Pratica 2

Prática 2
Isolamento de microrganismos a partir de utensílios, superfícies e

mãos
Parte 1
Critérios
Critérios microbiológicos para análise de mãos e utensílios
Como não existem parâmetros na legislação brasileira para análise microbiológica de mãos,
utilizam-se critérios experimentais de acordo com o proposto por SILVA JR (2012).
Critérios microbiológicos para mãos
Um indicador importante de sujidade do manipulador é a presença de um número

significativo de Staphylococcus aureus e de coliformes nas mãos (também podem ser
avaliados outros, se necessário). O S. aureus é um importante agente causador de doenças
transmitidas por alimentos, principalmente a variedade que produz uma enzima, denominada
coagulase. Por outro lado, coliformes não devem estar presente em mãos lavadas, uma vez
que essas bactérias estão presentes na microbiota intestinal de animais e do homem.
Nas análises de laboratório, são considerados aceitáveis, a contagem de Staphylococcus
aureus coagulase positiva (+) até 100 colônias e a AUSÊNCIA de Coliformes a 45 oC.
Para a coleta das amostras de mãos e superfícies, utilizamos o “SWAB” (cotonete
grande).
Critérios microbiológicos para equipamentos e utensílios de preparação sugeridos por

Silva (2012)
Silva sugere que a principal metodologia para análise de utensílios e mãos seja a
contagem padrão em placa contendo meio de cultivo para identificação de de micro-
organismos aeróbios mesófilos (crescimento em temperaturas de 20-45oC) ou facultativos
(podem crescer nestas e outras temperaturas).
Os critérios são:
1. Contagem até 50 UFC/cm2 e ausência de Coliformes fecais, Staphylococcus
coagulase positivo, Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa em 50 cm2 da amostra,
indicam condições higiênico-sanitárias satisfatórias.
2. Contagem acima de 50 UFC/cm2 e ausência de microrganismos patogênicos, indicam
condições higiênicas insatisfatórias, ou seja, falha no processamento de lavagem.
3. Contagem até 50 UFC/cm2 e presença de um dos microrganismos patogênicos,
indicam condições higiênicas insatisfatórias, ou seja, falha no processamento de desinfecção.
4. Contagem até 50 UFC/cm2 e presença de um microrganismo patogênico, indicam
condições higiênico-sanitárias insatisfatórias, ou seja, falha reavaliar a higiene (lavagem e
desinfecção).
Fonte: Silva Jr. E. A. Manual de Controle Higiênico-Sanitário em Serviços de

Alimentação. Varela, 6.Ed. Atualizada, 2007.
A seguir são apresentados protocolos padrões para identificação de microrganismos,

conforme descrito por Silva. Vocês devem ler os protocolos abaixo e acompanhar o vídeo
disponibilizado no moodle e apresentado em sala de aula. Neste vídeo, são apresentados
somente os protocolos de análise de tábua de carne e esponjas.
A. Preparo das amostras de utensílios e superfícies

Tábua de Carne
1. Umedecer o swab estéril em solução salina 0,9%;
2. Colocar o molde sobre a tábua e passar o swab dentro dessa área, no sentido
horizontal, vertical e diagonal;
3. Colocar o swab em um frasco contendo 10 mL de solução salina 0,9%;
4. Homogeneizar e deixar por 5 minutos.
Esponja
1. Pesar 1 g de esponja (cortar com tesoura esterilizada);
2. Colocar em um frasco contendo 10 mL de solução salina 0,9% estéril;
3. Agitar por 5 minutos;
Avental, celular ou balcão:

1. Umedecer o “swab em solução salina (0,9%). Usando um molde (4 cm x 4 cm)
esfregar na superfície do material a ser estudado;
2. Voltar o “swab” para o tubo com 10 ml de solução salina, cortar a haste para que
o “swab” mergulhe no líquido;
3. Homogeneizar e deixar em repouso por 15 minutos.
B. Métodos de Contagem de Staphylococcus aureus e Coliformes presentes nas

superfícies inanimadas
Figura 6. Esquema dos meios utilizados nas placas para plaqueamento das amostras
de superfícies inanimadas. Após a preparação da amostra coletada (depois do swab),
alíquotas de 100 μl devem ser plaqueadas em quatro meios diferentes para indicação
dos micro-organismos.
Contagem de estafilococos
1. Pipetar 100 µL da suspensão da amostra coletada, semear na superfície da
placa de Petri contendo o meio Ágar Mac Conkey (AMC) e homogeneizar
com ajuda da alça de Drigalski. Identificar a placa.
2. Pipetar 100 µL da suspensão, semear na superfície da placa de Petri contendo
o meio Ágar Manitol Salgado (AMS) e homogeneizar com ajuda da alça de
Drigalski. Identificar a placa;
3. Incubar as placas na estufa a 35-37oC por 24 horas;
4. Na aula seguinte realizar a contagem das placas.
Contagem de coliformes
1. Inocular 100 µL da suspensão na superfície da placa de Petri contendo o meio
Ágar Eosina Azul de Metileno (EAM); e homogeneizar com ajuda da alça de
Drigalski. Identificar a placa;
2. Incubar as placas na estufa a 35-37oC por 24 horas;
3. Na aula seguinte realizar contagem das placas.
Isolamento de estafilococos e coliformes presentes nas mãos (não apresentado no

vídeo)
1. Umedecer o “swab” em solução salina (SF) e passar na mão (palma e entre os
dedos),
2. Passar o “swab” na superfície da placa contendo ágar nutriente (AN),
3. Identificar a placa
4. Repetir os passos 2 e 3 para as placas com meio de cultivo Baird Parker (ABP),
Ágar Manitol Salgado (AMS) e Ágar Eosina Azul de Metileno (EAM)
5. Incubar as placas a 37°C por 24 – 48 horas,
6. Observar o número e a diversidade de colônias,
7. Contar as colônias
Parte 2
Análise dos resultados e questões
A. Cálculo do número de unidades formadoras de colônias em amostras de

alimentos
Exemplos
Sem diluição 10-1 10-2 10-3
___________________________________________
Figura 1. Resultado da incubação de placas contendo meio seletivo semeadas com

alíquotas de diferentes amostras de alimentos diluídas. A tendência da diluição é a
diminuição do número de colônias em amostras muito contaminadas para a contagem
correta do número de unidades formadoras de colônias. A parte inferior apresenta uma
placa com as unidades formadoras de colônias.
Análise de superfícies
● Superficie analisada: área dentro do molde 4x4 cm = 16 cm2

● A amostra coletada foi diluída em 10 ml
● Foram semeados 100 microlitros por placa
● Contar as colônias
Exemplo de cálculo
● 64 unidades formadoras de colônias (UFC) típicas de S. aureus foram contadas.

● 64 UFC estavam em 100 microlitros
● em 1 ml, correspondem a 640 UFC
● em 10 ml (que continham o material todo diluído, correspondente a 16 cm2) =
6400 UFC
● Resultado: 6400 UFC em 16 cm2 = 400 UFC/cm2
Análise de esponja
● 1 g de esponja foi transferida para 10 ml de diluente

● 100 microlitros foram semeados por placa
● contagem de colônias Unidades formadoras de colônias – UFC = 32
Exemplo de cálculo
● Ex: sua contagem deu 32 UFC em 100 microlitros

● Em 1 ml, teremos 320 UFC
● Nos 10 ml (contendo 1 g da esponja) deve haver 3200 UFC (= 1 g de esponja)
● Resultado: 3200 UFC/g de esponja
Questões para o relatório
1. Avaliar a aceitabilidade do resultado de análise da superfície da tábua de carne.

2. Qual a qualidade microbiológica da amostra de esponja?
3. Qual a importância da diluição seriada para os procedimentos de controle de
qualidade microbiológica?
4. Quais as diferenças entre os meios de cultura utilizados? Explique o uso de
diferentes meios de cultura no cultivo de microrganismos.
5. Os meios de cultura utilizados são complexos ou quimicamente definidos? S
6. Quais dos meios utilizados são seletivos? Quais são diferenciais? Justifique sua
resposta.

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Isolamento de microrganismos a partir de utensílios, superfícies e

Critérios microbiológicos para análise de mãos e utensílios

Critérios microbiológicos para mãos

Um indicador importante de sujidade do manipulador é a presença de um número

Critérios microbiológicos para equipamentos e utensílios de preparação sugeridos por

Fonte: Silva Jr. E. A. Manual de Controle Higiênico-Sanitário em Serviços de

A seguir são apresentados protocolos padrões para identificação de microrganismos,

A. Preparo das amostras de utensílios e superfícies

Avental, celular ou balcão:

B. Métodos de Contagem de Staphylococcus aureus e Coliformes presentes nas

Isolamento de estafilococos e coliformes presentes nas mãos (não apresentado no

A. Cálculo do número de unidades formadoras de colônias em amostras de

Sem diluição 10-1 10-2 10-3

Figura 1. Resultado da incubação de placas contendo meio seletivo semeadas com

● Superficie analisada: área dentro do molde 4x4 cm = 16 cm2

● 64 unidades formadoras de colônias (UFC) típicas de S. aureus foram contadas.

● 1 g de esponja foi transferida para 10 ml de diluente

● Ex: sua contagem deu 32 UFC em 100 microlitros

Questões para o relatório

1. Avaliar a aceitabilidade do resultado de análise da superfície da tábua de carne.

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