ARTIGO ORIGINAL | ORIGINAL ARTICLE | ARTÍCULO ORIGINAL

doi: 10.5123/S2176-62232014000400007

Perfil epidemiológico e caracterização molecular de

Salmonella Typhi isoladas no Estado do Pará, Brasil
Epidemiological profile and molecular characterization of Salmonella Typhi strains isolated in Pará
State, Brazil

Perfil epidemiológico y caracterización molecular de Salmonella Typhi aisladas en el Estado de Pará, Brasil

Daniela Cristiane da Cruz Rocha Iami Raiol Borges

Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

Anderson Nonato do Rosario Marinho Francisco Luzio de Paula Ramos

Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

Melissa de Sá Oliveira dos Reis Edvaldo Carlos Brito Loureiro

Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

RESUMO

A Salmonella enterica sorotipo Typhi é o agente etiológico da febre tifoide, doença sistêmica que ocasiona quadros
de febres prolongadas juntamente com distúrbios intestinais, podendo evoluir até a perfuração intestinal. No Estado
do Pará, a endemicidade reflete um vasto número de surtos e de casos esporádicos em diferentes municípios. O
presente estudo teve como objetivo realizar uma caracterização epidemiológica e molecular de Salmonella Typhi
isoladas no Pará. Foram analisados quatro genes de virulência (viaB, prt, fliC-d e invA) em 75 casos de febre
tifoide com isolamento a partir de hemoculturas e coproculturas, no período de 2009 a 2011. Para averiguação
de reação cruzada, foram incluídas seis espécies de outras enterobactérias (Escherichia coli, Salmonella Paratyphi A,
Salmonella Typhimurium, Salmonella Panama, Proteus mirabilis e Shigella flexneri). Do total de amostras analisadas,
64% são oriundas de indivíduos do gênero masculino e 36%, do feminino, com diferença significativa entre os sexos
(p = 0,0209). Na análise da distribuição anual dos casos de febre tifoide destaca-se a maior ocorrência em 2010,
com 31 casos. A maioria destes foi detectada na hemocultura (72%) em relação à coprocultura (28%) (p = 0,0002).
A PCR convencional, com quatro pares de primers, identificou corretamente S. Typhi, produzindo quatro bandas
positivas, observadas em 100% das amostras analisadas. Na análise genética, as cepas S. Typhi foram altamente
similares para os genes analisados, que permaneceram estáveis ao longo das análises, desde o isolamento. Desta
forma, os quatros pares de primers apresentaram-se específicos e, deste modo, passíveis de serem utilizados na
identificação e caracterização de S. Typhi.
Palavras-chave: Salmonella Typhi; Reação em Cadeia da Polimerase; Fatores de Virulência; Diagnóstico.

INTRODUÇÃO Em todo o mundo estima-se, anualmente, a

A febre tifoide é uma doença sistêmica, causada ocorrência de 12 a 33 milhões de casos de febre
pela Salmonella enterica sorotipo Typhi, caracterizada tifoide que ocasiona 600 mil mortes, com a maioria
clinicamente por febre alta, cefaleia, diarreia e dor das notificações ocorrendo em países da Ásia (60%) e
abdominal, com elevada prevalência em regiões África (35%), onde se apresenta de forma endêmica,
de precárias condições sanitárias, cuja transmissão com epidemias esporádicas. Em países desenvolvidos,
ocorre por meio do consumo de água e alimentos os casos verificados são geralmente "importados" por
contaminados1,2. meio de indivíduos que viajam aos países onde ocorre
a doença3. No Brasil, todas as regiões registram
casos, com índices maiores nos estados do Norte e
Nordeste brasileiro, com os Estados da Bahia (1.765)
e Amazonas (1.447) apresentando o maior número de
Correspondência / Correspondence / Correspondencia: casos nos dez últimos anos4.
Daniela Cristiane da Cruz Rocha
Laboratório de Enteroinfecções Bacterianas, Seção de Bacteriologia e No Estado do Pará, surtos de febre tifoide têm sido
Micologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS frequentemente registrados e os primeiros registros da
Rodovia BR 316, km 7, s/n°. Bairro: Levilândia
CEP: 67030-000 Ananindeua-Pará-Brasil
doença foram feitos por Santos et al5 com a notificação
Tel.: +55 (91) 3214-2297 / (91) 3214-2122 de 281 casos no ano de 1985. Em seguida, no final da
E-mail: [email protected] / [email protected] década de 1980, ocorreram surtos nos Municípios de

http://revista.iec.pa.gov.br Rev Pan-Amaz Saude 2014; 5(4):53-62 53

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Marabá e Abaetetuba, seguidos de outros relatos nos Na Salmonella Patogenicity Island (SP-1) foi
Municípios de Óbidos, em 1997, Moju, em 1999, e descrito o operon Inv (invasibility) que possui em sua
Anajás, em 2001, com 61, 72 e 79 casos identificados constituição sete genes denominados de invABCDEFG.
da doença, respectivamente6,7,8,9. Por meio de métodos O gene invA apresenta-se no operon como o primeiro,
moleculares (Nested PCR) foi também possível detectar desempenhando papel crítico na invasão das células
S. Typhi em amostras de água de poços freáticos e do epitélio. A ausência do gene invA em S. enterica
igarapés do Estado10. Mais recentemente, no período leva a não expressão dos genes invABC, ocasionando
de 1991 a 2008 identificaram-se 835 casos de a perda do potencial de invadir células no epitélio
salmonelose em 43 municípios do Estado do Pará, dos dos mamíferos19,20. A S. enterica sorotipo Typhi possui
quais 492 (58,9%) representaram casos de febre tifoide. fímbrias responsáveis pela adesão nas células intestinais
Dos 47 sorotipos de Salmonella identificados, a S. Typhi e os lipopolissacarídeos (LPS) que proporcionam a
foi a mais frequente, com 77,8%, demonstrando assim proteção da bactéria da atuação letal das defensinas,
a importância epidemiológica da febre tifoide na ambos considerados fatores de virulência por suas
região11. propriedades de adesão e proteção para S. Typhi.
A síntese do LPS é codificada por cerca de 20 genes,
O método atualmente utilizado para o diagnóstico
entre eles o gene prt. Porém o antígeno capsular Vi
é o cultivo. Esse procedimento requer o emprego de
parece ser o mais importante, pela propriedade de
diferentes etapas, que vão desde o isolamento até
proteger a bactéria da ação dos mecanismos de
a identificação final, com o emprego de diferentes
imunidade inata, tornando-a potencialmente patogênica
meios de cultura, demandando técnicas laboriosas e,
para o hospedeiro21.
sobretudo, tempo, até que se conclua o diagnóstico,
que ainda pode resultar em falso-negativos, em função Dentre os isolados de Salmonella, em sua maioria
de muitos fatores interferentes que podem atuar durante foi observado que apenas a expressão de dois genes é
o processo. A demora no diagnóstico inviabiliza a responsável por codificar os antígenos flagelares, quais
conduta terapêutica desejada, constituindo fator sejam: o gene fliC, responsável por codificar o antígeno
agravante diante da severidade clínica que alguns casos de fase 1, e o gene fljB, responsável por codificar o
podem assumir. Uma forma de contornar esse problema antígeno da fase 2, ambos conservados no gênero.
é desenvolver ensaios baseados na amplificação de São expressos por um mecanismo de variação de fases,
DNA, os quais, futuramente, poderão ter utilização no qual o fliC é encontrado em todas as salmonelas
rotineira, beneficiando o usuário do sistema por e em Escherichia coli, que possui um homólogo,
encurtar o tempo para o diagnóstico e pela precisão e diferentemente do fljB, que se encontra apenas no
confiabilidade na identificação do agente, facilitando genoma de Salmonella, podendo ser isolado em
a atuação das autoridades de saúde nas ações de quatro das seis subespécies, com a presença do gene
controle do agravo12,13. fliC estando relacionado ao aumento da virulência do
patógeno in vivo22.
Com a disseminação desses métodos, técnicas
genotípicas, como a amplificação e o sequenciamento Bons resultados na vigilância epidemiológica da
do genoma de patógenos, entre outras, têm mudado febre tifoide só serão possíveis por meio da admissão
de forma significativa as oportunidades para a definitiva de testes que, além de permitirem o
realização de investigações epidemiológicas, estudos da diagnóstico rápido da infecção e fornecerem resultados
patogênese, de diagnóstico e de controle das doenças confiáveis, possam ser largamente disponibilizados.
microbianas14. Esses métodos moleculares apresentam Ressalta-se que esses métodos são capazes de superar
muitas vantagens sobre as técnicas convencionais. Uma os problemas ocasionados pelas barreiras geográficas,
das mais importantes é o poder discriminatório dos que implicam diretamente na viabilidade do agente
métodos baseados em análise de DNA, que é maior para o cultivo do sangue e das fezes, além de superar
quando comparados aos procedimentos fenotípicos15. também o frequente problema do uso prévio de
antibióticos. Assim, o objetivo desse estudo foi a
A presença de fatores de virulência, codificado identificação rápida e caracterização, por meio de
por genes presentes nos microrganismos patogênicos, métodos moleculares, de S. Typhi isoladas no período
proporciona a aptidão de determinadas bactérias em de 2009 a 2011 no Estado do Pará e identificar as
provocar doenças16. Para um melhor dimensionamento características demográficas (sexo, idade, município de
do papel destes genes no mecanismo de residência) e epidemiológicas (localidade provável de
patogenicidade torna-se indispensável uma total infecção) dos pacientes.
compreensão das etapas do processo infeccioso, que
podem ser divididas em adesão, invasão, replicação, MATERIAIS E MÉTODOS
seguida de mecanismos que levam a resistência ao
sistema de defesa, causando danos ao hospedeiro17. Aspectos epidemiológicos e demográficos
Estes genes de virulência podem estar presentes tanto Foram estudados 75 casos de febre tifoide com
em elementos genéticos móveis, como transposons ou isolamento de S. Typhi a partir de hemoculturas e
plasmídeos, bem como integrar regiões específicas do coproculturas, no período de 2009 a 2011, com
material genético, cromossomo da bactéria, sendo este os isolados disponíveis na Bacterioteca da Seção
último denominado de ilhas de patogenicidade (IP)18. de Bacteriologia e Micologia do Instituto Evandro

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Chagas (IEC). O número de casos avaliados obedeceu Ewing24. Após essa etapa foi realizada identificação
à demanda anual da febre tifoide diagnosticada pelo sorológica determinando os antígenos somáticos (OD1),
IEC. Os pacientes foram constituídos de crianças e de envoltório (Vi) e flagelar (Hd) para a confirmação do
adultos procedentes de 18 municípios do Estado do sorotipo S. Typhi.
Pará (Figura 1). Esta pesquisa utilizou levantamento
Extração do DNA bacteriano e PCR
de dados junto a prontuários para conhecer as
características demográficas e epidemiológicas, os quais O DNA das amostras bacterianas foi extraído pela
foram mantidos em sigilo, em conformidade com o que técnica de fervura e congelamento25. Na PCR foram
prevê os termos da Resolução 466/12 do Conselho utilizados iniciadores para a região do gene viaB,
Nacional de Saúde23. prt, fliC-d e invA, como descrito na tabela 1. Cada
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de reação de amplificação teve um volume final 25 µL,
Ética em Pesquisa com Seres Humanos do IEC, sob contendo 20 ng de DNA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,5,
parecer n° CAAE: 04511612.9.0000.0019. 50 mM KCl, 1,5/µM MgCl2, 1,25 mM de cada dNTP,
1,25 mM de cada primer e 0,5 unidade de Taq DNA
Identificação bacteriana polimerase Platinum (Invitrogen). As amplificações foram
As amostras bacterianas estavam armazenadas realizadas em termociclador automático de gradiente
em ágar estoque (Difco/USA) e foram repicadas modelo Vereti™ 96-Well Thermal Cycler (Applied
para caldo Luria (LB-Difco/USA). Após a turvação do Biosystems – US), com a utilização do programa:
caldo, uma alíquota foi semeada em placas de ágar 4 min a 95º C, 35 ciclos com de 1 min a 95º C,
Salmonella–Shigella (SS-Difco/USA). De cada placa 1 min a 60º C e 1 min a 72º C, terminando com uma
foram selecionadas duas colônias lactose negativas e etapa de alongamento final de 7 min a 72º C. Após a
semeadas em ágar tríplice-açúcar-ferro (TSI-Difco/USA) e amplificação para visualização do produto final da PCR,
ágar lisina ferro (LIA-Difco/USA), seguida de incubação todas as amostras foram aplicadas em gel de agarose
à temperatura de 37º C por 24 h. As amostras que (2%). E os tamanhos dos fragmentos amplificados foram
apresentaram reações características foram identificadas mensurados com a utilização de marcador de peso
bioquimicamente segundo as recomendações de molecular 1 Kb.

Fonte: LabGeo IEC/SVS/MS.

Figura 1 – Estado do Pará, com destaque para os 18 municípios investigados neste estudo

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Tabela 1 – Genes alvo, primers utilizados, números de pares de bases dos amplicons (pb) e referência
Gene Alvo Sequência dos primers Amplicon (pb) Referência
viaB F GTTATTTCAGCATAAGGAG 439 pb Levy et al26
viaB R CTTCCATACCACTTTCCG
prt F CGTTTGGGTTCCTTGGATCACG 369 pb Kumar et al12
prt R CTATAATGGCGGCGGCGAGTTC
fliC-d F GCTTAATGTCCAAGATGCCTAC 587 pb Kumar et al12
fliC-d R GAGCAACGCCAGTACCATCTG
invA F CGAGCAGCCGCTTAGTATTGAG 881 pb Kumar et al12
invA R CCATCAAATTAGCGGAGGCTTC

Determinação dos parâmetros de (p = 0,0209). Na análise da distribuição anual dos

especificidade e sensibilidade da técnica casos de febre tifoide no período de 2009 a 2011
A especificidade dos primers foi testada destaca-se a maior ocorrência em 2010, com 31 casos,
submetendo-se à PCR o DNA de diferentes seguido dos anos 200923 e 201121; sendo que a maioria
microrganismos de referência da microbiota do trato foi detectada na hemocultura (54-72%) em relação à
gastrointestinal e de agentes patogênicos, tais como: coprocultura (21-28%) (p = 0,0002) (Tabela 4).
E. coli ATCC 25922, Salmonella Paratyphi A ATCC Locais de ocorrência
7245, Salmonella Typhimurium ATCC 14028,
Durante o período de 2009-2011, verificou-se
Salmonella Panama ATCC 2656, Proteus mirabilis
a ocorrência de pacientes com febre tifoide em 18
ATCC 25933 e Shigella flexneri ATCC 12022. Para
municípios, com destaque para Belém, com 28
determinação da sensibilidade da técnica, o DNA de
casos (37,3%), e, em sequência, as prevalências dos
S. Typhi foi submetido a diluições seriadas em água
Municípios de Ananindeua, 14 (18,7%) e Abaetetuba,
ultra pura (Invitrogen) e em seguida ao protocolo
seis (8,0%). E por ordem decrescente de frequência,
da PCR. Para quantificar o DNA, usou-se um
os demais Municípios: Santa Cruz do Ararí, quatro
espectofotômetro (Nano-Drop ND 100 UV-Vis).
(5,3%), Curralinho, três (4%); Mocajuba, Muaná, Ponta
Análise estatística de Pedras e Portel com dois (2,7%); Acará, Anajás,
Análise estatística dos resultados foi realizada por Benevides, Breves, Cachoeira do Arari, Cametá,
testes não-paramétricos (Qui-quadrado com correção Marituba, Moju e Oeiras do Pará com um (1,3%). Não
de Yates), utilizando o programa Bioestat 5.027, com informados, três (4%).
α = 0,05 e nível de significância dos resultados no Na figura 2 localiza-se a distribuição dos casos de
valor de p < 0,05. febre tifoide nos bairros do Município de Belém, com a
maior prevalência nos bairros de Jurunas e Marco, cinco
RESULTADOS (17,8%), seguido de Condor e Terra Firme, três (10,7%),
e Tenoné, dois (7,1%).
Faixa etária/gênero
A tabela 2 apresenta o total e o percentual dos sexos Detecção de genes de virulência viaB, prt, fliC-d
masculino e feminino envolvidos nos casos de febre e invA por meio da PCR
tifoide, transcritos das fichas clínico-epidemiológicas, A PCR convencional, com quatro pares de primers
e a distribuição nas diferentes faixas etárias durante viaB, prt, fliC-d e invA identificaram corretamente S. Typhi
o período de 2009 a 2011. Do total de amostras produzindo quatro bandas positivas; que consistem
analisadas, 64% (48/75) são pertencentes ao gênero dos seguintes produtos da PCR: viaB (439 pb), prt
masculino e 36% (27/75) ao feminino, com diferença (369 pb), fliC-d (587 pb) e invA (881 pb) pesquisados
significativa entre os sexos (p = 0,0209). A faixa etária em todas as 75 amostras selecionadas. Todos os
variou de 1 a 60 anos, com maior frequência da doença quatros marcadores foram amplificados e observados
entre 19 e 60 anos em ambos os sexos. Ainda no que em 100% das amostras analisadas (Figura 3).
tange a faixa de idade, os dados obtidos demonstram
Especificidade e sensibilidade da técnica
que 52 (69,3%) eram adultos e nove (12%) eram
crianças (p = < 0,0001). A especificidade da técnica foi avaliada submetendo-
se à PCR o DNA de diferentes microrganismos da
Sazonalidade dos casos microbiota normal do trato gastrointestinal e de
Com relação à distribuição sazonal da doença, a enteropatógeno (Tabela 5). Todas as amostras de
tabela 3 mostra o semestre/ano, respectivamente, dos Salmonella foram positivas para o gene invA. Como
isolamentos das amostras analisadas. Observa-se que esperado, os iniciadores prt neste estudo amplificaram
a maior ocorrência foi no segundo semestre, o que tanto os sorotipos Typhi como os Paratyphi A, obtendo-
coincide com o período de pouca chuva na região se produtos de PCR com o mesmo tamanho (369 pb).

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Por outro lado, os genes viaB e fliC-d apresentaram bactérias de referência, bem como os isolados clínicos de
amplificação somente em S. Typhi. Estes resultados Salmonella, foram identificadas com precisão pelo teste.
demonstram que os genes viaB, prt, fliC-d e invA, quando O limite de detecção da PCR, ou seja, a quantidade
amplificados em conjunto, foram específicos para as mínima de DNA necessária para se obter uma reação
cepas de S. Typhi. Assinala-se que todas as amostras de positiva, foi de 0,5 pg/25 µL de reação.

Tabela 2 – D
 istribuição dos casos de febre tifoide de acordo com a faixa etária e o sexo no período de 2009 a
2011, Estado do Pará, Brasil
Sexo
Total
Grupos Faixa etária Masculino Feminino
N % N % N %
Crianças 1 – 12 6 8 3 4 9 12
Adolescentes 13 – 18 10 13,3 2 2,7 12 16
Adultos 19 – 60 32 42,7 20 26,7 52 69,3
Não informado – – 2 2,7 2 2,7
Total 48 64 27 36 75 100
Sinal convencional utilizado: – Dado numérico igual a zero não resultante de arredondamento.

Tabela 3 – D
 istribuição dos casos de febre tifoide por semestre e ano no período de 2009 a 2011, Estado do Pará, Brasil
Ano
Total
Semestre 2009 2010 2011
N % N % N % N %
1° semestre 9 12 10 13,3 8 10,7 27 36
2° semestre 14 18,7 21 28 13 17,3 48 64
Total 23 30,7 31 41,3 21 28 75 100

Tabela 4 – D
 istribuição e percentual dos isolamentos de S. Typhi em coproculturas e hemoculturas no período de
2009 a 2011, Estado do Pará, Brasil
Ano
Total
Exames 2009 2010 2011
N % N % N % N %
Hemocultura 16 21,3 24 32 14 18,7 54 72
Coprocultura 7 9,3 7 9,3 7 9,3 21 28
Total 23 30,7 31 41,3 21 28 75 100

6
Número de pacientes

0
as

es
or

do
m

ra
má

rco

é
ia
ão

iro

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n
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Figura 2 – Distribuição dos casos de febre tifoide de acordo com os bairros do Município de Belém, Estado do Pará, Brasil, no
período de 2009 a 2011

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

viaB prt
650 pb
439 pb 400 pb 369 pb 300 pb
100 pb
A B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
fliC invA
587 pb 650 pb 1.000 pb
500 pb 881 pb 850 pb

C
D
A: viaB; B: prt; C: fliC-d; D: invA; Linha 16 Ladder de 1 Kb; Linhas 1 a 15 de S. Typhi.

Figura 3 – Eletroforese em gel de agarose a 2% dos produtos de amplificação para os genes viaB, prt, fliC-d e invA, respectivamente

Tabela 5 – C
 epas bacterianas utilizadas para a avaliação da especificidade dos
iniciadores de PCR
Cepas bacterianas viaB prt fliC-d invA

Salmonella Enteritidis

Typhi + + + +

Typhimurium ATCC 14028 – – – +

Panama ATCC 2656 – – – +

Paratyphi A ATCC 7245 – + – +

Proteus mirabilis ATCC 25933 – – – –

Shigella flexneri ATCC 12022 – – – –

Escherichia coli ATCC 25922 – – – –

DISCUSSÃO na identificação do agente etiológico, nos diagnósticos

laboratoriais; existem diferenças nos dados sobre febre
Características demográficas e epidemiológicas
dos pacientes tifoide, quando se compara o sistema de informação
com fontes distintas. Outro aspecto se concentra nas
Em relação à faixa etária/gênero, os dados sobre análises por unidades da federação e regiões, quando
a maior incidência de doença se situaram na faixa se verifica variações importantes nesses indicadores.
etária de 19 a 60 anos, tanto para o sexo masculino
como para o feminino, próximo daquela que é O Norte e o Nordeste concentram maior número
observada no Brasil, que é entre 15 a 45 anos28. de casos, devido às deficiências das condições
Nas últimas décadas, foi constatado no Brasil um sanitárias, uma vez que poucos indivíduos do total
declínio referente aos coeficientes de morbimortalidade da população dispõem de esgotos e acesso à rede
ocasionada por febre tifoide. Na década de 2000, de água29, estando sua distribuição relacionada com
foram notificados, em média, 800 casos. A partir de o desenvolvimento socioeconômico de cada região.
2007, essa média tem sido de 399 casos, com maior Com base nos dados, observa-se que a febre tifoide
concentração nas Regiões Norte e Nordeste2,4. Tais no Estado do Pará apresenta sazonalidade de maior
dados devem ser avaliados cuidadosamente no que se ocorrência no segundo semestre, o que coincide
refere à representatividade e à fidedignidade, uma vez com o período de pouca chuva na região. Como a
que pouco menos da metade dos óbitos registrados carga infectante é de 106 a 109 unidades de bactérias
possuem causa básica ignorada; existem dificuldades ingeridas, torna-se incomum a ocorrência de surtos

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durante o período chuvoso, possivelmente devido à expressar o antígeno capsular Vi. Destes, o gene viaB
diluição do agente infectante no meio, dificultando que apresenta-se específico para cepas que expressam o
reúna a concentração de organismos em quantidade antígeno Vi, enquanto o viaA é observado nas bactérias
comparável à dose infectante28. entéricas18. No presente trabalho, o gene viaB foi
Durante o período de estudo, verificou-se maior amplificado nas 75 amostras de S. Typhi investigadas.
frequência de febre tifoide no Município de Belém, Análises realizadas pela utilização da PCR com o DNA
nos bairros do Jurunas e Marco. Admite-se que essa de outras bactérias (E. coli ATCC 25922, S. Paratyphi A
elevada frequência no bairro do Jurunas deve-se à ATCC 7245, S. Typhimurium ATCC 14028, S. Panama
existência de portos que facilitem a entrada de pessoas ATCC 2656, Proteus mirabilis ATCC 25933 e Shigella
oriundas de áreas com maior endemicidade. Este bairro flexneri ATCC 12022) não evidenciaram a amplificação
também detém, no Município de Belém, os maiores deste gene.
consumos e comercialização de frutos do açaí (Euterpe O lipopolissacárico - antígeno O, juntamente com
oleracea Mart.), cuja safra ocorre no segundo semestre os antígenos flagelares H1 e H2, servem de base
do ano, coincidindo com o período de sazonalidade da para sorotipagem de Salmonella34. A síntese do LPS é
doença30. codificada por cerca de 20 genes, entre eles o gene
O IEC mantém um programa de vigilância das prt. Das 75 amostras de S. Typhi analisadas, 100%
doenças entéricas, destacando-se ações voltadas apresentaram amplificação positiva para o gene prt,
ao diagnóstico de febre tifoide como laboratório de sinalizando o potencial patogênico das amostras
referência regional para o agravo. Do final dos anos investigadas e a sensibilidade da técnica da PCR na
1980 até o início dos anos 1990, essa atividade identificação de genes envolvidos na virulência.
ganhou impulso, sobretudo com a observação Alguns dos antígenos flagelares são compostos
do aumento da incidência da doença em alguns de um único fator antigênico (dito monofásico), como
municípios, como descrito acima. Apesar destas para a detecção do gene fliC-d (gene para o antígeno
relevantes observações, a doença ainda é subnotificada, da flagelina d[H: d]) de S. Typhi, apresentando-se como
principalmente pela dificuldade encontrada no excelente marcador para identificação da S. Typhi.
reconhecimento clínico, dada a extensa lista de outras No presente trabalho, todas as amostras de S. Typhi
causas de febre, que constitui diagnóstico diferencial, analisadas foram positivas para a presença do gene
com ela, contribuindo para que muitos casos não sejam fliC-d. Estes resultados eram esperados com frequência
identificados e notificados. de 100%, visto que este gene é considerado alvo para
determinação do sorotipo S. Typhi.
Fatores de virulência
A PCR fornece um meio rápido e específico para CONCLUSÃO
monitorar este microrganismos numa variedade de
A maioria dos casos ocorreu entre os adultos,
amostras. Vários métodos de amplificação como
sem diferença significativa em relação ao sexo, no
monoplex PCR, Nested PCR e PCR em tempo real têm
período não chuvoso, durante o segundo semestre de
sido usados para a detecção de Salmonella10,26,31.
cada ano, com aumento de casos no ano de 2010
A diferenciação de Salmonella sp dos demais em relação aos demais anos. A maior prevalência foi
microrganismos pela utilização da PCR do gene na capital, Belém, nos bairros do Jurunas e Marco,
invA foi constatada por Rahn et al32, que observaram seguida dos Municípios de Ananindeua e Abaetetuba.
que a sequência do gene fora amplificada e era Na análise genética, as cepas S. Typhi foram altamente
única em 630 amostras de Salmonella estudadas, similares para os genes de virulência analisados viaB,
pertencentes a 100 sorotipos diferentes. Em nosso prt, fliC-d e invA; os genes permaneceram estáveis ao
trabalho, foi evidenciado que todas as amostras de longo das análises desde o isolamento. Desta forma,
S. Typhi analisadas foram positivas para o gene invA, os primers apresentaram-se específicos para todas as
estando de acordo com os trabalhos desenvolvidos por cepas testadas de S. Typhi e, deste modo, passíveis de
Rahn et al32 e corroboram os experimentos serem utilizados na detecção deste microrganismo pela
desenvolvidos por Whang et al33, quando afirmaram PCR. Ensaios estão sendo realizados para avaliação
que o gene invA se apresenta conservado em todos destes primers frente a amostras clínicas (sangue
os sorotipos de Salmonella, sendo o gene eleito para e fezes) buscando-se o estabelecimento de uma
detecção desta bactéria pela PCR. metodologia para o diagnóstico da febre tifoide por
O antígeno Vi pode ser encontrado também em meio da PCR.
S. Paratyphi C, Salmonella Dublin e Citrobacter freundii.
Estudos com S. Typhi identificaram a presença de pelo agradecimentos
menos dois loci para o gene codificante do antígeno Aos profissionais da Seção de Bacteriologia e
Vi, denominados viaA e viaB, ambos responsáveis por Micologia do IEC pelo apoio técnico e administrativo.

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 Rocha DCC, et al. Perfil epidemiológico e caracterização molecular de Salmonella Typhi

Epidemiological profile and molecular characterization of Salmonella Typhi strains

isolated in Pará State, Brazil
ABSTRACT
Salmonella enterica serotype Typhi, the etiological agent of typhoid fever, a systemic disease that causes prolonged
fevers with intestinal disorders and may progress to bowel perforation. In Pará State, Brazil, the endemicity reflects a
great number of outbreaks and sporadic cases in different municipalities. The aim of this present study was to carry
out an epidemiologic and molecular characterization of Salmonella Typhi strains isolated in Pará State. Four virulence
genes (viaB, prt, fliC-d and invA) were analyzed in 75 cases with typhoid fever isolation from blood cultures and stool
cultures in the period 2009 to 2011. In order to investigate the cross-reactivity, six other species of enterobacteria
(Escherichia coli, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhimurium, Salmonella Panama, Proteus mirabilis, and Shigella
flexneri) were included. Samples were analyzed and 64% of them are from male subjects and 36% from female
ones, with a significant difference between sexes (p = 0.0209). The analysis of annual distribution of typhoid cases
highlights the biggest event in 2010, with 31 cases. Most of the cases was detected in blood culture (72%) compared
to fecal culture (28%) (p = 0.0002). Conventional PCR with four pairs of primers identified S. Typhi correctly,
producing four positive bands observed in 100% of samples. In the genetic analysis, the S. Typhi strains were highly
similar to the genes analyzed which remained stable throughout the analysis since their isolation. Thus, the four pairs
were specific primers capable of being used in the identification and characterization of S. Typhi.
Keywords: Salmonella Typhi; Polymerase Chain Reaction; Virulence Factors; Diagnosis.

Perfil epidemiológico y caracterización molecular de Salmonella Typhi aisladas en el

Estado de Pará, Brasil
RESUMEN
La Salmonella enterica serotipo Typhi es el agente etiológico de la fiebre tifoidea, enfermedad sistémica que ocasiona
cuadros de fiebres prolongadas juntamente con disturbios intestinales, que pueden evolucionar hasta la perforación
intestinal. En el Estado de Pará, Brasil, la endemicidad refleja un vasto número de brotes y de casos esporádicos en
diferentes municipios. El presente estudio tuvo como objetivo realizar una caracterización epidemiológica y molecular
de Salmonella Typhi aisladas en el Estado de Pará. Se analizaron cuatro genes de virulencia (viaB, prt, fliC-d e invA)
en 75 casos de fiebre tifoidea con aislamiento a partir de hemocultivos y coprocultivos, en el período de 2009 a
2011. Para averiguar una reacción cruzada, se incluyeron seis especies de otras enterobacterias (Escherichia coli,
Salmonella Paratyphi A, Salmonella Typhimurium, Salmonella Panama, Proteus mirabilis y Shigella flexneri). Del total
de muestras analizadas, 64% son oriundas de individuos del género masculino y 36%, del femenino, con diferencia
significativa entre los sexos (p = 0,0209). En el análisis de la distribución anual de los casos de fiebre tifoidea se
destaca la mayor ocurrencia en el 2010, con 31 casos. La mayoría se detectó en el hemocultivo (72%) en relación
al coprocultivo (28%) (p = 0,0002). La PCR convencional, con cuatro pares de primers identificó correctamente S.
Typhi, produciendo cuatro bandas positivas, observadas en 100% de las muestras analizadas. En el análisis genético,
las cepas S. Typhi fueron altamente similares para los genes analizados, que permanecieron estables durante los
análisis, desde el aislado. De esta forma, los cuatros pares de primers se presentaron específicos y, de este modo,
pasibles de ser utilizados en la identificación y caracterización de S. Typhi.
Palabras clave: Salmonella Typhi; Reacción en Cadena de la Polimerasa; Factores de Virulencia; Diagnóstico.

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Recebido em / Received / Recibido en: 20/3/2014

Aceito em / Accepted / Aceito en: 12/11/2014

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