생어 염기서열 분석

생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)은 Applied Biosystems에 의해 처음 상용화된 DNA 시퀀싱의 한 방법으로 시험관 DNA 복제 중에 DNA사슬을 마치는 디디옥시뉴클레오티드가 DNA 중합효소에 의해 제한적으로 삽입되는 것에 기반한다. 프래드릭 생어와 동료가 1977년에 개발하여, 약 25년동안 가장 널리 쓰인 시퀀싱 방법이다. 최근에는, 많은 양의 생어 염기서열 분석은 특히 대규모, 자동 게놈 분석을 위해 "NGS" 방법으로 대체되고 있다. 그러나, 생어의 방법은 더 작은 규모의 프로젝트와 NGS 결과의 검증, 긴 연속 DNA 염기서열 분석 (> 500 뉴클레오티드)을 위하여 아직 널리 쓰이고 있다.

DNA 시퀀싱의 생어(사슬 종료)의 방법

방법

고전적인 사슬 종료 방법은 하나의 단일 나선 DNA 주형, 하나의 DNA 시발체(primer), DNA 중합효소, 보통의 디옥시뉴클레오시드3인산염 (dNTP), 수정된 디-디옥시뉴클레오시드3인산염(ddNTP), DNA 나선연장을 종료하는 ddNTP가 필요하다. 이런 사슬 종료 뉴클레오티드는 인산이에스테르 결합 형성에 필요한 3'-OH가 없어 수정된 ddNTP가 삽입되었을 때 DNA 중합효소가 DNA 연장하는 것을 중단하도록 한다. ddNTP는 방사성이나 형광으로 표지되어 자동 시퀀싱 기계에서 감지된다.

DNA 샘플은 네 가지 분리된 시퀀싱 반응을 위한 샘플로 나뉘어 네 가지 표준 디옥시뉴클레오티드 (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 와 DNA 중합효소를 포함한다. 각 반응에 오직 넷 중 하나의 디디옥시뉴클레오티드 (ddATP,ddGTP,ddCTP,또는 ddTTP)가 추가되고, 나머지 추가할 뉴클레오티드는 보통의 것들이다. 이 디디옥시뉴클레오티드는 상응하는 디뉴클레오티드보다 약 100배 적은 농도로 추가되어(e.g. 0/005mM ddATP : 0.5mM dATP) 전체 염기서열이 계속 복제되는 동안 충분한 조각이 만들어지도록 한다. 이것을 더 실용적으로 정돈하여, 네 가지 분리된 샘플에서 모든 네 가지 ddNTP를 시험하기 위해 이 과정이 필요하다. 시발체에서의 주형 DNA 연장이 여러 차례 이루어지면, 생기는 DNA 조각은 열변성되고 겔 전기 영동을 사용해서 크기별로 분리된다. 1977년의 원본 발표에서는 ssDNA의 염기쌍 고리 형성이 같은 위치를 의 란하게 하였다. 이것은 변성된 polyacrylamide-urea gel에서 각 4개의 샘플이 하나의 개별 레인에서 처리될 때 자주 일어났다. DNA 띠들은 방사능 촬영이나 UV로 보여지게 되고 DNA 염기서열은 X-ray 필름이나 겔 이미지에서 바로 읽어질 수 있다.

방사성 표지된 시퀀싱 겔의 일부. 어두운 띠가 보인다.

오른쪽 사진에서 X-ray 필름이 겔에 노출되고 어두운 띠는 다양한 길이의 DNA 조각에 상응한다. 한 레인의 어두운 띠는 디디옥시뉴클레오티드(ddATP,ddGTP,ddCTP,또는 ddTTP)의 삽입에 따른 사슬 종료의 결과인 DNA 조각을 나타낸다. 네 레인의 다양한 띠의 상대적인 위치는 아래에서 위로 DNA 염기서열을 읽는 데에 사용된다.

표지된 dNTP 또는 표지된 ddNTP의 새 DNA 나선에서 DNA 조각은 시발체(1)에 방사성이나 형광으로 표지된다.