CURSO DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS

ANNE CAROLINE CARDOSO MONTEIRO

MARIELE GONÇALVES CRIPPA

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA NA PRODUÇÃO DE ETANOL:

UMA REVISÃO SOBRE OS PROCESSOS E FATORES
DETERMINANTES DO RENDIMENTO

Marília

2016
 CURSO DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS

ANNE CAROLINE CARDOSO MONTEIRO

MARIELE GONÇALVES CRIPPA

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA NA PRODUÇÃO DE ETANOL:

UMA REVISÃO SOBRE OS PROCESSOS E FATORES
DETERMINANTES DO RENDIMENTO

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à

Faculdade de Tecnologia “Estudante Rafael Almeida
Camarinha” - FATEC, como requisito para conclusão do
Curso de Tecnologia em Alimentos.

Orientadora: Profa. Dra. Silvana Pedroso de Goes Favoni

Marília – 2016
 RESUMO

O presente trabalho tem o interesse em demonstrar os vários fatores e

situações que estressam e dificultam a atividade das leveduras
Saccharomyces cerevisiae nas fases existentes no processo da fermentação
alcoólica nas usinas sucroalcooleiras, causando uma redução na produção de
etanol em relação à quantidade esperada e reduzindo consequentemente a
eficiência industrial. Foram estudados os interferentes no processo de
fermentação alcoólica; a qualidade da matéria prima empregada à cana de
açúcar; e as diferentes formas de condução de uma fermentação. Sendo
estudada a viabilidade das leveduras em diferentes meios de concentração de
açucares e fermento, bem como os fatores físicos e ambientais na qual se
destacam a temperatura, pH, sulfito e o próprio etanol que impactam no
rendimento fermentativo e os principais micro-organismos contaminantes que
podem ser encontrados e desenvolvidos no processo de fermentação alcoólica
nas usinas sucroalcooleiras.

Palavras Chave: Levedura. Fermentação Alcoólica. Processo industrial.

Fatores interferentes. Eficiência Industrial.
 ABSTRACT

This study is interested in showing the various factors and situations that stress
out and hinder the activity of the yeast Saccharomyces cerevisiae in the existing
phases in the process of fermentation in sugar and alcohol plants, causing a
reduction in ethanol production compared to the expected amount and thereby
reducing industrial efficiency. interferents were studied in the fermentation
process; the quality of the raw material used to cane sugar; and different ways
of conducting a fermentation. the viability of the yeast in different means of
concentration of sugar and yeast being studied, as well as the physical and
environmental factors in which stand the temperature, pH, sulfite and own
ethanol impacting the fermentative yield and the main micro-organisms
contaminants that they can be found and developed in the alcoholic
fermentation process in sugarcane mills.

Keywords: Yeast. Alcoholic fermentation. Industrial process. confounders.

Industrial efficiency.
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................4

2 MATERIAL E MÉTODO..................................................................................5

3 REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................6

3.1 Processo de produção de etanol nas usinas sucroalcooleira...............6

3.2 Processo fermentativo...............................................................................8

3.3 Levedura: o agente da fermentação alcoólica.......................................12

3.4 Fatores que influenciam a fermentação alcoólica.................................18

3.4.1 Concentração etanólica.........................................................................18

3.4.2 pH............................................................................................................18

3.4.3Temperatura............................................................................................19

3.4.4 Contaminação Bacteriana.....................................................................20

3.4.5 Sulfito......................................................................................................24

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................................26

REFERÊNCIAS................................................................................................27
 7

1 INTRODUÇÃO

Em meados da década de 70, acontecimentos mundiais

associadas à emissão de substancias que comprometem o meio ambiente,
pressões de preços e perspectivas de esgotamento das fontes não renováveis
de combustíveis fósseis, levaram o Brasil a implementar o Programa Nacional
do Álcool (PROALCOOL). Este fato introduziu definitivamente o etanol na
matriz energética nacional, levando o país à posição de primeiro produtor
mundial de etanol combustível (MAPA, 2016; VITAL, 2013; ANDRADE et al.,
2009; BASTOS, 2007). Na safra 2015/2016, a produção brasileira de etanol
está estimada em 29,2 bilhões de litros e conforme projeções, num futuro
próximo, pode garantir ao país o perfil renovável de sua matriz energética
(CONAB, 2015; MILANEZ et al., 2012).

A produção de etanol no Brasil tem como principal matéria

prima a cana de açúcar (Saccharum officinarum L.), uma gramínea rica em
sacarose, que num processo fermentativo, pela ação da levedura
Saccharomyces cerevisiae, é transformada em etanol (C2H6O) e gás carbônico
(CO2) (LIMA, 2013). A eficiência e viabilidade econômica deste processo
biotecnológico são alcançadas a partir de três parâmetros fundamentais: a
eficiência na extração da matéria prima açucarada, ou seja, do caldo de cana,
a eficiência do micro-organismo na transformação da matéria prima em produto
e um sistema industrial apropriado, com equipamentos e condições que
favoreçam a ação do micro-organismo (MILANEZ et al., 2012; ANDRADE et al.,
2009).

Conforme Vanzella (2014) e Chieppe Junior (2012), a

levedura apresenta inúmeras reações enzimáticas em seu metabolismo celular
e, diversos fatores físicos, químicos e biológicos podem interferir
negativamente na eficiência fermentativa, ou seja, em sua capacidade de
converter os açúcares do mosto em etanol. Assim, o estudo de fatores como a
temperatura, pH, presença de nutrientes e inibidores, concentração de
leveduras, contaminações microbianas entre outros são fundamentais na busca
pela melhoria do rendimento alcoólico na prática industrial.
 7

Diante desse contexto, o objetivo do trabalho foi estudar os

parâmetros e processos relacionados à eficiência da produção alcoólica em
usinas sucroalcooleiras, sobretudo os fatores que interferem na etapa de
fermentação realizada pela levedura Saccharomyces cerevisiae.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi baseado em revisão da literatura realizada na

base de dados Scielo, no Google acadêmico e em livros disponíveis on line e
na Biblioteca da Fatec Marília. A busca foi definida pelos uni termos relativos
ao processo de fermentação alcoólica, fatores determinantes e interferentes do
processo e rendimento alcoólico.

A escolha dos artigos encontrados nas bases de dados foi

realizada através da leitura de seus resumos e, após a seleção dos artigos e
dos conteúdos dos livros, estes foram analisados e utilizados na elaboração do
trabalho. Foram pontos de exclusão trabalhos e livros publicados antes de
2001.

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Processo de produção de etanol nas usinas sucroalcooleira

A demanda interna de etanol carburante vem aumentando nos

últimos anos em função do forte crescimento da frota de veículos flex no Brasil
e, conforme Milanez et al. (2012), se as estimativas de crescimento deste setor
automotivo se confirmar, a participação do biocombustível na matriz veicular
brasileira passaria a ser de 63% nos próximos anos, garantindo ao país o perfil
renovável de sua matriz energética. Neste cenário, vários fatores tornam-se
fundamentais, entre eles a produtividade agrícola, a qualidade da matéria prima
e a produtividade industrial. Quanto à produtividade industrial, destaca-se a
etapa de fermentação alcoólica em si, processo pelo qual é obtido o álcool
etílico através da ação de micro-organismos específicos, as leveduras.

No Brasil, a cana de açúcar constitui a principal matéria prima

para a obtenção do etanol carburante. De acordo com Lima (2012) a cana-de-
açúcar está entre as culturas agrícolas mais antigas e mais exploradas no
Brasil, sendo o país o maior produtor mundial da planta, de açúcar e de etanol
(MAPA, 2016). Na safra 2015/2016, conforme estimativa da Conab –
 7

Companhia Nacional de Abastecimento, a safra está estimada em 658,7

milhões de toneladas, enquanto a produção de etanol deve situar-se em torno
de 29,21 bilhões de litros (CONAB, 2015).

A cultura da cana de açúcar espalha-se pelo Centro-Sul e pelo

Norte e Nordeste do país em dois períodos de safra. No Centro-Sul, a colheita
ocorre no período de abril/maio a novembro/dezembro de um mesmo ano e
equivale a 85% da produção total do país, sendo o estado de São Paulo o
principal produtor. Já na região Norte-Nordeste, a colheita ocorre no período de
agosto/setembro de um ano até março/abril do ano seguinte representando
15% da produção total do país (VIEIRA, 2012).

Na composição da cana de açúcar destaca-se cerca de 80%

de água e aproximadamente 20% de sólidos totais, principalmente açúcares
sacarose (17%), glicose (0,4%), e frutose (0,2%), além das cinzas (LIMA,
2012). Segundo Vieira (2012) tão importante quanto à produção de cana por
hectare, é a qualidade da matéria prima, medida pelo teor de sacarose contida
na planta e que determina o potencial de produção de açúcar por tonelada de
cana. A qualidade da matéria-prima em São Paulo e no Centro-Sul está entre
14 e 15,5% de POL (sacarose aparente), o que equivale ao rendimento médio
de 140 a 145 kg de açúcares totais recuperados (ATR) por tonelada de cana.
Para o etanol, isso significa rendimento entre 80 e 85 litros por tonelada.

Nas usinas sucroalcooleiras, a produção do açúcar e de etanol

segue as seguintes etapas: moagem da cana de açúcar, tratamento químico do
caldo e filtração. A partir daí, para a produção de açúcar o caldo filtrado passa
por evaporação, cozimento, centrifugação e secagem, enquanto para a
obtenção do etanol, o caldo será fermentado por leveduras, destilado e
retificado para obtenção do etanol hidratado (com grau alcoólico entre 92,6 a
93,8%) ou segue para a desidratação após a destilação para obter etanol
anidro (teor alcoólico mínimo de 99,3%) (Figura 1) (CHIEPPE FILHO, 2012;
LIMA; MARCONDES, 2002).
 7

Figura 1- Fluxograma resumido das etapas do processo de fabricação de açúcar

e etanol nas usinas sucroalcooleiras.

FONTE: LIMA; MARCONDES, (2002).

A moagem constitui a primeira etapa na fabricação do açúcar e

do álcool tendo como objetivo a separação da sacarose contida do caldo da
cana. A moenda é considerada uma unidade esmagadora constituída de
grupos de quatros cilindros perfeitamente ajustada formando os ternos da
moenda que geralmente possui de 4 a 6 ternos. No primeiro terno é possível
uma extração de 70% do caldo, e segue para os demais ternos com o intuito de
se obter um bagaço com o mínimo de umidade possível, o que resulta numa
maior eficiência de extração (OGANDO, 2015; LIMA e MARCONDES, 2002). O
caldo então obtido contém entre 78 a 86% de água, 10 a 20 % de sacarose, 0,1
a 0,2% de açúcares redutores, 0,3 a 0,5% de cinzas e 0,5 a 1,0% de
compostos nitrogenados (Lima et al., 2001).

De acordo com Holz (2010) uma vez realizada a moagem, o

bagaço é encaminhado para a caldeira para a queima e geração de energia,
enquanto o caldo pode ser destinado à fabricação de açúcar ou de etanol.
Segundo Schiavone (2009) para a obtenção de álcool  após a moagem, o caldo
é submetido a aquecimento entre 102-105ºC, decantação, filtração e correção
 7

de pH. Em seguida o caldo clarificado é aquecido a 115ºC para evaporação da

água e concentração dos sólidos solúveis em 20 ºBrix, promovendo também
sua esterilização. Este caldo aquecido é resfriado a 30 0C em trocadores de
calor e corrigido para compor o mosto (líquido açucarado fermentável),
constituído pelo caldo clarificado adicionado de melaço (também chamado de
Mel final) e água para diluição do oBrix , geralmente sendo utilizado 18 oBrix
(LIMA et al., 2011). São características desejadas do mosto: ausência de
sólidos (bagacilho, areia e terra), temperatura máxima de 32 0C e nível de
contaminação microbiana abaixo de 10 2 células/mL (CHIEPPE JUNIOR, 2012).
O mosto é então conduzido às dornas fermentativas e entra em contato com o
fermento, dando inicio à fermentação alcoólica.

3.2 Processo fermentativo

De acordo com Santos (2008), a fermentação alcoólica é um

processo anaeróbico que ocorre pela transformação de açúcares em álcool
etílico (C2H6O), e dióxido de carbono (CO 2), catalizado por enzimas. Este
processo é executado principalmente por leveduras, em nível citoplasmático,
tendo como objetivo a produção de energia, na forma de ATP, que será
empregada nas funções fisiológicas e ainda para o crescimento e reprodução
do micro-organismo. O álcool etílico produzido constitui somente um
subproduto de excreção desse processo.

Segundo Lima et. al (2001), a fermentação alcoólica se divide

em três fases: preliminar, tumultuosa e complementar. A fase preliminar inicia-
se, quando o substrato é acrescentado junto às células. Nesta fase, a
multiplicação celular é intensa, e o açúcar consumido é usado na reprodução.
Caracteriza-se por uma pequena elevação da temperatura e baixo
desprendimento de CO2, cuja duração depende das características do sistema
de fermentação, e pode ser reduzida quando se emprega elevada
concentração de células ou pela adição de células em um meio
nutricionalmente mais rico que o original, tendo em média duração de 4 a 6
horas.

Conforme Venturini Filho (2010), a fase tumultuosa se inicia

com o desprendimento intenso de dióxido de carbono, que faz com que o
 7

mosto se agite como em ebulição, formando espuma. Durante esta fase há

aumento da temperatura que é corrigida através de trocadores de calor. A
duração desta fase se dá em torno de 12 a 16 horas, evidenciada o seu
término pela diminuição do desprendimento de CO 2.

Na fase complementar, que leva de 4 a 6 horas, o

desprendimento de gás carbônico diminui sensivelmente e o líquido ascenta na
dorna fermentativa, a temperatura abaixa e há redução abrupta no teor de
açúcares do meio, completando o processo em torno de 24 horas
(PASCHOALINI; ALCARDE, 2009).

De acordo com Ferrari (2013), os processos fermentativos são

classificados conforme a maneira que o substrato é adicionado às dornas de
fermentação e o produto obtido é retirado. Para a obtenção de etanol, existem
três tipos básicos: processo em batelada ou descontínuo, batelada alimentada,
e o processo contínuo.

No processo em batelada, considerado um sistema fechado,

substrato e micro-organismos são adicionados apenas no inicio da operação e
o produto formado retirado ao final do processo. No transcorrer da fermentação
apenas oxigênio pode ser adicionado na fase inicial para a formação da
biomassa, antiespumante quando houver aumento acentuado de espuma
durante a fase tumultuosa e ácidos ou bases para a correção do pH (no
preparo do mosto). Ao final da batelada, o fermentador é lavado e esterilizado
ficando apto para a próxima batelada (CARDOSO, 2006).

Cardoso (2006) destaca que uma das principais características

da fermentação descontínua é a manutenção do volume na dorna durante todo
o processo, tendo em vista que não há adição de soluções para o controle do
processo e nem perdas de material por evaporação, sendo esta uma das
vantagens deste método. Entretanto, a adição total do substrato pode
ocasionar baixo rendimento fermentativo, pois pode gerar efeitos de inibição e
produtos metabólicos não desejáveis no processo fermentativo. Steinle (2013)
associa o estresse induzido pelo aumento da osmolaridade externa com a
redução em crescimento e perda da viabilidade das células das leveduras,
devido às perturbações no gradiente osmótico através da membrana
plasmática. Isto leva, por sua vez, a perdas em volume das células que se
 7

contraem por causa de diferenças em pressão osmótica entre o exterior e o

meio intracelular.

Nas destilarias brasileiras o processo mais utilizado é a

batelada alimentada, em que se mistura o mosto ao fermento conforme a dorna
vai sendo abastecida. Este método é produtivo e expõe as leveduras a
menores riscos de se tornarem inativas por repressão catabólica (PACHECO,
2010).

A fermentação contínua é considera um sistema aberto, em

que se adiciona continuamente o mosto esteril ao fermentador, no qual o
volume da reação é mantido constante através da retirada sistemática do vinho
(líquido fermentado), fazendo com que o sistema atinja a condição de “estágio
estacionário” com as variáveis do processo (concentração de células, de
substrato limitante e produto) constantes (CARDOSO, 2006).

O reaproveitamento de células de leveduras provenientes de

uma fermentação anterior é prática comum nas destilarias brasileiras, num
processo conhecido como Melle-Boinot (OLIVEIRA, 2010). Neste processo as
células são separadas do vinho por centrifugação, saindo de um lado o leite de
levedura composto pelas células e de outro o vinho delevedurado (Figura 2).
Após a separação das células, estas são tratadas com ácido sulfúrico
comercial concentração a 98% até obtenção de pH entre 2,5 a 3,0, o que leva
em torno de 3 horas para ocorrer, cuja finalidade é o controle da contaminação
bacteriana. Além deste tratamento ácido, água é adicionada às células com o
propósito de reduzir o teor alcoólico do meio, uma vez que o álcool constitui um
importante fator estressante para a levedura. Nutrientes também são
adicionados para suprir as necessidades metabólicas dos micro-organismos e
a homogeneização é feita com agitação. Toda esta etapa ocorre em dornas
menores denominadas dornas de tratamento e uma vez tratado o inóculo este
é re-enviado à dorna de fermentação para a próxima batelada (VENTURINI
FILHO, 2010). Conforme Missawa (2009), cerca de 90% das leveduras são
reaproveitadas de uma batelada para outra e o reciclo de células ocorre
durante toda a safra.

Figura 2- Fermentação pelo processo Melle-Boinot.

 7

FONTE: VENTURINI FILHO (2010).

Normalmente a multiplicação do fermento é realizada no inicio
da safra até que se atinja a concentração ideal de células para a condução do
processo. Nesta etapa aeróbia a oxigenação normalmente é realizada com ar
comprimido e sob agitação, em caldo de cana com sólidos solúveis entre 6 a
100 Brix. Para favorecer a multiplicação rápida do fermento, sulfato de amônio,
sulfato de magnésio, potássio, zinco, fósforo, entre outros são adicionados.
Durante a safra o monitoramento desta concentração e viabilidade celular é
realizado, e quando necessário às células são multiplicadas para garantir o
percentual de células viáveis, pois mortes por envelhecimento e perdas de
células durante o processo são comuns (CHIEPPE JUNIOR, 2012). Conforme
Pacheco (2010), a concentração inicial do inóculo é de 10 6 a 107 células/mL de
mosto, e ao final da fermentação esta concentração passa para 10 8 células/mL
ou mais, sendo a concentração inicial de fermento um dos parâmetros
fundamentais para a produtividade da fermentação.

De acordo com Venturini Filho (2010) alguns fatores levam o

método Melle-Boinot em batelada alimentada a ser o mais empregado nas
usinas sucroalcooleiras, pois acarreta maior rendimento em etanol com
fermentações mais rápidas, necessita menor volume de dornas, isto é, um
 7

menor custo em instalação, garante grande pureza das fermentações

diminuindo os riscos de contaminações.

3.3 Levedura: o agente da fermentação alcoólica

Segundo Silva (2009), os micro-organismos do gênero

Saccharomyces constituem os mais empregados pelas usinas sucroalcooleiras
no Brasil, destinados à fermentação alcoólica. São fungos unicelulares,
diploides (2n), cuja principal forma de reprodução é assexuada por brotamento,
que ocorre com a formação de uma dilatação denominada gema, formada
através de mitoses na superfície externa da célula progenitora, podendo
separar-se e dar origem a um novo indivíduo. Além da reprodução assexuada,
as leveduras também se reproduzem sexuadamente por esporulação através
de meiose seguida de segregação e formação de haploides e posteriores
cruzamentos entre eles formando as células diploides. As leveduras
apresentam formas com dimensões variáveis, cerca de 4 a 8 µm no menor
diâmetro por 5 a 16 µm no maior diâmetro. As formas apresentadas por uma
dada espécie variam grandemente em função da composição do meio de
cultivo e em circunstâncias nutricionais favoráveis, são capazes de dividirem-se
a cada 90 minutos.

As leveduras são micro-organismos facultativos, isto é,

realizam respiração pelo metabolismo aeróbico resultando na transformação do
açúcar em H2O e CO2 e também o metabolismo anaeróbico quando na
ausência do oxigênio, produzindo etanol (C 2H6O) e dióxido de carbono (CO 2),
além de subprodutos como ácidos orgânicos e glicerol (VENTURINI FILHO,
2010).

Segundo Del Rio (2004), as leveduras devem

apresentar certas características fundamentais para a eficiência do processo,
como a velocidade de fermentação que é determinada pela quantidade de
açúcar fermentado por uma quantidade de leveduras durante certo tempo.
Quanto maior a velocidade de fermentação, maior a produtividade em
fermentações mais rápidas, o que leva ao aumento da produção diária e reduz,
consequentemente, o custo de produção e o risco de contaminação por micro-
organismos prejudiciais. Outra característica desejada para as leveduras
alcooleiras é a tolerância ao álcool em valores acima de 10% p:v, uma vez que
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a baixa tolerância ao etanol limita o seu rendimento e produtividade durante a

fermentação industrial. Além destes fatores, a resistência e dominância perante
contaminantes e a estabilidade fisiológica para suportar oscilações no processo
industrial também são fundamentais para estes micro-organismos.

Conforme Cardoso (2006), a levedura é capaz de utilizar a

sacarose presente na cana-de-açúcar quase que imediatamente, hidrolisando o
dissacarídeo em glicose e frutose pela produção e ação da enzima sacarase ou
invertase (β- fructofuranosífrutohidrolase, EC. 3.2.1.26). A Saccharomyces
cerevisiae dispõe de dois tipos de invertase, uma na forma extracelular ou
periplasmática e outra intracelular, sendo que a extracelular apresenta- se
como uma glicoproteína com cerca de 50% de carboidratos. A utilização dos
açúcares pelas leveduras envolve inicialmente o seu transporte para o interior
da célula, sendo executada pela invertase extracelular, numa reação que
acontece fora da célula, chamada de hidrólise extracelular (SALVATO, 2010).

Conforme Pacheco (2010), a fermentação da glicose (C6H12O6)

ocorre em uma via comum denominada glicólise, também conhecida como via
de Ebden-Meyerhof, e é o primeiro estágio do metabolismo, caracterizada por
dez etapas sucessivas, com participação de dez enzimas em sequencia. O
processo glicolítico não necessita do oxigênio molecular (O 2) para a sua
ocorrência, visto que a transformação do açúcar não é caracterizada por uma
oxidação. De forma geral, o processo envolve a quebra da glicose com 6
átomos de carbono em duas moléculas de piruvato (C3H4O3), cada uma com 3
átomos de carbono. Os primeiros cinco passos enzimáticos formam a fase
conhecida como fase preparatória, onde a glicose será fosforilada
enzimaticamente pelo ATP (Adenosina Trifosfato), primeiro no carbono 6 e
depois no carbono 1, obtendo-se assim a frutose 1,6-difosfato, a qual é
quebrada ao meio, produzindo duas moléculas de gliceraldeído 3-fosfato
(molécula com 3 átomos de carbono) produto da primeira fase da glicólise. Os
cinco passos restantes, na segunda fase da glicólise, representam o
“pagamento” do rendimento da glicólise, sendo a energia liberada pela
transformação de duas moléculas de gliceraldeído 3-fosfato em duas moléculas
de piruvato, conservada através do acoplamento da fosforilação de quatro
moléculas de ADP a ATP (Figura 3). Embora quatro moléculas de ATP sejam
 7

formadas na segunda fase da glicólise, o rendimento líquido final é de apenas

duas moléculas de ATP por molécula de glicose degradada, uma vez que duas
moléculas de ATP foram gastas na primeira fase da glicólise.

A fermentação ocorre quando, após a glicólise, não é realizado

o ciclo de Krebs, porque esta via está bloqueada pela hipóxia (ausência de
oxigênio). Então, as duas moléculas de piruvato sofrem descarboxilação pela
ação da enzima piruvato descarboxilase, gerando duas moléculas de CO 2 e
duas de acetaldeído, que será convertido em duas moléculas de etanol pela
ação da enzima álcool desidrogenase (Figura 4) (MADIGAN et al., 2010)..

Figura 3- Sequencia das reações enzimáticas pela fermentação alcoólica de

carboidratos, conduzida por Saccharomyces.

FONTE: LIMA et al. (2001).

De acordo com Monteiro (2016) deve ser levado em conta o

relevante papel da glicose na regulação das opções metabólicas da levedura. A
 7

presença de glicose acima de 0,3% no mosto ocasiona um efeito repressor

sobre os genes que codificam as enzimas da cadeia respiratória e estruturas
mitocondriais, isto é, exerce uma repressão catabólica. Com isso, ocorre
acumulo de biomoléculas em sua forma reduzida na qual o NADH gerado
durante a glicólise é prevalentemente oxidado através da reação de conversão
do piruvato em etanol, isto é, mesmo sob condições de aerobiose a
fermentação predomina sobre a respiração. Com a repressão catabolica,
ocorre aumento da taxa de fermentação e isto influencia negativamente os
transportadores de açúcar para o interior da célula, resultando numa baixa
produtividade de etanol. Este efeito regulatório do metabolismo da levedura é
conhecido como efeito Crabtree.

Figura 4- Esquema da fermentação alcoólica.

FONTE: MADIGAN et al. (2010).

Segundo Lima et al. (2001), a função primordial da levedura em

metabolizar o açúcar é a geração de ATP, ou seja, uma forma de energia
química instável que determinará a realização de diversas funções fisiológicas
e biossínteses necessárias para manutenção do metabolismo da célula. O
 7

etanol e o CO2 resultantes constituem tão somente produtos de excreção, sem

utilidade metabólica para a célula em anaerobiose. Entretanto, o etanol, bem
como outros produtos de excreção (como o glicerol e ácidos orgânicos), com
redução da disponibilidade de glicose no meio, pode ser oxidado
metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em condição de
aerobiose, constituindo um comportamento metabólico conhecido com
diáuxico.

De acordo com Steinle (2013) as relações da estequiometria

servem como base de calculo do rendimento da fermentação alcoólica, isto é
corresponde ao grau alcoólico ou massa específica, que pode ser convertido a
partir da sacarose ou de açúcar de determinada polarização. Após a inversão
da sacarose, as duas moléculas de açúcares invertidos podem ser diretamente
fermentadas para a conversão em quatro moléculas de etanol e quatro
moléculas de gás carbônico, mas a levedura utiliza preferencialmente a glicose.
Conforme representado na Equação 1, estequiometricamente 342,29g de
sacarose produzem 360,31g (2*180,1572) de açúcares redutores totais (ART)
que por sua vez produzem 184,25g de etanol, ou seja, cada quilograma de
sacarose corresponde a 4*46,07/342,30= 0,53 kg de etanol, essa massa de
etanol pode ser transformada em volume dividindo seu valor pelo grau mássico
do etanol, que é de 789,23 kg/m3.

Equação 1:

342,29 Kg → 4 ∗ 46,06 kg → 1000 ∗ 4 ∗ 46,06 Kg → 0,68 L

789,23 Kg∕L
Sacarose Kg etanol Kg fórmula conversão etanol L

O cálculo estequiométrico mais utilizado, porém, considera

apenas a glicose, onde 100 Kg do açúcar produzirão 51,1 Kg de etanol e 48,9
Kg de CO2 (MARTINS, 2009). Entretanto, relaciona que parte dos açúcares
presentes no meio será consumida em reações paralelas necessárias para a
síntese de etanol, formando outros produtos como glicerol e ácidos orgânicos,
principalmente acéticos e succínico, além de outros alcoóis. Por estes motivos
costuma-se observar rendimentos na fermentação alcoólica industrial em torno
 7

de 90% (CANHA, 2009; BIOCONTAL, 2011). Assim, a partir de 100 Kg de

glicose haverá uma produção real de aproximadamente 46,12 Kg de etanol.

A produção de glicerol na fermentação alcoólica está ligada ao

crescimento e à formação de ácidos e a situações de estafa para a levedura,
tais como o estresse osmótico causado por elevadas concentrações de
açúcares ou sais no mosto, contaminação bacteriana, presença de sulfito no
mosto e temperatura elevada.

3.4 Fatores que influenciam a fermentação alcoólica

3.4.1 Concentração etanólica

Segundo Dorta et al. (2006) a levedura Saccharomyces

cerevisiae tem sua tolerância limitada perante o etanol, cuja concentração
máxima que permite o crescimento é de 10% (p:v) proporcionando uma
produção de etanol no máximo de 20% (p:v). O efeito inibidor do etanol está
intimamente relacionado à temperatura da fermentação e a faixa de melhor
resistência ao etanol para levedura é de 13 a 27°C. Fora desta faixa de
temperatura ocorre inibição do crescimento da levedura em função do álcool
presente no meio.

Monteiro (2016) descreve que esta limitação quanto a presença

de etanol no meio é verificada pela queda da viabilidade celular e pela redução
do seu crescimento. O etanol tem a capacidade de se instalar no meio da
bicamada fosfolipídica mais precisamente na parte hidrofóbica, se alojando nos
espaços que resultam das interações entre ácidos graxos insaturados e
proteínas. Isto leva a um decréscimo na fluidez da membrana, pois restringi o
movimento dos ácidos graxos na cadeia e promove um aumento da polaridade
perturbando a troca livre das moléculas polares. O resultado é a alteração do
posicionamento das proteínas na bicamada fosfolipídica, que afeta diretamente
a capacidade da levedura em preservar o gradiente de concentração de
compostos variados através da membrana citoplasmática, refletindo na inibição
da taxa máxima de captação de glicose.

3.4.2 pH
 7

A sigla pH é utilizada para representar o potencial

hidrogeniônico presente em uma determinada solução ou mistura. Esse
potencial se refere à quantidade (concentração molar) de cátions
hidrônio (H+ ou H3O+) presentes no meio e indica se esse meio ou mistura
é ácido, básico ou neutro. Assim, a avaliação do pH de um meio sempre leva
em consideração a concentração de hidrônios (cátions) e a de hidróxidos
(ânions) ( SOUSA; MONTEIRO, 2011).

A faixa de pH ótimo para sobrevivência e crescimento de um

micro-organismo defini-se através do valor mínimo (no final ácido da escala) e
pelo valor máximo (no final básico da escala), sendo que cada espécie
apresenta um valor ótimo de pH (FORSYTHE, 2002).

Sousa, Monteiro (2011) cita que as fermentações alcoólicas,

cujos agentes são as leveduras, podem desenvolver-se em ampla faixa de pH,
porém a faixa considerada ideal para o crescimento microbiano situa-se entre
4,0 e 5,0. Entretanto, a fermentação alcoólica industrial inicia-se com valores
de pH mais baixos entre 2,0 e 3,0 e finaliza com valores entre 3,5 a 4,0. Isto se
dá porque fermentações alcoólicas quando são conduzidas em meios mais
ácidos apresentam melhores resultados quanto ao rendimento em etanol, pelo
fato de restringir o crescimento do fermento, e consequentemente a redução da
produção de glicerol. Ao mesmo tempo, pH mais baixo reduz a contaminação
bacteriana, e considerando que não há correção do pH durante o processo de
fermentativo e tão somente durante o tratamento inicial do fermento, a
condução da fermentação em pH em faixa abaixo do ótimo é benéfica ao
processo (LIMA et al., 2001; SOUSA; MONTEIRO, 2001).

Além da condução do processo industrial em faixa de pH mais

baixo, durante a fermentação o pH pode variar em função do consumo de
fontes de nitrogênio e também pela formação de ácidos orgânicos como
acético, láctico, pirúvico, succínico, contribuindo para a prevenção de
contaminações bacterianas.

3.4.3 Temperatura
 7

De acordo com Forsythe, (2002) as faixas de temperatura para

o crescimento microbiano, assim como ocorre com o pH, dispõe um valor
mínimo e um valor máximo, obtendo um valor ótimo de temperatura para o
crescimento máximo. O controle da temperatura consiste num fator importante
durante o processo de fermentação alcoólica, pois para a produção de
biomassa a temperatura ótima situa-se entre 25º C e 30º C, caracterizando-as
como mesófilas, enquanto para a produção alcoólica as temperaturas ótimas
situam-se na faixa mais ampla de 26º a 35º. Sousa, Monteiro (2001) e Chieppe
Junior (2012) relacionam que valores de temperatura na faixa 26º a 35º
causam enfraquecimento da levedura, ou seja, o crescimento é reduzido, além
de ser propicio ao surgimento de contaminantes e ocasionar perdas do produto
formado por evaporação. Já em temperaturas abaixo de 25º C, a levedura
apresenta menor atividade de crescimento e também de formação do produto.

No Brasil, o inicio da safra se dá no mês abril que condiz com o

inverno, cuja temperatura é baixa, chegando perto de 14ºC a 15°C, nas regiões
Sul e Sudeste requerendo o aquecimento prévio do mosto para atingir a
temperatura entre 28ºC a 30°C, benéfico à atividade da levedura alcoólica. No
decorrer da safra, com o aumento da temperatura ambiente, esta medida se
faz desnecessária. Como a fermentação alcoólica é um processo exotérmico, a
temperatura do mosto pode exceder os limites admitidos para uma
fermentação normal, isso acarreta em fatores que afetam a atividade
microbiana e por isso a temperatura durante a fermentação é controlada
havendo resfriamento por trocadores de calor nas dornas fermentativas
(SOUSA, MONTEIRO, 2011).

Embora as leveduras S. cerevisiae sejam mesófilas, não

esporadicamente as temperaturas nas destilarias alcançam 38º C, dependendo
das condições climáticas da região, pois o mosto é dispensado na dorna em
temperatura ambiente. À medida que a temperatura se amplia, eleva-se a
velocidade da fermentação, porém, conforme descrito acima, esta condição
torna-se mais propicia à contaminação bacteriana, ao mesmo tempo em que a
levedura fica mais sensível a toxidez do álcool, levando a formação de
metabolitos secundários como o glicerol (LIMA et al., 2001).

3.4.4 Contaminações bacterianas

 7

Segundo Viégas (2011) a cana de açúcar constitui um

excelente meio de crescimento não apenas para as leveduras alcoólicas, mas
também para bactérias contaminantes do processo, pois apresenta teor
relevante de nutrientes, alta atividade de água e pH favorável, e sujidades
vindas do campo ou mesmo provenientes do processo de obtenção do caldo
da cana. Além disso, a má assepsia dos equipamentos intensifica ainda mais a
contaminação bacteriana no processo de fermentação alcoólica.

De acordo com Nobre (2005) o processo de infecção na

fermentação alcoólica pode ocasionar inúmeros danos ao processo industrial
tais como: consumo de açúcar e redução da produção alcoólica, formação de
goma refletindo no aumento da viscosidade do caldo e consequentemente
ligado ao entupimento nas tubulações, danos aos equipamentos como
centrifugas, peneiras e trocadores de calor elevando os custos em
manutenção.

No decurso da infecção pode ocorrer a floculação do fermento,

com diminuição da velocidade de fermentação, gerando perda de células de
leveduras no fundo das dornas, o que dificulta o exercício das centrifugas, além
do baixo rendimento alcoólico. Várias podem ser as causas para a floculação
do fermento, todas relacionadas a contaminações: presença de gomas
sintetizadas por bactérias, o próprio contato com bactérias indutoras da
floculação e ainda pela presença de leveduras selvagens floculantes. Outro
ponto de destaque para as contaminações é a presença de toxinas e ácidos
orgânicos que ocasionam a inibição e a queda da viabilidade celular. Estes
compostos excretados no meio pelos contaminantes, juntamente com todo o
processo ocorrido leva a redução no rendimento da fermentação e interfere na
eficiência da fermentação industrial (NOBRE, 2005; LUDWING et al., 2001).

Conforme Naves et al. (2010), no âmbito da fermentação e

destilação industrial as bactérias lácticas são as predominantes iniciadoras de
fermentações indesejáveis, particularmente as bactérias Gram-positivas do
gênero Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc, sendo as do tipo Lactobacillus e
Bacillus as mais presente na fermentação industrial uma vez que apresentam
tolerância ao álcool. Nos Lactobacillus e Bacillus, a floculação ocorre devido a
presença de uma capa proteica gelatinosa presente nestes micro-organismos,
 7

o que os torna capazes de se fixar mecanicamente nas células de leveduras.

Desta forma as leveduras se agregam umas as outras dando origem a flocos
que sedimentam drasticamente no meio (COSTA, 2006; ALCARDE, 2001).

Os inconvenientes gerados pela floculação da levedura por

contaminação bacteriana são intensificados pelo reciclo de células, que
promove a condensação dos agentes de floculação juntamente com as
leveduras e consequentemente decréscimo da produção de etanol.
(ALCARDE, 2001). Assim, o controle microbiano é extremamente relevante do
ponto de vista da produção alcoólica com altos rendimentos. Procedimentos
como o tratamento com acido sulfúrico realizado no creme de levedura, cujos
custos são relativamente baixos, o uso de antibióticos tais como tetraciclina,
cloranfenicol, penicilina e virginiamicina e a busca por novos métodos de
controle devem ser amplamente estudados e otimizados, uma vez que podem
prevenir a contaminação bacteriana (GOMES, 2009). Embora o tratamento
com ácido sulfúrico seja amplamente empregado nas destilarias brasileiras, às
leveduras são prejudicadas pelo ácido, que provoca extração de nutrientes
como nitrogênio, fósforo e potássio, e ocasiona desgaste em sua parede
celular prejudicando a produção de etanol (VIÉGAS, 2011; DORTA, 2006).

De acordo com Bertoletti (2008), a floculação gerada por

espécies do gênero Lactobacillus estaria relativamente ligada com um
mecanismo intracelular, na qual abrange os resíduos de aminoácidos indicados
pela presença proteica do grupo indol do triptofano e o grupo hidroxil fenólico
da tirosina da superfície celular da bactéria e carboidratos da parede celular da
levedura. Alem disto a relação intracelular necessita também da presença de
íons Ca++, que atuam de modo direto na floculação. O cálcio exerce uma ponte
de ligação entre os grupos negativos das fosfomananas que é um complexo de
fosfato e mananas situada na parede celular da levedura e os receptores
proteicos das células bacterianas. Níveis de pH acima de 3,0 contribui para que
estas ligações ocorram, enquanto em pH inferiores a 3,0 e com quantidades
elevadas de íons H+ no meio, estes disputam as ligações com os íons Ca ++. Por
esse motivo as indústrias fazem uso da metodologia de reciclo de células
(processo Melle-Boinoit) com a adição de acido sulfúrico no tratamento do
fermento para manter o pH baixo ocasionando o rompimento dessas pontes de
 7

ligação dos íons Ca++, apesar das injúrias que este tratamento pode provocar
nas leveduras.

Outro procedimento que pode ser adotado no controle da

contaminação bacteriana é o uso de antibióticos, cuja função é inibir ou anular
o crescimento de bactérias através das vias metabólicas, e pela mudança do
equilíbrio osmótico afetando a estrutura de suas paredes celulares. Porém, o
uso contínuo de antibióticos traz limitações como, por exemplo, a indução da
resistência bacteriana a ação do antibiótico, além do custo elevado que este
tratamento apresenta, considerando que seu uso deve ser contínuo na
indústria (VIÉGAS, 2011; NAVES et al., 2010). Assim, conforme Viégas (2011)
é constante a busca por novos compostos naturais bactericidas, que sejam
mais eficientes que os atuais a um custo menor e que possam substituir
antibióticos sintéticos, reduzindo então a resistência microbiana aos antibióticos
empregados atualmente. Um exemplo disto é a própolis, substância resinosa
produzida por abelhas e que tem se destacado no controle de bactérias
contaminantes, sendo tão eficiente quanto à ampicilina em testes laboratoriais.
Sua ação antimicrobiana está relacionada à presença de flavonoides, ácidos
fenólicos, ésteres, aldeídos fenólicos e cetonas, cujo mecanismo da atividade
antimicrobiana é complexo e atribuído ao sinergismo entre flavonoides,
hidroxiácidos e sesquiterpenos (CAETANO, MADALENO, 2011).

Segundo Caetano e Madaleno (2011), outros biocidas naturais

como o jambolão e o lúpulo estão sendo estudados pelo seu fator bactericida.
Quanto ao jambolão, as folhas são ricas em taninos e saponinas e são citadas
três hipótese para a ação antimicrobiana atribuída aos taninos. Uma delas é a
de que os taninos inibem enzimas bacterianas e fúngicas e ou se complexam
com os substratos dessas enzimas. A segunda hipótese inclui a ação dos
taninos sobre as membranas celulares dos micro-organismos, modificando seu
metabolismo, e a terceira fundamenta-se na complexação dos taninos com
íons metálicos, diminuindo a disponibilidade de íons essenciais para o
metabolismo microbiano. No que diz respeito ao lúpulo, os β-ácidos conhecidos
como lupulonas possuem ação bactericida, agindo no transporte de metabólitos
na membrana celular e alterando o pH intracelular. Sua pronunciada ação
bacteriostática sobre bactérias Gram-positivas parece estar relacionada à
 7

interferência do grupo prenil, presente nas cadeias laterais dos β-ácidos, sobre
a membrana plasmática das células, inibindo fortemente o seu crescimento.
Porém, apesar de promissores, estes métodos alternativos ainda não são
aplicados em nível industrial, sendo o procedimento quase que padrão nas
destilarias brasileiras o uso de ácido sulfúrico no controle de contaminantes.

3.5.5 Sulfito

Conforme Dorta et. al (2006), o sulfito presente na fermentação

alcoólica é proveniente da queima do enxofre elementar em fornos rotativos, no
tratamento químico do caldo primário para retirada de impurezas solúveis,
coloidais ou insolúveis com a finalidade de se fabricar o açúcar branco. Durante
o processo de fabricação do açúcar gera-se um subproduto denominado
melaço, também conhecido como Mel final. Um produto esgotado, que não
serve para extrair mais açúcar por razões de ordens técnico-econômicas.

De acordo com Steinle (2013) desde 1990, há um crescimento

elevado da utilização do melaço na formulação do mosto juntamente com água
e caldo de cana-de-açúcar para fermentação alcoólica. A utilização do melaço
tem como finalidades principais a correção de sólidos solúveis do caldo e
também por motivos econômicos, evitando assim perdas na eficiência da
fabricação do açúcar. Amaral (2009), relata que o sulfito de sódio adicionado
ao processo industrial é na faixa de 200 a 700 mg/L, gerando na maioria das
vezes mostos com até 300 mg/L de dióxido de enxofre (SO 2).

Esta presença de sulfito no mosto ocasiona redução do

rendimento alcoólico e diminuição da viabilidade das células das leveduras,
sendo que os níveis de toxicidade pode ser maior ou menor perante as
condições em que se encontram os níveis de pH, a contaminação, assim como
o teor alcoólico no decorrer do processo fermentativo (DORTA et. al, 2006).
Conforme Favero et. al (2011), o sulfito age como um antimicrobiano tanto para
bactérias como para as leveduras através de sua ligação a receptores celulares
situados na parede celular do micro-organismo, ocasionando rompimento na
membrana citoplasmática, inativação da replicação do DNA e da síntese de
proteínas, inibição das reações catalisadas enzimaticamente vinculadas com a
membrana citoplasmática, bem como, em reações individuais com os
componentes de vias metabólicas. Um exemplo da ação antimicrobiana do
 7

sulfito está na inibição da cadeia enzimática encarregada pela produção de

ATP, o que leva a diminuição da viabilidade celular.

Apesar de sua ação indesejada sobre as leveduras, Meneses

(2008) cita que estudos relacionados com a toxidez do sulfito, mostraram que
sua presença no meio fermentativo em até cerca de 100 ppm (partes por
milhão) acarretaria benefícios ao processo de fermentação alcoólica, uma vez
que diminui os custos de produção, pois exerce efeito inibitório no crescimento
bacteriano, visto que a contaminação acarreta maiores danos ao rendimento
alcoólico do que a presença de sulfito prejudicial às leveduras. Amaral (2009)
relaciona que a concentração mínima inibitória (CMI), para o sulfito de sódio
em pH 4,5 se encontra na faixa de 10-40 mg/mL para bactérias contaminantes
do processo fermentativo, enquanto para a levedura os valores são de
5000mg/mL em pH 4,5, o que justifica o uso do Mel na composição do mosto.

4. Considerações Finais

A partir de revisões da literatura foi possível constatar que

vários fatores tem influência direta na eficiência de conversão de açúcar em
etanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae, ligados diretamente com o
rendimento alcoólico. Dentre os fatores analisados o controle de pH,
temperatura, presença de sulfito e teor alcoólico do meio é fundamental, pois
relacionam-se diretamente ao desempenho da levedura e à sua viabilidade.
Uma vez afetada a viabilidade celular, a tendência é o aumento do tempo de
fermentação, o que acarreta custos mais elevados e propicia o aumento das
contaminações bacterianas. As contaminações bacterianas por sua vez, em
níveis acima de 102 células /mL, provocam redução da produção alcoólica e
aumento da acidez, o que leva à diminuição da qualidade do produto final.
Assim, considerando a importância do etanol no mercado nacional, conhecer
os fatores interferentes da fermentação alcoólica bem como de medidas que
melhorem a eficiência de sua obtenção devem ser cada vez mais estudados a
fim de contribuir para melhorias do processo industrial.
 7

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