (satu telah berisi media padat steril)
Gelas Kimia 100 ml 1 buah
Pemanas (lampu spiritus) 1 set
Autoklav 1 set
Tabung reaksi 6 buah
Kain kasa, kapas, plastik wrap secukupnya
Jarum Ose 1 buah
Shacker 1 set
Botol semprot 1 buah
Erlenmeyer 50 mL 4 buah

2. Bahan
Glukosa 2,0 %
Yeast ekstrak 0,5 – 1,0 %
Agar bakto 3,0 – 4,0 %
Pepton 1,0 %
Alkohol teknis 70% 100 mL
Aquades

3
 Kultur
Acetobacter xylinum disingkat A.xylinum
Saccharomyces cerevisiae disingkat S.cerevisiae

E. Prosedur Kerja
Membuat media cair steril S.cerevisiae dan A. xylinum
1. Timbang bahan media cair (tanpa agar) untuk 10 mL air
masing-masing untuk S.cerevisiae (glukosa, yeast ekstrak),
dan A.xylinum (glukosa, yeast ekstrak, pepton)
2. Larutkan masing-masing media di dalam 10 mL air dalam
tabung reaksi atau Erlenmeyer (boleh dipanaskan agar cepat
larut)
3. Label tabung reaksi dengan nama kultur
4. Media sebanyak 5 mL dituang ke dalam tabung reaksi sesuai
label. Dengan demikian anda mempunyai 4 buah media cair (2
untuk S.cerevisiae atau 2 untuk A.xylinum).
5. Tabung reaksi ditutup dan disterilkan dalam autoklav pada
15 lb selama 15 menit (dalam pengawasan asisten!) Satu media
steril S.cerevisiae digunakan untuk pertumbuhan S.cerevisiae
satu untuk „kontrol‟nya (tidak ditambahkan S.cerevisiae).
Begitu juga untuk media cair A.xylinum.

Membiakkan S.cerevisiae dan A. xylinum pada media cair steril

1. Siapkan meja kerja dalam keadaan bersih, lampu spiritus,
tabung reaksi berisi 2 mL alkohol teknis 70% serta alkohol
teknis 70% di dalam botol semprot.
2. Semprot meja kerja dengan alkohol teknis. Rendam jarum ose
dalam alkohol teknis 70%. Nyalakan lampu spiritus.
3. Ambil jarum ose dan segera panaskan hingga membara,
dinginkan ujung ose pada tepi media padat steril. Setelah yakin
ose dingin ambil biakan S.cerevisiae dengan ujung ose pada
stock biakan S.cerevisiae (pada tabung reaksi atau petri). Segera
panaskan mulut tabung reaksi atau tepi petri dan tutup kembali.

4
4. Ambil tabung reaksi berisi media cair steril buka tutupnya
(tutup tetap dipegang) panaskan mulut tabung dan segera
celupkan dan goyang-goyang ujung ose pada media cair.
Segera panaskan mulut tabung dan tutup kembali. Ujung ose
dipanaskan kembali sampai nyala dan dinginkan, kemudian
celupkan pada alkohol 70%.
5. Ulangi pekerjaan untuk media cair steril A.xylinum.
6. Letakkan tabung reaksi pada shaker posisi setimbang dan
digoyang 150 rpm suhu ruang selama sekitar 16-24 jam
(dalam pengawasan asisten!). Amati media cair pada tabung
reaksi tersebut dan bandingkan dengan „kontrol‟.

Menyiapkan media padat dalam cawan petri dan tabung

reaksi
1. Buat penutup tabung reaksi dari kapas yang dibungkus kain
kasa
2. Timbang bahan media padat untuk 15 mL air masing-masing
untuk Saccharomyces cerevisiae (glukosa, yeast ekstrak, agar
bakto) dan Acetobacter xylinum (glukosa, yeast ekstrak,
pepton, agar bakto)
3. Larutkan media di dalam 15 mL air di Erlenmeyer (boleh
dipanaskan agar cepat larut). Tutup Erlenmeyer dengan
kapas yang dibungkus kain kasa.
4. Masukkan cawan petri dan tabung reaksi bertutup ke plastik
tahan panas, tutup. Petri boleh dibungkus kertas HVS bekas
bersih.
5. Sterilkan memakai autoclave (dalam pengawasan asisten)
6. Setelah sterilasi selesai didinginkan sampai sekitar suhu 45-
50ºC “suam kuku” (Erlenmeyer dapat dipegang dengan tangan)
7. Dekatkan mulut Erlenmeyer ke api dan tuang media ke dalam
cawan petri (+ 15-20 mL) dan ke tabung reaksi (+ 5-10mL).
Bisakan anda menuang media selagi memegang petri/tabung
reaksi dan penutupnya di tangan kiri dan media di kanan ?
Cara seperti ini sebaiknya dilakukan.

5
8. Tabung reaksi dibiarkan miring dekat api sampai media
memadat, kemudian ditutup. Setelah media memadat pada
petri, tutup sisi kedua petri dengan plastik wrab. Simpan
petri dalam keadaan terbalik.

Membuat koloni tunggal dengan Streak-plate technique

1. Pada prinsipnya streak-plate technique menggunakan jarum
ose. Siapkan agar miring, agar plate dan jarum ose, Tabung
reaksi berisi 2 mL alkohol teknis 70% serta botol semprot
berisi alkohol teknis 70%.
2. Atur meja kerja supaya agar miring, agar plate dan biakan
berada di sebelah kiri api, sedangkan jarum ose dan alkohol
teknis 70% di sebelah kanan api. Pastikan permukaan media
padat pada petri dan tabung reaksi bebas uap air.
3. Pastikan tutup petri bebas uap air.
4. Ambil tabung yang berisi biakan murni dengan tangan kiri.
Buka tutup tabung dengan menjepitnya di antara kelingking
dan jari manis tangan kiri, segera panaskan mulut tabung.
5. Dengan tangan kanan ambil jarum ose dan segera panaskan
hingga membara, dinginkan sesaat pada tepi media padat.
Setelah yakin ose dingin ambil biakan dengan jarum ose,
segera panaskan mulut tabung dan tutup. Letakkan tabung
pada rak.
6. Ambil tabung agar miring buka tutupnya (tutup tetap
dipegang) panaskan mulut tabung dan segera gesekkan ujung
ose pelan pada permukaan media padat dimulai dari arah
bagian dasar tabung ke arah mulut tabung. Segera panaskan
mulut tabung dan tutup kembali.
7. Ulangi pekerjaan untuk media padat di dalam petri (agar plate).
Pola goresan dapat dilihat pada Gambar 2. Tutup sisi kedua petri
dengan plastik wrab.
8. Letakkan petri dalam keadaan terbalik pada suhu ruang, 16-
24 jam. Amati permukaan petri. Apakah terbentuk koloni
tunggal S.cerevisiae dan A.xylinum.

6
 Gambar 2. Pola goresan ose pada media agar plate (b)
dan agar miring (d)
Perhatian
Jangan lupa memberi nama. tanggal percobaan dan keterangan
sampel sebelum menyimpan di dalam inkubator. Setelah selesai
bekerja dengan mikroba, jangan lupa sterilkan kembali meja
kerja dan semua peralatan. Buang sampah mikrobiologi pada
tempat khusus (yang mengandung desinfektan).

Alkohol mudah terbakar, dijauhkan dari api.

Cuci tangan sebelum dan setelah bekerja. (pake sabun)

F. Pertanyaan
1. Amati koloni yang tumbuh pada biakan yang telah An anda
tanam. Kalau perlu gunakan lup? Tulis karakteristik koloninya
yaitu warna koloni, bentuk koloni, elepasi koloni, dan margin
koloni. Apakah koloninya seragam?
2. Apakah terdapat kontaminan? Kalau ya, jelaskan. Kalautidak,
jelaskan.
3. Jika terjadi kontaminasi pada tugas praktikum yang anda
kerjakan. Pada bagian mana kemungkinan
7
 besar yang „tidak steril‟ yang telah anda lakukan?
Mengapa demikian ? Bagaimana cara mengatasinya?
4. Apa perbedaan media cair dan media padat ?
5. Jejak apakah yang anda lihat pada permukaan agar
streak plate
6. Bagaimana anda yakin bahwa bakteri yang anda biakan telah tumbuh
pada streak plate, bakteri tersebut bukan kontaminan?
7. Mengapa menyimpan media padat pada petri, dan menumbuhkan
mikroorganisme pada petri, petri diletakkan pada posisi terbalik?
8. Apa tujuan meletakkan tabung reaksi “miring‟ ketika proses
pemadatan media pada tabung reaksi ?
9. Jelaskan langkah menggunakan autoclave untuk sterilisasi.
10. Untuk membuat “koloni tunggal‟ pada permukaan media padat
di petri sebaiknya permukaan media dan tutup petri bebas dari uap
air. Jelaskan mengapa demikian?
11. Perhatikan “koloni bakteri” pada media padat di petri. Manakah
yang merupakan kultur murni?

G. Tugas pendahuluan
1. Jelaskan kegunaan Acetobacter xylinum dan Saccharomyces
cerevisiae dalam kehidupan
2. Jelaskan tujuan dan metoda sterilisasi ?
3. Bagaiman mensterilkan zat yang mudah rusak karena panas ?
4. Apakah yang dimaksud kultur murni dan kultur campuran ?
5. Jelaskan kegunaan streak-plate technique dan spread-plate technique
6. Telusuri gambar karakteristik koloni bakteri yang meliputi
bentuk koloni, elepasi koloni, margin koloni. Printlah.

H. Referensi
Laboratory exercises in microbiology fifth edition by Harleyand
Prescott. MC Grow Hill 2002
Brock Biology of Microorganisms by Madikan et al.
Benjamin Cummings, 2012.

8
 Praktikum Biokimia
Percobaan 02

PENENTUAN KADAR VITAMIN C

A. Standar Kompetensi
Mahasiswa dapat menentukan kadar vitamin C dari berbagai
jenis bahan makanan/buah-buahan.

B. Kompetensi Dasar
Mahasiswa dapat
1. membuat reagen untuk penentuan kadar vitamin C.
2. menggunakan alat titrasi untuk penentuan kadar vitamin C.
3. mengumpulkan, menganalisa data, menuliskan kesimpulan.
4. mengkomunikasikan hasil percobaan.

C. Dasar Teori
Vitamin dapat digolongkan atas kelarutannya yaitu vitamin yang
larut dalan air, dan vitamin yang larut dalam lemak/minyak. Vitamin
yang larut dalam air adalah vitamin B dan C, sedangkan vitamin yang
larut dalam lemak adalah A, D, E, dan K. Vitamin yang larut dalam air
bila dikonsumsi berlebihan akan dibuang ke luar tubuh bersama
urine dan keringat. Penentuan kadar vitamin C dapat dilakukan
dengan dua cara yaitu cara titrasi dan spektrofotometri. Vitamin C
sangat mudah teroksidasi sehingga vitamin ini mudah rusak.

D. Alat dan Bahan

1. Alat
Erlenmeyer 100 mL 3 buah
Pipet takar 10 mL 1 buah
Labu ukur 100 mL 1 buah
Corong kaca 1 buah
Buret 50 ml 1 set
Botol semprot 1 buah
Timbangan analitik 1 set

9
 Lumpang 1 set
Kertas saring secukupnya
Kapas secukupnya

2. Bahan
Sampel (buah pisang, jeruk, papaya, dll)
disediakan sendiri.
Larutan kanji 1%
Larutan yodium 0,01 N
Aquades

E. Prosedur Kerja.
1. Bahan dihancurkan sampai diperoleh slury.
2. Timbang 10 gram slury, masukkan ke dalam labu takar 100 mL,
dan encerkan sampai tanda batas.
3. Saring dengan menggunakan kapas, filtrat yang diperoleh
dimasukkan ke dalam Erlenmeyer sebanyak 10 mL.
4. Tambahkan larutan kanji 1% titrasi dengan cepat dengan
menggunakan larutan Yodium 0,01 N sampai timbul
perubahan warna (warna biru kehitaman).

A = mL Iod 0,01 N x 0,88 x p

Perhitungan: gram sampel

Keterangan : A = mg vitamin C per gram bahan

p = jumlah pengenceran

Catatan: Gunakan vitamin C IPI sebagai pembanding

F. Pertanyaan
1. Apa tujuan penambahan larutan kanji pada percobaan ini ?
2. Apa guna larutan Yodium pada percobaan ini ?
3. Apakah larutan Yodium dapat diganti dengan zat lain?
Jelaskan jawaban anda ?

10
 4. Bagaimana tingkat ketelitian penentuan kadar vitamin C antara
metoda titrasi dengan spektrofotometri ? Jelaskan jawaban Anda!

G. Tugas Pendahuluan
1. Tuliskan rumus molekul dan struktur vitamin C ?.
2. Tuliskan sifat fisika dan sifat kimia vitamin C ?
3. Apa kaitan antara struktur Vitamin C dengan sifatnya?
4. Tuliskan reaksi oksidasi vitamin C?
5. Berapa kebutuhan vitamin C setiap hari untuk orang dewasa ?

H. Referensi
Less, R. 1975. Food Analysis: Analytical and Qualitative Control
Methode for the Food Manufactore and Buyer. London: Leonard
Hill Book.

11
 Praktikum Biokimia
Percobaan 03

PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM LIPASE

A. Standar Kompetensi
Mahasiswa dapat melakukan penentuan aktivitas enzim lipase

B. Kompetensi Dasar
Mahasiswa dapat
1. membuat reagen penentuan aktivitas enzim lipase.
2. menggunakan peralatan penentuan aktivitas enzim lipase
3. melakukan percobaan
4. menganalisa dan mengambil kesimpulan hasil percobaan
5. mengkomunikasikan hasil percobaan

C. Dasar Teori
Trigliserida termasuk lipid. Trigliserida merupakan ester antara
asam lemak dengan gliserol. Minyak dan lemak merupakan
trigliserida. Minyak dapat dihidrolisa secara kimiawi dan enzimatik.
Secara kimiawi dapat digunakan asam atau basa, sedangkan secara
enzimatik menggunakan enzim lipase. Aktivitas enzim sangat
ditentukan oleh beberapa faktor seperti suhu, pH. Enzim akan
bekerja maksimum pada suhu dan pH optimum. Hidrolisa minyak
oleh enzim lipase akan menghasilkan asam lemak dan gliserol. Enzim
lipase merupakan salah satu enzim yang sangat besar peranannya
dalam pencernaan dan juga salah satu penyebab rusaknya minyak.
Aktivitas lipase ini dihitung berdasarkan kemampuan enzim ini
untuk menghidrolisa minyak menjadi asam lemak dan gliserol yang
setara dengan jumlah mmol KOH 0,5 N pada kondisi reaksi tertentu.

D. Alat dan Bahan

1. Alat
Erlenmeyer 100 mL 2 buah

12
 Buret 50 mL lengkap 1 set
Tabung reaksi 12 buah
Rak tabung reaksi 1 buah
Water batch 1 set
Blender 1 set
Batang pengaduk 1 buah
Lumpang 1 set
Gelas kimia 50 mL 1 buah
Gelas piala 250 mL 1 buah
Pipet takar 10 mL 1 buah
Pipet tetes 1 buah
Penjepit tabung reaksi 1 buah
Botol semprot 1 buah
Gelas ukur 25 mL 1 buah

2. Bahan
Enzim pencernaan (tablet enzimplek) 10%
Minyak
Gum arab
Buffer posfat pH 6,8
Larutan KOH 0,5 N
Indikator phenol ptalein
Aquades

E. Prosedur Kerja
1. Pembuatan emulsi minyak.
Sebanyak 25 mL minyak ditambahkan 25 mL gum arab,
ditambahkan aquades sebanyak 50 mL, kemudian diblender
sampai diperoleh emulsi yang stabil (kira-kira 15 menit).

2. Penentuan aktivitas enzim lipase terhadap waktu.

Sediakan 6 buah tabung reaksi besar (masing-masing diberi
nomor 1 sampai 6) dimasukkan 1 mL buffer posfat pH 6,8,
ditambahkan 1 mL enzim lipase. Masing-masing tabung reaksi
dimasukkan 10 mL emulsi minyak. Kemudian tabung 1
dimasukkan selama 15 menit p a d a a i r mendidih, tabung 2

13
 sampai tabung 6 diinkubasi selama masing-masing 5, 10, 15,
20, dan 25 menit pada temperatur 37◦C. Setiap tabung
ditambah 3 tetes indikator pp, titrasi dengan KOH 0,5 N. Hitung
aktivitas lipase pada masing-masing waktu inkubasi. Buat
grafik waktu vs aktivitas enzim.

F. Pertanyaan
1. Pada percobaan ini mana yang merupakan substrat enzim
lipase? Jelaskan jawaban anda! Berapakah konsentrasisubstrat
yang Anda gunakan?
2. Jelaskan kenapa substrat harus dibuat dalam bentuk emulsi ?
3. Jelaskan grafik yang diperoleh dari hasil percobaan !
4. Apa guna penambahan buffer fosfat 6,8 pada percobaan ini?.
5. Apa guna indikator pp, larutan KOH pada percobaan ini ?
6. Apa guna gum arab pada percobaan ini
7. Pada percobaan yang saudara lakukan faktor apakah yang
mempengaruhi aktivitas enzim lipase, jelaskan jawaban
saudara
8. Apa definisi aktivitas enzim lipase pada percobaan ini

G. Tugas Pendahuluan
1. Tulislah struktur trigliserida
2. Tulislah persamaan reaksi hidrolisis trigliserida
3. Enzim adalah protein. Jelaskan mengapa suatu enzim
digolongkan protein
4. Jelaskan perbedaan katalis enzim dengan katalis anorganik ?
5. Jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim ?.
6. Jelaskan klasifikasi enzim berdasarkan reaksi yang dikatalisnya,
dan enzim lipase yang saudara gunakan termasuk golongan yang
mana ?
7. Berapakah pH dan suhu optimum dari enzim lipase ?

H. Referensi
Wakil, S.J. (1970). Lipid Metabolisme. New York; Academic Pree.
pp. 281-282.

14
 Praktikum Biokimia
Percobaan 04

PENENTUAN KADAR PROTEIN SECARA LOWRY

A. Standar Kompetensi
Mahasiswa dapat melakukan menentukan kadar protein bahan
makanan secara lowry

B. Kompetensi Dasar
Mahasiswa dapat
1. Mahasiswa dapat mengoperasikan spektrofotometer.
2. Mahasiswa dapat membuat reagen dan melakukan percobaan
penentuan kadar protein pada beberapa sampel secara Lowry.
3. Mahasiswa dapat mengumpulkan dan menganalisis data dengan
benar.
4. Mahasiswa dapat mengambil kesimpulan dari hasil percobaan.
5. Mahasiswa dapat menginformasikan hasil percobaan.

C. Dasar Teori
Protein adalah biomolekul. Protein merupakan polimer yang
monomernya adalah asam-asam amino. Antara residu asam amino pada
protein terdapat ikatan peptida. Kadar protein dapat ditentukan dengan
beberapa cara, antara lain cara Lowry dan cara Biuret. Dengan metode
Lowry dapat ditentukan kadar protein yang lebih kecil (5–100µg
protein). Prinsip penentuan kadar protein secara Lowry berdasarkan
pengukuran serapan cahaya oleh senyawa kompleks berwarna ungu.
Warna ungu ini timbul akibat reaksi antara larutan protein dengan Cu 2+
dalam suasana alkalis yang terdapat dalam reagen dan reduksi
fosfomolibdat dan fosfotungstat oleh tirosin dan triptopan yang
terdapat dalam protein. Intensitas warna menunjukkan konsentrasi
protein dalam suatu larutan protein tersebut. Oleh sebab itu, kadar
protein dapat ditentukan dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.

15
D. Alat dan Bahan
1. Alat
Tabung reaksi besar 10 buah
Pipet takar 2 mL 1 buah
Piket takar 10 mL 1 buah
Pipet tetes 2 buah
Labu ukur 10 mL 6 buah
Batang pengaduk 1 buah
Rak tabung reaksi 1 buah
Gelas kimia 250 mL 2 buah
Spektrometer spektronik 21 1 set
Kuvet 2 buah
Botol semprot 1 buah

2. Bahan
Reagen A; 2% Na2CO3 dalam 0,1N NaOH 100 mL
Reagen B;0,5%CuSO4.5H2O dalam 1% Na-K tartrat 100 mL
Reagen C;
Campuran larutan 50 mL reagen A dengan 1 mL reagen B,
buang setelah 1 hari.
Reagen E;
Encerkan reagen Folin – Ciocalteu (dalam botol 2N)
menjadi 1 N dengan air.
Larutan serum albumin (larutan standar ) 1.000 g/mL
Aquades

E. Prosedur Kerja
1. Pembuatan larutan standar protein dan Mecing kuvet
a. Buatlah larutan serum albumin dengan konsentarsi berturut-
turut 50, 100, 150, 200, 250, dan 300 g/mL dalam labu takar
10 mL.
b. Ambil beberapa kuvet dan pilihlah kuvet yang mempunyai sifat
optik yang sama (macing kuvet). Gunakan aqudes untuk macing
kuvet. Dalam pengukuran gunakan 2 buah kuvet yang macing
(satu untuk larutan standar, satu untuk blanko).

16
 2. Pembuatan kurva kalibrasi standar larutan protein
a. Pipet masing-masing 2 mL larutan standar, tambahkan 10 mL
reagen C dan biarkan pada suhu kamar selama paling kurang
10 menit. Tambahkan 1 mL Reagen E dan kocok dengan segera.
Biarkan selama 30 menit atau lebih sampai terbentuk warna
ungu. Simpan larutan tersebut untuk digunakan pada
pembuatan kurva standar.
b. Tentukan λmaks dari larutan yang akan digunakan dengan
menggunakan konsentrasi yang mewakili larutan standar. Atur
λ mulai 500 nm sampai 750 nm.
c. Ukur absorbansi masing-masing larutan standar pada λmaks.
Alurkan dalam grafik Absorbansi vs Konsentrasi (sumbu X
konsentrasi, sumbu Y absorbansi).
d. Cari persamaan regresi linier, dan tentukan besar koefisien
regresi (r).
e. Dengan cara yang sama pipet masing-masing 2 mL larutan
sampel, tambahkan 10 mL reagen C, biarkan pada suhu kamar
selama paling kurang 10 menit. Tambahkan 1 mL Reagen E,
kocok dengan segera, biarkan selama 30 menit atau lebih
sampai terbentuk warna ungu. Ukurlah serapan pada λmaks

Catatan
Untuk protein padat perlu dilarutkan misalnya dengan alkohol
encer (etanol). Protein yang sukar larut seringkali dilarutkan
dengan alkali 1N, bahkan dipanaskan selama 10 menit atau lebih
pada suhu 100 0C.

F. Pertanyaan
1. Larutan protein setelah ditambah dengan reagen C dan E
terbentuk larutan berwarna ungu. Senyawa apakah yang
berwarna tersebut dan tulis persamaan reaksinya!

G. Tugas Pendahuluan
1. Jelaskan pengertian larutan blanko
2. Jelaskan perbedaan penentuan kadar protein secara Lowry dan
Biuret !
3. Berapakah volume larutan albumin 1.000 g/mL yang dibutuhkan
untuk masing-masing larutan standar? Tuliskan perhitungannya.
17
 4. Mengapa pada pengukuran absorbansi sampel menggunakan
spektrofotometer sebaiknya diukur pada λmaks. Sertai penjelasan
Anda dengan gambar.

H. Referensi
Plummer, David T (1977), An Introduction to Practical Biochemistry,
second edition. New Delhi.: Tata Mc. Graw-Hill Publishing
Company Ltd.pp.145.
Soedigdo P, dkk. (1980). Penuntun Praktikum Biokimia Dasar.
Bandung. Jurusan Kimia FMIPA ITB.

18
 Praktikum Biokimia
Percobaan 05
ESTRAKSI DNA DARI BUAH

A. Standar Kompetensi
Mahasiswa dapat mengektraksi DNA dan menentukan komposisi
nukleotida pada asam nukleat.

B. Kompetensi Dasar
1. Mahasiswa dapat mendiskripsikan tentang DNA
2. Mahasiswa dapat membuat reagen yang terkait dengan percobaan ini.
3. Mahasiswa dapat mengumpulkan data, menganalisis dan merumuskan
kesimpulan.
4. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan.

C. Dasar Teori
Asam nukleat adalah suatu polinukleotida yang berfungsi sebagai
pembawa, penyimpan dan pentransfer informasi genetika pada makhluk
hidup. Monomer asam nukleat adalah nukleotida. Komponen penyusun
nukleotida adalah basa nitrogen, monosakarida dengan lima atom C dan
gugus fosfat. Asam nukleat ada dua yaitu DNA dan RNA. Untuk memperoleh
DNA dapat dilakukan dengan mengekstraknya dari suatu bahan dengan
menggunakan beberapa reagen. Komponen DNA adalah basa nitrogen
(Adenin, Timin, Guanin, dan Sitosin), deoksiribosa (monosakarida dengan
lima atom C), dan gugus fosfat, sedangkan komponen RNA adalah basa
nitrogen (Adenin, Urasil, Guanin , dan sitosin),ribosa (monosakarida dengan
lima atom C), dan gugus fosfat.

D. Alat dan Bahan

1. Alat
Gelas kimia 250 ml 2 buah
Tabung reaksi 5 buah
Erlenmeyer 250 ml 2 buah
Corong kaca 1 buah
Lumpang porselen 1 set

19
 Pipet tetes panjang 2 buah
Batang pengaduk 1 buah
Waterbatch 1 set
Gelas ukur 10 ml 1 buah
Penjepit tabung 1 buah
Botol semprot 1 buah
Kain kasa/kapas secukupnya

2. Bahan
Buah kiwi (boleh diganti dengan buah lain)
Garam NaCl
Detergen (gunakan sabun cuci piring) secukupnya.
Etanol 95% (dingin/disimpan dalam freezer)
HNO3 pekat
Larutan amonium molibdat 5%
Larutan asam asetat 5%
Larutan CuSO4 5%
Larutan NaHSO4 jenuh
Reagen Bennedict
Batu es
Aquades

E. Prosedur Kerja
1. Ekstraksi DNA dari buah Kiwi (boleh diganti dengan buah-buahan yang
lunak).
Kuliti buah kiwi dan potong empat, hancurkan buah kiwi tersebut di
dalam gelas kimia 250 mL. Tambahkan 3 gram NaCl, aduk, kemudian
tambahkan 10 mL detergen sambil diaduk dan tambahkan aquades
sampai volumenya 100 mL. Hancurkan kiwi kembali dengan lumpang.
Saring dengan kain kasa dan filtratnya dikumpulkan. Apakah filtratnya
terdapat DNA ?. Lakukan pengujian sebagai berikut. Biarkan filtratnya
beberapa menit, kemudian pindahkan 6 mL sampel yang jernih ke tabung
reaksi. Dinginkan filtrat pada tabung reaksi dengan cara membenamkan
tabung reaksi tersebut ke dalam bongkahan es kira-kira 5 menit.
Tambahkan 9 mL etanol 95% dingin dengan perlahan-lahan pada sisi
tabung. Tunggu beberapa menit agar DNA memasuki lapisan etanol
sebagai kabut atau benang halus yang putih. Ambil DNA menggunakan
batang pengaduk secara perlahan-lahan. Jika filtrat mengandung DNA
20
 lakukan uji komponen penyusun DNA untuk percobaan ini.

2. Pengujian ekstrak Asam Nukleat (DNA).

1). Ambil ekstrak asam nukleat lakukan pengujian:
a. Ribosa.
Ambil 5 mL ekstrak asam nukleat, tambahkan 4 mL reagen Bennedict,
kocok dan panaskan pada penangas air. Amati apa yang terjadi!
b. Fosfat
Ambil 2 mL ekstrak asam nukleat, tambahkan 1 mL HNO3, panaskan
pada penangas air. Kemudian tambahkan 2 mL larutan amonium
molibdat 5 %. Amati apa yang terjadi !.
c. Basa Nitrogen
Ambil 2 mL ekstrak asam nukleat, tambahkan beberapa tetes asam
asetat 5%, panaskan pada panangas air. Selanjutnya tambahkan 1 mL
larutan CuSO4 , dan 1 mL larutan NaHSO3.
2). Dengan cara yang sama uji lilitan DNA
3). Lilitan DNA dilarutkan dengan 1.500 µL dH2O steril, dimasukkan ke
kuvet dan diukur A pada panjang gelombang 220 sd 290 nm.
4). Ukurlah A pada 260 nm
5). Ukurlah A pada 280 nm

Perhitungan:
Konsentrasi DNA (µg/mL) = A 260 nm x 50 x faktor pengenceran

Kemurnian DNA = A 260nm : A 280 nm

= 1.9 sd 2 (murni)

F. Pertanyaan
1. Apa guna penambahan NaCl, detergen dan etanol dingin pada
percobaan ini?
2. Apa yang terjadi jika ke dalam filtrat yang mengandung DNA
ditambahkan reagen Benedict.
3. Tulis reaksi jika posfat pada ekstrak asam nukleat direaksikan dengan
HNO3.
4. Tentukan konsentrasi DNA
5. Tentukan tingkat kemurnian DNA

21
G. Tugas Pendahuluan
1. Gambarkan struktur double helix-DNA, tujukkan ikatan hidrogen,
ikatan posfodiester.
2. Jelaskan perbedaan antara DNA dengan RNA !
3. Tuliskan kembali penemuan Watson – Crick tentang DNA

H. Referensi
Plummer, David T. (1977). An Introduction to Practical Biochemistry.
Second edition. New Delhi: Tata Mc.Graw-Hill Publishing Company
Ltd. pp. 231

22
 Praktikum Biokimia
Percobaan 06

PENENTUAN KADAR GULA PEREDUKSI PADA MAKANAN

SECARA SPEKTROFOTOMETRI

A. Standar Kompetensi
Mahasiswa dapat menentukan kadar gula pereduksi pada makanan secara
spektrofotometri.

B. Kompetensi Dasar
1. Mahasiswa dapat mediskripsikan konsep dasar karbohidrat.
2. Mahasiswa dapat membuat reagen berkaitan percobaan di atas.
3. Mahasiswa dapat mengoperasikan alat spektrofometer.
4. Mahasiswa dapat melakukan percobaan penentuan kadar gula
pereduksi pada makanan secara spektrofotometri.
5. Mahasiswa dapat mengumpulkan dan menganalisa data.
6. Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan.

C. Dasar Teori
Glukosa merupakan kelompok karbohidrat. Glukosa termasuk
kelompok gula pereduksi. Penentuan kadar gula pereduksi akan
dipengaruhi oleh adanya protein. Oleh sebab itu, protein harus diendapkan
terlebih dahulu. Protein dapat diendapkan dengan menambahkan Seng
sulfat (ZnSO4) dan Barium hidroksida (Ba(OH)2). Hasil reaksi reduksi ion kupri
oleh glukosa dalam suasana basa dengan reagen arsenomolibdat
memberikan warna biru yang kekuatan intensitasnya sesuai dengan
konsentrasi glukosa tersebut. Pengukuran absorbansi dari sampel berwarna
ini dilakukan pada panjang gelombang maksimum yaitu 660 nm dengan
menggunakan spektrofotometer. Berdasarkan hukum Lambert-Beer dapat
dihitung kadar glukosa.

23
D. Alat dan Bahan
1. Alat
Tabung reaksi kecil 2 buah
Tabung sentrifuga 2 buah
Tabung reaksi besar 10 buah
Pipet takar 2 ml 1 buah
Pipet takat 10 ml 1 buah
Pipet tetes 2 buah
Labu ukur 10 ml 6 buah
Batang pengaduk 1 buah
Rak tabung reaksi 1 buah
Penjepit tabung reaksi 7 buah
Gelas kimia 250 ml 2 buah
Alat setrifuga 1 set
Spektrofotometer spektronik 211 set
Kuvet 2 buah
Penangas air 1 buah
Botol semprot 1 buah
2. Bahan
Sampel minuman masing-masing 1 mL
Larutan standar glukosa 1,0 mg/mL
Larutan Ba(OH)2 0,3 N
Larutan Zn SO4 5 %
Reagen Arsenomolibdat
Larutan Nelson A
Larutan Nelson B
Larutan Cu alkalis
Aquades
Catatan
Pembuatan reagen Arsenomolibdat
2,5 gram kristal amonium molibdat dilarutkan dalam 50 ml aquades,
ditambah dengan 4,2 ml H2SO4 pekat sambil diaduk, dinginkan.
Sebanyak 0,6 gram kristal Na2HasO4.7 H2O dilarutkan dalam 5 ml
aquades. Larutan ini dicampur dengan larutan yang pertama dan
aduk. Larutan berwarna kuning bening ini disimpan dalam botol
berwarna coklat dan diinkubasi selama 24 jam – 48 jam pada suhu 37
0
C. Setelah itu simpan dalam lemari es.
Larutan Nelson A.
24
 1,5 gram garam Rochlle, 3 gram Na2CO3 anhidrat, 2 gram NaHCO3 dan
18 gram Na2SO4 anhidrat dilarutkan dalam aquades sambil diaduk dan
diencerkan hingga volume total 100 mL.
Larutan Nelson B
2 gram CuSO4.5H2O dilarutkan dalam aqudes lalu ditambahkan 18 gram
Na2SO4 anhidrat, aduk hingga larut semuanya. Tambahkan 1 - 2
tetes H2SO4 pekat dan encerkan hingga volume 100 mL.
Larutan Cu Alkali
Campurkan 4 volume sampel Nelson A dengan 1 volume Larutan
Nelson B aduk. Larutan ini harus dibuat saat akan digunakan (segar).

E. Prosedur Kerja
1. Pembuatan filtrat bebas protein
Ambil dengan teliti 0,1 mL sampel segar (Sampel diencerkan
berapa kalikah agar masuk pada sederetan larutan standar ?)
,masukkan ke dalam tabung sentrifuga, tambahkan 1,90 mL aquades,
aduk sampai homogen, kemudian tambahkan 1,50 mL Ba(OH) 2 0,3 N
aduk. Tambahkan lagi 1,50 mL larutan ZnSO4 5%, aduk sampai
homogen, biarkan selama 5 menit. Setelah itu sentrifuga selama 20
menit. Pisahkan filtrat dari endapan. Filtrat yang bening itu digunakan
untuk percobaan selanjutnya (Berapa kali pengenceran pada
percobaan ini ?).
2. Pembuatan larutan standard dan Macing kuvet.
a. Buat larutan standar glukosa dari larutan induk (1,0 mg/mL),
masing- masing dengan konsentrasi 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, dan
0,1 mg/mL dalam labu takar 10 mL
b. Ambil beberapa kuvet dan pilihlah kuvet yang mempunyai sifat optik
yang sama (macing kuvet). Gunakan aqudes untuk macing kuvet.
Dalam pengukuran gunakan 2 buah kuvet yang macing (satu untuk
larutan standar, satu untuk blanko).
3. Pembuatan Kurva Standar.
1).Sediakan 7 buah tabung reaksi, ke dalam tabung reaksi 1-6 masing-
masing diisi dengan 1 mL larutan standar sesuai konsentrasi yang
telah disediakan, dan tabung reaksi ke 7 diisi dengan blangko.
Tambahkan masing-masing dengan 1,0 mL larutan Cu-alkalis,
panaskan tabung reaksi pada air mendidih dalam penangas air
selama 20 menit. Dinginkan dalam air (sebaiknya pakai batu es).

25
 Setelah dingin pada setiap tabung reaksi tambahkan 1,0 mL reagen
Arsenomolibdat, aduk sampai homogen. Tambahkan lagi aquades
7,0 mL, kocok sampai gas C02-nya habis. Simpan larutan tersebut
untuk penentuan λmaks dan kurva standar (kurva kalibrasi)
2).Tentukan λmaksdari larutan yang akan digunakan dengan
menggunakan konsentrasi yang mewakili larutan standar. Atur
panjang gelombang mulai dari 600 nm sampai 750 nm dengan
range 10 nm
3).Ukurlah absorbansi masing-masing larutan standar pada λmaks.
Alurkanlah ke dalam grafik Absorbansi vs Konsentrasi.
4).Carilah persamaan regresi linier, dan tentukan besar
koefisien regresinya (r).
4. Penentuan Kadar Gula pereduksi
Sediakan 2 buah tabung reaksi, ke dalam tabung reaksi 1 masukkan 1
mL sampel bebas protein, dan ke dalam tabung reaksi ke 2 1mL
sampel bebas protein yang lain. Ke dalam masing-masing tabung
reaksi tambahkan 1,0 mL larutan Cu alkalis, panaskan tabung reaksi
pada air mendidih dalam penangas air selama 20 menit. Dinginkan
dalam air (sebaiknya pakai batu es). Setelah dingin pada setiap tabung
reaksi tambahkan 1,0 mL reagen arsenomolibdat, aduk sampai
homogen. Tambahkan lagi aquades 7,0 mL, kocok sampai gas CO2-nya
habis. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan dengan
spektronik pada panjang gelombang maksimum.

F. Pertanyaan
1. Apa yang dimaksud dengan larutan standard dan apa fungsinya ?
2. Apa yang dimaksud dengan λmaks , dan kenapa pengukuran absorbansi
dilakukan pada λmaks ?
3. Pada percobaan ini mengapa protein harus diendapkan dan dipisahkan
dari filtrat
4. Setelah penambahan reagen arsenomolibdat terbentuk gas CO2.
Tuliskan reaksi yang terjadi ?

G. Tugas Pendahuluan
1. Jelaskan karbohidrat yang termasuk gula pereduksi
2. Selain glukosa, zat-zat apa saja yang terdapat di dalam sampel Ananda ?
3. Berapa kadar gula pereduksi pada sampel tesebut ?

26
4. Berapakah volume larutan glukosa 1,0 mg/mL yang dibutuhkan
untukmasing-masing larutan standar ? Tuliskan perhitungannya.
5. Dapatkah metoda ini digunakan untuk menentukan kadar sukrosa, kadar
laktosa dan kadar maltosa?

H. Referensi
Dotti, Louis B; Orten, JM (1997), Laboratorium Instructions in Biochemistry, S
Louir: Mosby Company.
Harrow, Benjamin, et.al, Laboratorium Manual og Biochemistry, fifth
edition,London: Saunder Company.
Somogy, M, (1952), “ Notes on sugar Determination”, Journal of Biochemistry,
195, pp. 19-23.

27