Karina Oliveira Ioc Mest 2019

INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
ESTUDO DO PAPEL DOS CORPÚSCULOS LIPÍDICOS DURANTE A INFECÇÃO

DE CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS PELO Toxoplasma gondii
Karina da Silva Oliveira
Rio de Janeiro
2019

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz

como parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Biologia Celular e
Molecular – área de concentração:
Farmacologia e Imunologia
Orientadora: Patrícia Torres Bozza
Rio de Janeiro
2019
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
iii

Orientadora: Patrícia Torres Bozza
Aprovada em: 19/08/2019
Banca examinadora: Prof. Dr. Helene Santos Barbosa - FIOCRUZ (presidente)

Prof. Dr. Patrícia Elaine de Almeida - UFJF
Prof. Dr. Adriana César Bonomo - FIOCRUZ
Suplente: Prof. Dr. Christianne Bandeira de Melo - UFRJ

Prof. Dr. Tânia Zaverucha do Valle - FIOCRUZ (revisora)
Rio de Janeiro
Agosto de 2019
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço de forma infinita, e mesmo assim não suficiente, a Deus. Foi Ele
quem planejou, me guiou e capacitou até aqui. Esperei nEle e nunca fiquei
desamparada.
À Nossa Senhora do Perpétuo Socorro, que não desistiu de mim nunca e me

segurou pela mão sempre.
À Dra Patrícia Bozza, por toda orientação e oportunidade de fazer parte de um

grupo tão enriquecedor e promissor.
À Dra Adriana Vallochi, que me fez crescer como profissional e, principalmente,

como pessoa.
À Maria Rosania, minha mãe, pelo seu amparo, seu apoio, carinho e suprema
dedicação. Você aguentou todas as minhas crises, não sei onde estaria sem você.
Ao meu pai, Luiz Henrique, por todo incentivo e orgulho que sente de mim.
Aos meus irmãos, Pedro e Giovanna, que mesmo agora longe de mim estão
sempre me acompanhando.
Ao Paulo Henrique, meu esposo, por todo amor que me dá e toda a confiança
que tem em mim. Você é minha força.
Aos pesquisadores do laboratório de Imunofarmacologia. Obrigada pelo

incentivo, preocupação e sugestões.
Aos queridos alunos do Laboratório de Imunofarmacologia. Vocês me

ensinaram muito! Agradeço a vocês por terem me acolhido de forma tão linda.
v
Ao grupo corpúsculo lipídico, companheiros diários nos momentos de alegria,
de choro, de discussão e, principalmente, de trabalho.
Às minha “wifes” Ellen e Lívia, que dividiram comigo não só a casa, mas a
experiência, os sofrimentos de cada dia e as conquistas. Vocês são uma inspiração
para mim.
Aos amigos de caminhada que tive o prazer de conhecer: Érica, Filipe, Júlia
Góes, Lohanna, Lucas, Maiara, Ester e Isaclaudia. Levarei a amizade e os
ensinamentos de vocês para sempre comigo.
Aos alunos de iniciação cientifica Taynná, Felipe Ferraro e Victória, que tanto
me ajudaram.
À Dra Patricia Reis, exemplo de profissional, e seus alunos, pessoas

maravilhosas que tive o prazer de conhecer e conviver.
Aos meus amigos Cássia, Helena e Ramiro. Vocês foram minha válvula de
escape para todo e qualquer problema. Estavam sempre presentes quando precisei,
com todo o apoio que necessitava.
Aos funcionários do pavilhão 108. Pessoas maravilhosas sem as quais esse

trabalho não poderia ser desenvolvido. Em especial à Rose Branco, com sua incrível
capacidade de manter tudo organizado.
Aos funcionários do Serviço de Hemoterapia do Hospital Clementino Fraga

Filho–UFRJ, sempre muito gentis e pacientes.
Aos integrantes da banca, pela gentileza de aceitarem o convite.
À CAPES e à FIOCRUZ, pelo apoio científico e financeiro.
vi
A todos aqueles que de alguma maneira contribuíram para o desenvolvimento
desse trabalho.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de
Financiamento 001.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... x
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. xiii
RESUMO ................................................................................................................ xv
ABSTRACT ........................................................................................................... xvi
1. INTRODUÇAO ...................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 18
3. METODOLOGIA ................................................................................................. 19
3.1. Parasitos ................................................................................................. 19
3.1.1. Manutenção dos parasitos ........................................................ 19
3.1.2. Teste de viabilidade de taquizoítos de T. gondii ..................... 19
3.2. Soluções tamponadas para análise de diferenças na sensibilidade ao

pH de CTFarRed e PKH-26 ..................................................................... 19
3.3. Obtenção de células dendríticas humanas (hDC) ............................... 20
3.4. Infecção de células dendríticas por taquizoítas de Toxoplasma gondii

................................................................................................................. 21
3.5. Análise de corpúsculos lipídicos (CLs) durante a infecção de hDCs

pelo T. gondii .......................................................................................... 21
3.5.1. Análise de CLs em hDC sem infecção e infectadas pelo T.

gondii 21
3.5.2. Inibição de enzimas envolvidas no metabolismo lipídico ...... 22
3.5.3. Suplementação do meio de cultura com Ácidos Graxo.......... 22
3.6. Dosagem de citocínas - ELISA .............................................................. 23
3.7. Citometria de Fluxo ................................................................................ 23
3.7.1. Análise da viabilidade da hDC.................................................. 23
3.7.2. Análise da expressão de moléculas de superfície .................. 24
3.8. Análise Estatística .................................................................................. 24

viii
4. RESULTADOS ................................................................................................... 25
4.1. Obtenção de células dendríticas a partir de monócitos mononucleares

de sangue periférico .............................................................................. 25
4.2. Análise da viabilidade do Toxoplasma gondii e de Células Dendríticas

humanas durante a infecção. ................................................................ 27
4.3. Perfil de infecção de células dendríticas humanas vivas e mortas ... 32
4.4. Biogênese de Corpúsculos Lipídicos e infectividade de células

dendríticas humanas pelo Toxoplasma gondii .................................... 37
4.5. Impacto da taxa de infecção na biogênese de CLs e na viabilidade de

hDCs. ....................................................................................................... 41
4.6. Determinação da concentração dos inibidores da biogênese de CLs

................................................................................................................. 44
4.7. Impacto da inibição da biogênese de CLs em hDCs infectadas pelo T.

gondii ....................................................................................................... 55
4.8. Efeitos da suplementação com Ácido Oleico na infecção de células

Dendríticas infectadas pelo Toxoplasma gondii ................................. 63
4.9. Expressão de moléculas de superfície induzida pela infecção com T.

gondii ....................................................................................................... 69
5. DISCUSSÃO....................................................................................................... 71
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 83
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 84
ANEXO I ................................................................................................................. 95
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
AA = ácido Aracdônico
ACAT = acil-CoA:colesterol aciltransferase
ADRP = proteína relacionada à diferenciação de adipócitos (do inglês adipose
differentiation-related protein)
AMA 1 = proteína Antígeno Apical de Membrana 1 (do inglês Apical Membrane
Antigen 1).
AO = ácido oleico
ATG ( ) = proteína relacionada a autofagia (do inglês autophagy-related)
ATGL = lipase de triacilglicerídeo do adipócito (do inglês Adipose triglyceride lipase)
BSA = albumina de soro bovino (do inglês Bovine serum albumin)
CCL ( ) = ligante de quimiocina com motivo CC (do inglês C-C motif chemokine ligand)
CCR ( ) = receptor de quimiocina CC ( do inglês C-C chemokine receptor)
CD ( ) = grupo de diferenciação (do inglês cluster of differentiation)
COX = Cicloxigenase
CLs = corpúsculos lipídicos
CTFarRed = marcador de proliferação celular (do inglês Cell Tracer Far Red)
CXCL ( ) = ligante de quimiocína com motivo CXC ( do inglês C-X-C motif chemokine
ligand)
DC = células cendríticas (do inglês Dendritic Cells)
DC-SIGN = ligante de molécula de adesão intercelular não-integrina específica de
célula dendrítica (do inglês Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-
Grabbing Non-integrin)
DGAT ( ) = diacilglicerol aciltransferase (do inglês diacylglycerol acyltransferase)
DHFR = dihidrofolato redutase
DHPS = di-hidropteroato sintase
DMSO = dimetilsulfóxido (do inglês Dimethyl Sulfoxide)
EC = éster de colesterol
FAS = enzima ácido graxo sintase (do inglês fatty acid synthase)
FACS = citometria de fluxo (do inglês fluorescence activated cell sorting)
FSC = parâmetro na citometria de fluxo que indica tamanho do evento (do inglês
Forward Scatter)
x
FVD = corante indicador de viabilidade (do inglês Fixable Viability Dye)
GBP = família de proteínas de ligação ao guanilato (do inglês guanylate-binding
protein)
GM-CSF = fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (do inglês
Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor)
GPI = glicosilfosfatidilinositol
hDC = célula dendrítica humana
iDGAT = Inibidor da enzima Diacilglicerol Aciltransferase
IFNγ = interferon gama
IL ( ) = interleucina
IRG = GTPase relacionada a imunidade (do inglês immunity-related GTPases)
LDL = lipoproteína de baixa densidade (do inglês Low-Density Lipoprotein)
LO = lipoxigenase
LT ( ) = leucotrieno
MHC = complexo de histocompatibilidade principal (do inglês major histocompatibility
complex)
MIF = média de intensidade de fluorescência
MOI = multiplicidade de infecção (do inglês multiplicity of infection)
MVP = membrana do vacúolo parasitóforo
mTOR = proteína alvo da rapamicina em mamíferos (do inglês mammalian target
of rapamycin)
NK = célula matadora natural (do inglês natural killer)
NO = óxido nítrico
ORO = do inglês Oil Red O
PAT = família de proteínas estruturais dos corpúsculos lipídicos (perilipina, ADRP e
TIP47).
PBMC = células mononucleares do sangue periférico (do inglês Peripheral Blood
Mononuclear Cells)
PG ( ) = prostaglandina
PLA2 = fosfolipase A2
PPAR ( ) = receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (do inglês
peroxisome proliferator-activated receptor)
PV = vacúolo parasitóforo
xi
RE = retículo endoplasmático
ROS = espécie reativa de oxigênio (do inglês reactive oxygen species)
SFB = soro fetal bovino
SFBd = soro fetal bovino delipidado
SSC = parâmetro na citometria de fluxo que indica granulosidade/complexidade do
evento (do inglês Side Scatter)
STAT ( ) = transdutor de sinal e ativador da transcrição (do inglês Signal transducer
and activator of transcription)
TAG = triacilglicerol
TGF β = fator transformador de crescimento beta (do inglês Transforming Growth
Factor Beta)
TIP47 = proteína de interação de cauda de 47 kDa
TLR = receptores do tipo Toll (do inglês Toll-like receptor)
TNFα = fator de necrose tumoral alfa (do inglês tumor necrosis fator alpha)
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura da forma taquizoíta de T. gondii.. ............................................ 1

Figura 2. Ciclo de vida do T. gondii. ........................................................................ 3
Figura 3. Resposta imune contra infecção pelo T. gondii. .................................. 11
Figura 4. Destruição do T. gondii pelo sistema imune......................................... 12
Figura 5. A biogênese dos corpúsculos lipídicos. ............................................... 15
Figura 6. Caracterização fenotípica das células dendríticas humanas derivadas
de monócitos. .......................................................................................................... 26
Figura 7. Taquizoítas duplo marcados com PKH-26 e Cell Tracer Far Red. ...... 29
Figura 8. Análise da infectividade e viabilidade de Células Dendríticas humanas
e viabilidade do T. gondii (continua). .................................................................... 30
Figura 9. Avaliação da viabilidade de células Dendríticas infectadas pelo T.
gondii (continua). .................................................................................................... 33
Figura 10. Quantificação de citocinas nas culturas de DCs infectadas com
taquizoítas de T. gondii ao longo do tempo.......................................................... 36
Figura 11. Análise da Biogênese de Corpúsculo Lipídicos em Células Dendrítica
humanas infectadas com taquizoítas de T. gondii (continua)............................. 38
Figura 12. Influência da biogênese de CLs em hDC na infectividade e
multiplicidade do T. gondii. .................................................................................... 40
Figura 13. Avaliação da biogênese de Corpúsculos Lipídicos e da viabilidade de
Células Dendríticas infectadas por T. gondii, em diferentes MOI (continua)..... 42
Figura 14.Determinação da concentração do inibidor C75, em células dendríticas
humanas infectadas pelo T. gondii (continua). .................................................... 45
Figura 15. Avalição da viabilidade de células dendríticas humanas infectadas
pelo T. gondii, tratadas com diferentes concentrações do inibidor C75............ 47
Figura 16. Determinação da concentração do inibidor da DGAT-1, em células
dendríticas humanas infectadas pelo T. gondii (continua). ................................ 49
Figura 17. Avaliação da viabilidade do T. gondii e de células dendríticas
humanas, tratadas com diferentes concentrações do inibidor da DGAT1
(continua). ................................................................................................................ 52
Figura 18. Tratamento com C75 (inibidor da FAS) e A922500 (inibidor da DGAT-
1) em taquizoítas. .................................................................................................... 54
xiii
Figura 19. Efeitos da inibição farmacológica da biogênese de Corpúsculos
Lipídicos na viabilidade durante a infecção de células dendríticas pelo T. gondii
(continua). ................................................................................................................ 57
Figura 20. Inibição farmacológica da biogênese de Corpúsculos Lipídicos
durante a infecção de células dendríticas pelo T. gondii (continua). ................. 60
Figura 21. Efeitos da inibição farmacológica da biogênese de Corpúsculos
Lipídicos na infectividade e replicação do T. gondii durante a infecção de células
dendríticas. .............................................................................................................. 62
Figura 22. Influência da suplementação com Ácido Oleico na viabilidade de
células dendríticas e do T. gondii (continua)........................................................ 64
Figura 23. Efeitos da suplementação com ácido graxo na biogênese de CL e na
replicação e infectividade do T. gondii (continua). .............................................. 67
Figura 24. Expressão de moléculas de superfície de hDC infectadas com
taquizoítas de T. gondii por 24 horas. ................................................................... 70
Figura 25 Resumo dos dados encontrados. ......................................................... 82
xiv

RESUMO
Dissertação
O Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório, capaz de infectar vários

tipos de células nucleadas, sendo compartimentalizado no vacúolo parasitóforo. Uma
vez no vacúolo, o parasita é capaz de induzir diversas alterações na célula hospedeira
que visam sua sobrevivência, dentre elas, a indução da biogênese de corpúsculos
lipídicos (CLs). CLs são organelas presentes em todos os tipos celulares, com várias
funções como, armazenamento de lipídios, regulação do metabolismo lipídico, tráfego
de membranas e controle da síntese e secreção de mediadores inflamatórios. Porém,
até o momento, pouco se sabe a respeito da função dos CLs na infecção pelo T. gondii
em células humanas. Neste trabalho investigamos a participação dos CLs durante a
infecção de células dendríticas humanas (hDC) por T. gondii. Nossos dados
mostraram na cinética de infecção em hDC, pico de infecção e replicação em 24 horas
(30%), seguidos de queda em 48 horas (10%). A infecção promoveu aumento de
CD83 e MHC II na membrana, além da produção de TNF-α, IL-6, IL-8, IP-10 e MIF. A
análise da viabilidade do parasita intracelular mostrou que as hDC foram capazes de
destruir os parasitos intracelulares (60%). A infecção levou à perda da viabilidade da
célula hospedeira em 48 horas de infecção (50%), ao mesmo tempo em que induziu
a maior biogênese de CLs nessas células (30CL/cél). O aumento da taxa de infecção
fez com que a biogênese de CLs e a perda da viabilidade das células hospedeiras
ocorressem de forma mais precoce, já em 24 horas de infecção. Os tratamentos com
o inibidor (C75) da enzima ácido graxo sintase (FAS) ou inibidor (A922500) da enzima
diacilglicerol aciltransferase 1 (DGAT1) foram capazes de reduzir a biogênese de CLs
(3 CL/cél) e diminuíram também o percentual de células infectadas e a taxa de
replicação do parasito, fazendo com que ela ocorresse de forma mais lenta. O mesmo
fenômeno pôde ser visto quando as células foram cultivadas em soro fetal bovino
delipidado. Além disso, os tratamentos se mostraram protetivos para as células
hospedeiras durante a infecção, mantendo sua viabilidade (~80%). O tratamento com
o inibidor da DGAT1 ainda reduziu a presença de MHC I na membrana. A
suplementação com ácido oleico em células tratadas com o inibdor da DGAT1,
recuperou a taxa de infecção e, de forma parcial, auxiliou na replicação do parasita
frente à ausência dos CLs. Em conclusão, nossos dados sugerem que os CLs
possuem funções tanto como fonte de nutrientes para o T. gondii, quanto na
modulação da resposta imune da hDC.
xv
STUDY OF THE LIPID DROPLET ROLE DURING HUMAN DENDRITIC CELL

INFECTION BY Toxoplasma gondii
ABSTRACT
MSc THESIS
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite, capable of infecting

several types of nucleated cells, being compartmentalized in the parasitophorous
vacuole. Once in the vacuole, the parasite can induce several changes in the host cell
aimed at its survival, among them the induction of lipid droplets biogenesis (LD). LDs
are organelles present in all cell types, involved in the most diverse functions such as
lipid storage, regulation of lipid metabolism, membrane traffic, and control of synthesis
and secretion of inflammatory mediators. However, the role of LD during human cells
infection by T. gondii is unknown. In this work, we investigated the participation of lipid
droplets during the infection of human dendritic cells(hDC) by T. gondii. Our data
showed the peak of infection and replication in 24 hours (30%), followed by a
subsequent fall in 48 hours (10%) in hDC infection kinetics. The infection promoted an
increase of CD83 and MHC II in the membrane, besides the production of TNF-a, IL-
6, IL-8, IP-10, and MIF. Analysis of the intracellular parasite viability showed that (hDC)
were able to destroy intracellular parasites (60%). The infection led to the loss of host
cell viability within 48 hours (50%) and inducing the greater biogenesis of CLs in these
cells at the same time (30 CL/cell). The infection rate increase caused the earlier LD
biogenesis and the host cells viability loss. Treatments with the fatty acid synthase
(FAS) enzyme inhibitor (C75) or the diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1) enzyme
inhibitor (A922500) was able to reduce the LD biogenesis, also decreased the
percentage of infected cells and the replication rate of the parasite, slowing it down.
The same could be seen when the cells were cultured in delipidated fetal bovine serum.
Also, the treatments proved to be protective to the host cells during the infection,
maintaining their viability. The DGAT1 inhibtor treatment further reduced the presence
of MHC I in the membrane. Supplementation with oleic acid in DGAT1 inhibtor treated
cells recovered the infection rate and, in a partial way, aided in the replication of the
parasite in the absence of the LDs. In conclusion, our data suggest that CLs have
functions in both as a source of nutrients for T. gondii and in modulating hDC immune
response.
xvi
1. INTRODUÇAO
Descrito pela primeira vez em 1909 (Nicolle and Manceaux, 1909), o

Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório. Protozoário do filo
Apicomplexa, exibe uma alta organização polarizada de suas estruturas subcelulares.
Em particular, o sistema secretor contém organelas únicas orientadas apicalmente: os
micronemas e as róptrias, bem como os grânulos densos citosólicos mais dispersos,
que são essenciais para a virulência do parasito e a invasão da célula hospedeira
(Baum et al., 2006; figura 1).
Figura 1. Estrutura da forma taquizoíta de T. gondii. Esquema apresentando, além das

organelas características de células eucariotas, o complexo apical presente nos seres do filo
Apicomplexa, além de outras estruturas característica, como o apicoplasto. (Adaptado de
Baum et al. (2006).
O T. gondii pode infectar mais de 300 espécies de animais entre mamíferos e

aves – domésticos ou silvestres. Os felídeos são os hospedeiros definitivos pois são
os únicos onde ocorre a fase sexuada (coccídea) do seu ciclo biológico. Suas formas
de vida são todas infectantes e incluem: taquizoítos, também chamados de forma
proliferativa, forma livre ou trofozoíto; bradizoítos, alocados dentro dos cistos teciduais
(principalmente no músculo esquelético e cardíaco e tecido nervoso, mas também no
pulmão e fígado), e esporozoítos contidos em oocistos livres no ambiente, que
1
correspondem à forma de resistência, possuindo uma parede dupla bastante
resistente às condições do meio ambiente (Rey, 2008). Membros da família Felidae,
como os gatos, podem ser infectados diretamente pela ingestão de oocistos
esporulados (liberados no ambiente) e por bradizoítos (ao se alimentarem de
pequenos animais infectados, contendo cistos teciduais), denominadas de
transmissão horizontal, ou ainda infectados por taquizoítos (durante a vida intrauterina
pela via transplacentária), denominada de transmissão vertical.
Na fase sexuada, a replicação do parasita ocorre dentro das células intestinais
do felídeo. Durante a fase sexuada do ciclo, alguns parasitas se diferenciam em
microgametas flagelados e móveis (♂) ou em macrogametas imóveis (♀) e, ao se
fundirem no processo de fecundação, dão origem ao zigoto. Deste processo, que
ocorre somente nos hospedeiros definitivos, surgem os oocistos, contendo
esporoblastos no interior. Durante uma infecção aguda, milhões de oocistos são
liberados no ambiente através das fezes do animal, por um período de 7 a 21 dias. Ao
fim do processo de esporulação, que ocorre em condições de umidade por 2 e 3 dias,
os oocistos contendo esporozoítos se tornam infectivos, podendo ser ingeridos por
aves e mamíferos (incluindo o homem) e, uma vez no ambiente intracelular, se
diferenciar em taquizoíto (Figura 2) (Robert-Gangneux & Dardé, 2012).
As diversas formas de transmissão do T. gondii e a grande gama de
hospedeiros intermediários, fazem com que a toxoplasmose seja uma das zoonoses
mais difundidas no mundo. O ser humano pode adquirir a infecção por três vias
principais: pela ingestão de cistos encontrados em carne crua ou malcozida, que é
considerada a causa mais comum; através da ingestão de oocistos presentes no solo,
em alimentos ou água contaminada; e por transmissão vertical de forma congênita ou
transplacentária. De forma menos comum também é possível ocorrer a transmissão
por transplante de órgãos (Figura 2) (Wang et al., 2019). No que diz respeito a
transmissão por ingestão, os parasitos emergem de oocistos ou cistos teciduais no
estômago (Dubey et al., 1998). Os parasitas libertos então cruzam para o intestino
delgado e acessam a lâmina própria, onde infectam e replicam dentro de uma ampla
variedade de células, sendo mais abundantemente encontrados dentro de monócitos,
macrófagos e células dendríticas. Essas células então são utilizadas pelo parasita
para alcançar órgãos mais distantes como, cérebro, retina e tecido muscular (Figura
2B) ( Lambert et al., 2006; Sanecka & Frickel, 2012; Gregg et al., 2013).
2
Figura 2. Ciclo de vida do T. gondii. Fase sexuada que ocorre no epitélio intestinal dos
felídeos (A), que são infectados após a ingestão de cistos teciduais (B) a partir da qual são
gerados os oocistos não-esporulados que são liberados no ambiente (C). Após processo de
esporulação na fase ambiental do ciclo (D), hospedeiros intermediários e definitivos podem
ser infectados. Os oocistos esporulados podem contaminar o solo, a água, os vegetais e as
frutas (E), fornecendo uma rota de infecção para uma ampla gama de hospedeiros
intermediários e felídeos. A infecção por T. gondii é iniciada em humanos pela ingestão de
oocistos em alimentos ou água contaminados ou ingestão de cistos viáveis de tecidos em
carne crua ou malcozida (F). Uma vez estabelecidos, esses parasitas podem promover a
transmissão congênita durante a gravidez (G), e/ou formar cistos em diferentes órgãos, como:
cérebro, retina e tecido muscular (H), possibilitando a transmissão por transplante de órgãos
(I) (Adaptado de Moura et al., 2009).
3
A entrada do parasita na célula hospedeira ocorre de forma ativa. É um evento
característico, que só é possível pelas das organelas do complexo apical que o T.
gondii possui. Estas organelas contribuem para uma infinidade de funções que vão
desde a ligação e invasão da célula hospedeira até o estabelecimento e manutenção
do vacúolo parasitóforo (PV) à replicação e sobrevivência do parasita. Inicialmente,
ocorre a adesão via região apical do parasito à membrana da célula hospedeira. As
proteínas de micronemas proporcionam o contato firme do parasito com as células
hospedeiras e são as primeiras a secretarem seu conteúdo, liberando uma série de
adesinas cálcio-dependentes, as quais reconhecem receptores específicos na
superfície celular promovendo a adesão. As roptrias participam do processo de
invasão juntamente com a proteína de micronema AMA1, estabelecendo a junção
móvel, uma estrutura adesiva transitória em forma de anel, que ajuda a propulsão do
parasita na célula hospedeira (revisto em Venugopal & Marion, 2018). Enquanto as
proteínas presentes no pescoço da roptria favorecem a invasão, aquelas presentes
no bulbo da roptria e proteínas de grânulos densos desempenham um papel essencial
na sobrevivência do parasita modulando respostas imunes e metabólicas do
hospedeiro (Bougdour et al., 2014). A interação com os receptores presentes na
superfície da célula hospedeira promove um movimento de invaginação da membrana
plasmática ao redor do parasita, que é selada após a sua entrada, gerando um vacúolo
denominado vacúolo parasitóforo (VP) ( Saadatnia & Golkar, 2012; Dart et al., 2016).
Esse processo permite a agregação de componentes da membrana plasmática do
hospedeiro na membrana do recém-formado do VP (Drewry & Sibley, 2019). A
membrana do VP é permeável de modo que, no interior desse vacúolo, o T. gondii é
capaz de adquirir nutrientes da célula hospedeira e utilizá-los para sua própria
sobrevivência. Após sua entrada, o parasita modifica o VP, secretando proteínas
dentro do espaço vacuolar, gerando um compartimento metabolicamente ativo para
favorecer o crescimento do parasito (Lige et al., 2013; Dou et al., 2014). A rápida
replicação dos taquizoítas por multiplicação assexuada do tipo endodiogenia,
promove a lise da célula hospedeira e disseminação dos novos parasitas para as
células adjacentes.
A toxoplasmose é considerada uma das maiores infecções oportunistas
existentes. Sua característica sintomatológica silenciosa, na maioria dos casos,
contribui para que a toxoplasmose seja tida como uma doença negligenciada e para
4
que seus dados epidemiológicos atuais sejam subestimados. Estima-se que
aproximadamente 25 a 30% da população humana mundial está infectada pelo T.
gondii (Flegr et al., 2014). Na verdade, as prevalências variam amplamente entre os
países (de 10 a 80%) e, muitas vezes, dentro de um determinado país ou entre
diferentes comunidades na mesma região (Pappas et al., 2009). Baixas
soroprevalências (10 a 30%) foram observadas na América do Norte, no sudeste da
Ásia, no norte da Europa e nos países do Sahel na África. Prevalências moderadas
(30 a 50%) foram encontradas em países da Europa Central e do Sul e altas
prevalências foram encontradas na América Latina e em países tropicais africanos
(Robert-Gangneux & Dardé, 2012). Já no Brasil, considerado um dos países com
maior soroprevalência, esta varia de 50% a 80% (Dubey et al., 2012).
Durante a forma aguda da doença, os taquizoítos são a forma evolutiva
encontrada no hospedeiro, possuindo uma replicação bem rápida e infectando
qualquer célula nucleada. Embora a maioria da população infectada seja
assintomática, a infecção pode evoluir para latência com formação de cistos em
alguns tecidos (como: cérebro, retina e músculos), que se diferenciam da forma
taquizoítas para bradizoítas, caracterizando a toxoplasmose crônica (Dubey et al.,
1970). No entanto, em pacientes imunocomprometidos, a infecção pode evoluir para
sua forma grave resultando no desenvolvimento da toxoplasmose ocular ou cerebral
(Garcia et al., 2015). Em mulheres grávidas, o parasita pode atravessar a placenta,
infectar o feto e causar retinocoroidite, hidrocefalia, retardo mental, convulsões ou até
mesmo a morte do feto. O risco de infecção congênita e a gravidade dos sintomas
dependem da idade gestacional no qual a gestante adquire a infecção; quanto mais
cedo a infecção ocorre durante a gravidez, maior a gravidade dos sintomas (Saadatnia
& Golkar, 2012).
A maioria dos tratamentos eficazes e disponíveis contra T. gondii incluem
antibióticos tipo Sulfonamida, como a Sulfadiazina e o Sulfametoxazol, combinados
com Pirimetamina ou Trimetoprima. Além de não ser efetivo contra os bradizoítos, a
forma infectante normalmente encontrada em indivíduos imuno competentes, trata-se
de um tratamento com alto grau de toxicidade. A pirimetamina e a sulfadiazina,
respectivamente, inibem as enzimas dihidrofolato redutase (DHFR) e di-hidropteroato
sintase (DHPS), proporcionando um bloqueio sinérgico da via de biossintese do folato,
composto crucial para a sobrevivência, bem como a replicação do parasita. A inibição
da síntese do folato pode levar depressão gradual da medula óssea, devendo ser feita
5
uma suplementação com ácido fólico durante o tratamento (Mitsuka-Bregano & Lopes-
Mori, 2010). Além disso, sabe-se que Pirimetamina é uma substancia teratogênica e
que as Sulfonamidas são importantes antagonista de mTOR, uma serina/treonina -
proteína-quinase, que regula crescimento, proliferação, motilidade e sobrevivência
celular, além da síntese proteica e a transcrição (Khanfar et al., 2013; Mitsuka-
breganó and Lopes-mori, 2010). A falha terapêutica no tratamento da toxoplasmose
foi relatada tanto em casos de indivíduos imunocomprometidos, quanto em casos de
transmissão congênita. Estas falhas acabam selecionando parasitas resistentes aos
medicamentos e podem estar associados a fatores como: má absorção, ou
intolerância da droga; e/ou fatores parasitários tais como variabilidade na
suscetibilidade a drogas entre cepas geneticamente diferentes do parasita (Meneceur
et al., 2008; Silva et al., 2019).
Mesmo sendo uma infecção bastante estudada, até o presente momento não
foi desenvolvida uma vacina que previna a toxoplasmose. As vacinas em
desenvolvimento até o momento, ainda se encontram da fase pré-clínica de testes,
em modelos animais. Atualmente, existem vacinas baseadas em parasitas mortos e
atenuados, antígenos lisados, proteínas secretadas durante o processo de infecção e
DNA. Entre os antígenos testados, os estudos se concentraram nos antígenos de
superfície do T.gondii, antígenos de proteínas da róptria, de micronemas, de grânulos
densos e outros antígenos secretados por taquizoítas e bradizoitas (Wang et al.,
2019). Muito embora hajam epitopos do T. gondii descritos, os resultados obtidos não
são promissores (Assolini et al., 2017).
O T. gondii é um parasito altamente adaptado, sendo capaz de infectar com
sucesso qualquer célula nucleada de modo que não é possível dizer que exista um
tropismo, mas sim, uma preferência do parasito por alguns tipos celulares, como:
células do sistema nervoso central, células da retina e miócitos (Sanecka & Frickel,
2012). A lâmina própria e as placas de Peyer são ricas em células dendríticas (DCs)
e macrófagos. Uma vez que T. gondii atravessa a barreira intestinal, estas são as
primeiras células imunes a reconhecer a infecção do parasita e iniciar a montagem da
resposta imune do hospedeiro. Esse reconhecimento pode ocorrer através de pelo
menos três rotas distintas: 1) as DCs e os macrófagos fagocitam diretamente
parasitas opsonizados ao atravessarem a barreira epitelial; 2) ambas as células
também fagocitam células intestinais apoptóticas infectadas; 3) ou as DCs, capazes
de se alongar através das junções estreitas do epitélio, reconhecem o perfil de
6
antígeno de T. gondii solúvel no lúmen (revisto em Delgado Betancourt et al., 2019).
No sangue, a frequência de infecção é maior em DCs, infectando-as rapidamente e
despertando nelas um fenótipo hipermigratório, sugestivo de seu uso pelo parasita
como cavalo de Troia para que possa chegar a tecidos distantes (Sanecka & Frickel,
2012; Weidner & Barragan, 2014).
As DCs atuam como reguladores das respostas imunológicas e são
consideradas as células apresentadoras de antígeno mais eficientes, com a
capacidade de ativar ou tolerizar células T naïve (revisto em Lewis & Reizis, 2012).
DCs imaturas apresentam uma alta capacidade endocítica, o que as faz eficientes na
captura do antígeno. O contato com produtos microbianos ou citocinas inflamatórias,
promove nas DCs um processo denominado maturação, que as capacita para o
processamento e apresentação dos antígenos para as células T naïve (Vargas et al.,
2015).
No estado imaturo, as DCs são capazes de fagocitar e reconhecer padrões
moleculares associados a patógenos traveses de receptores de reconhecimento de
pedrões, como os receptores do tipo Toll (TLRs). O reconhecimento desses padrões
leva à maturação das DCs, um fenômeno muito importante para a resposta do
hospedeiro, que ocorre paralelamente ao reconhecimento dos antígenos proteicos
pelas moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), que então
migram para a superfície celular. Juntamente a esse processo ocorre a liberação das
citocinas ativadoras IL-1β e TNFα pelas células vizinhas. A maturação está
correlacionada com a regulação positiva da expressão de moléculas MHC classe I e
II na superfície celular e de moléculas co-estimulatórias (CD80 e CD86 e CD83).
Somados, esses sinais vão provocar mudanças funcionais e fenotípicas, gerando
células com capacidade de ativar células T naïve (revisto em Al-Ashmawy, 2018).
A maturação das DCs leva a uma alteração do padrão de expressão dos
receptores de quimiocínas, o que permite que as DCs migrem até os linfonodos.
Durante esse processo, se observa a diminuição de receptores “homing”, como CCR2,
enquanto aumenta a expressão de CCR7, tornando a célula mais responsiva às
citocinas CCL19 e CCL21, que são co-expressas nos órgãos linfóides. Com isso, DCs
CCR7+ são atraídas para os linfonodos, onde entrarão em contato com as células T
naïve (Worbs et al., 2017).
Na infecção por T. gondii já foram descritos antígenos proteicos apresentados
pelas moléculas MHC I, de modo que a ativação de linfócitos T CD8+ é descrita por
7
vários grupos como fundamental para a resposta imune protetora (Taylor et al., 2007;
Zhao et al., 2009). Sendo um parasita intracelular obrigatório, os mecanismos pelos
quais esses antígenos são processados e apresentados via MHC I ainda são
desconhecidos pois, classicamente, antígenos complexos e armazenados em
vesículas ou vacúolos (como o T. gondii), são associados às moléculas de MHC II e
apresentados aos linfócitos TCD4+. A associação inesperada desses antígenos a
moléculas de MHC I é chamada de Apresentação Cruzada e suas vias ainda são
pouco conhecidas (Goldszmid et al., 2009). Existem trabalhos que sugerem a via
vacuolar, com participação de lisossomos e fagossomos, enquanto outros sugerem a
via citosólica, com transporte do antígeno para o citoplasma na indução da
apresentação de antígenos (Bougnères et al., 2009; Haldar et al., 2013).
As interações entre microrganismos intracelulares e fagócitos do hospedeiro
podem determinar a patogênese ou a resposta imunológica protetora. É consenso que
a resposta imune celular específica é vital para controlar a infecção pelo T. gondii,
contendo a proliferação dos parasitas, que passam a formar os cistos teciduais
característicos da infecção crônica (Denkers & Butcher, 2005). Durante a infecção, as
primeiras células hospedeiras a responder são as DCs. Conforme ilustrado na figura
3, a interação de proteínas do parasito, como a profilina, com os receptores TLR11 e
também TLR12, de DCs murinas, estimulam estas células a produzir interleucina 12
(IL-12) (Tosh et al., 2016). Embora em humanos o TLR12 esteja totalmente ausente
e o TLR11 seja aparentemente um pseudogene não funcional, monócitos humanos
produzem citocinas pró-inflamatórias em resposta à infecção por T. gondii (Sasai et
al., 2018), sugerindo que outros TLRs em humanos reconhecem diferentes
compartimentos de T. gondii para produzir IL-12, ou que exista outro receptor não
identificado que reconhece a infecção por T. gondii em humanos, independente de
TLRs. Células dendríticas foram caracterizadas como o principal tipo celular produtor
de IL-12, o que magnifica a importância desse tipo celular na resposta imune protetora
contra o T. gondii (Tosh et al., 2016).
Em adição ao estímulo de IL-12, macrófagos aumentam a expressão do fator
de necrose tumoral-alpha (TNF-α) em resposta à detecção de proteínas de
ancoragem do parasita, as glicosilfosfatidilinositol (GPI), reconhecidas através dos
receptores Toll-like 2 e 4. Em conjunto, IL-12 e TNF-α promoverão a ativação das
células Natural Killer (NK) e de células T, tornando-as células efetoras. Estas, por sua
vez, passarão a produzir interferon gama (IFN-γ), responsável por ativar células que
8
controlam a infecção. A ligação de IFN-y ao seu receptor, promoverá a ativação do
transdutor de sinal e o ativador da transcrição (STAT) 1, culminando em grande
produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS), por monócitos
e macrófagos, que irá colaborar para a morte dos parasitos, além da regulação
positiva de duas famílias de proteínas de defesa, as IRGs (immunity-related GTPases)
e as GBPs (guanylate-binding proteins). Ambas as famílias fazem parte do grupo de
proteínas do tipo GTPases que são recrutadas, aderem especificamente ao vacúolo
parasitóforo e estão envolvidas na eliminação do parasita (Hunter & Sibley, 2012;
Yamamoto et al., 2012).
As proteínas IRGs são subdivididas em GKS e GMS. As GKS são proteínas
capazes de se ligar a endomenbranas da célula, levando a sua ruptura e destruição
pela via autofágica. Conforme demonstrado na figura 4, em células ativadas por IFN-
γ, as proteínas GKS efetoras são citosólicas e permanecem no estado inativo,
reguladas pela presença das GMS. As proteínas GMS, por sua vez, estão fortemente
associadas à endomembrana das organelas celulares e restritas a organelas
específicas. Em camundongos existem 3 Irgm, que são proteínas da família GMS: a
Irgm1 localiza-se principalmente na membrana do complexo de Golgi, no
compartimento endolissossômico, nas mitocôndrias, nos peroxissomos e nos
Corpúsculos Lipídicos (CLs); Irgm2 localiza-se com o Complexo Golgi e Irgm3 ao
Retículo Endoplasmático (RE) e CLs. Desta forma, a ligação das GMS às
endomembranas das organelas do hospedeiro previne o acúmulo de proteínas GKS
ativadas, permitindo diferenciar entre membranas de organelas do hospedeiro das dos
vacúolos de patógenos (revisto em Vallochi et al., 2018).
Vários membros da subfamília GKS podem reconhecer moléculas lipídicas
hospedeiras específicas presentes na membrana dos vacúolos parasitóforos (MVPs),
rotulando-as para ruptura ou fusão com lisossomos, a fim de inibir o crescimento de
patógenos intracelulares. Desta forma, quando as proteínas GMS estão ausentes nas
endomembranas, as proteínas GKS ativam-se espontaneamente e formam estruturas
semelhantes a agregados, preferencialmente nas MVPs, resultando no rompimento
do vacúolo e a liberação do patógeno no citosol, resultando em necroptose ou
autofagia (Haldar et al., 2013). Enquanto isso, as proteínas GBPs são capazes de
recrutar complexos de proteínas antimicrobianas, a maquinaria de autofagia e
inflamossomas (Hunter & Sibley, 2012). A destruição do parasita pela via autofágica
9
tem sido implicada na indução da apresentação cruzada de antígenos vacuolares,
derivados de vacúolos lisados, via MHC de classe I em DCs (Haldar et al., 2015).
10
Figura 3. Resposta imune contra infecção pelo T. gondii. Resposta inicial pelas
células do sistema imune, envolve diferentes antígenos como a âncora
glicosilfosfatidilinositol (GPI), ativando monócitos e macrófagos pelos receptores Toll-
like 2 (TLR2) e 4 (TLR4), ou a Profilina ativando Células Dendríticas (DC) pela
interação com o receptor Toll-like 11(TLR11). Dessa interação resulta a produção das
citocínas interleucina 12 (IL-12) e fator de necrose tumoral-alpha (TNF-α) que iniciarão
a resposta efetora do sistema imune intato e adaptativo. Nesta fase da resposta as
células principais são as Natural Killer (cél NK) e os Linfócitos T (cél T) CD4+ e CD8+,
que produzem o interferon gama (IFN-γ), fundamental para o controle e destruição do
parasito. O Transdutor de sinal e ativador da transcrição (STAT1), induz a produção
de espécies reativas de oxigênio (ROS), de óxido nítrico (NO), apenas por monócitos
e macrófagos, e a expressão das proteínas IRGs e GBPs que, juntamente com as
Proteínas de Autofagia 5 (ATG5) promovem a destruição do vacúolo parasitóforo (PV).
(adaptado de Hunter & Sibley, 2012).
11
Figura 4. Destruição do T. gondii pelo sistema imune. A sinalização do receptor
interferon (IFN) -γ induz a expressão de moléculas da família GTPases - GTPases
relacionadas à imunidade (GKS e IRGM) e as GPBs - que desempenham papéis
essenciais no tráfico vesicular de membrana, autofagia e respostas antimicrobiana. O
IRGM é uma proteína presente em endomembranas de organelas da célula
hospedeira como Complexo de Golgi (CG), Reticulo Endoplasmático (RE) e
Corpúsculos Lipídicos (CL), protegendo-as da destruição via GKS e proteínas de
ligação a guanilato (GBP), pela maquinaria de autofagia e fusão com lisossomos (Li).
As proteínas inativas GKS e GBP presentes no citoplasma se ligam de maneira
estável às membranas deficientes de IRGM, como a membrana do vacúolo
parasitóforo e eventualmente os CLs, para direcioná-los à autofagia, ou lipofagia,
respectivamente. Os CLs fornecem ácidos graxos para a formação da membrana do
autofagossomo. Os antígenos dos parasitas processados via autofagia eventualmente
são apresentados via moléculas do complexo de hiscompatibilidade de classe I (MHC
I) (adaptado de Vallochi et al., 2018).
12
Ao longo dos anos a evolução do T. gondii com seus hospedeiros permitiu o
desenvolvimento de estratégias para evadir com sucesso o sistema imunológico e
estabelecer uma infecção ao longo da vida em hospedeiros infectados. Por exemplo,
durante a infecção o T. gondii é capaz de decorar o PV com proteínas GMS, como
Irgm1 e 3, evitando dessa forma a destruição pela maquinaria de autofagia, via
proteínas GKS e GBP (Haldar et al., 2013). A resposta imune contra o T.gondii ocorre
através da ação do fator de transcrição STAT 1, transdutor de sinal do IFNγ (figura
3) (revisto por Hunter & Sibley, 2012) . Durante a infecção de macrófagos murinos o T.
gondii foi capaz de inibir as vias de sinalização relacionadas à imunidade, através do
bloqueio de STAT 1 (revisto em Lima & Lodoen, 2019).
Além disso, o T. gondii é capaz de modificar importantes vias de sinalização
durante a infecção de células imunes, como promover a ativação do transdutor de
sinal e o ativador da transcrição 3 e 6 (STAT3 e STAT6) em células humanas e
murinas, que são fosforiladas pela ROP16, diminuindo assim a produção IL-12 (Saeij
et al., 2007). A apoptose também é um meio importante de eliminar os patógenos
intracelulares e o T. gondii se mostrou capaz de deter tanto as vias de apoptose
celular intrínsecas (mitocondriais) como extrínsecas (mediadas pelo receptor de
morte) nas células hospedeiras (revisto em Lima & Lodoen, 2019). Isso pode ajudar o
parasita a preservar seu nicho intracelular, replicar e evitar a depuração pela
imunidade humoral.
Mesmo sem um entendimento completo a respeito dos mecanismos de
sobrevivência do T. gondii, sabe-se que são várias as alterações que o parasito
promove nas células hospedeiras e que a maioria ocorre com a finalidade de promover
a proteção do parasito, aumentando sua sobrevivência no ambiente intracelular e
possibilitando sua nutrição e replicação. Durante o processo de infecção ativa, ocorre
a formação do VP não-fusogênico ao redor do T. gondii. De dentro do VP, o parasita
é capaz de interagir com muitas estruturas do hospedeiro, como CLs, microtúbulos,
endossomos, RE, mitocôndrias e vesículas de Golgi, que se mostram intimamente
associadas ao vacúolo para a aquisição de nutrientes (Gomes et al., 2014; Dou et al.,
2014; Nolan et al., 2017; Nolan et al., 2018). Logo após o processo de entrada, o
parasita começa a secretar proteínas dentro do PV, como as proteínas do granulo
denso GRA2, GRA4 e GRA6, que ajudam a formar uma rede de estruturas
semelhantes a microtúbulos chamada de rede intravacuolar. Está rede ajuda o
parasito a recrutar organelas para próximo do VP, a fim de adquirir nutrientes a partir
13
do hospedeiro (Magno et al., 2005). Por exemplo, através da rede intravacuolar o
parasita é capaz de recrutar vesículas do sistema endolisossomal da célula
hospedeira, utilizando de proteases ai presentes para ingerir e digerir proteínas
citosólicas (Dou et al., 2014).
O T. gondii adquiri os lipídios necessários para sua manutenção e replicação
através de complexos mecanismos, sendo capaz de internalizar colesterol do plasma
e esterificá-lo para armazenamento através das duas enzimas acil-CoA:colesterol
aciltransferase (ACAT) que possui. Tanto as lipoproteína de baixa desidade (LDL),
quanto o colesterol sintetizado pelo hospedeiro são co-transportados para o VP do
parasita, mas a via biossintética do esterol, ou linhas celulares defeituosas do LDL,
não impedem o crescimento do parasita, sugerindo formas compensatórias de
fornecer colesterol ao parasita ( Nishikawa et al., 2005; Lige et al., 2013). Além disso,
o parasita também é capaz de interceptar vesículas positivas para Rab 14, Rab 30 e
Rab 43 derivadas do Complexo de Golgi, retirando o conteúdo de esfingolipídios
(Romano et al., 2013). Recentemente foi mostrado um aumento da biogênese de CLs
induzido pela infecção do T. gondii, em diferentes tipos celulares, e a associação
dessas organelas com o VP (Gomes et al., 2014; Mota et al., 2014; Nolan et al., 2017,
2018). Essa indução também foi observada em DCs humanas infectadas pelo T.
gondii (Vallochi, dados não publicados).
Os CLs são organelas presentes em virtualmente todos os tipos celulares.
Possuem uma hemi-membrana (monocamada) composta por fosfolipídios, colesterol,
sendo locais onde as células armazenam lipídios neutros, como triglicerídeos (TAG)
e ésteres de colesterol (EC), que podem então ser usados em tempos de necessidade
para gerar energia, suprir componentes de membrana e sinalização por mediadores
lipídicos (Welte, 2015).
Não se sabe ao certo como ocorre a biogênese de CLs. A principal hipótese
sugere que a organela é derivada do RE e diferentes modelos dessa biogênese são
propostos. O mais amplamente aceito, apresentado na figura 5, baseia-se na
formação de um núcleo hidrofóbico entre os folhetos do RE, onde ocorre o acúmulo
de enzimas envolvidas no metabolismo lipídico e são sintetizados os lipídios neutros.
Neste local, ocorre o brotamento da membrana do RE, dando origem a uma organela
independente contendo lipídios e proteínas; algumas delas características destas
organelas, como as proteínas da família PAT (perilipina, ADRP e TIP47) (Martin &
Parton, 2006; Bozza et al., 2009).
14
Figura 5. A biogênese dos corpúsculos lipídicos. No modelo atual, os lipídios
neutros são sintetizados entre os folhetos da membrana do reticulo endoplasmático
(RE). A partir de um brotamento de membrana forma-se uma organela independente,
o Corpúsculo Lipídico (CL) que é delimitada por uma monocamada de fosfolipídios e
proteínas. Algumas das proteínas associadas ao CL caracterizam essa organela, são
membros da família de proteínas PAT (perilipina, ADRP e proteína TIP47). (Adaptado
de Martin & Parton, 2006)
As enzimas diacilglicerol aciltransferase 1 e 2 (DGAT2) e ACAT são

responsáveis pela síntese dos principais lipídios que compõe os CLs (TAG e EC). A
DGAT está presente exclusivamente no folheto externo da membrana do RE, podendo
compor a superfície da membrana dos CLs durante sua formação, promovendo a
síntese de TAGs e o crescimento dos CLs. Estas organelas também
compartimentalizam as enzimas responsáveis pela lipólise, a lipase de triacilglicerol
do adipócito (ATGL), bem como as perilipinas, que modulam tanto as atividades de
lipase sensível a hormônio quanto as ATGL (Greenberg et al., 2011; Meyers et al.,
2017).
15
Além do acúmulo de lipídios, os CLs compartimentalizam várias proteínas,
relacionando-os às funções de sinalização e ativação celulares, regulação do
metabolismo de lipídios, tráfego de membranas e controle da síntese e secreção de
mediadores inflamatórios (D’Avila et al., 2008), também estando envolvidos na
resposta imunológica, agindo tanto na imunidade inata quanto na adaptativa
(Bougnères et al., 2009).
Além do armazenamento de lipídios, uma das funções mais bem conhecidas
dos CLs em leucócitos e outras células da resposta imune é a sua capacidade de
atuar como plataformas para a síntese de eicosanóides (Bozza et al., 2011).
Eicosanóides são lipídios não-armazenáveis derivados da oxigenação enzimática do
ácido araquidônico (AA) através das vias da ciclooxigenase (COX) e da lipoxigenase
(LO). São lipídios sinalizadores que desempenham papéis importantes tanto nas
condições fisiológicas como patológicas, como homeostase tecidual, defesa do
hospedeiro e inflamação (revisto em Vallochi et al., 2018; Pereira‐Dutra et al., 2019).
Nos leucócitos, os CLs são um dos principais locais de armazenamento do AA,
esterificados em fosfolipídios e nos triglicerídeos, de onde podem ser mobilizados por
fosfolipases, como a fosfolipase A2 (PLA2), ou pela ATGL, respectivamente. Somado
a isso, os CLs compartimentam todo o aparato enzimático necessário para a síntese
de eicosanoides, como ATGL, PLA2, PGE 2 sintase e LTC 4 sintase. É possível
verificar ainda uma correlação entre a biogênese de corpúsculos lipídicos e a geração
de eicosanóides derivados de COX e LO durante condições inflamatórias, como
prostaglandina E2 (PGE2) e D2 (PGD2), leucotrieno B4 (LTB4) e C4 (LTC 4 ) (revisto por
Vallochi et al., 2018).
Além da imunidade inata, os CLs tem sido implicados na imunidade adaptativa.
A primeira observação de CLs em células dendríticas foi relatada na primeira
descrição morfológica das células (Steinman & Cohn, 1973). Recentemente, um
aumento no número de CLs em células dendríticas tem sido descrito durante a
infecção por Leishmania amazonensis, Nocardia brasiliensis, no câncer e também
após a estimulação por ligantes de TLR, IFN-γ ou adjuvantes baseados em saponina
(Pereira‐Dutra et al., 2019). Sabe-se que as GMS Irgm3 se encontram co-localizadas
com o CLs, interagindo com a proteínas ADRP e sendo fundamental para evitar sua
destruição por lipofagia. A inibição genética ou farmacológica da biogênese dos CL,
ou na ausência de Irgm3, leva a um defeito na via de apresentação cruzada de
16
antígenos em modelo murino, utilizando beads revestidas por ovalbumina (Bougneres
et al., 2010).
O aumento na biogênese de CLs em leucócitos e outras células não imunes,
como fibroblastos e miócitos, é observado em doenças infecciosas causadas por
parasitas, bactérias, vírus, fungos e protozoários. O acúmulo de CL no citoplasma de
diferentes tipos de células hospedeiras foi relatado após a infecção por Plasmodium
berguei, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii e Leishmania sp. e suas
contribuições na patogênese da doença começam a ser reveladas (revisto em Pereira‐
Dutra et al. 2019). Os CLs dos hospedeiros são principal fonte de lipídios para muitos
parasitas intracelulares. Além de atrair os CLs para próximo do PV
o Toxoplasma também é capaz de internalizá-los no lúmen da VP e, através de
mecanismos ainda não conhecidos, adquire lipídios, principalmente colesterol,
importantes para sua replicação e manutenção (Gomes et al., 2014). As duas enzimas
ACAT que o parasita possui, são capazes de esterificar o colesterol e orquestrar a
formação de CLs nos parasitas (Nolan et al., 2017, 2018).
Não se sabe exatamente por quais vias o T. gonii é capaz de induzir a
biogênese de CLs. Sabe-se que a infecção promove a expressão de alguns genes
de síntese de triglicerídeos e transportadores de lipídios, além de inibir a expressão
de genes lipolíticos, principalmente o ATGL, favorecendo o acúmulo de CLs na célula
hospedeira (Nolan et al., 2018). O propósito da indução de CLs em leucócitos
infectados ainda não é bem compreendido. Assim como descrito em outros tipos
celulares, especula-se sua função como fonte de nutrientes e colesterol, uma vez que
o T. gondii altera o metabolismo da célula durante a invasão e utiliza nutrientes
derivados do hospedeiro para manutenção do seu metabolismo (Gomes et al., 2014;
Nolan et al., 2017, 2018). Por outro lado, uma vez que o papel e importância dos CLs
na imunidade contra patógeno vem sendo evidenciado com o passar dos anos, sua
indução em leucócitos pode estar envolvida com a proteção da célula hospedeira,
através de sua participação tanto em processos da imunidade inata quando da
adaptativa.
Baseado nisso, a nossa hipótese é de que os corpúsculos lipídicos participam
da manutenção da infecção de células dendríticas pelo Toxoplasma gondii, como
fonte de lipídios para o parasita, sendo importantes para sua sobrevida, ao mesmo
tempo em que auxiliam na resposta imune pela produção de mediadores importantes
para a ativação celular.
17
2. OBJETIVOS
Objetivo geral
Investigar o papel dos corpúsculos lipídicos durante a infecção de Células
Dendríticas humanas pelo Toxoplasma gondii.
Objetivos específicos
1 Avaliar a viabilidade do parasito intracelular e da célula hospedeira durante a
cinética de infecção de células dendríticas pelo Toxoplasma gondii.
2 Investigar a formação de corpúsculos lipídicos (CL) induzida pela infecção de T.

gondii em DC.
3 Avaliar o impacto da inibição da biogênese de CLs na sobrevida do parasito e na

viabilidade das células hospedeiras.
4 Avaliar o impacto da inibição da biogênese de CLs na imunidade ao T. gondii

caracterizando o fenótipo de células dendríticas humanas após infecção.
18
3. METODOLOGIA
3.1. Parasitos
3.1.1. Manutenção dos parasitos

Taquizoítas da cepa RH de Toxoplasma gondii foram mantidos por passagens
sucessivas em camundongos susceptíveis Swiss Webster infectados com inóculos
em diferentes concentrações (106, 2,5x106, 5x106). Após 2 a 3 dias de infecção, o
peritônio dos animais foi lavado com 5 mL de PBS 1x estéril. O lavado foi passado em
filtro de 5 γm (Millipore) para exclusão de células contaminantes e depois centrifugado
para lavagem a 3.000g, por 10 min, 10 ºC. O protocolo de manutenção e interação
dos parasitas foi autorizado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da IOC
sob a licença CEUA L-13/16.
3.1.2. Teste de viabilidade de taquizoítos de T. gondii

A fim de avaliar a viabilidade dos parasitos pós-infecção, eles foram
previamente marcados com dois fluoróforos: o PKH-26 [3uM] (Sigma-Aldrich – Cat.
MINI26) e o Cell Tracer Far Red [1uM] (CTFarRed) (Thermo Fisher Scientific – Cat.
C34553). O CTFarRed foi diluído em 200 μL de DMSO obtendo-se uma solução
estoque com concentração de 5mM. Os parasitas recuperados de lavado peritoneal
foram lavados uma vez com PBS antes da incubação em CTFarRed [1uM], durante
20 minutos a 37 °C. Após centrifugação a 4.000g, 10 min, a 15ºC, os parasitas foram
ressuspendidos em 1mL de SFB, seguido de incubação por 10 min, a 37ºC, a fim de
retirar o corante extracelular. Antes da marcação com PKH-26, os parasitas foram
lavados duas vezes com PBS estéril. Para a marcação com PKH-26 os parasitas
foram incubados durante 5 minutos com PKH-26 diluído em Diluente C ([3uM]
reagente que acompanha o kit). A reação foi interrompida pela adição de 500uL de
Soro Fetal Bovino. Após a marcação os parasitas foram lavados extensivamente em
PBS, contados e ressuspendido em meio RPMI completo para infecção.
3.2. Soluções tamponadas para análise de diferenças na sensibilidade ao

pH de CTFarRed e PKH-26
As soluções tamponadas em diferentes pHs foram feitas utilizando Tampão
Citrato (para pH 3,0 a 6,2) e Tampão Fosfato (para pH 5,8 a 8,0) conforme
19
previamente descrito por Mcllvaine (1921). Para obter as diferentes soluções de
Tampão Citrato foram adicionadas diferentes proporções das soluções de Ácido
Cítrico 0,1M (Sigma-Aldrich) e de Citrato de Sódio 0,1M (Sigma-Aldrich). Para obter
as diferentes soluções de Tampão Fosfato foram utilizadas diferentes proporções das
soluções de Fosfato de Sódio Monobásico 0,1M (Sigma-Aldrich) e de Fosfato de Sódio
Dibásico 0,1M (Sigma-Aldrich).
3.3. Obtenção de células dendríticas humanas (hDC)

O concentrado de leucócitos (buffy coat) foi obtido através de bolsas doadas
por voluntários sadios ao Serviço de Hemoterapia do Hospital Universitário Clemente
Fraga Filho (HUCFF/UFRJ). Após processamento para retirada do concentrado de
hemácias e do plasma rico em plaquetas, restaram aproximadamente 50mL de Buffy
coat. Nosso protocolo de manipulação é autorizado pelo Comitê de Ética da Fiocruz,
CEP 539/2009.
Células mononucleares (PBMC- Peripheral Blood Mononuclear Cells), foram
isoladas do Buffy Coat, através de gradiente de densidade em Ficoll-Paque PLUS (GE
Healthcare). Cada 5 mL de Buffy Coat foram diluídos em 25 mL de RPMI-1640
(Invitrogem). Os gradientes foram montados em tubos estéreis de polipropileno,
contendo 15 mL de Ficoll, sobreposto de 30mL do Buffy Coat diluído em meio RPMI
puro. Os gradientes foram centrifugados 900g, durante 20 min, a 25ºC e os anéis de
células mononucleares, formados na interface do gradiente, foram recolhidos e
lavados 2 vezes com 40 mL de RPMI puro (400g/10min/10°C). Foi realizada a
contagem do número de células no precipitado em câmara de Neubauer, com
exclusão de células mortas por Azul de Tripan. As células foram plaqueadas em
frascos de cultura de 150cm² (CORNING), na concentração de 5 x 106 monócitos por
mL, com volume final de 30mL de RPMI puro, por frasco de cultura. As células então
foram mantidas na estufa, a 37°C com 5% de CO2, durante duas horas, para
enriquecimento da população de monócitos por adesão. Após o tempo de incubação,
o sobrenadante foi recolhido e os frascos foram lavados vigorosamente três vezes,
com DPBS estéril (Invitrogen), para remoção das células não aderentes. Após as
lavagens foram adicionados 25mL de meio RPMI completo - suplementado com 10%
de SFB (Gibco), penicilina [1.000ug/mL] e estreptomicina [1.000U/mL], L-Glutamina
(Gibco; 2mM), piruvato de sódio (Gibco, 0,1mM), aminoácidos não essenciais
20
(HyClone, 0,1mM), 2-mercaptoetanol (Gibco, 2,5mM) e Vitaminas (Gibco, 0,1mM). As
células foram mantidas a 37°C, 5% CO2, durante 7 dias.
A fim de promover a derivação de células dendríticas humanas, monócitos
enriquecidos a partir de sangue periférico foram cultivados em meio contendo
interleucina-4 (IL-4) e o fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos
(GM-CSF – granulocyte macrophage – colony fator). Foram adicionados aos
monócitos em cultura 50ng/mL das proteínas recombinantes IL-4 e GM-CSF humano
(Peprotech), que foram repostos a cada 2-3 dias.
Após 7 dias de derivação as células foram recolhidas, centrifugadas 400g, 10
min, 10°C, ressuspendidas em RPMI e contadas em câmara de Neubauer, com
exclusão de células inviáveis por azul de Tripan. Foram plaqueadas 2,5x105 por poço,
em placa de 24 poços, em volume final de 500uL por poço, em meio RPMI completo
com 2% de SFB e 25 ng/mL de cada citocínas recombinante.
3.4. Infecção de células dendríticas por taquizoítas de Toxoplasma gondii

Para infecção, os parasitas foram ressuspendidos em meio RPMI, contados em
câmara de Neubauer com Tripan Blue, com a exclusão de parasitas inviáveis. As
células dendríticas obtidas foram plaqueadas em meio contendo 2% de SFB por 16-
18h antes da infecção e receberam taquizoítas na proporção de um parasita para uma
célula (MOI 1) ou dois parasitas para cada célula (MOI 2), ou apenas meio de cultura.
Após 1, 12, 24 e/ou 48 horas de infecção, as células foram recolhidas e centrifugadas
a 400g, por 10 min, a 10°C. Os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -
80°C para posterior dosagem de citocinas e o precipitado celular seguiu para as
análises por citometria de fluxo ou microscopia.
3.5. Análise de corpúsculos lipídicos (CLs) durante a infecção de hDCs

pelo T. gondii
3.5.1. Análise de CLs em hDC sem infecção e infectadas pelo T. gondii

Após infecção, 2x104 hDC, foram citocentrifugadas (4500 rpm/5 min) em lâmina
de vidro e fixadas em formalina a 4% em PBS, durante 20 minutos. Para coloração
das células, foi utilizada uma solução estoque de Oil Red – O (Sigma) diluído a 0,3%
em isopropanol. A solução de trabalho foi diluída a 60% em água e filtrada 3 vezes
antes do uso. As lâminas foram submergidas na solução de trabalho durante 2
21
minutos, mergulhadas 1 vez em isopopanol, lavadas 3 vezes em água e mergulhadas
então em Hematoxilina de Meyer (Merck) durante 4 minutos. Após retirar todo o
excesso de corante lavando em água, as lâminas foram montadas utilizando 5uL do
meio de montagem Fluoroumont G (Southern Biotech). Na análise de Corpúsculos
Lipídicos vários campos das lâminas foram investigados no microscópio de luz
convencional (Olympus, aumento de 100x) e 50 células por lâmina foram avaliadas
nas triplicatas experimentais. A contagem de parasitas por vacúolo parasitóforo foi
realizada pela análise de 100 vácuolos, em cada experimento. A área vermelha por
células e o tamanho médio dos Corpúsculos Lipídicos foram avaliados através do
software Image J e expressos em gráficos por número de pixels.
3.5.2. Inibição de enzimas envolvidas no metabolismo lipídico

Nos experimentos de avaliação da importância dos CLs na infecção de hDCs
por Toxoplasma gondii, as células foram tratadas 1 horas após infecção, ou
receberam um pré-tratamento 30 minutos antes da infecção, com o inibidor da enzima
ácido graxo sintase, (C75, Sigma-Aldrich) ou o inibidor da diacilglicerol aciltransferase
1 (A 922500, Sigma), em diferentes concentrações. Nos poços controles foi
adicionado o veículo das drogas, DMSO.
A fim de privar as hDC de lipídios exógenos utilizamos o soro fetal bovino
delipidado, que foi gentilmente cedido pela Dra Georgia Corrêa Atella, do Laboratório
de Lipídios e Bioquímica de Lipoproteínas, do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ,
Rio de Janeiro, Brasil. O soro foi delipidado conforme previamente descrito por Cham
and Knowles (1976)
3.5.3. Suplementação do meio de cultura com Ácidos Graxo

Para avaliar a importância de lipídio na viabilidade e replicação do Toxoplasma
gondii, as células tiveram o meio de cultura suplementado com Ácido oleico (AO
[50uM]). Para a preparação, o AO (Sigma-Aldrich) foi dissolvido em DMSO a uma
concentração estoque de 400 mM, depois misturado cuidadosamente em meio de
cultura contendo 5% de BSA, em uma concentração final de 10 mM. Para assegurar
a formação de complexos BSA-AO e evitar a formação de micelas, a mistura foi
incubada durante 20 minutos, a 37°C, em banho-maria, com sonicador (Nolan et al.,
2018).
22
3.6. Dosagem de citocínas - ELISA
As dosagens das citocinas foram realizadas utilizando o kit DuoSet® ELISA da
R&D Systems. Foram dosadas as citocinas IL-1-beta, TNF-alfa, IL-6, IL-8 e TGF-beta
e as quimiocinas IP10 e MIF de acordo com o fabricante do kit. O anticorpo de captura
diluído na concentração de trabalho, em PBS, foi utilizado para cobrir os poços (50uL)
de uma placa de 96 poços, que foi selada e incubado over night, a temperatura
ambiente. No dia seguinte a placa foi lavada cinco vezes com o tampão de lavagem
(0,05 Tween 20 [Bio Rad] em PBS) e incubada com a solução de bloqueio (1% BSA
em PBS), durante duas horas, a temperatura ambiente. Ao fim do período de bloqueio
a placa foi lavada e as amostras foram plaqueadas (50uL), assim como a curva padrão
que foi diluída no tampão de bloqueio, conforme recomendado pelo fabricante. Após
duas horas de incubação, a temperatura ambiente, as placas foram lavadas e foi
adicionado o anticorpo de detecção (50uL), diluído em PBS na concentração de
trabalho e incubado por mais duas horas. A placa foi lavada por mais cinco vezes e
foi feita a adição do complexo Streptavidina-HRP diluído (50uL), incubando por uma
hora. Por fim, após lavagem, foi adicionado o substrado cromogênico 3,3 ′, 5,5′-
Tetrametilbenzidina (TMB – Bio Rad), incubando por vinte minutos. A reação foi
interrompida pela adição de 2N H2SO4. A leitura foi realizada na leitora de placas
Spectramax 190, através do software SoftMax Pro versão 5.4.1, nos comprimentos de
onda determinados pelo fabricante.
3.7. Citometria de Fluxo
3.7.1. Análise da viabilidade da hDC

As células foram lavadas e mantidas em 300uL de PBS, suplementado com
2mM EDTA e 2% SFB (Tampão FACS) para aquisição no citômetro de fluxo
(FACSCalibur, BD Pharmingen). A viabilidade das células infectadas foi avaliada pelo
marcador de morte celular fluorescente Fixable Viability Dye eFluor 780 (eBioscience)
na diluição de 1:15.000 em PBS, incubado durante 10 minutos, no escuro. Foram
adquiridos 10.000 eventos por amostra e os dados foram analisados no programa
FlowJo versão 10.5.3 (FlowJo LLC).
23
3.7.2. Análise da expressão de moléculas de superfície
As DC foram ressuspendidas em solução de Tampão FACS + 10% soro
humano inativado para bloqueio dos receptores da porção Fc de anticorpos, por 20
minutos, à 4ºC. Terminado o período de bloqueio, as células foram centrifugadas
(400g / 10 minutos / 4ºC). O sobrenadante foi desprezado e as células ressuspendidas
em PBS e plaqueadas em placas de 96 poços com fundo em “U” (105DC/100 µl).
A marcação foi realizada em 20uL finais com anticorpos diluídos em Tampão
FACS, seguida de intervalo de 20 minutos de incubação à 4ºC e lavagem (400g / 8
minutos). Foram utilizados os seguintes anticorpos:
DC-SIGN-PerCP-Cy5.5 BD Biosciences; 558263
CD14-FITC SouthernBiotech; 9560-02
CD11c-PECy5 eBioscience; 12-0116-42
CD83-FITC eBioscience; 11-0839-42
CD86-PE eBioscience; 12-0869-42
CD273-PerCP-Cy5.5 BD Biosciences; 564256
CD197-PerCP-Cy5.5 BD Biosciences; 1505503
HLA ABC-AlexaFluor488 BioLegend; 311415
HLA DR-APC BioLegend; 307610
Controle Isotipo FITC eBioscience; 11-4031-81
Controle Isotipo PE eBioscience; 25-4031-81
Controle Isotipo PerCP-Cy5.5 BD Biosciences; 550795
Controle Isotipo APC eBioscience; 17-4724-42
Ao final das marcações as células foram fixadas com paraformadeído 2%

diluído em PBS, por 20 min e armazenadas à 4ºC, para posterior aquisição no
citômetro de fluxo.
3.8. Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa GraphPad
Prism versão 8.0.1 para Windows (GraphPad Software Incorporation, San Diego,
California USA). Foram utilizados o teste t de Student e os teste One-way e Two-way
ANOVA. Valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
24
4. RESULTADOS
4.1. Obtenção de células dendríticas a partir de monócitos mononucleares

de sangue periférico
Células dendríticas humanas (hDCs) derivadas de monócitos foram geradas a
partir da separação de monócitos presentes no concentrado de leucócitos de
voluntários sadios. Para o processo de derivação, foram utilizados as citocinas
humanas recombinantes IL-4 e GM-CSF. Após 7 dias de derivação, uma amostra das
células foi recolhida para caracterização da cultura. As células foram marcadas com
anticorpos monoclonais ligados a fluoróforos. As hDCs se mostraram negativas para
o marcador de monócito (CD14), e positiva para os marcadores padrões de células
dendríticas humanas derivadas de monócito (DC-SIGN, CD11c, HLA-DR). As células
apresentaram perfil de DCs imaturas (não ativadas), negativas para CD83. A cultura
apresentou aproximadamente 90% de pureza e 3% de linfócitos residuais (figura 6).
25
Figura 6. Caracterização fenotípica das células dendríticas humanas derivadas
de monócitos. Após 7 dias de derivação sobre estímulo de GMCS-F e IL-4 humano
recombinantes, as células dendríticas foram recolhidas e marcadas com os
anticorpos. O fenótipo das células foi avaliado por citometria de fluxo e os dados são
representados em gráfico de pontos por tamanho (FSC) e complexidade (SSC) e em
histogramas, mostrando as marcações com os anticorpos. A figura mostra o perfil das
células que são DC-SIGN+, CD11c+, HLA-DR+, CD14-, CD83- . Gráfico de pontos
mostra a população de células dendríticas (~90%) e de linfócitos contaminantes
(~3%).
26
4.2. Análise da viabilidade do Toxoplasma gondii e de Células Dendríticas
humanas durante a infecção.
A fim de avaliar a cinética da viabilidade durante a infecção de hDCs pelo T.
gondii, as células foram plaqueadas em meio contendo 2% SFB por 16-18h antes da
infecção, a fim de diminuir a quantidade basal de CLs e, então, foram cultivadas com
taquizoítas recuperados do lavado peritoneal de camundongos Swiss Webster. Após
1, 12, 24 e 48 horas de infecção, foram avaliadas por citometria de fluxo a viabilidade
das hDCs, através do marcador Fixable Viability Dye (FVD), e da infectividade e
viabilidade dos parasitas pela dupla marcação do T. gondii com os fluoróforos PKH-
26 e Cell Tracer Far Red (CTFarRed), realizada antes da infecção.
A identificação dos parasitas mortos ocorreu pela perda da fluorescência do
CTFarRed, quando exposto a pHs ácidos (menores que 4) (figura 7A), diferentemente
do PKH-26 (figura7B). Parasitas previamente marcados, podem entrar nas células por
infecção ativa e se manterem vivos no meio intracelular, mantendo-se duplamente
marcados. Por outro lado, esses parasitas podem ser detectados pela célula
hospedeira ou fagocitados, sendo destruídos por fusão lisossomal com o VP, com
posterior acidificação do meio. Desta forma, parasitas completamente destruídos ou
em processo de destruição, perdem a fluorescência do CTFarRed, se mostrando
positivos apenas para PKH-26. Mais do que isso, o PKH-26 consiste em um lipídio
ligado a um fluoróforo com característica estável, o que faz com que, mesmo após
destruição total do parasita, a célula previamente infectada se mantenha ainda
positiva para o PKH-26 sendo possível detectar células que foram infectadas mesmo
após longos tempos de infecção.
Taquizoítas marcados com CTFarRed e PKH-26 foram incubados overnigth em
soluções tamponadas com diferentes pHs (7,0; 6,0; 5,0; 4,0; 3,0). Como esperado, a
fluorescência de CTFarRed diminuiu proporcionalmente à redução do pH (figura 7A),
enquanto a de PKH-26 se manteve (figura 7B). Em seguida, foi avaliado se a marcação
do T. gondii com PKH-26 (3uM) e CTFarRed (1uM) estaria causando a morte do
parasita. O parasita duplamente marcado foi inicialmente avaliado por citometria de
fluxo, apresentando marcação homogênea para ambos os fluoróforos (figura 7C).
Posteriormente, os mesmos parasitas foram marcados com Fixable Viability Dye
eFluor780 (FVD), um indicador de morte celular. A população CTFarRedposPKH-26pos
se mostrou negativa para FVD, indicando que a dupla marcação com CTFarRed e PKH-
26 não está induzindo a morte do parasita (figura 7D).
27
Na figura 8 apresentamos os dados de citometria de fluxo da viabilidade do
parasita intracelular e das hDC durante a cinética de infecção. Em A, apresentamos a
estratégia de análise com a definição da população de hDC para excluir linfócitos e
debris celulares, gráficos de pontos da intensidade de florescência de PKH26 versus
CTFarRed e histogramas da intensidade de fluorescência de FVD representativos de
cada tempo avaliado e de células não infectadas. Em B temos a média e desvio
padrão da porcentagem de hDC positivas para PKH-26 e negativas para CTFarRed
de três voluntários avaliados em triplicata. Podemos observar o aumento da
população infectada com parasitas mortos ao longo do tempo, com média aproximada
de 5% após 1h de infecção (P≥0,001), 40% já em 12h, 50% em 24h e atingindo 58%
em 48h. Em C temos a porcentagem de hDC duplo positivas para PKH26 e CTFarRed,
representando hDC infectadas com parasitas vivos intracelularmente. Após 1h já
observamos média aproximada de 10% de hDC infectadas, a população de células
infectadas com parasitas vivos aumentou ao longo do tempo, com 21% em 12h, pico
de infecção em 24h, correspondendo a 27% da população, e posterior diminuição para
10% da população em 48 horas (P ≤ 0,0008).
As hDCs mantiveram-se viáveis ao longo do tempo, com mais de 87% da
população FVD negativas, sem diferença com a população controle. Apenas após 48
horas de infecção a população diminuiu para 60% das células vivas (FVDneg),
enquanto as células-controle não infectadas, mantiveram viabilidade de 87,7% (figura
8 A e D).
28
Figura 7. Taquizoítas duplo marcados com PKH-26 e Cell Tracer Far Red. Taquizoítas da
cepa RH foram duplamente marcados com Cell Tracer Far Red (CTFarRed [1uM]) e PKH-26
[3uM]. Após marcação, os parasitas foram incubados, over night, em soluções tamponadas
de pH 7, 6, 5, 4, e 3. Os parasitas também foram marcados com Fixable Viability Dye 780
(FVD) e analisados por citometria de fluxo e microscopia confocal. (A) Histograma da
intensidade de fluorescência de parasitas duplamente marcados com CTFarRed e (B) PKH-
26 submetidos a diferentes pHs. As cores dos histogramas representação parasitas incubados
em cada pH, de acordo com a legenda de cores. (C) DotPlot das duas fluorescências mostram
a marcação homogênea em pH 7 (D) e o histograma de FVD eFluor 780 indica que estão
vivos. (E) Taquizoíta duplo marcado analisado por microscopia e corado por software. Dados
de um único experimento, representativo de 3 experimentos realizados.
29
Figura 8. Análise da infectividade e viabilidade de Células Dendríticas humanas e
viabilidade do T. gondii (continua).
30
Células Dendríticas Humanas (hDC) foram cultivadas em triplicata com taquizoítos
duplamente marcados com PKH26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CTFarRed (1uM)] na MOI 1.
A infectividade e a viabilidade das hDC e dos parasitas foram avaliadas por Citometria de
Fluxo após 1h, 12h, 24h e 48h de cultura. (A-C) Avaliação da viabilidade dos parasitas
intracelulares. (A) Estratégia da análise com a definição da população de hDC por tamanho e
complexidade (gate “DC” em FSC x SSC), das populações de hDC negativas para PKH26 e
CTFarRed ([DC] PKH26 x CTFarRed) em gráficos de pontos e das populações Fixable
Viability Dye 780 positivas (FVD+) e negativas (FVD-) em histograma. (B) A frequência de
hDC com parasitas mortos (PKH26posCTFarRedneg) aumenta ao longo do tempo, enquanto
(C) a frequência de hDC com parasitas vivos (PKH26posCTFarRedpos) tem pico em 24 horas
(27%) e decresce após 48 horas de cultura. Os resultados representam a média e DP de três
experimento independentes, em triplicata (* P≤0,05; ** P≤ 0,003; *** P≤ 0,0008 **** P≤ 0,0001
One-way ANOVA). (D) A viabilidade das hDCs é representada pelo percentual de células
Fixable Viability Dye 780 negativas (FVDneg). As hDC cultivadas na presença do parasita se
mantém alta e apresenta diminuição expressiva após 48 horas (60%) em relação aos demais
tempos e seu controle (87%). Os resultados representam a média e DP dos três experimentos
independentes. (**** P≤ 0,0001 One-way ANOVA. Teste t Student).
31
4.3. Perfil de infecção de células dendríticas humanas vivas e mortas
Uma vez que o cultivo de hDCs com taquizoítas resultou na redução da
viabilidade das células hospedeiras, foi avaliado qual seria o perfil de infecção e a
viabilidade dos parasitas intracelulares, nas hDCs vivas e mortas que foram cultivadas
com o parasita. As células cultivadas com parasitas duplamente marcados (PKH-26 e
CTFarRed), MOI1, foram marcadas com FVD e tiveram sua viabilidade avaliada por
citometria de fluxo após 24 horas e 48 horas de infecção.
Na figura 9A, apresentamos gráficos do controle do experimento
representativos da população PKH26 negativa e positiva em hDCs não cultivadas
(gráfico da esquerda) e cultivadas (direita) com o parasita marcado. As células
cultivadas com o parasita por 24 ou 48 horas foram divididas em dois grupos de acordo
com a sua positividade para PKH-26: células que foram infectadas (PKH-26pos) e
células que não foram infectadas (PKH-26neg). Em seguida, avaliamos o percentual
de células viáveis em cada população (FVD negativas). Em B podemos observar que
as células que apresentaram ou apresentam o parasita em seu citoplasma (PKH-
26pos) mostraram menor viabilidade em 24 horas (~80%) e 48 horas (58%) em
comparação com as células que não foram infectadas (PKH-26 neg) (95% e 78%,
respectivamente).
Após 48h de infecção, avaliamos a viabilidade dos parasitas intracelulares em
hDCs vivas e mortas. Para isso, as células foram divididas em células vivas (FVDneg)
e células mortas (FVDpos) (Figura 9C) e avaliadas quanto a positividade para PKH-
26 e CTFarRed. Foi possível observar que as células mortas (FVDpos) se
apresentaram majoritariamente positivas apenas para PKH-26 e não para CTFarRed,
portanto infectadas com parasitas mortos (91%). Enquanto as células vivas (FVDneg)
apresentam populações positivas tanto para ambos os marcadores (parasitas vivos:
13%), quanto apenas para PKH-26 (parasitas mortos: 72%) (figura 9 C e D).
32
Figura 9. Avaliação da viabilidade de células Dendríticas infectadas pelo T.
gondii (continua).
33
Células Dendríticas Humanas (hDC) foram cultivadas com taquizoítas duplamente
marcados com PKH26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CT FarRed (1uM)] na MOI 1. Após
24 horas ou 48 horas de infecção, as células foram marcadas com Fixable Viability Dye 780
(FVD-780). A viabilidade das hDC e dos parasitas foi avaliado por Citometria de Fluxo. (A)
Estratégia de análise com a definição das populações positiva e negativa para PKH26 em
gráfico de complexidade (SSC) versus PKH26, apresentado em curvas de densidade da
frequência das populações (contour plot). Dessas populações foram construídos histogramas
da fluorescência detectada para FVD-780 e definidas a viabilidade (FVDneg) das populações
infectada (PKH26+) e não infectada (PKH26-). (B) Análise da viabilidade de células infectadas
(PKH26pos) ou não infectadas (PKH26neg) através do percentual de Células dendríticas
humanas negativas para FVD-780(FVDneg). Os resultados representam a média e DP de três
experimento independentes, em triplicata (* P≤ 0,01; *** P≤ 0,003 teste t Student). (C)
Estratégia de análise com a definição das populações de DC vivas (FVDneg) e mortas
(FVDpos), a partir do gráfico de complexidade (SSC) e versus fluorescência para FVD-780.
Dentre as DC vivas ou mortas, foram identificadas as populações positivas para PKH26 e
CTFarRed em gráficos contour plot das duas fluorescências, definindo três populações quanto
a positividade apenas para PKH-26 (PKH-26+CTFR-), para ambos os marcadores (PKH-
26+CTFR+) ou para nenhum deles (PKH-26-CTFR-). (D) Análise do perfil de infecção das
populações de células vivas (FVDneg) e mortas (FVDpos), após 48 horas de infecção pela
frequência das populações infectadas com parasitas mortos (PKH-26+CTFR-), com parasitas
vivos (PKH-26+CTFR+), ou não infectadas (PKH-26-CTFR-). Os resultados representam as
médias e DP de três experimento independentes, em triplicata.
34
Avaliamos nos sobrenadantes das culturas de células dendríticas a produção
de citocinas ao longo da infecção. Observamos um aumento da produção de TNF-alfa
a partir do tempo de 12 horas, nas células cultivadas com o parasita. A produção de
IL-6 também apresentou aumento, porém estatisticamente significativo apenas após
48 horas de infecção, em relação ao controle não infectado. A produção de IL-8 foi
maior nas células infectadas a partir de 24 horas. Em 48 horas, identificamos uma
maior secreção da citocina também no grupo controle, em relação aos demais tempos.
Porém, a produção pelas células infectadas neste mesmo tempo, ainda se mostrou
maior do que o controle não infectado. Não detectamos a produção de IL-1 beta e não
houve alteração na produção de TGF-beta ao longo dos tempos de infecção (figura
10).
Detectamos uma alta produção da quimiocína Proteína induzida por IFN-γ
(IP10/CXCL10) e do Fator inibidor de macrófagos (MIF). IP10 se mostrou aumentada
a partir de 12 horas nas células cultivadas com T. gondii em relação ao controle não
infectado; e foi maior nas células infectadas quando comparada ao tempo de 1 hora.
Da mesma forma, a produção de MIF também apresentou aumento, porém apenas
24 horas após infecção, com relação ao controle não infectado, mantendo-se
aumentada até 48 horas (figura 10).
35
Figura 10. Quantificação de citocinas nas culturas de DCs infectadas com taquizoítas
de T. gondii ao longo do tempo. Células dendríticas foram cultivadas com taquizoítas (MOI
1) por 1, 12, 24 e 48 horas. Ao fim do intervalo de infecção, os sobrenadantes foram coletados
e armazenados à -80°C, até a realização do ensaio de detecção de citocinas por ELISA. As
figuras apresentam a produção de citocinas e quimiocinas em relação ao controle não
infectado (*) e aos demais tempos de infecção (#). Dados representam a média e DP de três
experimentos independentes. (* P≤ 0,03; ** P≤ 0,001; *** P≤0,0003 Teste t Student. # P≤ 0,05;
## P≤ 0,01; ### P≤ 0,002; #### P≤ 0,0001. One-way ANOVA).
36
4.4. Biogênese de Corpúsculos Lipídicos e infectividade de células
dendríticas humanas pelo Toxoplasma gondii
A cinética da infecção e da biogênese de Corpúsculos Lipídicos foi avaliada
pelo cultivo de células dendríticas humanas com taquizoítas (MOI 1), durante 1, 12,
24 e 48 horas. Após os tempos de infeção, as células foram citocentrifugadas, coradas
com Oil Red O e hematoxilina e analisadas por microscopia de campo claro. A análise
das lâminas permitiu observar que o percentual de células infectadas era o mesmo
que o encontrado nas células infectadas com parasitas vivos, pela citometria de fluxo
(figura 8C): pico em 24 horas (30%), seguido de decréscimo em 48 horas para 10%
de células infectadas (figura 11A). O mesmo perfil pôde ser observado quanto ao
número médio de parasitas por células. Ao calcularmos o número médio de parasitas
por vacúolo parasitóforo (VP), observamos vacúolos com 2 a 4 parasitas em 12 horas
e o surgimento de populações com 8 a 16 parasitas por VP em 24 horas. Após 48
horas da infecção, a grande maioria dos VPs apresentam 1 a 2 parasitas por células
novamente.
A contagem do número de corpúsculos lipídicos por célula (figura 11B) e a
determinação da área vermelha por célula (figura 11C) apresentaram aumento, com
diferença estatística significativa no tempo de 24 horas pós-infecção, em relação ao
controle não infectado e aos demais tempos. A biogênese de CLs foi maior após 48
horas de infecção quando comparado ao seu controle (P≥ 0,001) e ao tempo de 24
horas (P≥0,0001). O mesmo aumento pôde ser observado no percentual de células
que apresentam CLs, chegando a 95% em 48 horas. O tamanho médio dos CLs se
manteve o mesmo entre os tempos, exceto após 48 horas de infecção onde os CLs
se mostram maiores em comparação ao seu controle não infectado (P≥0,05) e aos
demais tempos de infecção (P≥0,02).
37
Figura 11. Análise da Biogênese de Corpúsculo Lipídicos em Células Dendrítica
humanas infectadas com taquizoítas de T. gondii (continua).
38
Células Dendríticas Humanas (hDC) foram cultivadas com taquizoítas duplamente marcados
com PKH-26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CT FarRed (1uM)] naMOI 1. Após 1 hora, 12 horas,
24 horas e 48 horas, as células foram citocentrifugadas, fixadas com formalina 4%, coradas e
avaliadas por microscopia. (A) O percentual de hDCs infectadas (figura superior) e o número
de parasitas por células (figura do meio), foi mensurado pela contagem de 50 células de
diferentes campos, em cada replicata. Os resultados representam as médias e os desvio
padrão (DP) de três experimentos independentes, em triplicatas (*P≤ 0,04; **P≤ 0,008;
****P≤0,0001; ns = não significativo, One-way ANOVA). A taxa de replicação do parasita
(figura inferior) ao longo do tempo, foi mensurada pelo número de parasitas por vacúolo
parasitóforo (PV). Os dados representam as médias e os DP de 100 vacúolos parasitóforos.
(B) O número de CL por células (esquerda) e o percentual de células com CL ao longo do
tempo (direita), correspondem à média e ao DP de três experimentos independentes, em
triplicatas, em que foram contadas 50 células de diferentes campos, em cada replicata. Tanto
o número de células com CL quanto a porcentagem de células com CL após 24 e 48h
aumentaram nas células cultivadas com o parasita em comparação ao controle do mesmo
tempo de cultura (*), e ao grupo infectado do tempo anterior (#). Os resultados representam
as médias e DP de três experimentos independentes, em triplicata (**P≤0,001; ***P≤0,0008
Teste t Student. #P≤0,02; ##P≤0,001; ####P≤0,0001 One-way ANOVA). (C) Biogênese de
corpúsculos lipídicos avaliada pela área vermelha por células e pelo tamanho de cada área
em número de pixels. Ao longo da infecção, em triplicatas de células infectadas e controles,
50 células em campos aleatórios por replicata foram analisadas utilizando o programa Image
J. Há aumento da área vermelha por célula nas células infectadas quando comparados ao
controle do mesmo tempo (*), e ao grupo infectado do tempo anterior (#).Os resultados
representam as médias e DP de três experimento independentes. (*P≤ 0,02; **P≤0,001;
****P≤0,0001, teste t Student. ##P≤0,01; ###P≤0,008 One-way ANOVA). (D) Imagens
representativas. As células foram coradas com Hematoxilina de Mayer e Oil Red–O (ORO) e
analisadas em microscópio de luz convencional, em objetiva de 100x. A barra corresponde a
20µm e as setas indicam taquizoítas intracelulares. Dados representativos de 3 experimentos
independentes (n=3), feitos em triplicata.
39
As populações de células que apresentavam ou não taquizoítas intracelulares,
foram avaliadas quanto a presença de CLs após 24 horas. Observamos que as células
parasitadas (30%), em sua maioria, não apresentavam CLs em seu citoplasma (26%),
e as células com CLs não apresentavam parasitas, o que inferiria um possível
consumo dos CLs pelos parasitas (figura 12A). Avaliamos então, a quantidade de
parasitas por PV, em células com e sem CLs. A contagem dos parasitas mostrou que
nas células em que os CLs estão ausentes, há VPs com 4 a 8 parasitas e há também
VPs com 16 parasitas. Já nas células com CLs, a maioria dos VPs apresentam de 1
a 4 parasitas e não há PV com mais de 4 parasitas (figura 12B).
Figura 12. Influência da biogênese de CLs em hDC na infectividade e multiplicidade do

T. gondii. Células Dendríticas Humanas (hDC) foram cultivadas com taquizoítas duplamente
marcados com PKH-26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CT FarRed (1uM)] na MOI 1. Após 24
horas de infecção, as células foram citocentrifugadas, fixadas com formalina 2%, coradas e
avaliadas por microscopia. (A) Biogênese de CLs em hDC infectadas e não infectadas após
cultivo com T. gondii por 24 horas. Os resultados representam as médias e DP de 50 células
em campos aleatórios, de três experimentos independentes, em triplicata. As porcentagens
de hDCs com CLs dentre as células infectadas ou não infectadas (**) são maiores do que nas
hDC sem CLs. As porcentagens de células não parasitadas (taquizoítas ausentes), com ou
sem CLs (##), são maiores do que as células parasitadas (taquizoítas presentes) (** P≤ 0,005
e ## P≤ 0,005 Two-way ANOVA). (B) Perfil do número de parasitas por vacúolo, ao longo do
tempo, em células que apresentaram e não apresentaram corpúsculos lipídicos (CL) após 24h
de infecção. Os dados representam as médias e os DP de 100 vacúolos parasitóforos, de três
experimentos independentes, em triplicata.
40
4.5. Impacto da taxa de infecção na biogênese de CLs e na viabilidade de
hDCs.
Com o objetivo de avaliar se o MOI utilizado altera a cinética da infecção, as
Células Dendríticas humanas foram plaqueadas e cultivadas com T. gondii na
proporção de 1 ou 2 parasitas para cada células hospedeira (MOI 1 e 2). Após 24 e
48 horas em cultura, as células foram marcadas com Fixable Viability Dye (FVD) para
análise da viabilidade das células por citometria de fluxo, além da taxa de infecção e
biogênese de CLs por microscopia de campo claro.
Por microscopia foi possível observar que a taxa de infecção é proporcional ao
MOI utilizado. Células infectadas na proporção de 1 parasita para cada célula
apresentaram pico de infecção de 30% das células em 24 horas. Em contrapartida,
células cultivadas na proporção de 2 parasitas para cada célula mostraram taxa de
infecção máxima de 60% em 24 horas. Em ambos os casos, temos a diminuição da
taxa de infecção em 48 horas. Além disso, existe a interferência do MOI na média de
parasitas por células (figura 13A). As hDCs infectadas na MOI 1 apresentam a média
de 2 parasitas por célula em 24 horas, enquanto as infectadas na MOI 2 tem a média
mais alta com pico de 6 parasitas por células em 24 horas. É possível observar a
diminuição dessa média em 48 horas, em ambos os MOIs avaliados (figura 13B).
A análise da viabilidade através da população FVDneg mostrou que células
infectadas com MOI 2 apresentam menor viabilidade em comparação às hDCs
infectadas com MOI 1, tanto em 24 quanto em 48 horas. As hDCs infectadas com MOI
2 apresentaram diminuição da viabilidade em relação ao controle já em 24 horas
(40%), enquanto as hDC infectadas com MOI 1 não apresentaram perda da
viabilidade em 24 horas, apenas em 48 horas, com 50% das células vivas (figura 13C).
Quanto a indução de Corpúsculos Lipídicos, os dados mostraram a variação da
biogênese de acordo com o MOI. A utilização da MOI 1 resultou no pico da biogênese
em 48 horas, enquanto na MOI 2 o pico ocorreu de forma precoce, já em 24 horas. O
mesmo fenômeno pôde ser visto quanto à porcentagem de hDCs apresentando CLs
(figura 13 D e E).
Através da análise de correlação, foi possível observar que o pico da biogênese
de CLs se relaciona inversamente com viabilidade das células hospedeiras. Em 24
horas, as células infectadas com MOI 1 ainda não sofreram perda da viabilidade e a
produção de CLs é baixa. Porém, nas hDCs infectadas com MOI 2 podemos observar
logo em 24 horas que a viabilidade das células se encontra ao redor de 50% e temos
41
o pico da biogênese de CLs (figura 13F). Conforme esperado, a taxa de infecção
também se correlaciona com a perda da viabilidade. Quanto maior a taxa de infecção,
mais precocemente se tem a diminuição da viabilidade (figura 13G).
Juntos os dados mostram que tanto a viabilidade das hDCs infectadas pelo T.
gondii, quanto a taxa de infecção e a biogênese de CLs são dependentes do MOI
utilizado para infecção. Deste modo, quanto maior a taxa de infecção, mais
precocemente ocorre a perda viabilidade celular e, curiosamente, o pico da biogênese
de CLs.
Figura 13. Avaliação da biogênese de Corpúsculos Lipídicos e da viabilidade de Células

Dendríticas infectadas por T. gondii, em diferentes MOI (continua).
42
Células Dendriticas Humanas cultivadas com taquizoítas MOI 1 e 2 (RH), foram avaliadas por
citometria de fluxo e microscopia de luz convencional, 24h e 48h pós-infecção. (A)
Comparação da taxa de infecção (B) e do número de parasitas por células entre infecções
com diferentes MOI, após 24 horas e 48 horas de infecção. Os dados apresentam média e
DP de experimentos independentes. (* P≤ 0,02; ** P≤ 0,001; *** P≤ 0,0003; **** P≤ <0,0001,
teste t Student). (C) Análise da viabilidade das hDCs controle ou cultivadas com T. gondii,
representada pelo percentual de células Fixable Viability Dye negativas (FVDneg), em 24
horas e 48 horas pós-infecção. Dados apresentam análise estatística entre células cultivadas
com o parasita em comparação ao controle (*) e entre células infectadas com diferentes MOI
(#). Os dados apresentam média e DP de experimentos independentes. (** P≤ 0,002; *** P≤
0,0001 teste t Student. ## P≤ 0,002; ### P≤ 0,0004 One-way ANOVA). (D) Média de CL por
células (E) e o percentual de células com CL, em células dendríticas humanas cultivas com
T. gondii em diferentes MOI, após 24 horas e 48 horas de infecção. Dados correspondem à
média da contagem de 50 células de diferentes campos, em cada replicata. Análise estatística
entre células cultivadas com o parasita em comparação ao controle (*) e entre células
infectadas com diferentes MOI (#). Resultados apesentam média e DP de experimentos
independentes. (** P≤ 0,003; *** P≤ 0,0008; **** P≤ <0,0001 teste t Student. ### P≤ 0,0004;
#### P≤ <0,0001 One-way ANOVA). (F) Análise da correlação entre viabilidade das hDC
infectadas e taxa de infecção em 24 horas (G) e do número de CL por células e a viabilidade
em 24 horas. Gráficos foram montados utilizando valores de células dendríticas humanas que
foram cultivadas com taquizoítas MOI 1 e 2. Dados correspondem à média da contagem de
50 células de diferentes campos, em cada replicata. Nos gráficos são apresentados média de
três experimentos independentes (n=3) com MOI 1 e dois experimentos independentes (n=2)
com MOI 2.
43
4.6. Determinação da concentração dos inibidores da biogênese de CLs
Uma vez que o cultivo de hDCs com o T. gondii levou ao aumento da biogênese
de CLs, avaliamos qual seria o impacto da inibição da biogênese na sobrevida do
parasita intracelular. Para esse objetivo, utilizamos dois inibidores: o C75, que tem
efeito inibitório sobre a enzima ácido graxo sintase (FAS), responsável pela síntese
de ácidos graxos; ou o inibidor A922500 da diacilglicerol aciltransferase 1 (DGAT-1),
que catalisa a formação de triacilglicerol a partir de diacilglicerol. Para isso, foi
necessário determinar a melhor concentração a ser utilizada de ambos os inibidores.
Primeiramente, foi feito um experimento com o C75 em hDCs cultivadas com
T. gondii MOI 2, a fim de se ter uma indução maior de CLs, após 24 horas de infecção.
As células foram plaqueadas overnight em meio com 2% de SFB e, 30 minutos antes
da infecção, receberam um pré-tratamento com C75 nas concentrações de 5, 2,5 e
1,25 ug/mL. Após 24 horas de infecção, as células foram recolhidas e marcadas com
FVD para avalição da viabilidade por citometria de fluxo. Além disso, foi realizada a
citocentrifugação das células e a coloração com hematoxilina e ORO para análise da
taxa de infecção, da replicação dos parasitas e da indução da biogênese de CLs por
microscópio de luz. Os dados apresentados correspondem a dois experimentos
realizados em duplicata.
As avaliações por microscopia mostraram que apenas a concentração de
5ug/mL de C75 pareceu capaz de diminuir a biogênese de CLs após 24h de infecção.
Tanto a concentração de 5ug/mL quanto a de 2,5ug/mL pareceram diminuir a
porcentagem de hDCs que apresentaram CLs, porém, as células tratadas com 5ug/mL
mostraram um percentual aparentemente menor (figura 14A e C). O tratamento com
a maior concentração de C75 também apresentou uma tendência de diminuição da
taxa de infecção para 20%, em comparação com o controle apenas com o veículo,
que apresentou taxa de 60% de células infectadas. Da mesma forma, também houve
uma diminuição na média de parasitas por células, que reduziu de 8 parasitas por
célula no grupo DMSO, para 2 parasita por célula no grupo tratado com 5ug/mL. A
concentração de 2,5ug/mL também levou a diminuição, mas de forma aparentemente
menos significativa, de ambos os parâmetros (figura 14B e C). Como foi realizado o
pré-tratamento das hDCs antes do cultivo com os parasitas, não é possível afirmar
que tal diminuição seja consequência da ausência de corpúsculos lipídicos, uma vez
44
que o inibidor pode ter tido um efeito direto no parasita, causando sua morte, ou de
alguma forma interferido no processo de infecção.
Figura 14.Determinação da concentração do inibidor C75, em células dendríticas

humanas infectadas pelo T. gondii (continua).
45
Células Dendríticas humanas (hDC) foram cultivadas com taquizoítas na MOI 2. As células
receberam pré-tratamento com C75, o inibidor da enzima Ácido Graxo Sintase, ou seu veículo
(DMSO), 30 minutos antes da infecção, nas concentrações de 5ug/mL, 2,5ug/mL e 1,25ug/mL.
Após 24 horas, as células foram citocentrifugadas, fixadas com Formalina 4%, coradas e
avaliadas por microscopia. Dados correspondem à média da contagem de 50 células de
diferentes campos. O pré-tratamento com C75 parece ter causado aparente redução na (A)
média do número de corpúsculos lipídicos (CL) por célula (esquerda) e na porcentagem de
células com CL (direita), nas células tratadas com 5ug/mL de C75. Além disso, quando pré-
tratadas com C75, (B) a porcentagem de hDC que apresentam parasitas (esquerda [5uM]) e
o número médio de parasitas por células (direita [5uM e 2.5uM]) também pareceram
apresentar redução. (C) Imagens representativas. As células foram coradas com
Hematoxilina de Mayer e Oil Red–O (ORO) e analisadas em microscópio de luz convencional,
em aumento de 100x, barra de 20µm. Setas indicando taquizoítas intracelulares.
46
Para avaliar se o tratamento se mostrou citotóxico para as hDCs, as células
foram marcadas com FVD e avaliadas por FACS. A partir dos dados da citometria de
fluxo foi possível observar que o tratamento com inibidor não afetou a viabilidade das
células controle e pareceu ser protetor para as células infectadas, na concentração de
5ug/mL, concluindo assim que o tratamento com o inibidor não causou a morte das
hDCs (figura 15 A e B).
Figura 15. Avalição da viabilidade de células dendríticas humanas infectadas pelo T.

gondii, tratadas com diferentes concentrações do inibidor C75. Células Dendríticas
humanas (hDC) foram cultivadas com taquizoítas na MOI 2. As células receberam pré-
tratamento com C75, o inibidor da enzima Ácido Graxo Sintase, ou seu veículo (DMSO), 30
minutos antes da infecção, nas concentrações de 5ug/mL, 2,5ug/mL e 1,25ug/mL. Após 24
horas de infecção, as células tiveram sua viabilidade avaliada por citometria de fluxo. (A)
Análise da viabilidade das hDCs controle, ou cultivadas com T. gondii, representada pelo
percentual de células Fixable Viability Dye negativas (FVDneg), nas diferentes condições. (B)
Histogramas representativo das populações Fixable Viability Dye 780 positivas (FVD+) e
negativas (FVD-) em histograma. Dados representativos de 2 experimentos independentes,
realizados em duplicata.
47
Também foi realizado um experimento para determinar a concentração a ser
usada do inibidor da DGAT-1. As hDCs foram plaqueadas em meio com 2% de SFB
e infectadas com T. gondii MOI 1, marcado com PKH-26 e CTFarRed, para avaliação
do impactado da possível inibição dos CLs na sobrevida do parasita. A fim de evitar
efeitos diretos dos inibidores nos parasitas, os tratamentos foram realizados 1 hora
após a infecção, nas concentrações de 10uM, 5uM e 2,5uM. Após 24 horas de
infecção, foi realizada a análise por citometria de fluxo da viabilidade das hDCs, bem
como da viabilidade dos parasitas. Pela coloração com hematoxilina e ORO foram
avaliadas por microscopia de luz convencional a infectividade dos parasitas e a
biogênese de CLs. Os dados apresentados correspondem a um único experimento
feito em triplicata.
A contagem de CLs mostrou tendência de diminuição do número de corpúsculo
por célula, em relação ao controle tratado apenas com o veículo, causada pelo
tratamento com inibidor da DGAT na concentração de 5uM e, de forma mais
acentuada, na concentração de 10uM, caindo de 13 CL/célula no grupo controle, para
6 CL/célula e 3 CL/cél, respectivamente. A aparente redução também foi observada
por citometria de fluxo na porcentagem de células que apresentaram CLs, em ambas
as concentrações (figura 16A e C).
Observamos a redução da taxa de infecção (em torno de 20%) nas células
tratadas com 10uM do inibidor da DGAT-1, comparada a 29% nas células tratadas
com veículo. Também parece ocorrer uma diminuição significativa no número de
parasitas por célula, principalmente nas concentrações de 10uM e 5uM, em relação
ao grupo controle (figura 16B e C).
48
Figura 16. Determinação da concentração do inibidor da DGAT-1, em células
dendríticas humanas infectadas pelo T. gondii (continua).
49
com PKH-26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CTFarRed (1uM)], na MOI 1 em triplicata. Após 1
hora, as células foram tratadas com o inibidor (A92500) da enzima Diacilglicerol
Aciltransferase 1 (iDGAT) nas concentrações de 10uM, 5uM e 2,5uM, ou seu veículo (DMSO).
Após 24 horas, as células foram citocentrifugadas, fixadas com formalina 4%, coradas e
avaliadas por microscopia. Dados correspondem à média da contagem de 50 células de
diferentes campos. O tratamento com iDGAT parece ter causado aparente redução na (A)
média do número de corpúsculos lipídicos (CL) por célula (esquerda) e na porcentagem de
células com CL (direita), nas células tratadas com 10uM de iDGAT em relação às células
DMSO. Além disso, quando tratadas com iDGAT, (B) a porcentagem de hDC que apresentam
parasitas (esquerda [10uM]) e o número médio de parasitas por células (direita [10uM e 5uM])
também pareceram apresentar redução em comparação com o grupo veículo (*). (C) Imagens
analisadas em microscópio de luz convencional, em aumento de 100x, barra de 20µm. Setas
indicando taquizoítas intracelulares. (*) em relação ao controle não infectado. (#) em relação
ao controle infectado, tratado com o veículo. Média e DP, triplicata. # P <0,05; ## P <0,008
### P <0,001; #### P <0.0001ANOVA, Tukey. ** P 0,03; *** P <0,001; **** P <0,0001 Teste t
Student. Dados de um experimento (n=1) realizado em triplicata.
50
Os dados de citometria de fluxo sugerem que o tratamento com o inibidor da
DGAT 1 na concentração de 10uM aumentou a sobrevida do parasita intracelular. O
percentual de células dendríticas PKHposCTFarRedneg, que representam as células
infectadas com parasita intracelular morto ou em processo de destruição, foi de 43%
no grupo tratado enquanto no grupo controle (DMSO) foi de 35% (figura 17 A e B).
Corroborando com os dados da taxa de infecção por microscopia, as hDCs infectadas
tratadas com DMSO, que se encontram com parasita intracelular vivo (PKH-
26posCTFarRedpos), apresentaram uma taxa de infecção de 30%, enquanto as
células tratadas com inibidor da DGAT (10uM e 5uM) apresentaram uma porcentagem
menor (22%) (figura 17 A e C) .
O tratamento com o inibidor da DGAT-1 não alterou a viabilidade das hDCs em
relação ao controle, indicando assim, que o tratamento não foi tóxico para as células
(figura 17, A e D).
Juntos esses dados inferem que o tratamento com o inibidor da DGAT-1 e C75
foi capaz de diminuir a biogênese de CLs, impactando na taxa de infecção e no
número de parasitas por célula, sem de mostrar tóxicos para as hDCs.
Realizamos ainda um experimento para avaliar uma possível ação direta dos
tratamentos sobre os taquizoítas. Para tal, os parasitas foram incubados durante 24
horas em meio suplementado com 2%SFB, contendo 10uM de A922500 ou 5ug/mL
de C75. Após esse tempo os parasitas foram recolhidos e marcados com FVD para
avalição da viabilidade por citometria de fluxo. Os dados apresentados correspondem
a um experimento único feito em triplicata. Os grupos experimentais apresentaram o
mesmo percentual de parasitas vivos, em torno de 80%, inferindo assim que o
tratamento não causou a morte dos parasitas (figura 18 A e B).
51
Figura 17. Avaliação da viabilidade do T. gondii e de células dendríticas humanas,
tratadas com diferentes concentrações do inibidor da DGAT1 (continua).
52
na MOI 1 e em triplicata. Após 1 hora, as células foram tratadas com o inibidor da enzima
Diacilglicerol Aciltransferase 1 (iDGAT) nas concentrações de 10uM, 5uM e 2,5uM, ou seu
veículo (DMSO). Após 24 horas de infecção, as células tiveram sua viabilidade avaliada por
citometria de fluxo. (A) Estratégia da análise com a definição da população de hDC por
tamanho e complexidade (gate “DC” em FSC x SSC), seguida das populações de hDC
negativas para PKH26 e CTFarRed ([DC] PKH26 x CTFarRed) em gráficos de pontos e das
populações Fixable Viability Dye 780 positivas (FVD+) e negativas (FVD-) em histograma. (B)
Percentual de hDC com parasitas mortos (PKH26posCTFarRedneg) e (C) a frequência de hDC
com parasitas vivos (PKH26posCTFarRedpos) ao longo do tempo. (D) Análise da viabilidade
das hDCs representada pelo percentual de células FVDneg. Os resultados representam a
média e o DP das triplicatas de um experimento (n=1). ** P≤ <0,008 *** P≤ <0,001 ANOVA,
Tukey.
53
Figura 18. Tratamento com C75 (inibidor da FAS) e A922500 (inibidor da DGAT-1) em
taquizoítas. Parasitas foram mantidos em meio contendo o inibidor da enzima ácido graxo
sintase, C75 [5ug/ml], ou o inibidor da enzima Diacilglicerol Aciltransferase 1 (A922500,
iDGAT [10ug/ml]), ou seu veículo (DMSO). Após 24h de incubação, os parasitas foram
marcados com o indicador de viabilidade Fixable Viability Dye e analisados por citometria de
fluxo. (A) Análise da viabilidade dos parasitas representada pelo percentual de células
FVDneg, não apresentando diferença em relação aos parasitas não tratados (meio) e ao
veículo (DMSO). (B) Histograma representativo do gráfico anterior, apresentando percentual
da população FVD+ e FVD-. Dados de um único experimento (n=1) feito em triplicata.
54
4.7. Impacto da inibição da biogênese de CLs em hDCs infectadas pelo T.
gondii
Para avaliar como a ausência de CLs impactaria a infecção de células
dendríticas pelo T. gondii, hDCs foram plaqueadas 16-18 horas antes da infecção em
meio contendo 2% de SFB ou de SFB delipidado (SFBd). A infecção das células foi
realizada com taquizoítas duplamente marcados, na MOI 1 em triplicada. Após 1 hora
de infecção, as células foram tratadas com o inibidor da FAS (C75 [5ug/mL]), ou com
o inibidor da enzima DGAT 1 (A922500 [10uM]), ou seu veículo (DMSO). Após 24 e
48 horas pós-infecção, as células foram marcadas com FVD. Também foram feitos
citoesfregaços em lâminas de vidro, corados com ORO e Hematoxilina, para análise
da biogênese de CL, infectividade e replicação dos parasitas.
A avaliação da viabilidade e infectividade dos parasitas intracelulares por
citometria de fluxo mostrou que o percentual de células com parasitas mortos (PKH-
26posCTFarRedneg) se manteve igual entre células tratadas e não tratadas, no tempo
de 24 horas, com exceção do grupo tratado com C75 que apresentou redução
estatisticamente significativa (22%) em relação ao veículo (32%). Após 48 horas de
infecção, as células sem tratamento e as que receberam o veículo apresentaram um
aumento na população de células com parasitas mortos (PKH-26posCTFarRedneg
aproximadamente 44%), enquanto as células tratadas com C75 se mantiveram
semelhantes ao tempo de 24 horas, com 21% das células com parasitas vivos. Não
houve diferença estatística entre as células tratadas com iDGAT ou SFBd (figura 19,
A e C).
A frequência de células infectadas com parasitas vivos (PKH-
26posCTFarRedpos) foi menor nas células tratadas com C75 e iDGAT e nas células
cultivadas com SFBd (em torno de 13%), em relação com o grupo DMSO e sem
tratamentos (aproximadamente 26%). Após 48 horas de infecção, foi observada a
redução do percentual de células PKH-26posCTFarRedpos apenas nos grupos não
tratado e veículo (10%), enquanto os grupos tratados não apresentaram alterações,
comparados ao tempo de 24 horas (figura 19 B e C).
A viabilidade das células dendríticas não apresentou alterações no tempo de
24 horas, em nenhum dos grupos. Após 48 horas de infecção, as células cultivadas
com T. gondii sem tratamento (62%), veículo (58%) e tratadas com C75 (79%)
apresentaram redução da viabilidade em comparação com seu controle não infectado
(aproximadamente 88%). Mesmo assim, o grupo SFBd (80%), iDGAT (78%) e C75
55
apresentaram viabilidade maior dentre as células infectadas em comparação com o
grupo sem tratamento e veículo (figura 17, D e E).
56
Figura 19. Efeitos da inibição farmacológica da biogênese de Corpúsculos Lipídicos na
viabilidade durante a infecção de células dendríticas pelo T. gondii (continua).
57
Células Dendríticas humanas (hDC) foram cultivadas com taquizoítas duplamente marcados
com PKH-26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CT FarRed (1uM)] na MOI 1. As hDC foram
mantidas overnight em meio contendo 2% de soro fetal bovino, ou soro fetal bovino delipitado
(SFBd). Após 1 hora de infecção, as células foram tratadas com o inibidor da diacilglicerol
aciltransferase 1 (A922500, iDGAT [10uM]) com o inibidor da enzima ácido graxo sintase
(C75 [5ug/ml]), ou com o veículo (DMSO). (A-C) Avaliação da viabilidade dos parasitas
intracelulares por citometria de fluxo, 24h e 48h pós-infecção. (A) A frequência de hDC com
parasitas mortos (PKH-26posCTFarRedneg) se manteve semelhante entre os tratamentos em
24 horas, exceto pelo tratamento com C75 que mostrou redução do percentual em relação ao
veículo (*). Em 48 horas os grupos meio e veículo apresentaram aumento do percentual
quando comparado com 24 horas (#). O percentual de C75 se manteve menor que o do grupo
veículo do mesmo tempo (*). (B) A frequência de hDC com parasitas vivos
(PKH26posCTFarRedpos) em 24 horas se mostrou reduzida em todos os tratamentos em
relação ao veículo, assim como no grupo SFBd em relação ao grupo meio (*). Em 48 horas,
houve redução do percentual do grupo meio e veículo, quando comparado a 24 horas. Os
resultados representam a média e DP de três experimento independentes, em triplicata (* P≤
0,01; ** P≤ 0,001; *** P≤ 0,0004 One-way ANOVA. ## P≤ 0,003 Teste t Student). (C) Gráficos
de pontos representativos dos gráficos anteriores, apresentando as frequências das
populações de hDC infectadas ([DC] PKH26 x CTFarRed), perante diferentes tratamentos, 24
horas e 48 horas pós infecção. (D) A viabilidade das hDCs é representada pelo percentual de
células Fixable Viability Dye 780 negativas (FVDneg). Não houve diferença de viabilidade
entre grupo Toxoplasma e Controle em 24 horas. Após 48 horas de infecção as células do
grupo Toxoplasma, tratadas com o veículo, C75 e sem tratamento (meio) apresentaram
redução da viabilidade em relação ao seu controle. Houve diferença estatística significativa
entre o grupo Toxoplasma tratado e SFBd, em relação ao grupo veículo e meio (#). Os
resultados representam a média e DP dos três experimentos independentes (* P≤ 0,002; ***
P≤ 0,0003; **** P≤ 0,0001; ns= não significativo; Teste t Student. #### **** P≤ 0,0001 One-
way ANOVA). (E) Histograma representativo do gráfico anterior, apresentando a avaliação da
população FVD positiva (FVD+) e negativa (FVD-), no grupo Toxoplasma, entre diferentes
tratamentos, no tempo de 48 horas.
58
As células cultivadas com parasitas, que foram tratadas com iDGAT, C75 ou
cultivadas com SFBd, apresentaram a diminuição da biogênese de CLs em
comparação com o veículo e com as células cultivadas com SFB, tanto em 24 horas
quanto em 48 horas pós infecção. O fenômeno é observado tanto pelo número médio
de CLs por células (figura 20, A e E), quanto pelo percentual de células com CLs
(figura B e C) ou a área vermelha por célula (figura C e E). A avaliação da área
vermelha por células apresentou um pequeno aumento nas células tratadas com o
C75, em relação ao seu controle não infectado, tanto em 24 horas, quanto em 48
horas (figura 20, C e E). Foi observada alteração no tamanho médio dos CLs, apenas
no tempo de 48 horas, entre as células infectadas sem tratamentos (figura 20, D e E).
O tratamento com os inibidores e o cultivo com SFBd levou a uma redução no
percentual de células infectadas em relação às células controle. Como já observado
durante a cinética de infecção (figura 8D), há redução do percentual de células
infectadas de 24 para 48 horas, enquanto as células tratadas não mostraram alteração
na porcentagem de céulas infectadas de um tempo para outro (figura 21A). Quanto à
média de CLs, as células sem tratamentos e com veículo apresentam o pico de
replicação em 24 horas, com posterior redução em 48 horas pós infecção, enquanto
as células tratadas com os inibidores e com SFBd apresentaram aumento do número
de parasitas por células apenas 48 horas pós-infecção (figura 21B). A avalição do
número de parasitas por VP em 24 horas mostrou que a maioria possui 8 parasitas e
há VPs com 16 parasitas, entre as células não tratadas e veículo. Este perfil foi
alterado após 48 horas de infecção, onde a maioria dos VPs apresentam apenas 1 a
2 parasitas. De forma curiosa, células que receberam os inibidores apresentaram no
máximo 4 parasitas por VP em 24 horas. Após 48 horas de infecção, observamos VPs
com 8 parasitas e um pequeno número de células com 16 parasitas por VP (figura 21
C). Juntos esses dados mostram que o tratamento com C75, iDGAT e o uso do SFBd
levou a uma redução da biogênese de CLs e, consequentemente, um atraso na
replicação dos parasitas em comparação aos grupos não tratados e que receberam o
veículo.
59
Figura 20. Inibição farmacológica da biogênese de Corpúsculos Lipídicos durante a
infecção de células dendríticas pelo T. gondii (continua).
60
Dendríticas humanas (hDC) foram cultivadas com taquizoítas duplamente marcados com
PKH-26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CT FarRed (1uM)], na MOI 1. As hDC foram mantidas
overnight em meio contendo 2% de soro fetal bovino, ou soro fetal bovino delipitado (SFBd).
Após 1 hora de infecção, as células foram tratadas com o inibidor da diacilglicerol
aciltransferase 1 (A922500, iDGAT [10uM]) com o inibidor da enzima ácido graxo sintase (C75
[5ug/ml]), ou apenas com o veículo (DMSO). Após 24 horas e 48 horas, as células foram
citocentrifugadas, fixadas com formalina 4%, coradas e avaliadas por microscopia. Os dados
correspondem à média da contagem de 50 células de diferentes campos. (A) A média de CL
por células, (B) o percentual de células com CL, (C) e a área vermelha por células apresentam
aumento nas células cultivadas com o parasita (Toxoplasma), sem tratamento ou tratadas
com o veículo, em comparação ao controle do mesmo tempo (*). Os tratamentos
farmacológicos levaram à inibição da biogênese de CL no grupo Toxoplasma, assim como o
uso do SFBd, quando comparado ao veículo e ao grupo meio (#), em ambos os tempos. O
tratamento com C75 após 48 horas de infecção, promoveu uma inibição parcial no número de
CL por células e pequeno aumento na área vermelha por célula, em 24 horas e 48 horas,
quando comparado ao grupo controle no mesmo tempo (*). (D) O tamanho médio dos CLs
não se altera pelos tratamentos ou pela infecção após 24 horas. Após 48 horas é possível
observar aumento do tamanho dos CLs no grupo Toxoplasma tratado com DMSO, C75 e sem
tratamento, em comparação com os grupos 24 horas (*). Os CL dos grupos
farmacologicamente tratados se mostraram menores do que o das células tratadas com
DMSO ou sem tratamento após 48h de infecção (#). As análises da média da área vermelha
por células e tamanho médio dos CL foram realizadas em 50 células, pelo software Image J.
Dados apresentados em número de pixels. Resultados representam a média e o DP de três
experimento independentes, em triplicata. (* P≤ 0,02 ** P≤ 0,002; *** P≤ 0,0005; **** P≤
0,0001 teste t Student. ## P≤ 0,001; #### P≤ 0,0001 One-way ANOVA). (E) Imagens
analisadas em microscópio de luz convencional, em aumento de 100x, barra de 20µm. Setas
indicando taquizoítas intracelulares.
61
Figura 21. Efeitos da inibição farmacológica da biogênese de Corpúsculos Lipídicos na
infectividade e replicação do T. gondii durante a infecção de células dendríticas. Células
Dendríticas humanas (hDC) foram cultivadas com taquizoítas duplamente marcados com
PKH-26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CT FarRed (1uM)] na MOI 1. As hDC foram mantidas
overnight em meio contendo 2% de soro fetal bovino ou soro fetal bovino delipitado (SFBd).
Após 1 hora de infecção, as células foram tratadas com o inibidor da diacilglicerol
aciltransferase 1 (A92250, iDGAT [10uM]), o inibidor da enzima ácido graxo sintase (C75
[5ug/ml]), ou apenas com o veículo (DMSO). Após 24 horas e 48 horas, as células foram
citocentrifugadas, fixadas com formalina 4%, coradas e avaliadas por microscopia. (A) O
percentual de hDCs infectadas (B) e o número médio de parasitas por células, foi mensurado
pela contagem de 50 células de diferentes campos, em cada replicata. Dados apresentam
menor taxa de infecção nas células farmacologicamente tratadas, em comparação com o
veículo, em 24 horas (*). O grupo não tratado (meio) e o veículo apresentaram diminuição da
taxa de infecção com comparação com o tempo de 24 horas (#). É um possível observar um
aumento no número de parasitas por células, nos grupos tratados, em comparação com o
tempo de 24 horas (#) e com o veículo (*), que por sua vez apresentou diminuição em
comparação com o tempo de 24 horas (#). Os dados representam a média e oDP de três
experimento independentes, em triplicata (* P≤ 0,02; *** P≤ 0,0002; **** P≤ <0,0001; One-way
ANOVA. # P≤ 0,01; ## P≤ 0,001; Teste t Student). (C) A taxa de replicação do parasita foi
mensurada pelo número de parasitas por vacúolo parasitóforo (PV). Os dados apresentam
média e DP de 100 vacúolos parasitóforos, de três experimento independentes.
62
4.8. Efeitos da suplementação com Ácido Oleico na infecção de células
Dendríticas infectadas pelo Toxoplasma gondii
Uma vez que os parasitas pareceram demonstrar uma dependência do aporte
lipídico da célula hospedeira para sua replicação, nos perguntamos se a
suplementação da cultura com ácido graxo poderia recuperar os efeitos causados pela
inibição da biogênese de CLs. Para isso, mantivemos o protocolo e as hDCs foram
plaqueadas 16-18 horas antes da infecção em meio contendo 2% de SFB e infectadas
com taquizoítas duplamente marcados com PKH-26 e CTFR na MOI 1. Após 1 hora
de infecção, as células foram tratadas com o inibidor da enzima DGAT 1
(iDGAT[10uM]) e 50uM de Ácido Oleico conjugado a BSA. Para comparação, as
células controle receberam o veículo (DMSO) e BSA nas mesmas concentrações
utilizadas nos tratamentos. As células foram marcadas com FVD 24 horas após a
infecção para avaliação da viabilidade das hDCS. Também foram feitos citoesfregaços
em lâminas de vidro, corados com ORO e Hematoxilina, para análise da biogênese
de CL, infectividade e replicação dos parasitas.
Ao avaliar a viabilidade e infectividade dos parasitas intracelulares por
citometria de fluxo foi possível observar que o percentual de células com parasitas
mortos (PKH-26posCTFaRedneg) se manteve igual entre células tratadas e não tratadas
(figura 22, A e C), enquanto o percentual de células infectadas com parasitas vivos
(PKH-26posCTFarRedpos) foi menor nas células tratadas com iDGAT (10%) em relação
ao veículo (25%) (figura 22, B e C). A suplementação com Ácido Oleico das células
tratadas com iDGAT pareceu recuperar a taxa de infecção, apresentando-se similar
ao controle e maior do que as células tratadas apenas com iDGAT. Não houve
alterações na viabilidade das células hospedeiras perante os tratamentos ou à
infecção (figura 21D).
63
Figura 22. Influência da suplementação com Ácido Oleico na viabilidade de células
dendríticas e do T. gondii (continua).
64
com PKH-26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CT FarRed (1uM)] na MOI 1. Após 1 hora de
infecção, as células foram tratadas com inibidor da diacilglicerol aciltransferase 1 (A922500,
iDGAT [10uM]), e ácido oleico [50uM], ou apenas com o veículo. As células foram avaliadas
por citometria de fluxo, 24h e 48h pós-infecção. (A-C) Avaliação da viabilidade dos parasitas
intracelulares. (A) A frequência de hDC com parasitas mortos (PKH-26posCTFarRedneg) se
manteve semelhante entre os tratamentos em 24 horas. (B) A frequência de hDC com
parasitas vivos (PKH26posCTFarRedpos), em 24 horas, se mostrou reduzida nas células
tratadas com iDGAT, enquanto a suplementação com AO recuperou a infecção de forma
similar ao controle (ns) e foi maior do que as células tratadas apenas com iDGAT (#). Os
resultados representam a média e o DP de três experimentos independentes (* P≤ 0,01; ** P≤
0,006; ns= não significativo One-way ANOVA). (C) Estratégia da análise com a definição da
população de hDC por tamanho e complexidade (gate “DC” em FSC x SSC), das populações
de hDC negativas para PKH26 e CTFarRed ([DC] PKH26 x CTFarRed) em gráficos de pontos.
(D) A viabilidade das hDCs é representada pelo percentual de células Fixable Viability Dye
780 negativas (FVDneg). Não houve diferença de viabilidade entre grupo Toxoplasma e
Controle em 24 horas. Os resultados representam a média e DP dos três experimentos
independentes. (Teste t Student.)
65
Como o esperado, a avaliação da média de CLs por células e da área vermelha
mostrou que o cultivo das hDCs com os parasitas levou ao aumento da biogênese de
CLs, exceto pelas células tratadas com iDGAT onde o tratamento levou à inibição. As
células tratadas com AO mostraram aumento da biogênese tanto nas células
infectadas, quanto nas não cultivadas com parasita, na mesma proporção e o
tratamento com AO levou à geração de CLs com maior área, quando comparado ao
veículo (figura 23 F).
O tratamento dessas células com iDGAT levou a uma redução do número de
CLs no controle, similar às células não tratadas, e causou uma pequena redução entre
as células cultivadas com T. gondii, quando comparado às células apenas
suplementadas com AO, havendo assim uma inibição parcial da biogênese nesse
grupo (figura 23 D e E).
Quanto à infectividade e replicação do parasita, o tratamento com iDGAT levou
à redução do percentual de células infectadas e da média de parasitas por célula. A
suplementação com AO das células tratadas com iDGAT levou ao aumento da média
de parasitas por células, e fez com que o percentual de células infectadas se
assemelhasse ao das células controle (figura 23 A e B). O perfil de parasitas por
vacúolo mostrou que a suplementação da cultura com AO, ajudou na replicação dos
parasitas (maioria de VPs com 8 parasitas) em comparação com as células não
tratadas (maioria de VPs com 4 parasitas). O tratamento com iDGAT levou à redução
do número de parasitas por VP (maioria de VPs com 1-2 parasitas) e a suplementação
desse grupo com ácido oleico ajudou na replicação dos parasitas, que aumentou o
número de VPs com 4 parasitas e apresentou VPs com 8 parasitas (figura 23 C).
Juntos esses dados mostram que a adição de ácido graxos à cultura auxiliou a
replicação do parasita, mesmo diante da inibição farmacológica da biogênese de CLs
lipídicos, embora de forma parcial nesses casos.
66
Figura 23. Efeitos da suplementação com ácido graxo na biogênese de CL e na
replicação e infectividade do T. gondii (continua).
67
com PKH-26 (3uM) e Cell Tracer Far Red [CT FarRed (1uM)] na MOI 1. Após 1 hora de
infecção, as células foram tratadas com inibidor da diacilglicerol aciltransferase 1 (A922500,
iDGAT [10uM]), e ácido oleico [50uM]), ou apenas com o veículo. Após 24 horas de infecção,
as células foram citocentrifugadas, fixadas com formalina 4%, coradas e avaliadas por
microscopia. Os dados correspondem à média da contagem de 50 células de diferentes
campos. (A) O percentual de hDCs infectadas se mostrou menor nas células tratadas com
iDGAT. (B) O número médio de parasitas por células se mostrou reduzido nos tratamentos,
quando comparado ao veículo (*). As células tratadas com ácido oleico juntamente com
iDGAT, mostraram um menor número de parasitas em relação ao veículo (**) e às células
tratadas apenas com ácido oleico (#), porém a média foi maior quando comparada às células
tratadas com iDGAT (&). Os resultados representam a média e o DP de três experimento
independentes. (* P≤ 0,01; ** P≤ 0,002; One-way ANOVA). (C) A taxa de replicação do
parasita foi mensurada pelo número de parasitas por vacúolo parasitóforo (PV). Os dados
representam a média e o DP de 100 vacúolos parasitóforos, de três experimento
independentes. (D) A média de CL por células, (E) e a área vermelha por células
apresentaram aumento nas células cultivadas com o parasita, em relação ao grupo não
infectado (*), em todas as condições experimentais, exceto nas células tratadas apenas com
iDGAT. Todos os tratamentos levaram a uma redução nas células infectadas, em comparação
com o veículo (#). As células tratadas com ácido oleico e iDGAT mostraram inibição parcial
da biogênese de corpúsculo, em comparação com o grupo iDGAT (&). As análises da média
da área vermelha por células e tamanho médio dos CL foram realizadas em 50 células, pelo
software Image J. Os dados representam a média e DP em número de pixels de três
experimentos independentes. (** P≤ 0,002; *** P≤ 0,0005; **** P≤ 0,0001 teste t Student. ##
P≤ 0,001; ### P≤ 0,0003; #### P≤ 0,0001 One-way ANOVA). (F) O tamanho médio dos CLs
não se altera pela infecção ou entre os tratamentos, exceto pelas células tratadas com ácido
oleico, que apresentaram um aumento em relação ao veículo. Resultados apesentam média
e DP de três experimento independentes. (One-way ANOVA). (G) Imagens representativas.
As células foram coradas com Hematoxilina de Mayer e Oil Red–O (ORO) e analisadas em
microscópio de luz convencional, em aumento de 100x, barra de 20µm. Setas indicando
taquizoítas intracelulares.
68
4.9. Expressão de moléculas de superfície induzida pela infecção com T.
gondii
Para investigar a modulação do fenótipo das hDCs sem CLs e infectadas,
avaliamos por citometria de fluxo a expressão de moléculas relacionadas com a
apresentação de antígenos (MHC de classe I [MHC I] e de classe II [MHC II]),
moléculas coestimuladoras CD86 e CD273, de ativação CD83 e de migração CCR7
(CD197). As células foram infectadas com taquizoítas na MOI 1 e avaliadas após 24
horas de infecção.
A infecção induziu uma tendência de aumento de células positivas para MHC II
e aumentou as células positivas para CD83 (figura 24A). A análise da média da
intensidade de fluorescência (MIF), apresentou tendência de aumento de MHC II, em
células infectadas. O tratamento com o inibidor da DGAT 1 reduziu a intensidade de
fluorescência do MHC I em células infectadas (figura 24B).
69
Figura 24. Expressão de moléculas de superfície de hDC infectadas com taquizoítas de
T. gondii por 24 horas. Cultura de células dendríticas humanas foram infectadas com
taquizoítas na MOI 1, por 24 horas. As DCs foram recolhidas, bloqueadas, fixadas e incubadas
com os anticorpos anti MHC I, MHC II-APC, CD83-FITC, CD86-PE, CD273-PerCP-Cy5.5 e
CCR7-PerCP-Cy5.5. A figura A mostra a expressão das moléculas de superfície em % de DC
positivas para cada molécula. Em B temos os dados de média intensidade de fluorescência
(MIF). Nos gráficos são apresentados dados de 1 experimento (n=1) com MHC II e média das
de três experimentos independentes (n=3) com os demais marcadores. Os dados
representam a média e DP (* P≤ 0,02 teste t Student).
70
5. DISCUSSÃO
O Toxoplasma gondii é um parasita altamente adaptado, capaz de infectar e

persistir, virtualmente, em todos os tipos de células nucleadas de animais de sangue
quente (revisto em Sanecka e Frickel, 2012). Dentre as células sanguíneas,
observa-se uma predileção do T. gondii à infecção de macrófagos e células
dendríticas (DC), células permissivas à divisão por endodiogenia dos parasitas
(Delgado Betancourt et al., 2019). O sucesso da infecção irá depender da capacidade
do parasita de se estabelecer na célula hospedeira, conseguindo o aporte necessário
para sua sobrevivência e replicação. Essa replicação requer um aumento substancial
na quantidade de lipídios para formação de estruturas do novo parasita. Desta forma,
o T. gondii precisa ser capaz de modular o metabolismo do hospedeiro, desviando
para o vacúolo parasitóforo os nutrientes e componentes necessários para sua
manutenção, principalmente aqueles que não é capaz de produzir, como o colesterol
(Nishikawa et al., 2005).
Os corpúsculos lipídicos (CLs) são tidos como a principal fonte lipídica para
diferentes patógenos, como Mycobacterium bovis BCG, M. tuberculosis, M. lepare, C.
pneumonia, Plasmodium berguei, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma
gondii e Leishmania sp (revisto em Pereira‐Dutra et al., 2019). Já foi demostrado que
o T. gondii é capaz não só de induzir a produção dos CLs em diferentes modelos
(macrófagos murinos, fibroblastos humanos, células de músculos esquelético), mas
também de trazê-los para próximo do PV e internalizar seus lipídios (Gomes et al.,
2014; Mota et al., 2014; Hu et al., 2017, Nolan et al., 2017, 2018). Qual seria o papel
de fato dos CLs, principalmente durante a infecção de células do sistema imune é faz
uma pergunta atual e relevante. Enquanto alguns autores vem demostrando papeis
dessa organela na sobrevivência do parasita intracelular (Nolan et al., 2017, 2018),
outros demonstraram que os CLs têm participação importante na resposta
imunológica contra o parasita (Haldar et al., 2013; Mota et al., 2014). A maioria destes
trabalhos foram realizados utilizando modelos de células murinas, ou células não
imunes, e pouco se sabe sobre os eventos que ocorrem durante o desenrolar da
infecção em células humanas.
Diante disso, o objetivo inicial deste trabalho foi identificar, em modelo de
células dendríticas humanas, qual seria a função dos CLs na sobrevida do parasita
intracelular e na resposta imune contra ele. Para isso, células dendríticas humanas
71
(hDCs) foram infectadas com taquizoítas da cepa RH, duplamente marcados com
PKH-26 e Cell Tracer Far Red (CTFarRed), e avaliados posteriormente por citometria
de fluxo e microscopia de luz, em diferentes tempos. Dupont e col. (2014)
demostraram que a infecção ativa de DCs murinas pelo T. gondii é de suma
importância para que ocorra a maturação dessas células, tornando-as capazes de
efetuar sua principal função durante a infecção: ativar células T naiive. Neste trabalho
foram utilizados taquizoítas da cepa RH de T. gondii, a mais virulenta dentre as
classicamente descritas, na tentativa de termos o maior número possível de células
ativamente infectadas e os efeitos desse processo.
Nossos achados mostraram que células dendríticas humanas são permissivas
ao T. gondii. O parasita foi capaz de estabelecer a infecção e replicar nesse tipo
celular. hDCs infectadas com taquizoitas da cepa RH, MOI 1, apresentaram pico de
infecção após 24 horas de infecção, apresentando em torno de 30% de células
infectadas com parasitas viáveis, seguido de redução no número de células infectadas
e de parasitas por células após 48 horas de infecção. De forma interessante, a
redução do número de parasitas por células culminou com a perda da viabilidade das
DCs. Foi possível observar que, quanto maior a MOI utilizada, maior é o percentual
de DCs infectadas e maior é a taxa de morte das hDCs. Além disso, a análise da
população FVDpos (morta), mostrou que sua formação é em suma de células
dendríticas infectadas com parasitas mortos (PKH-26posCTFarRedneg).
Podemos inferir que a infecção pelo T. gondii acabou levando à morte da célula
hospedeira que, consequentemente, acarretou a morte do parasita intracelular. Juntos
esses dados poderiam indicar que, dentro do prazo de 48 horas de infecção, os
parasitas foram capazes de completar seu ciclo de replicação. Ao alcançar o limite de
replicação dentro da células hospedeira, o parasita causa lise destas células a fim de
infectar as células vizinhas (Black; Boothroyd, 2000). A perda da viabilidade apenas
após 48 horas de infecção pode ser justificado, uma vez que, de acordo com Radke e
White (1998), a divisão do parasita ocorre entre 6-8 horas, sendo encontrado vacúolos
com até 32 parasitas em fibroblastos humanos infectados, até que a célula seja
rompida e o parasita infecte às células vizinhas. O aumento da MOI, aumentou
também o número de parasitas por células, o que resultou da perda precoce da
viabilidade em células infectadas com MOI 2. Além disso, algumas células infectadas
podem ter identificado a presença do parasita em seu citoplasma e terem
desencadeado a maquinaria de apoptose celular, o que justificaria a menor viabilidade
72
entre as células que apresentavam marcação para PKH-26 (foram infectadas)(Lima &
Lodoen, 2019).
Credita-se à IL-12 o papel chave para a imunidade contra o Toxoplasma gondii,
por promover a produção de interferon gama (IFNy) e o fator de necrose tumoral alfa
(TNFa), por células NK e linfócitos que participam da resposta efetora do hospedeiro
contra a infecção (Tosh et al., 2016). A infecção experimental por T. gondii revelou
que DC esplênicas são a células iniciais que produzem IL-12, independente de IFNy
ou de sinais de linfócitos T (Reis e Sousa et al., 1997). Entretanto, estes estudos
utilizaram a injeção de antígenos de T. gondii, não definindo a função dos taquizoítas
vivos na indução da imunidade específica, além de terem sido realizadas em modelos
murinos. Diferentemente dos estudos em camundongos, investigações com células
dendríticas humanas, derivadas de monócitos, revelaram que DC secretam IL-12 em
resposta a taquizoítas vivos, não a taquizoítas mortos e apenas da presença de
linfócitos (Leiva Carlos S Subauste & Wessendarp, 2017).
Neste estudo, decidimos traçar o perfil de citócínas produzidas pelas DCs
humanas, durante a infecção pelo T. gondii. Observamos que a infecção induziu a
produção de interleucina (IL) 6, IL-8, TNFa, Fator Inibidor de macrófagos (MIF) e
proteína induzida por IFN-y (IP10/CXCL10). Ibrahim e col. (2012) identificaram duas
populações distintas de células dendríticas no fígado de camundongos e humanos,
que podem ser distinguidas pelo conteúdo lipídico: uma com alto e outra com baixo
teor lipídico. As DCs com maior conteúdo lipídico produziram níveis mais altos de
citocinas inflamatórias e quimiocinas, dentre elas IL‐6, IL‐8 e IP‐10, quando
comparadas a células dendríticas de baixo conteúdo lipídico.
TNFα é uma citocina pró-inflamatória produzida na fase aguda, de importância
na infecção pelo T. gondii por atuar de forma sinérgica com o IFNγ para o controle da
infecção pelo parasita (Tosh et al., 2016). Em modelos murinos de toxoplasmose
ocular, o tratamento com anticorpos monoclonais anti-IFN-γ ou anti-TNF-α resultou
em um aumento dramático no processo inflamatório, patologia no epitélio pigmentar
da retina e cicatrizes retinocoroidianas (Iqbal, 2016).
Durante seus estudos, Jebbari e col.(1998) demostraram que, na ausência de
IL-6, camundongos são incapazes de iniciar uma rápida resposta pró-inflamatória
contra o T. gondii, permitindo o aumento da proliferação do parasita. O aumento da
mortalidade de camundongos knockout para IL-6 pode ser diretamente devido a esse
73
aumento da carga parasitária. Esses achados sustentam a importância da IL-6 na
responda imune contra o parasita.
Nós também detectamos um aumento de IL-8, uma citocina com capacidade
quimioatraente e pró-inflamatória. As DCs derivadas de monócitos produzem IL-8 e
expressam os receptores funcionais de IL-8, CXCR1 e CXCR2 (Alfaro et al., 2011).
Durante a fase aguda da infecção pelo T. gondii é relatado o aumento da concentração
sérica de IL-8 no sangue de pacientes (Rostami Nejad et al., 2011).
A IP-10, ou CXCL10, é uma quimiocina secretada por vários tipos celulares em
resposta aos estímulos por IFN-γ. Essa quimiocina se liga ao receptor CXC3 (CXCR3)
e a ela se atribui vários papéis, tais como quimiotaxia de monócitos,
macrófagos, células T, células NK e células dendríticas (Yoneyama et al., 2002).
Tanto IP-10 quanto seu receptor foram descritos como importantes para a proteção
do hospedeiro durante a infecção pelo T. gondii. Durante a infecção, IP10 tem como
principal papel promover o recrutamento de linfócitos para tecidos em que o parasita
se encontra. Nossos dados mostraram um aumento significativo nos níveis de IP-10
a partir de 12 horas de infecção, mantendo-se elevado até 48 horas. Na literatura, os
níveis de IP-10 se mostraram aumentados no cérebro e retina de camundongos com
toxoplasmose cerebral ou ocular, respectivamente (Norose et al., 2011; Wen et al.,
2010). Além disso, camundongos knockouts para o receptor CXCR3 tiveram maior
susceptibilidade à toxoplasmose ocular, provavelmente devido à diminuição do
número de células T CD4+ e CD8+ e da produção de IFNγ na retina e ao aumento da
replicação dos parasitas (Snider et al., 2009).
O fator inibitório da migração de macrófagos (MIF) também tem sido implicado
como crítico para a resistência do hospedeiro contra o T. gondii. MIF é uma citocina
pró-inflamatória com atividade enzimática. Nós detectamos aumento da produção de
MIF após 24 horas de infecção. Demonstrou-se que o MIF está envolvido em
respostas imunes inatas e adaptativas, estimulando a produção de mediadores
pró-inflamatórios, como TNF-α e IL-8. DCs maturas estimuladas por TNFα tem seus
níveis de produção de MIF aumentado (Popa et al., 2006). Descobriu-se que a MIF
sustenta a sobrevivência de macrófagos e a função pró-inflamatória, suprimindo a
apoptose dependente de ativação e de p53 (Liu et al., 2019). Flores e col. (2008)
demonstraram o papel essencial de MIF para controlar a carga parasitária e a
sobrevivência em um modelo de infecção sistêmica por T. gondii.
74
Em acordo com a literatura, os parasitas foram capazes de induzir a biogênese
de corpúsculo lipídicos 24 horas pós-infecção, aumentando consideravelmente após
48 horas. Nossos achados não seguem o padrão de biogênese mostrado em
fibroblastos humanos infectados, onde o número de CLs na célula hospedeira flutua,
aumentando progressivamente, com um pico coincidente com o primeiro ciclo de
replicação do parasita (~ 8 h pós-invasão), declinando após esse período de tempo
(Nolan et al., 2017). Porém, corrobora com os dados de estudo realizados em
macrófagos murinos e células musculares esqueléticas, que apresentaram aumento
da biogênese após 24 h e 48h de infecção (Gomes et al., 2014; Mota et al., 2014).
Após 24 horas de infecção, observamos que havia muitas células infectadas,
porém sem CLs presente. A análise de parasitas por PV nessas células, mostrou que
células com CLs presentes apresentavam um menor números de parasitas por PV,
enquanto as células sem CLs mostravam PV com mais de 8 parasitas em sua maioria.
Nolan e col. (2017) demonstraram dados similares em seus experimentos de infecção
de fibroblastos humanos pelo T. gondii, onde as células contendo vacúolos com 1 a 4
parasitas apresentam um número maior de CLs em comparação ao controle não
infectado, o que não foi visto em células com 6 ou 16 parasitas por VP. No mesmo
artigo, foi visto que o T. gondii era capaz de retirar lipídios diretamente dos CLs,
internalizá-los e armazená-los nos seus próprios CLs (TgCLs). Pernas e col. (2018)
demostraram em fibroblastos humanos que a infecção pelo T. gondii induz lipofagia
nas primeiras 12 horas de infecção, onde temos aumento do número de CLs
colocalizados com moléculas de LC3 e da presença de ácidos graxos livres. Após 24
horas de infecção esse número decai significativamente, sendo um indicativo de
modulação do metabolismo lipídico do indivíduo para armazenamento. Somado a
isso, Hu e col., demonstraram recentemente, no mesmo modelo, que o T. gondii é
capaz de reduzir a expressão da enzima ATGL, envolvida na lipólise de TAGs, após
24 horas de infecção. Em acordo com esses achados, Nolan e col. (2017) mostraram
que após 9 horas de infecção ocorre o aumento da expressão do gene da enzima
DGAT2, responsável pela conversão de diacilgicerol em triacilglicerol, que irá ser
armazenado na forma de CLs, e da ADRP, proteína estrutural dos CLs. Esses dados
apoiam nossos achados de que o tamanho dos CLs aumenta após 48 horas de
infecção. Dessa forma, nossos resultados indicariam um possível consumo dos CLs
das células hospedeiras pelo parasita, principalmente nos tempos iniciais, visando sua
75
replicação. Em tempos mais tardios, ocorreria a indução do armazenamento de
lipídios nos CLs.
A nossa avaliação do perfil de biogênese de CLs mostrou que hDCs infectadas
com parasita na MOI 1 possuem pico de produção de CLs mais tardio, em 48 horas,
enquanto células infectadas com parasita na MOI 2 apresentam pico de produção já
em 24 horas. Além disso, a maior biogênese de CLs se correlacionou com o início da
perda da viabilidade que, de acordo com os nossos dados, seria o momento em que
o parasita sairia da célula hospedeira para infectar as células vizinhas. Deste modo,
poderíamos inferir que essa correlação entre perda da viabilidade e biogênese de CLs
poderia ser um mecanismo de sobrevivência do parasita, a fim de induzir os CLs nas
células vizinhas, preparando-as para sua infecção. De todo modo, a observação de
CLs em praticamente 100% das células após 48 horas de infecção sugere um
mecanismo parácrino de indução da biogênese, uma vez que células sem parasitas
apresentam CLs em 48 horas. Experimentos utilizando o sobrenadante de culturas de
DCs infectadas, avaliando se ocorrerá a biogênese dos CLs nessa condição, poderia
responder a essa pergunta e indicar possíveis fatores solúveis no meio que
desencadeie esse fenômeno em células vizinhas.
As vias pelas quais a biogênese de CLs é induzida, ainda é pouco conhecida.
Na infecção de DCs pelo T. gondii, essa lacuna é ainda maior. Mecanismos
dependentes de TLR2 têm sido implicados na formação de CLs desencadeada
por Mycobacterium bovis (BCG), Mycobacterium leprae, T. cruzi, Chlamydia
pneumonia, Histoplasma capsulatum e lipossomas esquistossomóticos (revisto em
Vallochi et al., 2018). Almeida e col. (2009) demonstraram, durante a infecção por M.
bovis BCG, que o reconhecimento por TLR2 regula a expressão e ativação do
receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama (PPARγ) e induz a formação
de CLs. A inibição do PPARγ pelo seu antagonista reduziu significativamente o
número de CLs nos macrófagos infectados pelo BCG, indicando seu envolvimento na
biogênese das CLs durante a infecção. Em macrófagos e células dendríticas, o PPARγ
provou ser um regulador chave do metabolismo lipídico e dos genes inflamatórios
(Szeles et al., 2007). O PPARγ é um membro da família de receptores nucleares
ativados por lipídios que regula diretamente vários genes que participam da captação
de ácidos graxos, armazenamento de lipídios e resposta inflamatória. O envolvimento
do PPARγ na biogênese dos CLs pode ocorrer de diferentes formas: PPARγ regula a
expressão de genes relacionados à síntese lipídica e formação dos CLs , como a
76
enzima ácido graxo sintase e ADRP (Gao e Serrero, 1999; Larigauderie et al., 2004);
aumenta o armazenamento de TAG e colesterol (Gao e Serrero, 1999; Larigauderie
et al., 2004) e pode aumentar o influxo de lipídios exógenos devido ao aumento da
expressão do receptor de eliminação (Almeida et al., 2014). Dados do grupo não
pulicados indicam o aumento de PPARγ durante a infecção de DCs humanas pelo T.
gondii (figura 25).
Embora não tenha sido demonstrado especificamente em DCs, o TLR2 pode
ser ativado em resposta ao T. gondii. TLR2 e TLR4 sinalizam após a ligação de
âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI), no entanto, a ausência única de TLR2 ou
TLR4 em DCs não reduzir a produção de IL-12 em resposta a antígeno solúvel do T.
gondii (STAg) (Sanecka and Frickel, 2012). Em camundongo, a imunidade inata é
mediada pelo reconhecimento da profilina do T. gondii pelo TLR11 e TLR12, que é o
mecanismo dominante que impulsiona a produção de IL-12. Notavelmente, o TLR11
não é funcional em humanos e o TLR12 não existe no genoma humano, indicando
mecanismos alternativos de detecção de parasitas em células humanas (Sasai et al.,
2018). Dupont & Hunter (2014) demonstraram que a infecção ativa do parasita em
DCs é necessária para que se gere uma resposta imune competente, com geração
de linfócitos T CD8+ específicos. A partir da literatura e dos nossos dados, podemos
hipotetizar que a ativação e indução de CLs pelo T. gondii em DCs possa ocorrer
durante o processo de infecção ativa, pelo reconhecimento através de um receptor de
reconhecimento de padrão, ou ainda pelo processo de replicação (figura 25).
Um dos papeis atribuídos aos CLs durante a infecção por parasitas, é seu uso
como fonte lipídica. Não se sabe se isso se aplica ao modelo de DCs humanas.
Experimentos de inibição da biogênese de CLs e posterior análise da viabilidade do
parasita e taxa de infecção das células, poderiam indicar a veracidade dessa hipótese.
Com esse objetivo, as hDCs foram tratadas com o C75, um inibidor da enzima ácido
graxo sintase (FAS), responsável pela síntese de ácidos graxos, e com o inibidor
A92500 da diacilglicerol Acil-CoA transferase 1 (DGAT-1), enzima responsável pela
conversão de diacilglicerol em triacilglicerol. Os tratamentos resultaram na diminuição
tanto da biogênese de CLs, quanto no número de células infectadas. Os dados da
média de parasitas por célula também apresentaram redução após 24 horas de
infecção em comparação com o controle, inferindo assim que a redução do número
de CLs produzidos na célula hospedeira afeta diretamente a replicação do parasita e,
consequentemente, o seu ciclo lítico e infecção das células vizinhas. Desta forma,
77
podemos inferir que a inibição dos CLs acabou dificultado a replicação do parasito,
fazendo com que ocorresse de forma mais lenta. Este mesmo fenômeno foi mostrado
por Nolan e col., (2017, 2018) durante a infecção de fibroblastos humanos, onde a
replicação do T. gondii foi reduzida em células hospedeiras que foram depletadas de
CLs ou prejudicadas na lipólise de TAG ou, ainda, no catabolismo de ácidos graxos.
Nossos dados corroboram com a ideia de que o parasita use os CLs como fonte de
lipídios para sua replicação, uma vez que já foi visto que ele é capaz de acessar
lipídios armazenados no CL do hospedeiro e incorpora esses lipídios em suas próprias
membranas e CLs.
Embora a inibição dos CLs tenha sido bem significativa, o percentual de células
com parasitas viáveis se manteve, mesmo após 48 horas de infecção e, mesmo que
de forma reduzida em comparação ao controle, o parasita ainda foi capaz de replicar.
Como as células foram cultivadas em meio com 2% de soro fetal bovino,
provavelmente o parasita pode obter lipídios suficientes para mantê-lo viável por
algum tempo, uma vez que o número de células infectadas com parasitas mortos
(PKH-26posCTFRneg) não sofreram grandes alterações, e replicam mesmo que de
forma limitada. Pensando nisso, realizamos experimentos utilizando o soro fetal
bovino delipidado na cultura, o que resultou em grande número de PVs com apenas
1 a 2 parasitas cada. Embora os parasitas tenham parecido replicar menos nessa
condição em comparação com os efeitos dos inibidores, ainda sim, em 48 horas pós
infecção, os parasitas foram capazes de se replicar. Dessa forma, a permanência do
parasita vivo pode ter sido possível devido à presença de ácidos graxos produzidos
pelas células hospedeiras antes da inibição, que ainda permaneceriam disponíveis,
sendo que o T. gondii não sintetiza seu próprio lipídio, mas o retira da célula
hospedeira e o modifica através das enzimas que possui (Coppens, 2006; Lige et al.,
2013a; Nolan et al., 2017a; Robibaro et al., 2002).
Com a inibição da DGAT, a produção de triacilglicerol, um dos principais lipídios
que compõe os CLs (Bozza et al., 2009), é diminuída, porém, a síntese de ácidos
graxos e diacilglicerol persiste na célula hospedeira, possibilitando a utilização de
outra fonte de lipídios que não os CLs, como o reticulo endoplasmático (RE), para a
sobrevivência do parasita. Conforme já visto na literatura, o T. gondii constrói uma
rede de túbulos a partir do PV capaz de aproximá-lo de outras organelas como RE e
Complexo de Golgi, servindo como fonte de esterol e esfingolipídios, respectivamente
(Dou et al., 2014). Além disso, o T. gondii explora muitas fontes de ácidos graxos
78
derivados do hospedeiro: ácidos graxos exógenos introduzidos no meio, ácidos
graxos sintetizados pela célula hospedeira, colesterol derivado das lipoproteínas de
baixa densidade e ácidos graxos armazenados no CL do hospedeiro e no PV (figura
25) (Gomes et al., 2014; Hu et al., 2017) ou, ainda, estimulando a lipofagia para liberar
os ácidos graxos do TAG (Pernas et al., 2018). Deste modo, podemos inferir que os
CLs sejam a principal, mas não a única fonte de lipídios para o parasita.
Uma vez que os CLs representam uma fonte oportuna de vários lipídios neutros
para o T. gondii, adicionamos ácido oleico (AO) à cultura de células tratadas com o
inibidor da DGAT 1, a fim de observar se os efeitos da inibição seriam revertidos. A
favor de nossos dados, Pernas et al (2018) demostraram que fibroblastos murinos
knockout para DGAT 1 e 2 infectados pelo T. gondii apresentam diminuição da carga
parasitária e defeitos na replicação, efeitos que foram revertidos pela adição de 30uM
de AO juntamente com colesterol na cultura. Conforme visto, a adição do AO reverteu
de forma parcial os efeitos da inibição da biogênese de CLs. Neste caso, a adição de
AO à cultura foi benéfico para o parasita, porém Nolan e colaboradores (2018)
mostraram o efeito inverso. Em seus experimentos o T. gondii incorporou
continuamente AO, ou lipídios derivados do metabolismo do OA da célula hospedeira,
resultando em uma superacumulação de várias espécies lipídicas neutras em CLs do
parasita e levando a lipotoxicidade. A inibição farmacológica da DGAT-1 com o inibitor
T863 reduziu drasticamente a replicação dos parasitas, levando a um atraso em sua
replicação após 24h de infecção. A combinação do inibidor da DGAT-1 e OA resultou
em PV muito pequenos, com 1 ou, raramente, 2 parasitas. Esses diferentes efeitos
provavelmente se devem às altas doses de AO utilizadas, em comparação com as
que utilizamos, o que poderia justificar os efeitos lipotóxicos que nós não vimos.
A principal característica das DC é a capacidade de ativar linfócitos naïve e
induzir uma resposta imunológica eficiente e duradoura. Para tal, elas dispõem de
uma gama de glicoproteínas que vão atuar na apresentação de antígenos para células
TCD4+ e TCD8+ (Al-Ashmawy, 2018). Analisamos a expressão de membrana de
moléculas relacionadas a apresentação de antígenos (MHC I e II), além de molécula
coestimulatória (CD86), glicoproteína de ativação (CD83) e receptores de quimiocinas
envolvidos em migração (CCR7). Nossos resultados mostraram que a infecção
induziu o aumento de MHCII e CD83 após 24 horas de infecção, assim como
demostrado por Lambert et col. (2006). Esses dados sugerem que a infecção induz a
79
ativação das DCs, que passam pelo processo de maturação e se tornam aptas para
apresentar antígenos.
Noor e col. (2010) demonstraram o aumento de CCR7 em células de fígado e
cérebro de camundongos com toxoplasmose, após 42 dias de infecção. O uso de
camundongos knockout para CCR7, aumentou a mortalidade dos animais pela
doença, por prejudicar a montagem da resposta imune competente. As DCs
infectadas pelo T. gondii apresentam grande motilidade, servindo como transporte do
parasita para linfonodos, baço, ou outros sítios no organismo. Barragan & Sibley
(2003) demonstraram que taquizoítas são capazes de infectar DCs e induzir um
fenótipo de hipermigração. Graças à migração das células infectadas, o T. gondii é
capaz de infectar sítios mais distantes do organismo, podendo atingir recintos
privilegiados como o sistema nervoso central, onde são comumente observados cistos
na infecção crônica (Furtado et al., 2012). Lambert e col. (2006) porém, demostraram
que essa migração de DC murinas ocorre independente de CCR7 ou CCR5, mas
dependente de sinalização via proteína G.
O tratamento com o inibidor da DGAT reduziu a presença da molécula de MHC
I na membrana das DCs. Sendo um parasita intracelular obrigatório, os mecanismos
pelos quais esses antígenos são processados e apresentados via MHC I ainda são
desconhecidos pois, classicamente, antígenos complexos e armazenados em
vesículas ou vacúolos (como o T. gondii), são associados às moléculas de MHC II e
apresentados aos linfócitos TCD4+. A associação inesperada desses antígenos a
moléculas de MHC I é chamada de Apresentação Cruzada e suas vias ainda são
pouco conhecidas. Existem trabalhos que sugerem a via vacuolar, com participação
de lisossomos e fagossomos, enquanto outros sugerem a via citosólica, com
transporte do antígeno para o citoplasma na indução da apresentação de antígenos.
Bougneres e colaboradores (2009) demonstraram a relação entre a apresentação
cruzada em DCs e os CLs, juntamente com a proteína Irmg3, que participa da via de
autofagia e foi detectada na membrana de organelas, inclusive dos CLs. Os autores
demonstraram que camundongos nocautes para ADRP tiveram diminuição no número
e tamanho dos CLs, o que resultou em uma apresentação cruzada tardia quando
comparada com camundongos selvagens. O mesmo fenômeno foi observado em
camundongos nocautes para Irgm3, que consequentemente também acumularam
menos CLs, sugerindo uma associação entre a presença de CLs e a apresentação
cruzada (Bougnérs et al., 2009). Anos depois foi constatado que CLs não decorados
80
com Irgm3 são degradados pela via de autofagia (Haldar et al., 2013). Nossos
achados, juntamente com a literatura, sugerem a participação dos CLs no
processamento de antígenos via MHC I, durante a apresentação cruzada. Mais
experimentos são necessários para confirmar essa hipótese. A análise das moléculas
de MHC I intracelular durante a infecção, em células com biogênese de CLs inibida,
poderiam indicar se existe um papel dos CLs no processo de recirculação das
moléculas de MCH I, por exemplo.
Em resumo, nossos dados mostraram que a infecção de células dendríticas
pelo Toxoplasma gondii induz uma alteração do fenótipo dessas células, para um perfil
de células ativadas, possivelmente aptas para a apresentação de antígeno. A infecção
ainda leva ao aumento da biogênese de CLs, que é alterada conforme se aumenta
taxa de infecção. A inibição dos CLs mostrou que essa organela é importante para a
manutenção e a replicação do parasita como fonte de lipídios para o processo, uma
vez que a adição de ácido graxo exógeno recuperou parcialmente os efeitos da
inibição. Além disso, a ausência de CLs levou a alteração no perfil fenotípico das DCs,
com redução das moléculas MHC I na membrana plasmática. Indicando assim uma
função dos CLs durante a infecção de células dendríticas para sobrevivência do
parasita, mas também na resposta imune do hospedeiro (figura 25).
81
Figura 25 Resumo dos dados encontrados. A infecção pelo T. gondii induz a
biogênese de Corpúsculos Lipídicos (CLs) por uma via ainda desconhecida. Essa
indução poderia ser desencadeada pelo processo ativo de infecção, pelo
reconhecimento por receptor desconhecido, ou de forma dependente de replicação,
resultado no aumento da expressão de PPARy, que promoveria o acúmulo de CLs. O
parasita utiliza de lipídios da célula hospedeira advindo de vesícula do complexo de
golgi, reticulo endoplasmático, lipoproteínas de baixa e alta densidade e,
principalmente, dos Corpúsculo Lipídicos para sua replicação. A infecção induz o
aumento de CD83 e MHC II. Além da produção de IL-6, IL-8, TNFa, IP-10 e MIF. A
inibição das enzimas Ácido Graxo Sintase (FAS) e Diacilglicerol Aciltranferase – 1
(DGAT-1) reduziu a biogênese dos CLs e resultou em um atraso da replicação do
parasita. A inibição ainda levou a uma redução de MHC I na membrana plasmática da
célula hospedeira.
82
6. CONCLUSÃO
O Toxoplasma gondii é capaz de infectar e replicar em células dendríticas

humanas, induzindo a ativação dessas células, a produção de citocinas e a biogênese
de corpúsculos lipídicos, que é modulada pela taxa de infecção. O uso de inibidores
da biogênese de CLs não causa a morte direta do T. gondii, mas a ausência dos CLs
leva ao atraso da replicação do parasita, efeito que foi parcialmente revertido pela
adição de ácido graxo livre na cultura. A redução do número de CLs ainda reduziu a
presença das moléculas MHC I na membrana das células dendríticas. Em conjunto
nossos dados sugerem que os CLs possuem funções tanto como fonte de nutrientes
para o T. gondii, quanto na modulação da resposta imune da hDC.
83
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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93
94
ANEXO I
95
Review
published: 23 May 2018
doi: 10.3389/fimmu.2018.01022
Lipid Droplet, a Key Player in

Host-Parasite interactions
Adriana Lima Vallochi*, Livia Teixeira, Karina da Silva Oliveira,
Clarissa Menezes Maya-Monteiro and Patricia T. Bozza*
Laboratório de Imunofarmacologia, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brazil
Lipid droplets (lipid bodies, LDs) are dynamic organelles that have important roles in
regulating lipid metabolism, energy homeostasis, cell signaling, membrane trafficking,
and inflammation. LD biogenesis, composition, and functions are highly regulated and
may vary according to the stimuli, cell type, activation state, and inflammatory environ-
ment. Increased cytoplasmic LDs are frequently observed in leukocytes and other cells
in a number of infectious diseases. Accumulating evidence reveals LDs participation
in fundamental mechanisms of host-pathogen interactions, including cell signaling and
immunity. LDs are sources of eicosanoid production, and may participate in different
aspects of innate signaling and antigen presentation. In addition, intracellular pathogens
evolved mechanisms to subvert host metabolism and may use host LDs, as ways of
Edited by:
Celio Geraldo Freire-de-Lima, immune evasion and nutrients source. Here, we review mechanisms of LDs biogenesis
Universidade Federal do and their contributions to the infection progress, and discuss the latest discoveries on
Rio de Janeiro, Brazil
mechanisms and pathways involving LDs roles as regulators of the immune response to
Reviewed by:
protozoan infection.
Joshua D. Nosanchuk,
Albert Einstein College of
Keywords: lipid droplets, lipid bodies, parasite, intracellular pathogen, eicosanoids, inflammation, immune
Medicine, United States response
Carlos Arterio Sorgi,
Universidade de São Paulo
Ribeirão Preto, Brazil INTRODUCTION
*Correspondence:
Lipid droplets (LDs) are dynamic and complex organelles, composed of a hydrophobic core enriched
Adriana Lima Vallochi
[email protected]; in neutral lipids such as triglyceride, cholesteryl ester, and retinyl ester, a surrounding monolayer
Patricia T. Bozza of phospholipid, cholesterol, and a varied array of associated proteins with diverse functions in cell
[email protected] homeostasis, metabolism, and signaling (1, 2). The accumulation of lipids within the cytoplasmic
LDs is a highly conserved feature, due to its role in energy homeostasis, membrane synthesis and cell
Specialty section: signaling, conferring an evolutionary advantage to the organism. Indeed, LDs are present in virtually
This article was submitted to all cell types and organisms, including in unicellular protozoan parasites (3, 4), and in leukocytes and
Microbial Immunology, other cells involved in immune response in mammalians (5, 6).
a section of the journal Interest in LDs biogenesis and functions has dramatically increased in recent years due to their
Frontiers in Immunology
association with metabolic and inflammatory diseases, including diabetes (7), atherosclerosis (8, 9),
Received: 31 January 2018 obesity, cancer (10, 11), allergy (12), neurodegenerative diseases (13, 14), and numerous infectious
Accepted: 24 April 2018
diseases [reviewed in Bozza et al. (15), van der Meer-Janssen et al. (16), and Saka and Valdivia (17)].
Published: 23 May 2018
Increased numbers of LDs in leukocytes and other cells are observed in infectious diseases caused by
Citation: bacteria, virus, fungus, and protozoan parasites (17–26). LD accumulation in the cytoplasm of dis-
Vallochi AL, Teixeira L, Oliveira KdS,
tinct host cell types has been reported after infection with Plasmodium berguei (27, 28), Trypanosoma
Maya-Monteiro CM and Bozza PT
(2018) Lipid Droplet, a Key Player in
cruzi (20, 29, 30), Toxoplasma gondii (31–34), and Leishmania sp. (35–37) and their contributions in
Host-Parasite Interactions. disease pathogenesis are starting to be unveilled.
Front. Immunol. 9:1022. Different signaling pathways have been implicated in LD biogenesis in leukocytes and other
doi: 10.3389/fimmu.2018.01022 cells involved in inflammatory and/or infectious reactions. Although molecular mechanisms that
Frontiers in Immunology | www.frontiersin.org 1 May 2018 | Volume 9 | Article 1022

Vallochi et al. LDs in Cell-Parasite Interactions
govern LD biogenesis are not fully characterized, the observa- is the presence of proteins with predicted membrane insertion
tions gathered so far indicate the involvement of both pathogen domains within these organelles (59, 60, 65, 72). Among the
and host factors. Moreover, acumulating evidence indicates proteins associated with LDs are the well-characterized perilipin
that infection-driven LD formation involves specific and well- familys’ proteins that share sequence similarities, previously
regulated mechanisms that involve innate immune receptors, termed as the PAT family, often used as molecular markers of
scavenger receptors, and nuclear receptors dependent pathways LDs. It includes perilipin 1, perilipin 2 [PLIN2/adipose differ-
(18, 21, 26, 30, 38–42). Newly formed host LDs play key roles in entiation-related protein (ADRP)], perilipin 3 [tail-interacting
host-pathogen interactions. Of note host LDs triggered during protein of 47 kDa (TIP-47)], perilipin 4 (S3-12), and perilipin 5
infection are major intracellular domains involved in eicosanoid (LSDA5, LSDP5, MLDP, and OXPAT) (73). Perilipins are major
synthesis with multiple functions in inflammation and immune structural proteins present at the surface of LDs involved in
signaling (18, 20, 21, 26, 30, 43, 44). More recently, parasite LDs regulating LD formation, incorporation, and accumulation of
were also demonstrated to compartmentalize eicosanoid synthe- lipid in different cells types (74–79). The enzymes Acyl-CoA:
sis with roles in parasite physiology and escape mechanisms (45, diacylglycerol acyltransferase 2 (DGAT2) and acyl-CoA: cho-
46). In addition to functioning as signaling platforms, host LDs lesterol acyltransferase (ACAT) are responsible for the synthesis
properties in energy storage and metabolic homeostasia may be of the main LD core lipids (TAGs and CE). DGAT2 is inserted
explored by intracellular pathogens for their survival and growth. exclusively into the external leaflet of the endoplasmic reticulum
Accordingly, different authors showed a close association of LDs (ER) membrane and, therefore, can diffuse onto the LD surface
with parasite vacuoles (PVs) (20, 21, 33, 34, 47–49). This asso- during LD formation, promoting TAGs synthesis and the con-
ciation may enable the nutrients’ flow between the host and the tinuation of LD growth (80). LDs also compartmentalize the
parasites, which is of crucial importance for parasite metabolism lipolysis enzyme, adipose tissue triacylglycerol lipase (ATGL), as
and may contribute to avoid the host response. Besides the acqui- well as perilipins, that modulate both hormone-sensitive lipase
sition of nutrients and imbalance of host metabolic pathways, the and ATGL activities (80–82).
parasites explore many additional biological host responses with Lipid droplets are organelles that are intimately related to the
impacts to disease pathogenesis. ER (1, 83). The first and still accepted model of LDs formation
Here, we will address the mechanisms of formation and suggests that these organelles are derived from the accumula-
functions of LDs in the interactions between protozoan parasites tion of newly synthesized lipids within the double layer of the
and mammalian host. We will highlight the LDs role in host- ER membrane, with subsequent budding off from the ER to
pathogen interactions, discussing the crosstalk between pathogen the cytoplasm after reaching a critical size (50, 83). According
and host cell on the immune response and survival mechanisms to this model, newly formed LDs detaches are surrounded by a
during infection. phospholipid monolayer derived from the cytoplasmic leaflet of
the ER coated with proteins that lack transmembrane spawning
domains (3, 70, 83–85). However, accumulating evidence, based
LD: A DYNAMIC CELL ORGANELLE on imaging and composition of LDs, reported the presence of
membrane-associated and transmembrane spanning proteins, as
The Organelle Complexity well as ribosomal structures and ribosomal associated proteins,
Lipid droplets are roughly spherical structures consisting mostly giving rise to new hypothetical models for LD biogenesis (2, 65,
of triacylglycerols and sterol esters, lacking a delimiting classical 70, 86). These different groups suggested that invaginations of ER
bilayer membrane but surrounding by a monolayer of phos- inside the LDs could be the membranous structure and hydro-
pholipids and cholesterol and a variety of associated proteins philic ambient that allow proteins in the core of LDs (65, 72, 86),
(50, 51). This unique organization defies understanding how and/or that LDs may remain associated to ER through physical
occur transport pathways to receive or deliver protein and lipid, bridges (2, 87). Together, these biogenesis models contemplate
once that arrangement does not fit in classical traffic vesicular the existence of subcompartments inside these organelles made
mechanisms. On the other hand, favors its distinction from other possible through the incorporation of ER-derived membranes
organelles under electron microscope. More than 160 lipid spe- enabling sequential enzymatic reactions to occur within LDs as
cies have been identified in LDs, with important variations in in the case of eicosanoid synthesis (5, 86, 88, 89).
contents according to the cell type. For instance, triglycerides Lipid droplets have gained importance as specialized and
are largely dominant in white adipocytes, whereas sterol esters inducible cytoplasmic organelle due to their various proteic
are more abundant in macrophages and retinyl esters in stellate and lipidic components, and their participation in fundamental
cells (52–56). LDs associated proteins vary according to the cellular processes. LD functions extend beyond the regulation
cell and stimulatory condition and contains perilipin family of lipid metabolism in cell signaling, immunological activation,
proteins, lipid biosynthetic enzymes, lipolytic enzymes; enzymes membrane trafficking participation, and control of the synthesis
involved in signaling and inflammatory mediator synthesis, and and secretion of inflammatory mediators. The LD in infectious
membrane-trafficking proteins (55, 57–65). Proteins associate diseases also suggests functions beyond the mere interaction
with LDs surface through amphipathic and/or hydrophobic with different viral proteins or bacteria; they can participate in
molecular moieties (66–69). Also, some proteins were detected important celular pathways of immune system.
within the hydrophobic core of the LD (59, 60, 70, 71). However, One of the best characterized functions of LDs in leukocytes
the most intriguing fact about protein content of LDs certainly and other cells of the immune response are their capacity to

act as platforms for heithened eicosanoid synthesis (90, 91). of LDs in their cytoplasm, but also non-infected neighboring
Eicosanoids—including prostaglandins, leukotrienes, and lipox- cells at the inflammatory microenvironment may also present
ins—are non-storable but promptly newly synthesized signaling increased numbers of LDs indicating that paracrine mechanisms
molecules, derived from the enzymatic oxygenation of arachi- of bystander amplification through host and pathogen-derived
donic acid (AA), that control key cellular processes, including signals also take place.
cell activation, metabolism, migration, proliferation, and death Pattern recognition receptors have been found to be involved
(92). Intracellular compartmentalization of eicosanoid synthesis in the generation of signals that induce LD formation. The main
within leukocytes and other cells has emerged as a key feature family of pattern recognition receptors with large range capacity
that regulates the amount and may also regulate the eicosanoid of sensing diverse pathogens is the toll-like receptors (TLR). Cells
produced, and LDs has been established as main locales involved from TLR4-null mutant mice and cells from signaling inactive
in the increased eicosanoid synthesis in inflammatory conditions mice fail to form LD after stimulation by LPS or during experimen-
(90). The substrate for eicosanoid synthesis— AA—is present in tal sepsis, establishing the dependency of TLR4 for macrophages
LDs, esterified in phospholipids and neutral lipids, where it can be LD formation (18, 43). TLR4 signaling triggers the production of
converted into eicosanoids by specialized enzymes (6, 55, 93–95). inflammatory mediators like platelet activator factor (PAF) and
cPLA2 and ATGL were shown to co-localize with LDs in different MCP-1/CCL2 that amplify the LD-induced response (18, 21, 43).
cells where it participates in the release of AA-associated LD from Other proteins found to be required for productive signaling in
phospholipids and triglyceride pool, respectively (55, 96–98). response to LPS, include LPS-binding protein, CD14, CD11b/
Notably, P. aeruginosa toxin ExoU also mobilizes AA from host CD18, and myeloid differentiation factor-2 because their neu-
LDs due to their phospholipase activity as part of their pathogenic tralization inhibits LPS-induced LD formation (18, 43). Indeed,
activity (94). The major eicosanoid-forming enzymes—cyclooxy- different pathogens may be specifically recognized through
genase, 5-lipoxygenase (5-LO), 15-LO, 5-LO-activating protein, innate receptors to trigger LDs in host cells. TLR2-dependent
and the terminal enzymes including PGE2 synthase and LTC4 mechanisms have been implicated in LD formation triggered
synthase—were described within LDs of stimulated cells obtained by Mycobacterium bovis (BCG), Mycobacterium leprae, T. cruzi,
under inflammatory and infectious conditions (18, 21, 26, 30, Chlamydia pneumonia, Histoplasma capsulatum, and schistoso-
43, 44, 59, 60, 99). Increased LD biogenesis correlates with an mal-lipids (21, 26, 38, 44, 102, 103). The studies of M. bovis (BCG)
enhanced capacity of the cells to produce eicosanoids and sug- infection and stimulation by the purified cell wall component
gests that the compartmentalization of the eicosanoid-synthetic lipoarabinomannan highlighted the importance of TLR2 in LD
machinery within LD have roles in the cellular ability to generate formation, but not essential roles of TLR4 or TLR6 (21, 38, 104).
eicosanoids (18, 21, 59, 100). Direct proof of eicosanoid synthesis However, classic TLR2 ligands as Pam3Cys and Zymozan and
at LDs came only after the development of a lipid immunolabe- non-pathogenic mycobacteria Mycobacterium smegmatis failed
ling technique termed EicosaCell (88, 101). Since eicosanoids to induce LDs formation or PGE2 production, while still inducing
are not stored but are synthesized and released immediately, the TLR2-dependent TNF-α production (38). This finding suggests
EicosaCell method enables to immobilize and label eicosanoids at that TLR2 activation, although essential is not sufficient to
the exact locale of their synthesis, and by the use of this method trigger pathways of LDs formation and other cofactors may be
the synthesis of leukotrienes and prostaglandins occuring at involved. Indeed, CD36, a multi-ligand scavenger receptor, has
LDs have been confirmed (21, 30, 43, 101). Accordingly, it has been demonstrated to cooperate with TLR2 in BCG signaling
been established that LDs are specialized, inducible cytoplasmic and LDs biogenesis in a mechanism dependent of compartmen-
domains that have central roles in the control of synthesis and talization within lipid rafts (39). Similarly, in M. leprae infection,
secretion of inflammatory mediators under different pathophysi- TLR2 and TLR6 were implicated in LD formation and bystander
ological conditions, including in infections [reviewed in Bozza amplification in macrophages with no internalized bacteria. This
et al. (90)]. suggests an important role for these receptors in LD biogenesis,
not only by direct recognition of microbial components, but also
by leading to secondary autocrine/paracrine signaling (21, 44).
Mechanisms of LD Formation in Infectious Accordingly, conditioned medium from M. leprae-infected wild-
Diseases Involves Specific and Regulated type cells induced LD in wild-type and TLR2-deficient cells (40).
Mechanisms Notably, many cytokines and chemokines have been described
Lipid droplet biogenesis in host cells during infections is a as being able to lead LDs formation (12, 18, 43, 99, 105–107).
highly regulated cellular event. Although still incomplete, great Indeed, MCP-1/CCL2 has been implicated in sepsis triggered LD
advances on the understanding of the molecular events that gov- formation, whereas IL-10 and CCL3 were shown to participate
ern LD formation in cells during host-pathogen interactions have in mechanisms of mycobacterial LD formation (41, 43). Lipid
been achieved in recent years. As detailed below, accumulation signaling is also involved in LD formation and may participate in
of LDs can be observed rapidly after infection with a variety of mechanisms of bystandar LD formation. PAF and PAF-like lipids
pathogens, and results from a balance between new lipid syn- are involved in LPS and oxidized low-density lipoprotein (LDL)-
thesis, increased lipid uptake, and regulated lypolisis involving induced LDs formation, since pretreatment with PAF receptor
both transcriptional dependent and independent mechanisms. antagonist significantly inhibits the number of these organelles
Of note, during infection, not only infected cells and/or cells in during experimental sepsis (18, 43, 107). In addition, cis-unsatu-
direct contact with pathogens exhibit increased accumulation rated fatty acids including AA and oleic acid are potent inducers

of LD formation in leukocytes and other cells (106, 108). TLR2 and PPARγ antagonist enhanced these phosphorylations. The
also mediates LD formation during protozoan parasite infection. increased C. pneumoniae-induced LD formation in LDL-treated
T. cruzi infections induced LD formation in macrophages in a THP-1 macrophages was interpreted to be the result of crosstalk
TLR2-dependent manner. Apoptotic cell uptake by these mac- between MAPK and PPARα/γ signaling pathways (118). Changes
rophages potentiated the LD formation and PGE2 production in the intracellular concentration of PPAR ligands can influence
via TGF-β signaling. The inhibition of LD formation by the fatty PPAR-dependent gene regulation (119).
acid synthase inhibitor C75 reverted the potentiating effects of Increasing amounts of data regarding the molecular mecha-
the apoptotic cells on LD biogenesis, eicosanoid synthesis, and nisms that govern lipogenesis, as well as regulation of the influx
parasite replication, suggesting a role for LD in lipid mediator and efflux of lipids, suggest that these mechanisms operate syner-
production and parasite escape mechanisms. Curiously, the effect gistically for LD formation during infection (34, 39, 40).
was not restricted to parasitized cells, suggesting the involvement
of paracrine mediators in LD biogenesis (30). Other classes of LDs IN PARASITE INFECTIONS
pattern recognition receptors have also been implicated in LD
biogenesis, including dectin-1 (26). Parasite Lipid Homeostasis and Their
Downstream mechanisms involved in infectious triggered LD Own LDs
formation are starting to be described. In this sense, signaling Throughout the entire infection process beginning with the host
pathways involved in expression of genes related to influx/efflux cell invasion, there is a huge involvement of lipids from both mem-
of lipids and de novo synthesis of lipids during infectious process bers’ interactions (120–122). Some parasites build and survive
have been evaluated. Recently, it was reported that bacterial inside their PV; others leave them to live in host cytoplasm. The
components may modulate expression and function of PPARγ. vacuole protects parasites but complicates access to some essen-
PPARγ is a member of lipid-activated nuclear receptor family that tial factors for parasite proliferation as, e.g., lipids. Intracellular
directly regulates several genes participating in fatty acids uptake, parasites scavenge cholesterol from LDL or host LDs. LDs are a
lipids storage, and inflammatory response. PPARγ heterodimer- vital source of energy, and an essential element for the homeostasis
ize with retinoid X receptor that binds directly to DNA response (detoxification) of blood-stage parasites, as Plasmodium spp. and
elements present in target gene. In macrophages and dendritic Schistosoma spp. Intracellular parasites have their own LDs—as an
cells, PPARγ have proven to be a key regulator of lipid metabolism energy storage source, for metabolic homeostasis, and to modulate
and inflammatory genes (109). In addition, PPARγ signaling and escape the host response. The roles of parasites’ LDs and their
pathway has been identified as central to foam cells formation in interplay with host cells will be discussed in the following section.
atherosclerotic lesions (110–113). During M. bovis BCG infec-
tion, TLR2 regulates the expression and activation of PPARγ Protozoa Are Unable to Synthesize Cholesterol
activation as well as LDs formation. PPARγ inhibition by its De Novo and May Retrieve It From Host LDs
antagonist significantly reduces number of LDs in BCG-infected Despite possessing complex molecular machinery to interact in a
macrophages, indicating its involvement in LDs biogenesis dur- variety of ways with their host cell, protozoa are unable to synthe-
ing mycobacterial infection (38). PPARγ involvement in LDs size cholesterol de novo. T. cruzi recruits host lysosomes for fusion
biogenesis may occur at different levels. PPARγ regulates expres- with the PV to initiate its egress from the PV and enter into the
sion of genes related to de novo lipid synthesis such as fatty acid host cell cytoplasm, where replication begins (123). Parasites of
synthase enzyme and PLIN2/ADRP, increasing TAG and choles- the genus Leishmania evolved mechanisms to survive and multi-
terol storage and reducing cholesterol efflux (114–116). PPARγ ply within acidified vesicles enriched in lysosomal enzymes (124).
can also increase the influx of exogenous lipids due to increased Otherwise, T. gondii and Plasmodium spp. have a so-called “active
expression of scavenger receptor CD36 (39). By contrast, liver invasion,” and both built a nonfusogenic PV. The T. gondii PV
X receptor, whose activation increases cholesterol efflux, has its interacts with many host structures such as LDs, microtubules,
transcriptional activity inhibited when viral and bacterial anti- endosomes, the ER, mitochondria, and Golgi vesicles, which
gens are recognize via TLR3 and TLR4 receptors (117). Together closely associated with the vacuole for nutrient acquisition (34,
these data show that LDs formation depends on specific signaling 125). T. gondii produces a network of tubule-like structures called
pathways activation, which regulate influx and efflux balance of the intravacuolar tubulovesicular network, a membranous inter-
lipids in cells. C. pneumoniae express a variety of potential TLR face derived from multilamellar vesicles secreted by the parasite
ligands and induces foam cell formation, facilitating athero- (126, 127). However, protozoan parasites rely on their ability to
genesis. C. pneumoniae-induced LD formation also involves steal cholesterol from different sources of the host (128–130).
MAPK phosphorylation, including JNK and ERK, participates in As in mammals, T. cruzi captures cholesterol from LDLs via
macrophage LD formation. C. pneumoniae infection induced the LDL receptor (LDLr). Experiments using LDLr knockout cells
down-regulation of PPARα and PPARγ expression (118), in con- showed a 62% decrease in the total parasite burden compared
trary to the upregulation observed in BCG-infected macrophages with wild-type T. cruzi-infected mice. LDLr signaling is also
where upregulation of PPARγ and PPARγ-dependent LD forma- essential in the invasion and fusion of PV with host lysosomes
tion was described (39). Surprisingly, JNK and ERK inhibitors (129). T. brucei also needs LDL or high-density lipoproteins
blocked LD formation and suppressed the down-regulation (HDL) for its multiplication (131).
of PPARα and PPARγ. PPARα or PPARγ agonists reverted the Leishmania amazonensis has specific binding sites to HDL and
infection-induced JNK and ERK phosphorylation while PPARα LDL in its membranes. The parasite can capture cholesterol from

LDL, and this process involves detergent-resistant membrane (34) and the parasite can modify the host-derived lipids (138),
lipid microdomains. In all L. amazonensis extensions, host largely exploring the host lipidome (34). Conversely, Plasmodium
cholesterol is found; the intracellular compartments engaged in cannot store cholesterol, because they do not express an ACAT
parasite lipid traffic and the presence of the LDLr remain to be enzyme, indicating that the parasite needs to scavenge lipids from
discovered (130). Recently, Carvalho and colleagues found that the host constantly (139). The blood-stage form of Plasmodium
some components of lipid metabolism had an association with scavenges cholesterol from HDL particles or directly from the
lipoprotein lipase (LPL), apolipoprotein E (ApoE), and PPARα erythrocyte membrane; how cholesterol is then transported to the
gene polymorphisms and presented the risk markers of visceral parasite is still unknown. It is important to note that Plasmodium
leishmaniasis (VL). Individuals with clinical manifestation of expresses sterol translocators and transporter genes and they can
VL filed high TAG and very-low-density lipoprotein cholesterol collect membrane components in their plasma membrane (140,
(VLDL-C) levels, and low high-density lipoprotein cholesterol 141). Furthermore, the Plasmodium PV has physical contact with
(HDL-C) levels. Furthermore, the LPL mutation (H+/H+ geno- the host plasma membrane, and the intracellular parasites can
type and the H+ allele) was associated with elevated VLDL-C access cholesterol (142). Plasmodium scavenges cholesterol from
and TAG levels, reduced HDL-C levels and revealed an odds ratio LDL and HDL particles and LDs from hepatocytes. Plasmodium-
of 21.3. The L162V polymorphism in the PPARα gene showed infected hepatocytes have genes encoding sterol biosynthesis and
an odds ratio of 8.77 for Leu/Val when compared with Leu/Leu metabolism components upregulated (143). Both LDL-derived
genotype. Thus, high TAG and VLDL-C levels were associated and host synthesized cholesterol are co-transported to the parasite’
with susceptibility to VL, whereas low HDL levels with resistance PV, but sterol biosynthetic pathway, or LDL defective cell lines, do
to L. infantum infection. The mutated LPL and the PPARα Leu/ not hamper parasite growth, suggesting compensatory ways to
Val genotypes may be considered risk markers for the develop- provide cholesterol to the parasite (144). Interestingly, the liver
ment of VL (132). form’s PV is enriched in cholesterol and tightly associated only
Trypanosoma cruzi infection is capable of modulating cho- with the host ER. It is permeable to small solutes through chan-
lesterol metabolism in the host tissue in both acute and chronic nels stably maintained by host-derived cholesterol accumulated
patients (133) as well as L. major in mice macrophages (48). at the PV membrane, suggesting that sterols might contribute
Quantitative PCR analysis shows an 8,000-fold increase of LDLr to parasite nutrient acquisition (144, 145). Then, intracellular
levels in heart tissue of T. cruzi-infected mice compared with the parasites have many strategies to scavenge cholesterol, and host
control. Both, the accumulation of LDL and its receptor were LDs are the essential source (Figure 1).
observed around amastigote nests within infected cardiomyo- The two parasite ACAT enzymes, which esterified cholesterol
cytes (129). Like T. cruzi, T. brucei, and L. amazonensis, T. gondii (146, 147), are known and orchestrate the formation of LDs into
also scavenges cholesterol from plasma (128). Experiments using the parasites (31, 34, 128, 138, 148). The parasite also hijacks host
LDLr knockout cells showed a 45% reduction in parasite load in T. Golgi-derived vesicles by Rab14, Rab30, and Rab43 transport,
gondii-infected LDLr knockout mice compared with control mice small GTPases family members, within the PV and acquires their
(134). However, Milovanović and colleagues showed a decrease sphingolipid content (125).
in HDL and cholesterol in T. gondii-infected outbred mice, but In Figure 1, we summarize the essential and general ways
LDL was unaltered until day 42 of infection. Moreover, they only discussed above by which parasites capture cholesterol from
observed an increase in LDL and consistent triglyceride levels at membrane receptors and host LDs. The organelle interactions
this end-point. The parasitemia only correlated with HDL levels highlight their importance on the traffic of lipids and metabolites.
and with LDL when the LDL levels were above 300 (135). Moreover, the LD formation on both host and parasite cytoplasm,
Host LDs are sources of lipids for many intracellular parasites. as well as the LD’s phagocytosis, discussed below are also illus-
Intracellular parasites have evolved ways to attract host LDs to their trated as general characteristics of intracellular parasites.
phagosomal compartment and engulf them intact by unknown Intraerythrocytic Plasmodium falciparum and T. gondii
mechanisms (20, 33, 34, 48, 49). Although the Toxoplasma PV tachyzoites can synthesize neutral lipids, such as triacylglycerol,
shares no characteristics with a phagosome, Toxoplasma also and store them in LDs present in the parasite cytoplasm (34,
internalizes host LDs into the PV lumen. In Toxoplasma-infected 148). The three forms of T. cruzi’s life also have intracellular LD
cells, this process is independent of host Golgi or endoplasmatic formation. Epimastigotes cultured in media with higher concen-
reticulum, and the parasite has cholesterol equally distributed, but trations of serum showed an increase in both cytoplasmic LD and
the PV membrane is low in cholesterol. When in excess, parasites LD-associated to reservosomes. In LD fraction present in puri-
release cholesterol and phosphatidylcholine using membrane- fied reservosomes, the major neutral lipid was cholesterol and
associated ABC-transport proteins (136). Overexpressing cholesteryl ester. No sterol synthesized by parasite pathways, such
TgRab51, a Rab5 homolog, parasite mutants have increased as ergosterol or ergosterol esther was found, which reinforces the
numbers of LD by enhanced uptake of cholesterol and had their idea that the lipid content of the LD-associated with reservos-
growth accelerated (137). omes comes from the uptake of exogenous lipids (149). Once
Toxoplasma gondii scavenges host LDs’ cholesterol and their endocytosed, these lipids may be used in biosynthetic pathways
lipolytic enzymatic activities to grow for its infectibility. It inter- of the T. cruzi. Carriers ABCA1-like, closely related to the mam-
cepts and engulfs host Rab7-associated LDs to the PV lumen, and mal’s cholesterol and phospholipid carriers (150), were detected
the parasite lipase releases lipids from host LD making them acces- associated with the plasma membrane, intracellular vesicles
sible to the parasite. These LDs can be captured by endocytosis and flagellar pocket in T. cruzi (151) and may participate in the

Figure 1 | Lipid droplets (LDs) on parasites lipid homeostasis. Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., and Toxoplasma gondii cannot synthesize
cholesterol, and the energy and lipid source for them is the host lipid synthesis and host LDs, as well as low-density lipoproteins, eventually high-density lipoproteins
particles and lipoprotein lipase. The close relationship with other organelles through Rab proteins can be lipid sources, such as endoplasmic reticulum (ER) for sterol
and Golgi complex (GC) for sphingolipid sources. Although the mechanisms are still unknown, some parasites can store lipids on their LD. Lipoprotein- and
ABC-proteins are involved in the mammalian lipid transport, as well as important enzymes to lipid synthesis like ACAT and DGAT proteins. These proteins are also
present in T. gondii and ACAT-like proteins are present in Trypanosoma cruzi. The parasite transfer lipids to their own LD to be stored, but in Plasmodium spp., or
they metabolize them as in Plasmodium and T. gondii. The parasite and host LDs are involved in essential cell functions that can favor the survival of the parasite,
such as energy and lipid source for intracellular parasites proliferation. They also can isolate lipids or toxic metabolites from the cytoplasm for detoxification, such as
hemozoin from heme on Plasmodium-infected cell LD.
cholesterol transport captured into the cytoplasm. Furthermore, deficient mice fed a high-fat diet. Importantly, it also induced
the presence of Rab 18 in reservosomes could contribute from the a systemic reduction of lipid since it was observed in adipose
traffic of lipids to other organelles (152). tissue around liver, heart, and blood vessels (153). The mecha-
Interestingly, the LDs formation in T. gondii cytoplasm was nisms responsible for this decrease remain unknown, but it may
observed only when the host cells are in a higher concentration be dependent on the presence of parasite eggs and are related to
of lipids (34). Then, the presence of LDs on P. falciparum and T. the immune granulomas formed around them (153, 154). It was
gondii was associated with parasite energy store and homeostasis; reported that eggs of Schistosoma japonicum require cholesteryl
since they are in a higher concentration of lipids, they could be ester for their maturation. The uptake of these lipids came from
toxic to these parasites (34, 148). HDL particles and CD36-related protein-mediated internaliza-
tion (155).
LDs in a Mechanism of Heme Detoxification Noteworthy, S. mansoni may also secrete parasite LDs.
Considering that the cholesterol source for an extracellular Numerous LD in the gut of parasites had hemozoin associated,
parasite residing within the mesenteric veins and capillaries and the authors suggested the role of LD in a mechanism of
of their hosts, would not be a problem, Schistosoma mansoni heme detoxification during parasite blood feeding (156, 157). In
indeed induce a reduction in serum total cholesterol of their agreement with this view, other authors observed a prominent
host (153). Curiously, this capability of hijack cholesterol from production of LD in Plasmodium berghei-infected hepatocytes
its host is correlated with decrease LD formation in the host. The and inside the parasitophorous vacuole and the food vacuole of P.
S. mansoni experimental model also shows the decreased levels falciparum-infected erythrocytes (27, 158, 159). These data sug-
of serum cholesterol, and of LDs in the liver cells of ApoE gest that the LDs might play roles in the detoxification of heme in

the Plasmodium parasites (148). As summarized in Figure 1, the Novel findings show that L. i. chagasi cytoplasmatic LDs
data discussed in the Sections “Protozoa Are Unable to Synthesize are intracellular sites of prostaglandin synthesis, mostly PGF2a
Cholesterol De Novo and May Retrieve It From Host LDs” and production (45). L. i. chagasi has increased LD numbers and
“LDs in a Mechanism of Heme Detoxification”indicate that LD amplified expression of prostaglandin F2α synthase according to
may exert a parasite energy store and a functional role in parasite metacyclogenesis stage: metacyclic and amastigotes LD formation
homeostasis including detoxification functions. raised, and is the PGF2a source. Accordingly, it was demonstrated
that the FP receptor is localized in the early phagocytic vacuoles
LDs in Parasite May Modulate Host Response and on surface parasitophorous vacuoles during macrophages
Intracellular parasites, such as T. cruzi, Leishmania infantum infection with metacyclic forms of L. i. chagasi. Furthermore, the
chagasi, P. falciparum, and T. gondii, also have cytoplasmic LDs. inhibition of the FP receptor in the macrophages diminished the
Notably, experiments with T. cruzi and L. i. chagasi are shedding L. i. chagasi parasite load 72 h after infection showing that the
light into LD functions in parasites. They went beyond sites for parasites may mobilize the eicosanoid machinery in the most
energy storage and suggested their involvement in the modulation infective stage of the parasite and suggest that the Leishmania’s
of the host immune response, and participation in mechanisms LD could act as a virulence factor (45).
of virulence (46, 160). These recent findings are illustrated in Trypanosoma cruzi LDs have also been associated with eicosa-
Figure 2 and discussed below. noid metabolism. The LDs of amastigotes growing in vivo have
Figure 2 | Host cell lipid droplet (LD) biogenesis in response to interaction with protozoan parasites. Increased numbers of LDs occur in the cytoplasm of many
cell types after infection with different parasite-containing vesicles as well as on cytoplasm of these parasites, such as Trypanosoma spp., Leishmania spp.,
Plasmodium spp., and Toxoplasma gondii. The signaling from toll-like receptors (TLRs) by pathogens and pathogen-derived molecules triggers signaling pathways,
such as PPARs and MAPKs, which are involved in the formation of LD. LDs produce lipid mediators; they compartmentalize both the substrate and the enzymatic
machinery necessary for eicosanoid syntheses, such as cPLA2, cyclooxygenases (COX)-2, and prostaglandin synthases. Prostaglandin E2 (PGE2) production
benefits parasite survival, as shown in Trypanosoma, Leishmania, Plasmodium, and Toxoplasma infections. On the other hand, leukotriene B4 (LTB4) production by
host cells via P2 × 7 receptor is related to parasite killing as seen in Leishmania infection, where LDs biogenesis and an anti-inflammatory balance in the PGE2/LTB4
axis could facilitate the Leishmania transmissibility and infection in vivo. Cytoplasmic LD in Leishmania express prostaglandin F2α synthase (PGFS) responsible for
PGF2α production. The PGF2α receptor (FP) is present on parasite vacuole (PV) surface, suggesting these LDs could act as a virulence factor. Then, LD could be
involved in inflammation and immune evasion.

increased the size and electron-density than those from amastig- pathogens emerge as a typical phenotype to viral, bacterial, and
otes cultured in vitro (46). Trypomastigotes forms also increased parasitic infections and highlights the involving of LD in different
LD after both host interaction and exogenous AA stimulation. aspects of inflammation [reviewed by Bozza et al. (5) and Saka
The AA content in LDs purified from AA-stimulated parasites and Valdivia (17)]. However, the understanding of LD formation
increased and these parasites released high amounts of PGE2 and and their dynamics in the interplay between hosts and parasites
showed PGE2 synthase expression. Importantly, a PGE2 synthesis is still limited. Here, we will discuss the mechanisms known that
occurred within LDs from AA-stimulated trypomastigotes, parasites induce LD formation on host cells. Figures 2 and 3
indicating that LDs are essential sources of PGE2, a potent lipid summarize the data knew until now.
mediator that inhibits many aspects of immune responses, and
can be implicated in the pathogen survival (46). These data dem- LDs in Eicosanoids Production and the Regulation of
onstrate novel functions for parasite-derived LDs in eicosanoid Host-Parasite Interactions
metabolism and evasion of the host immune response (45, 46). As a major source of eicosanoids production, LDs have been
implicated in the regulation of parasite-induced inflammation
Parasites Induce LDs on Host Cells: [reviewed in Bozza et al. (5, 90)]. Eicosanoids are bioactive
Friend or Foe? molecules produced by the oxidation of AA by specific enzymes,
Increasing data about the modulation of host lipid metabolism such as cyclooxygenases (COX), lipoxygenases, and terminal
through targeting LD formation and accumulation by intracellular eicosanoid synthases. Prostaglandins have a wide variety of
Figure 3 | Lipid droplets (LDs) and the molecular mechanisms regulating immune response during protozoan infection. Interferon (IFN)-γ receptor signaling induces
transduction of GTPases family molecules—immunity-related GTPases (GKS e IRGM proteins) and GPBs subfamilies—that play essential roles in membrane
vesicular trafficking, autophagy, and antimicrobial and anti-inflammatory responses. IRGM are abundant proteins on LDs and “protects self-vesicles” from GKS and
guanylate binding proteins (GBPs) destruction by autophagy machinery. The inactive GKS and GBP proteins built a pool of molecules available on cytoplasm and
could have a stable association with the IRGM-deficient membrane, as parasitophorous vacuole membrane and eventually as LDs, to target them to autophagy, or
lipophagy, respectively. LDs provide fatty acids, and lipids employed the phagophore membrane, implying their enzymes [steryl esters (STEs) and TAGs] on
autophagosome biogenesis. IFN-γ signaling induces upregulation of LDs, and it appears to involve perilipin 2 (PLIN2)/ADRP that physically associates with IRGM.
LD is also related to cross-presentation pathway since depletion of LDs by pharmacological inhibition of DGAT and by PLIN2/ADRP deficiency led to decreased LD
biogenesis and cross-presentation since MHC-I surface expression, and the rate of antigen-presenting cell conjugated with T CD8+ lymphocyte are reduced.

activities, including down-regulation of macrophage functions, in macrophages infected with live L. major parasites (37),
and regulatory roles in immune responses. Notably, COX-2 and highlighting the active role of the parasite with its cell host.
PGE-synthase compartmentalize within LDs (10, 18, 21), and Nevertheless, the protein level of COX-2 is unchanged in
LDs were the main site for heightened PGE2 production during L. donovani (176) and L. major infection, suggesting that LD
T. cruzi infection (30). formation may not correlate with PGE2 production in L. dono-
The crucial role of PGE2 in the modulation of the host immune vani and L. major infections (48). However, recent data showed
response can be illustrated by its higher plasma levels in patients the essential role of PGE2 in suppressing L. major-infected
with localized or diffuse cutaneous leishmaniasis than patient macrophages, and this suppression was mediated by B1 cell
control (161). Also, the PGE2 secretion through PLA2 induced in IL-10 production (177).
the progression of cutaneous disease in L. amazonensis infection A key observation is the host LDs in close apposition—and even
(162). More than that, PGE2 production benefits parasite survival, inside—parasite-containing phagosomes, such as in T. cruzi (20,
as showed in Leishmania spp. (35, 163–165), T. cruzi (20, 30, 166), 49), L. major (48), L. amazonensis (172), and T. gondii infections
and T. gondii infections (32, 33, 37). (33, 34). Nolan et al. (34) showed that the host LDs are necessary for
This association between LD formation and PGE2 production Toxoplasma infectivity in human foreskin fibroblasts (HFFs) and
was observed during in vivo infection with T. cruzi (20). Infected mouse embryonic fibroblasts (MEFs). The host LDs progressively
macrophages exhibit positive immunostaining for COX-2 and increased with a peak of 8 h post-invasion (p.i.) that coincided with
PGES, and both co-localize with PLIN2/ADRP staining, a LD PLIN2/ADRP and GDAT2 upregulation transcription, suggesting
structural protein, which confirms the presence of these enzymes stimulation of TAG synthesis in LD, and the host LDs cluster around
inside LD in T. cruzi-infected macrophages. The association of PV. After that, their number decline and abruptly dropped until
PGE2 production and parasite division highlighted the LD par- parasite egress at 24 h in HFF. In MEF, the host LD and GDAT2
ticipation on evasion mechanisms of T. cruzi (30, 167). decrease but the LDs remain around the PV. The authors suggested
In Toxoplasma-infected macrophages and muscle cells, the that the LD biogenesis and breakdown for lipolysis, the distribution
host LD formation is associated with reduced host microbicides of LD, and the DGAT2 expression levels reflect the highly dynamic
properties, with an increased PGE2 production, a potent inhibitor status of host neutral lipid metabolism during infection. T. gondii
of Th1 response, and with a decreased nitric oxide production may drive it, but it is also be part of a host cell defense mechanism
(32, 33). In muscle cells, the number of LD increased in a time in response to parasite-mediated lipid imbalances (34).
course manner earlier as 6 h, until 48 h post-infection. The LD Lipid droplet formation in L. major-infected macrophages
formation correlated with higher COX-2 and PGE2 expression, was very quick, time-dependent, and independent of parasite
which could be contributing to IL-12 and interferon (IFN)-γ viability. It suggests that the trigger for LD formation by L. major
secretion from muscle cells (33). The production of the PGE2 also has a cellular origin, as T. cruzi and T. gondii infections
with IL-12 and IFN-γ seems contradictory. However, IFN-γ is do (30, 33, 37). Microarray data and transcriptomic analysis
essential to control T. gondii infection—and the infections with from L. major-infected macrophages support this formation.
others parasites [reviewed in Ref. (168–170)]. They revealed an enhanced cholesterol-uptake coupled with a
The secretory serine protease of Leishmania donovani is decreased cholesterol efflux (48) and cholesterol uptake combined
involved in down-regulation of macrophage microbicidal activity with activation of de novo TAG synthesis (37). Furthermore, LD
by inducing COX-2-mediated PGE2 release (171). The cytokines, formation was independent of cytoskeleton movement and L.
such as IL-12 and IFN-γ, could favor the cyst formation in mus- major phagocytosis (37). As suggested for mycobacterial infec-
cle cells and the establishment and maintenance of the chronic tions (41, 178), the paracrine induction of LD formation is also
disease and transmission source via consumption of raw or observed in the parasites T. cruzi (30), Toxoplasma (33) and
undercooked meat containing T. gondii (33). The mechanisms L. major (37) infection. Then, soluble factors from infected
of these processes await further investigation. In dendritic cells, cells or parasites may act in a paracrine manner to induce LD
L. amazonensis infection likewise induced LD formation and the formation in uninfected bystander cells suggesting that receptors
modulation of cholesterol uptake pathways (172). Differently, L. are triggering and downstream signaling pathways are sufficient
i. chagasi-infected macrophages did not show LD formation, only to cause LD formation (30, 37, 178). It seems to have more and
the parasites showed LD formation (45). fundamental participants to achieve a homeostasis pattern. In
The pathogenesis of severe malarial anemia is also due to L. amazonensis infection, Afonso e collaborators suggested that
the release of soluble mediators of inflammation as part of host PGE2 and TGF-β1 pathways are involved with the enhanced
immune response driven by phagocytosis of malarial pigment parasite burden in L. amazonensis (179).
(hemozoin) present in parasitized RBC or free release on lysis The roles of LDs in leukotriene synthesis during infection by
of these cells (173). Although the suppression of COX-2-derived intracellular parasites have not yet been established. This would
PGE2 is also associated with enhanced severity of malaria, how be an important point to address since there is solid evidence
it alters the erythropoietic cascade remains to be determined that leukotriene B4 (LTB4) production by host cells is related
(174, 175). Recently, increased LDs were demonstrated during to parasite killing in Leishmania infection by nitric oxide and
malaria infection in different mice strains, however, there are not reactive oxygen species production (180–183). Although there is
an association of number of LDs and disease severity (28). evidence that 5-LO enzyme co-localize with LDs in hepatic stel-
Importantly, the stimulation of PLA2-COX-2-PGE2 pathway late cells from schistosomal granulomas, where it is involved in
that can suppress macrophage’s activation is observed only the release of Cys-LTs in a TGF-β-regulated manner, potentially

influencing pathogenesis and liver fibrosis in schistosomiasis membrane targeting of the GMS proteins prevent accumulation
(184). of activated GKS proteins and enable GKS proteins to distinguish
The Leishmania vector (sand fly, Lutzomia longipalpis) saliva organelles membranes from that of pathogen vacuoles. The GMS
components have a central role in parasite infection. They can proteins are tightly associated with endomembrane of cellular
modulate eicosanoids metabolism and LDs formation in the host organelles and restricted to specific organelles: Irgm1 localizes
cells (164, 185, 186). The Lutzomia longipalpis saliva activates mainly to the Golgi complex membrane, endolysosomal compart-
macrophages to produce PGE2 but not LTB4 (186) and the sand ment, mitochondria, peroxisomes, and LDs in uninfected cells;
flies salivary gland sonicate (SGS) increases PGE2 production by Irgm2 localizes to the Golgi and Irgm3 to the ER and LD (197).
neutrophils during L. infantum infection (164). The SGS during Several members of both GTPases families can recognize spe-
L. infantum inoculation increased the parasite viability inside cific host lipid molecules, to translocate and to adhere precisely to
peritoneal cells, and COX-2 inhibition blocked this action. The parasitophorous vacuole membranes (PVMs), labeling it for dis-
LD biogenesis on host or parasite and an anti-inflammatory ruption or delivery to lysosomes to inhibit intracellular pathogen
balance in the PGE2/LTB4 axis could facilitate the Leishmania growth [reviewed in MacMicking (189)]. The specificity of these
transmissibility and infection in vivo (160, 186). intracellular targeting events is well documented (168, 197–199)
The lipid derived pro-resolving mediators called lipoxins, and the underlying mechanism is beginning to be deciphered
resolvins, and protectins are potent anti-inflammatory media- (200–202). When GMS proteins are absent in the cell, GKS pro-
tors involved in the resolution of inflammation. As reviewed teins activate spontaneously and form aggregate-like structures,
by Russell and Schwarze, lipoxins are protective to host control preferentially on PVMs. The consequence is the disruption of the
of disease caused by T. gondii, T. cruzi, and P. berghei but not vacuole and the release of the pathogen into the cytosol or both
by Mycobacterium tuberculosis bacteria. It could be related to vacuole and parasite disruption, resulting in either necroptosis or
the balance between pathogen-control and excessive immune autophagy (203, 204).
response (187). However, the role of LDs in the synthesis of lipid Bougnères et al. (205) showed the Irgm3 role in LD forma-
mediators involved in the resolution of inflammation has not tion, as Irgm3-deficient DCs do not accumulate LDs (205). DCs
yet been characterized and it would be of interest to investigate isolated from Irgm3-deficient mice showed the impaired capacity
whether LD is also involved in lipoxin- or resolvin-mediated to stimulate specific CD8+ T cells owing to antigen phagocytosis
mechanisms of pathogen evasion or destruction. and did not increase LD biogenesis upon IFN-γ stimulation
when compared with wild-type mice. The increased antigen
Lipid Droplets in Vesicular Interactions and the cross-presentation competence correlated with LD biogenesis
Resistance of Host to Parasite Infections and the chemically inhibited LD biogenesis blocked it. The data
Interferons are effector key molecules involved in protective show that DCs from PLIN2 (ADRP) deficient mice had similar
responses to viruses and intracellular pathogens [reviewed in defects in antigen cross-presentation that Irgm3-deficient mice
Schroder et al. (168), Schneider et al. (169), and Pilla-Moffett had and that Irgm3 interacts with PLIN2 suggest that LDs play
et al. (170)]. They have their antimicrobial effects by a consid- a significant role in regulating cross-presentation (205). The
erable remodeling transcriptional expression profile of target absence of Irgm3 protein can explain the lack of LD biogenesis,
cells bearing the IFN receptors (188, 189). One of these IFN- where unprotected by IRGM protein, LD suffer an attack of GKS-
stimulated genes encoding viperin (for virus inhibitory protein, GBP proteins bounding on their membrane delivering them to
ER-associated, and IFN-inducible), a canonical protein evolu- autophagy pathway (201).
tionary conserved and found to be highly upregulated in response The essential functions of GBPs family proteins seem to be
to LPS, dsDNA, and RNA analogs, and in infection with various their ability to target membranes and to oligomerize in them.
viruses. Interestingly, viperin localizes to the cytoplasmic leaflet Several GBPs harbor C-terminal CaaX motifs for isoprenylation
of the ER and LD, and LDs are sites of viral assembly (190, 191), that enable them to associate with intracellular endomembranes
and has antiviral activity against various human viruses (192). (206). They bind and hydrolyze guanosine phosphated, allowing
Saka and Valdivia (17) already draw the attention for the GBPs to form homo- and hetero-oligomers. Once docked on PV
exciting data showing that two signaling pathway (JNK and IFN) membrane, GKS and GBPs proteins can recruit antimicrobial pro-
are involved in the cPLA2 activation required for LD biogenesis tein complexes, including autophagic cascade and inflammasome
(193), as well as in immunity to Chlamydia trachomatis (194) and pathway to destroy the parasite vacuolar compartment [reviewed
C. pneumoniae (118). In Figure 3, we highlighted the receptors by Schroder et al. (168)]. Interestingly, GBP proteins stimulate
described to induce LD formation and the key molecules and caspase-11-dependent pyroptosis in macrophages infected with
pathways involved in the modulation of parasite response. Others Gram-negative vacuole resident bacteria leading the activation
possible partners we also discuss in the following text. of the non-canonical inflammasome (207, 208).
Interferon-induced resistance genes include members of As inactive proteins, GKS and GBP have lipid binding sub-
two GTPase families named immunity-related GTPases (IRGs) strates on LD and T. gondii PVMs. Haldar et al. (201) proposed
and guanylate binding proteins (GBPs). The IRGs proteins are that the high expression of GMS proteins on LDs make them
subdivided into GKS and GMS IRGs class. The current model regulatory proteins by increasing the availability of GKS and GBP
of IRGs interaction describes that, in IFN-γ-activated cells, the inactive proteins allowing them to bind on PVMs and deliver
effector GKS proteins are cytosolic and stay in the inactive GDP- them to autophagosomes for parasite degradation. It was recently
bound state by GMS regulatory proteins (195, 196). The specific shown that murine GBP2 positively regulates the recruitment of

Irga6 (a GKS protein) to T. gondii PVMs (209) and directly targets processes could drive LD growth, autophagosome biogenesis,
the membrane of T. gondii after disruption of PVM (202). Then, and cellular homeostasis.
the vacuolar contents released into the cytosol may be removed Our current understanding of IFN-inducible GTPases role on
through autophagy (198, 203). The vacuolar contents released host resistance to the intracellular protozoa and on the LD role to
may be ubiquitinated, resulting in the recruitment of p62. ATG3 self-organelle recognition appoint to LD as important cell func-
and p62 also promote the cross-presentation of vacuolar antigens, tion modulator, implying the participation of LDs on parasite
derived from lysed vacuoles, on MHC class I (210). immune response.
Haldar and colleagues showed that Irgm1 and Irgm3 co-
localize on LD of IFN-γ-treated MEFs and that Gbp1 effector
protein p62 co-localizes with IRGM-deficient LDs MEFs. FINAL REMARKS AND FUTURE
Ichimura and Komatsu showed that p62Gbp1 binds directly to PERSPECTIVES
the LC3 to deliver its cargo to autophagosomes (211). As LDs
A number of key findings have evidenced a protagonist role for
from IRGM-deficient mice were inside autophagosomes upon
LDs in host parasite biology. LDs were shown to have major roles
IFN-γ activation, it could suggest that IRGM was not a role in
in metabolism, signaling and detoxification, and actively par-
LD formation. Instead, Irgm1 and Irgm3 proteins could protect
ticipates in innate immunity response to infection. Parasite-host
LDs from degradation in MEFs and p62Gbp1 could start LDs
interactions modulate the lipid metabolism of both organisms,
lipophagy (201).
and these studies provide valuable knowledge on cell biology,
Lipophagy occurs when lysosomes degrade LD after its seques-
immune response, and drugs development. In leukocytes and
tration by autophagosomes. The recognition of LD by autophagic
other cells involved in infectious conditions, LD biogenesis is
machinery is unknown [reviewed by Martinez-Lopez and Singh
highly induced through regulated mechanisms that involve
(212)]. Lipophagy could be related to lipid homeostasis, where
innate immune receptors and transcriptional dependent and
control size and the number of LDs are making a significant
independent pathways. Notably, it is now well established that
balance of energy source and survival mechanisms, such as cell
LDs are main sites for the generation of lipid mediators involved
stress. Accumulating evidence suggest the participation of LD in
in the host immune responses. The evolving understanding of
the regulation of the autophagic process and their destruction by
the interplay of LDs and critical pathways on immune response,
autophagy via lipophagy (212–214). LDs also act in concert with
as IFN-induced resistance genes, autophagy, antigen cross-pres-
the proteasomal and autophagic pathways of protein degradation,
entation and areas that still need to have roles of LDs investigated
proposing their role on isolation stress products inside LD, such
like resolution of inflammation, could illuminate our knowledge
as apo B in hepatocytes and a-synuclein in Parkinson’s disease
of the signaling ways that control parasite infections or, better to
(215, 216). On atherosclerosis, however, it seems that IRGM has
say, establish homeostasis with host and parasite living together.
a pathogenic role. IRGM proteins participate in the positive feed-
Furthermore, it is not a surprise that the intracellular parasites
back where ox-LDL up-regulates IRGM in macrophage, which, in
have developed strategies to evade or use LDs for surviving.
turn, modulates the CD36 to promote the ox-LDL uptake (217).
Parasites have adapted to exploit LDs as a source of lipids for
Studies on other systems are necessary to investigate the IRGM
membrane building, a crucial step for parasite growth, and as a
pathogenic role.
negative regulator of immune response.
Curiously, IRGM proteins physically interact with the central
Although great advances in the understanding of the mecha-
autophagy regulators and make molecular complexes with the
nisms of LD biogenesis and its roles in lipid metabolism and
pathogen sensor NOD2. In response to PAMPs, the RIG-1, and
inflammatory mediator production have been achieved, critical
TLR3 signaling boost the NOD2-IRGM association. NOD2-
questions remain about the formation and the functions that
IRGM complex promotes the assembly of autophagy regulators
LDs play in infectious diseases. In conclusion, recent studies
highlighting the critical role of IRGM proteins as organizer of the
have identified LDs as multifunctional organelles with key
core autophagy machinery and as a vital component of antimi-
functions in lipid storage and cell signaling in inflammation,
crobial and anti-inflammatory responses (200, 218, 219).
and as such, they are emerging as attractive target candidates
Recently, Shpilka and collaborators suggested that LDs provide
for therapeutic intervention. Future studies will be necessary
fatty acids and lipids for the formation and elongation of the pha-
to characterize the role of LDs as targets for therapeutic inter-
gophore membrane (220). This work also showed the involvement
vention in infectious diseases that progress with increased LD
of the enzymes responsible for the TAG and steryl esters synthesis
accumulation. These will need to include the development of
with autophagosome biogenesis in yeasts strains. Moreover, they
selective LD inhibitors. Moreover, the safety characterization
showed the essential participation of ER-LD contact-site proteins,
of LD inhibition is required, as lipid accumulation within LDs
Ldb16 and Ice2, in autophagosome formation. They suggested
may act as a protective mechanism in lipid homeostasis against
that these two organelles act together, and the lipid transfer from
cellular lipotoxicity.
LD to the ER is necessary for autophagosome formation (220).
Previously, the contribution of TAG mobilization from the LDs,
by the lipase PNPLA5, to autophagosome biogenesis was shown AUTHOR CONTRIBUTIONS
(213).
As the autophagic machinery is also implicated in the for- AV and PB contributed conception and design of the review. AV,
mation and growth of LDs (221), feedback between these two KO, and LT organized the database. AV wrote the first draft of the

manuscript. AV, PB, CM-M, KO, and LT contributed to writing a contributions. We acknowledge the comments and input of Dr.
subset discussion and to manuscript revision, read, and approved Jens Rietdorf (CDTS, FIOCRUZ). We apologize to investigators
the submitted version. whose relevant work has not been cited because of space con-
straints. The work of the authors is supported by Fundação de
Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ, Brasil); Conselho
ACKNOWLEDGMENTS Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq,
Brasil); PAPES/Fiocruz; Oswaldo Cruz Institute (IOC), and
We would like to recognize present and past members of Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
the Laboratory of Immunopharmacology for their valuable (Capes).
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cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution
dynamics. Dev Cell (2015) 32:678–92. doi:10.1016/j.devcel.2015.01.029 License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted,
provided the original author(s) and the copyright owner are credited and that the
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Karina Oliveira Ioc Mest 2019

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

ESTUDO DO PAPEL DOS CORPÚSCULOS LIPÍDICOS DURANTE A INFECÇÃO

Karina da Silva Oliveira

Karina da Silva Oliveira

ESTUDO DO PAPEL DOS CORPÚSCULOS LIPÍDICOS DURANTE A INFECÇÃO

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz

Orientadora: Patrícia Torres Bozza

Karina da Silva Oliveira

ESTUDO DO PAPEL DOS CORPÚSCULOS LIPÍDICOS DURANTE A INFECÇÃO

Orientadora: Patrícia Torres Bozza

Aprovada em: 19/08/2019

Banca examinadora: Prof. Dr. Helene Santos Barbosa - FIOCRUZ (presidente)

Suplente: Prof. Dr. Christianne Bandeira de Melo - UFRJ

À Nossa Senhora do Perpétuo Socorro, que não desistiu de mim nunca e me

À Dra Patrícia Bozza, por toda orientação e oportunidade de fazer parte de um

À Dra Adriana Vallochi, que me fez crescer como profissional e, principalmente,

Aos pesquisadores do laboratório de Imunofarmacologia. Obrigada pelo

Aos queridos alunos do Laboratório de Imunofarmacologia. Vocês me

À Dra Patricia Reis, exemplo de profissional, e seus alunos, pessoas

Aos funcionários do pavilhão 108. Pessoas maravilhosas sem as quais esse

Aos funcionários do Serviço de Hemoterapia do Hospital Clementino Fraga

Aos integrantes da banca, pela gentileza de aceitarem o convite.

À CAPES e à FIOCRUZ, pelo apoio científico e financeiro.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de

LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... x

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. xiii

ABSTRACT ........................................................................................................... xvi

3.1. Parasitos ................................................................................................. 19

3.1.1. Manutenção dos parasitos ........................................................ 19

3.1.2. Teste de viabilidade de taquizoítos de T. gondii ..................... 19

3.2. Soluções tamponadas para análise de diferenças na sensibilidade ao

3.3. Obtenção de células dendríticas humanas (hDC) ............................... 20

3.4. Infecção de células dendríticas por taquizoítas de Toxoplasma gondii

3.5. Análise de corpúsculos lipídicos (CLs) durante a infecção de hDCs

3.5.1. Análise de CLs em hDC sem infecção e infectadas pelo T.

3.5.2. Inibição de enzimas envolvidas no metabolismo lipídico ...... 22

3.5.3. Suplementação do meio de cultura com Ácidos Graxo.......... 22

3.6. Dosagem de citocínas - ELISA .............................................................. 23

3.7. Citometria de Fluxo ................................................................................ 23

3.7.1. Análise da viabilidade da hDC.................................................. 23

3.7.2. Análise da expressão de moléculas de superfície .................. 24

3.8. Análise Estatística .................................................................................. 24

4.1. Obtenção de células dendríticas a partir de monócitos mononucleares

4.2. Análise da viabilidade do Toxoplasma gondii e de Células Dendríticas

4.3. Perfil de infecção de células dendríticas humanas vivas e mortas ... 32

4.4. Biogênese de Corpúsculos Lipídicos e infectividade de células

4.5. Impacto da taxa de infecção na biogênese de CLs e na viabilidade de

4.6. Determinação da concentração dos inibidores da biogênese de CLs

4.7. Impacto da inibição da biogênese de CLs em hDCs infectadas pelo T.

4.8. Efeitos da suplementação com Ácido Oleico na infecção de células

4.9. Expressão de moléculas de superfície induzida pela infecção com T.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 84

Figura 1. Estrutura da forma taquizoíta de T. gondii.. ............................................ 1

ESTUDO DO PAPEL DOS CORPÚSCULOS LIPÍDICOS DURANTE A INFECÇÃO

O Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório, capaz de infectar vários

STUDY OF THE LIPID DROPLET ROLE DURING HUMAN DENDRITIC CELL

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite, capable of infecting

Descrito pela primeira vez em 1909 (Nicolle and Manceaux, 1909), o

Figura 1. Estrutura da forma taquizoíta de T. gondii. Esquema apresentando, além das