WESTERN BLOTTING: A TÉCNICA E APLICAÇÕES NA PESQUISA E ROTINA

DIAGNÓSTICA EM MEDICINA VETERINÁRIA

Marina Pacheco Miguel1, Liliana Borges de Menezes2, Eugênio Gonçalves de

Araújo3

1. Professora Doutora de Patologia Geral do Curso de Biomedicina, Campus

Jataí, Universidade Federal de Goiás (UFG). Coordenação do Curso de
Biomedicina, Unidade Jatobá, Campus Jataí, Universidade Federal de Goiás,
BR 364, Km 192, Parque Industrial, CEP: 75801-458, Jataí, GO, Brasil.
([email protected])
2. Professora Doutora de Patologia Geral, Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública, UFG
3. Professor Doutor de Patologia Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia,
UFG

Recebido em: 06/10/2012 – Aprovado em: 15/11/2012 – Publicado em: 30/11/2012

RESUMO

Os avanços na biologia molecular têm contribuído significativamente para o

entendimento da etiopatogênese das doenças. Proteínas realizam diferentes
funções no organismo e são responsáveis por manter sua homeostase. Mudanças
em sua composição podem desencadear processos patológicos, sendo de grande
importância, a aplicação de métodos moleculares para identificação de marcadores
de doenças. À partir do desenvolvimento da eletroforese em gel vários estudos
foram conduzidos a fim de permitir a imunodetecção de diferentes proteínas. O
advento da técnica de Western blotting, na década de 70, possibilitou que proteínas
separadas pela eletroforese fossem detectadas, caracterizadas e quantificadas. Este
método determinou grande avanço no estudo de diversas enfermidades animais,
principalmente por se tratar de um exame de alta sensibilidade e especificidade,
além de ser um método de rápida execução, precisão e acessível aos laboratórios
de pesquisa e de serviço de rotina diagnóstica. Esta abordagem tem por objetivo
revisar a técnica e apontar possibilidades de aplicação da técnica de Western
blotting para pesquisas e diagnóstico de agentes infecciosos em medicina
veterinária, sendo esta uma área em que os pesquisadores estão profundamente
envolvidos.

PALAVRAS-CHAVE: biologia molecular, imunodetecção, protein blotting, proteínas.

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer, Goiânia, v.8, n.15; p. 1704 2012
 WESTERN BLOTTING: THE TECHNIQUE AND APPLICATIONS ON THE
RESEARCH AND DIAGNOSTIC ROUTINE IN VETERINARY MEDICINE

ABSTRACT

Advances in molecular biology have contributed significantly to understanding the

genesis of diseases. The proteins perform different functions in the body and are
responsible for maintaining homeostasis. Changes in composition can trigger
pathological processes, so the application of molecular methods to identify disease
markers is of great importance. Various studies were conducted to allow
immunodetection of the different proteins since of the development of gel
electrophoresis. The advent of the Western blotting technique, in the 70s, allow
detection, characterization and quantified of the proteins by electrophoresis. This
method determined breakthrough in the study of various animal diseases, primarily
because it is a test of high sensitivity and specificity, and is a fast method of
execution, accuracy and accessible to research labs and diagnostic routine service.
This approach aims to review the WB technical and of application possibilities for
research and diagnosis of infectious agents in veterinary medicine, an area where
researchers are deeply involved.
KEYWORDS: imunodeteccion, molecular biology, protein blotting, proteins

INTRODUÇÃO

A separação de diferentes proteínas pela eletroforese passou a ser

realizada no início do século 20. A eletroforese em gel envolve a migração de
partículas, em um determinado gel, de acordo com seu tamanho e carga elétrica
(PAGANO, 1999). A utilidade desta técnica era limitada pelo fato de que as proteínas
separadas presentes em uma matriz gelatinosa eram de difícil acesso para provas
moleculares. A partir do advento do procedimento que permitia a transferência
destas proteínas para uma membrana adsorvente, esta limitação foi sanada
(KURIEN & SCOFIELD, 2003). Desde o início, em 1979, o protocolo para
transferência de proteínas de um gel de eletroforese para membrana tem evoluído
grandemente (KURIEN & SCOFIELD, 2006).
De acordo com alguns autores, a técnica de Western blotting (WB) iniciou
uma nova era no imunodiagnóstico, o qual reduziu significativamente as reações
cruzadas que podiam ser encontradas em outras técnicas moleculares de
diagnóstico. Este método foi inicialmente usado como teste de diagnóstico de
infecções virais e bacterianas e mais tarde foi empregado no campo da parasitologia
(SARIMEHMETOÚLU, 2002).
Esta revisão tem por objetivo revisar a técnica e apontar possibilidades de
aplicação da técnica de Western blotting para pesquisas e diagnóstico de agentes
infecciosos em medicina veterinária.

A TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING

Western blotting (WB) também conhecido como protein blotting ou

immunoblotting, é um poderoso e importante método em biologia molecular utilizado
para imunodetecção de proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e
transferência para membrana adsorvente (KURIEN & SCOFIELD, 2006). Esta
técnica permite detectar, caracterizar e quantificar múltiplas proteínas,
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principalmente aquelas que estão em baixas quantidades em determinada amostra
(KURIEN & SCOLFIELD, 2003).
WB evoluiu da técnica de DNA (Southern) blotting e RNA (Northern)
blotting. A denominação WB ao procedimento modificado superficialmente a partir da
técnica proposta por Towbin e seus colaboradores, e foi dada a fim de manter a
nominação geográfica tradicional destes métodos, iniciado pelo Southern blotting
(KURIEN & SCOLFIELD, 2003; 2006).
A técnica de WB oferece as seguintes vantagens: membranas úmidas são
maleáveis e de fácil manuseio; as proteínas imobilizadas na membrana são
rapidamente e uniformemente acessíveis a diferentes ligantes; somente uma
pequena quantidade de reagentes são necessários para a análise de transferência;
é possível fazer múltiplas réplicas do gel; o armazenamento da amostra transferida
pode ser prolongado, antes de ser usada e a mesma proteína transferida pode ser
usada para múltiplas análises sucessivas (KURIEN & SCOFIELD, 2006). Além disso,
em estudos relacionados à detecção de anticorpos e proteínas de agentes
infecciosos, este método é considerado altamente sensível e específico, sendo o
método de eleição para diagnóstico de inúmeras doenças dos animais (COOLEY et
al., 2001; TALMI-FRANK et al., 2006).
Desde seu início, protein blotting tem evoluído constantemente e agora a
comunidade cientista está diante de múltiplos caminhos e significados da
transferência e detecção de proteínas. O protocolo básico de WB pode ser resumido
nos seguintes passos: preparação das amostras e fracionamento de proteínas,
execução da eletroforese em gel, transferência das proteínas separadas do gel para
uma membrana adsorvente, bloqueio de ligações inespecíficas, adição de anticorpo
específico e detecção da reação.

PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS E FRACIONAMENTO PROTÉICO

A preparação de amostras é um dos passos cruciais do processo de

separação de proteínas. Os resultados do experimento dependem das condições
iniciais do material. Por esse motivo, um modelo experimental adequado e uma
preparação cuidadosa de amostras são essenciais para se obter resultados
significantes e confiáveis, particularmente em estudos comparativos de proteínas,
em que normalmente existem diferenças mínimas entre as amostras experimentais e
as do grupo controle (FREEMAN & HEMBY, 2004; BODZON-KULAKOWSKA et al.,
2007).
Tecidos, culturas celulares e fluídos corporais, como plasma ou liquido
cefalorraquidiano (LCR) são usados como fonte de proteínas. Além disso, podem ser
estudadas, também, proteínas de bactérias, vírus e outros agentes infecciosos
(BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).
Cada tecido possui sua particularidade e alguns agentes acometem
órgãos-alvo, os quais devem ser escolhidos para a realização de um correto
diagnóstico. Além disso, a pureza e estabilidade da proteína, a prevenção da
degradação e modificações durante a preparação das amostras tem importância
crítica para o bom resultado do procedimento. Por esse motivo alguns aspectos
devem ser considerados no momento da obtenção de amostras, conservação e
preparação do material (FREEMAN & HEMBY, 2004; BODZON-KULAKOWSKA et
al., 2007).
A remoção rápida do tecido, a dissecção e o congelamento (em nitrogênio
líquido ou a -80° C) são imperativos para manutençã o do bom estado das proteínas
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a serem estudadas no tecido selecionado (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).
Tecidos frescos ou provenientes de biopsia devem estar livres de sangue, soro,
estroma indesejável e gordura (AHMED & RICE, 2005). A prevenção da degradação
e desfosforilação protéica durante a preparação podem ser conseguidas com a
adição de proteases e inibidores de fosfatases (FREEMAN & HEMBY, 2004).
Após a coleta e armazenamento adequado da amostra, esta deve ser
homogeneizada, até que nenhuma partícula de tecido seja visualizada. O lisado
deve ser centrifugado, a fim de permitir a remoção de ácidos nucléicos, substâncias
insolúveis e proteínas abundantes. Em muitos casos, é recomendado o
fracionamento protéico com a intenção de concentrar proteínas menos abundantes e
de interesse para análises futuras (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).

Métodos para promover a ruptura celular e homogeneização

A homogeneização é um dos passos para a preparação de qualquer

amostra para análise de proteínas. O termo homogeneização tem vários sinônimos
tais como mistura, emulsificação e dispersão, que em geral, significam a obtenção
de amostras com mesma composição e estrutura em seu volume. Este processo
deve alterar as propriedades físicas sem provocar qualquer mudança na composição
química da amostra (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).
As forças aplicadas no processo de homogeneização permitem a
fragmentação de proteínas em pequenas partículas, facilitando o processo de
solubilização (CABRAL et al., 1997). Os métodos de homogeneização usados
podem ser divididos em cinco categorias: por homogeneização mecânica,
ultrassônica, por pressão, por descongelamento e osmótica ou lise por detergentes
(BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).

Solubilização de proteínas

O processo de solubilização de proteínas afeta sobremaneira a qualidade

do resultado final e é um determinante para o sucesso do processamento. A ruptura
das interações que agregam proteínas, como por exemplo, ligações
dissulfido/hidrogênio, forças de Van derWaals, ligações iônicas e interações
hidrofóbicas, permite a separação de proteínas na solução (BODZON-
KULAKOWSKA et al., 2007).
Considerando a heterogeneidade de proteínas e presença de
contaminantes em extratos biológicos, a separação simultânea dessas proteínas
remanescentes é um grande desafio. Na tentativa de impedir modificações,
agregações ou precipitações protéicas resultando em artefatos e subsequente perda
de proteínas, o processo de solubilização de amostras implica no uso de caotrópicos
(como uréia e/ou tiouréia), detergentes (como o 3-[(3-Colamidopropil)-dimetil-
amonio]-1-propano sulfonado (CHAPS) ou Triton X-100), agentes redutores (como
ditiotreitol/ditioeritritol (DTT/DTE) ou tributilfosfina (TBP) e inibidores de proteases. O
uso destas substâncias associado a um método de ruptura celular adequado e
técnicas de dissolução e concentração de proteínas determina a efetividade da
solubilização (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).

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 Remoção de contaminantes

Durante a preparação do tecido para análise de proteínas, é importante

diminuir a heterogeneidade da amostra o máximo possível. No SNC, por exemplo, é
particularmente abundante a presença de lipídios e esses devem ser eliminados
juntamente com os ácidos nucléicos, para obtenção de resultados de alta qualidade.
O método mais comumente usado é a precipitação seletiva de proteínas com
acetona ou ácido tricloroacético (TCA) (FREEMAN & HEMBY, 2004).
O pH e a força iônica das amostras influenciam consideravelmente na
solubilidade de proteínas. Por esse motivo, soluções tampões, soluções salinas e
detergentes são incluídos em amostras. Normalmente, estas soluções tendem a
interferir nos passos posteriores à separação de proteínas, inibindo o processo de
digestão e, por conseguinte, complicando a análise, razão pela qual precisam ser
removidos da análise em tempo apropriado (BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).
Em muitos casos, o uso de proteína pura não pode ser feito porque
proteínas como IgGs ou albumina constituem a grande maioria do concentrado de
proteínas na célula. A eliminação seletiva dessas proteínas permite a melhor
detecção de proteínas menos abundantes (LOLLO et al., 1999).

Métodos de enriquecimento de proteínas

Amostras biológicas usadas como fonte para análise de proteínas são

usualmente muito heterogêneas. Por isso, é de prioridade para a análise reduzir ao
máximo a complexidade das amostras por meio de um pré-fracionamento ou
promoção do enriquecimento das proteínas de interesse (BODZON-KULAKOWSKA
et al., 2007).
A idéia fundamental do pré-fracionamento é isolar amostras em frações
distinguíveis contendo número restrito de moléculas. As amostras podem ser
fracionadas usando uma variedade de métodos incluindo a precipitação,
centrifugação, cromatografia líquida e métodos baseados em eletroforese, filtração e
sedimentação por velocidade e equilíbrio. A seleção da técnica depende
grandemente da natureza da amostra a ser analisada e do objetivo do estudo
(FREEMAN & HEMBY, 2004).
Os métodos de enriquecimento permitem o aumento da concentração das
proteínas de interesse. Esta etapa possui grande importância no estudo de
proteínas, porque normalmente proteínas pouco abundantes possuem valiosas
informações diagnósticas e são responsáveis por processos importantes na célula
(AHMED & RICE, 2005).

ELETROFORESE EM GEL

A eletroforese é um processo analítico de separação de proteínas e

outras moléculas, em que a migração de partículas acontece em um campo elétrico
(matriz). Para tal evento é necessário que essas partículas sejam dotadas de carga
elétrica (VESTERBERG, 1989). O fracionamento de proteínas por eletroforese
começou no início do século 20 com a técnica de eletroforese livre em solução
tampão, criada por Arne Tiselius em 1937, a qual foi substituída pelo uso de géis de
poliacrilamida e agarose (PAGANO, 1999).
A escolha do material da matriz depende da resistência necessária para a
separação efetiva dos fragmentos protéicos. O gel de agarose possui poros com
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diâmetro que permitem a separação de fragmentos que variam de 200 pares de
bases (pb) a 50 kilobases (kb). A poliacrilamida é o material ideal para processos de
sequenciamento, pois permite a separação de fragmentos muito pequenos, de até
1.000 pb (SILVA & SOUSA, 2002).
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é um método simples e
rápido que separa pequenas proteínas de tamanhos diferentes usando enzimas de
restrição. Quando submetidas a um campo elétrico em pH neutro, as moléculas de
proteína são atraídas para o pólo positivo e repelidas do pólo negativo. Quando a
matriz apresenta resistência à migração das moléculas, os fragmentos menores
podem se mover com maior facilidade do que os maiores, havendo, então, uma
migração diferenciada dos fragmentos (Figura 1) (SILVA & SOUSA, 2002).

FIGURA 1: Esquema da eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). A amostra

é colocada em uma canaleta confeccionada no gel. Sob corrente
elétrica, as proteínas migram do lado de carga negativa para o lado
positivo. No gel, as proteínas se posicionam de acordo com seu
tamanho e peso.
Fonte: http://www.nehmi-ip.com.br/imagens_servicos/bio_23_p.gif

A separação de proteínas por tamanho é obtida com o uso do gel de

sódio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) (VESTERBERG, 1993). Esta
técnica é uma variação da técnica de PAGE amplamente utilizada para separar
subunidades protéicas e determinar suas massas moleculares (PAGANO, 1999). A
eletroforese SDS-PAGE é um poderoso procedimento, pois pode ser usado para
separar todos os tipos de proteínas incluindo proteínas de membrana, do
citoesqueleto e agregados de proteínas que normalmente são insolúveis em água,
alem de ser utilizado para separar proteínas em pequena quantidade (BÁRÁNY et
al., 1998).
Nesta fase, cada componente de uma mistura de proteínas é determinado
pelo SDS-PAGE como bandas separadas, através da migração de proteínas. A
mobilidade das proteínas no gel de poliacrilamida é dependente do seu tamanho e
da concentração de acrilamida. O gel age como uma peneira molecular. Pequenas
proteínas movem através do gel mais rápido que proteínas maiores. Quanto mais
alta a concentração de acrilamina, menores são os poros do gel e as proteínas se
movem mais lentamente. Entretanto, géis com alta concentração de acrilamida são
usados para determinar proteínas de tamanho pequeno, e géis com baixas
concentrações de acrilamida são usados na determinação de proteínas grandes
(PAGANO, 1999).
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 Antes da eletroforese, as amostras podem ser tratadas com uma solução
de β-mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio (SDS). O β-mercaptoetanol é um
agente de redução que cliva as ligações dissulfeto. O SDS é um detergente aniônico
que desnatura proteínas e forma uma camada de cargas negativas, o qual as
proteínas passam a ter uma carga intrínseca. Assim, as proteínas tratadas assumem
uma forma de haste e carregadas por uma malha de carga negativa. Quando as
proteínas tratadas são colocadas em eletroforese no SDS-PAGE, as proteínas
migram para o eletrodo positivo. Desta forma, as proteínas podem ser separadas
pelos seus pesos moleculares (PAGANO, 1999; GARCIA-RODRIGUEZ et al., 2003;
BODZON-KULAKOWSKA et al., 2007).

TRANSFERÊNCIA PARA MEMBRANA

A fim de tornar as proteínas acessíveis à detecção por anticorpos realiza-

se a transferência destas de um gel para uma membrana adsorvente (PAGANO,
1999). A membrana de transferência é colocada face-a-face com o gel de
separação, e aplica-se uma corrente elétrica. Durante a transferência, o gel esta na
face do eletrodo negativo e a membrana em sua face positiva. Então, as proteínas
contendo carga elétrica se movem do gel para a membrana mantendo a mesma
disposição do gel. Como resultado desse processo de transferência e ligação à
membrana, as proteínas são expostas a uma fina camada para detecção. A ligação
das proteínas à membrana é baseada tanto em interações hidrofóbicas quanto em
interações de cargas entre a membrana e as proteínas (KURIEN & SCOFIELD,
2003). A comunidade cientista tem confrontado uma variedade de caminhos e
significados para executar essa transferência (SILVA & SOUSA, 2002).
A eficiência na transferência de proteínas do gel para uma membrana
sólida depende grandemente da natureza do gel, massa molecular das proteínas
que estão sendo transferidas e o tipo de membrana usada. Proteínas com alto peso
molecular marcam pobremente após SDS-PAGE, resultando em menores níveis de
detecção no WB. No entanto, a eficiência na transferência de cada proteína tem sido
facilitada com o aquecimento, tampões especiais e digestão proteolítica parcial antes
da transferência (KURIEN & SCOFIELD, 2006).
Vários tipos de membrana estão disponíveis para a realização do
processo. Membranas à base de nitrocelulose, polivinildina difluorada (PVDF), papel
ativado ou nylon ativado têm sido utilizadas com sucesso para promover a ligação
proteína/ membrana no momento da transferência. A membrana mais comumente
usada é a de nitrocelulose, por apresentar melhor eficiência na ligação de diferentes
tipos de proteínas. Embora esta membrana apresente custo inferior que a de PVDF,
é menos eficiente para proteínas que promovam ligações não-covalentes, somando-
se a isto o fato de apresentarem uma fragilidade ao manuseio antes da hidratação
(PAGANO, 1999; KURIEN & SCOFIELD, 2006).
Embora a transferência de proteínas do SDS-PAGE para uma membrana
de nitrocelulose ou de PVDF possa ser executada de diferentes maneiras tais como:
difusão simples; transferência a vácuo; electroblotting, esta última é a que
correntemente tem sido utilizada na atualidade. As principais vantagens do
Electroblotting são a velocidade e a transferência completa quando comparada à
difusão simples e à transferência a vácuo. O eletroblotting pode ser realizado por
imersão completa de um sanduíche gel-membrana em uma solução tampão
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(transferência úmida) ou colocando o sanduíche gel-membrana entre papel filtro
absorvente em um tampão de transferência (transferência semi-seca). O método
mais consagrado é o de transferência horizontal semi-seca (Figura 2) (PAGANO,
1999; KURIEN & SCOFIELD, 2006).

FIGURA 2: Transferência de proteínas de gel para membrana com o

método de transferência horizontal semi seca.
Fonte:http://www.fermentas.com/techinfo/Electrophoresi/pprot
eintransfer.htm

BLOQUEIO DE LIGAÇÕES INESPECÍFICAS

Uma grande quantidade de proteínas indesejáveis ligam-se fortemente à

nitrocelulose em diferentes condições experimentais. No entanto, leite seco
desnatado, soro albumina bovina (BSA), Triton X-100, Nonidet P-40 e Tween 20 são
eficazes na remoção de ligações proteicas. Leite seco desnatado e BSA são
rotineiramente utilizados em procedimentos de imunodetecção de proteínas para
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evitar ligações inespecíficas (KURIEN & SCOFIELD, 2003; KURIEN & SCOFIELD,
2006).

ADIÇÃO DO ANTICORPO

Em mamíferos, um complexo grupo do sistema celular está envolvido na

proteção do organismo contra substâncias tóxicas e invasão por agentes
infecciosos. Como parte da resposta de defesa, células do sistema linfático podem
ser induzidas para produzir proteínas específicas (anticorpos) que se ligarão às
substâncias estranhas (antígenos) neutralizando seu impacto biológico. Em resposta
a mudança imunológica há sintetização de um simples anticorpo que reconhece, e
possui uma alta afinidade, uma região discreta chamada epítopo ou determinante
antigênico, imunizando o antígeno. Devido um antígeno geralmente possuir vários
epítopos diferentes, normalmente cada uma das várias células do sistema imune
produzem um diferente anticorpo contra um dos vários epítopos do antígeno. De tal
modo que um grupo de anticorpos, dos quais todos reagem com os diferentes
antígenos, são designados como anticorpo policlonal. Mais tarde os anticorpos
passaram a ser utilizados como diagnóstico de agentes para determinar a presença
de proteínas em amostras biológicas (GLICK & PASTERNAK, 1998).
Normalmente, esses anticorpos (monoclonais ou policlonais) são
utilizados para detectar uma proteína (antígeno ou epítopo) específica, ligando-se
diretamente a ela, sendo o anticorpo primário da técnica de immunoblotting.
Anticorpos monoclonais são melhores imunodetectores, entretanto, anticorpos
secundários antipeptídicos específicos devem ser usados (PAGANO, 1999).
Posteriormente, esta reação antígeno/ anticorpo primário será exposta a
um anticorpo secundário direcionado à porções espécie-específicas do anticorpo
primário (PAGANO, 1999). Normalmente, o anticorpo secundário está ligado à uma
enzima reveladora, por exemplo biotina, que gera uma mudança de coloração ou um
sinal fotométrico (Figura 3) (KURIEN & SCOFIELD, 2003).

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 FIGURA 3: Técnica de Western blotting evidenciando a adição de anticorpos.
Fonte: http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2B.asp

DETECÇÃO DE ANTÍGENOS

A imunomarcação de proteínas é mais sensível que os métodos de

detecção convencionais (PAGANO, 1999). O protein blotting somente é eficiente
quando um método de detecção apropriado é aplicado (KURIEN & SCOFIELD,
2003).
As proteínas no immublotting têm sido detectadas diretamente por uso de
corantes orgânicos (Ponceaus red, amido negro, fast green), marcadores
fluorescentes (fluorescamina, Coumarin), vários métodos com coloração de prata e
partículas coloidais como ouro, prata, cobre, ferro ou Indian ink. O tipo de coloração
a ser utilizado deve ser compatível com a membrana usada para a transferência de
proteínas (PAGANO, 1999; KURIEN & SCOLFIED, 2003).
Após a adição do anticorpo primário e anticorpo secundário, de acordo
com KURIEN & SCOLFIELD (2006) dois métodos de detecção de antígenos são
comumente usados: radioativo e imunoenzimática.
O método radioativo promove a ionização e subseqüente autoradiografia
para visualização da interação antígeno-anticorpo. A importância deste método de
detecção está em franco desuso, por apresentar um alto custo e riscos à saúde
(KURIEN & SCOLFIED, 2006).
A quimioluminescência preconiza a incubação de um substrato
fluorescente que ao ser exposto a uma enzima reveladora associada ao anticorpo
secundário gera uma coloração. Esta florescência é detectada por um
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filme fotográfico ou câmeras especias que capturam uma imagem digitalizada do
WB. A imagem é analisada por densitometria, a qual avalia a quantidade de proteína
colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade óptica (KURIEN &
SCOLFIED, 2006).
Atualmente, a quimioluminescência é o método imunoenzimático de
eleição em WB. Normalmente, horseadish peroxidase ou fosfatase alcalina ligados à
anticorpos são usados com inúmeros substratos solúveis que produzem produtos
coloridos insolúveis. Esses métodos são de simples execução e não requerem
equipamentos sofisticados, além de conferirem resultados rápidos. As desvantagens
do método compreendem na dificuldade de obtenção de fotografias com qualidade,
diferetemente do método radioativo, pois a coloração da reação apresenta baixo
contraste, somando-se a isto, o fato de não produzir resultados quantitativos
(PAGANO, 1999; KURIEN & SCOLFIED, 2006).

APLICAÇÕES DO WB NO DIAGNÓSTICO DAS ENFERMIDADES ANIMAIS

O emprego da técnica de WB teve início nos anos 70 com o advento da

transferência de proteínas de uma matriz gelatinosa para uma membrana
adsorvente. A partir disso, o emprego de anticorpos marcados com enzimas foi
possível, o que permitiu a detecção e quantificação de proteínas previamente
separadas (KURIEN & SCOFIELD, 2003). O WB é uma técnica recente, que possui
alta sensibilidade e especificidade e seu emprego em diagnóstico das doenças dos
animais é crescente (TALMI-FRANK et al., 2006).
Algumas enfermidades infecciosas de animais podem ser diagnosticadas
por western blotting. Um exemplo é o diagnóstico de encefalopatias espongiformes
transmissíveis (EETs), desordens neurodegenerativas crônicas fatais provocadas
por príons, que podem acometer animais e seres humanos (NEVES, 2003;
THOMZIG et al., 2007). O diagnóstico confirmatório é dado pós-morte, por meio de
exames histológicos e detecção da isoforma priônica, por meio de microscopia
eletrônica, imuno-histoquímica e WB (COOLEY et al., 2001; BARROS et al., 2006).
Entre os métodos imunológicos utilizados para detecção do príon, a técnica de WB
tem sido amplamente utilizada por permitir o diagnóstico rápido e preciso, pois
possui alta sensibilidade e especificidade, além de possibilitar novos estudos sobre
patogênese e etiologia da enfermidade. Além disso, o WB associado ao anticorpo
monoclonal 6H4 é o método de escolha para exames de sistema nervoso de bovinos
com BSE em vários países da Europa. Desde janeiro de 2000, esta técnica vem
sendo utilizada conjuntamente com o exame histopatológico e imuno-histoquímica
para diagnóstico de BSE e Scrapie (COOLEY et al., 2001; MIGLIORE et al., 2012).
Outra doença importante na medicina veterinária é a leishmaniose
visceral americana (LVA), causada pela Leishmania chagasi. Esta enfermidade é de
grande importância em saúde pública por sua natureza zoonótica, sendo o cão
reconhecido como um importante reservatório. O vetor da leishmaniose visceral no
Brasil é a fêmea do inseto Lutzomyia longipalpis (STRAUSS-AYALI & BANETH,
2000; LINHARES et al., 2005). Uma medida de controle da leishmaniose canina é a
eliminação de cães soropositivos em técnicas sorológicas, como imunofluorescência
indireta (IFA) e ELISA (SILVA et al., 2005). No entanto, este método tem
apresentado resultados conflitantes, principalmente, de falsos-positivos (DE PAULA
et al., 2003). Desta forma, estudos demonstraram que a técnica de WB mostrou-se
mais sensível e precoce quando comparada às técnicas de IFA e ELISA, sugerindo
a possibilidade de sua utilização como preditora da infecção no cão (AISA et al.,
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1998; SILVA et al., 2005). SILVA et al., (2005) em estudo para reconhecimento
antigênico de LVA em 120 cães demonstrou que 26% dos cães que eram negativos
para o teste de IFA tiveram o reconhecimento de frações antigênicas de L. chagasi
no WB. Os autores sugerem que os cães positivos para o WB e negativos para o IFA
eram animais resistentes que apresentavam baixos níveis de anticorpos, dessa
maneira não detectáveis pelo IFA.
A mieloencefalite equina por protozoário (MEP) é uma doença neurológica
infecciosa de equinos e outros equídeos das Américas, frequentemente fatal, que
tem como agente etiológico primário o protozoário Sarcocystis neurona (ROSSANO
et al., 2003; BARROS, 2007). Recentemente, outro microrganismo, Neospora
caninum/ Neospora hughesi, foi implicado na etiologia de alguns casos de MEP
(BARROS, 2007). Esta enfermidade tem sido diagnosticada no Brasil, porém não
existem dados sobre a prevalência de casos. Ainda hoje, a quantidade de equídeos
com sintomatologia nervosa que são necropsiados com diagnóstico de MEP é
diminuta, portanto a prevalência pode ser maior do que imaginada anteriormente
(BARROS, 2007).
O diagnóstico de MEP é dado por meio da realização de exame clínico
neurológico e pela realização de WB para detecção de anticorpos de S. neurona em
amostras de sangue e líquido cefalorraquidiano (LCR) (ROSSANO et al., 2003).
Estudos de soroprevalência têm mostrado que anticorpos contra S. neurona estão
presentes em grande proporção no soro de equinos aparentemente normais, por
isso é recomendado a clínicos veterinários a obtenção de LCR para determinação de
anticorpos contra o agente, indicando sua presença no SNC (FURR et al., 2002).
A salmonelose é uma infecção grave e de grande importância na
medicina e na veterinária. A Salmonella enteritidis possui proteínas de membrana e
lipolissacarídeos que tem importante papel na virulência e nas propriedades
imunológicas do agente, o que pode gerar quadros de intoxicação alimentar de
diferentes intensidades. Estudos utilizando WB são realizados para caracterização
dessas proteínas de membrana, principalmente para possibilitar o desenvolvimento
de vacinas, que são importante método para evitar a doença (MARIPANDI & Al-
SALAMAH, 2010).
Em suínos, a infecção por Mycoplasma hyopneumoniae é responsável por
grandes perdas econômicas na suinocultura, por apresentar alta morbidade e baixa
mortalidade. O diagnóstico precoce e confirmatório tem grande relevância para
eliminação do agente em uma granja acometida. Assim, o WB tem sido usado para
diminuir resultados os erros e resultados discrepantes dos testes sorológicos
(AMERI et al., 2006).
Na pesquisa, a técnica é muito empregada para entendimento de
mecanismos de neoplasias (ZHANG et al., 2012; CATTELANI et al., 2012), no
estudo de doenças hereditárias (SETA et al., 1996), para descoberta de proteínas
para produção de vacinas (MARIPANDI & Al-SALAMAH, 2010).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A técnica de eletroforese permite a separação de proteínas de cargas

elétricas diferentes, mas é limitada por não produzir a quantificação e detecção de
proteínas específicas. As técnicas de blotting abriram portas para novos estudos
acerca da patogênese e etiologia de inúmeras enfermidades animais, garantindo o
avanço da ciência. O Western blotting permitiu que proteínas específicas fossem
detectadas, se firmando como um método de diagnóstico de eleição de inúmeras
ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer, Goiânia, v.8, n.15; p. 1715 2012
doenças, por ser altamente sensível e específico e de rápido resultado.
O uso do WB na rotina diagnóstica ainda é insipiente, por se tratar de uma
técnica que necessita mão-de–obra qualificada e por apresentar custo relativamente
superior quando comparado a métodos convencionais e métodos alicerçados em
base da biologia molecular. Porém, vários estudos demonstram que a utilização de
técnicas convencionais já consagradas, em determinadas doenças, não apresentam
resultados totalmente confiáveis e satisfatórios, sendo a técnica de immunoblotting
preferencial para confirmação diagnóstica.

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