CURSO: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO

(POP) Página 1
BIOMEDICINA

ANÁ LISE DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES POR TUBOS MÚ LTIPLOS- testagem quantitativa- INDICADOR
TUBO INVERTIDO DE DURHAN E NÃ O AZUL DE BROMOCRESOL- O método de contagem NMP é meonos sensível que UFC
em 10%
ANÁ LISE DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES POR MEMBRANA FILTRANTE- testagem quantitativa- (mais
sensível)- MEIO COM INDICADOR DE AZUL DE BROMOCRESOL COMO INDICADOR- Contagem com fó rmula UFC
DOIS TESTAGEM QUALIFICATIVAS:
Métodos rápidos Colilert e Colitag
INTRODUÇÃO

Coliformes:

Coliformes totais: bacilos Gram - negativos, oxidase negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares ou agentes
tensoativos (como lauril sulfato de só dio) e de fermentar a lactose a 35-37°C, com produçã o de gá s e aldeído, em 24 horas. A
maior parte das bactérias do grupo coliforme pertencem aos gêneros Escherichia, Klebsiela, Enterobacter e Citrobacter.
Podem ocorrer no meio ambiente, fezes humanas, em á guas com alta concentraçã o de matéria orgâ nica, solo ou vegetaçã o
em decomposiçã o.

Coliformes termotolerantes( ou fecais): microorganismos capazes de fermentar a lactose a 44-45°C sendo representados
principalmente pela Escherichia coli (fecal), e algumas bactérias dos gêneros Klebsiela, Enterobacter e Citrobacter. Somente
Escherichia coli dentre estes microorganismos é de origem exclusivamente fecal, estando presente em densidades elevadas
nas fezes humanas, mamíferos e pá ssaros, sendo raramente encontrada na á gua ou no solo que nã o tenham recebido
contaminaçã o fecal. Os demais, podem estar presentes com alto teor de matéria orgâ nica (efluentes industriais), ou em
material vegetal ou solo em decomposiçã o.

OBJETIVOS

Aplicaçã o do Teste O teste de contagem de coliformes fecais é aplicável para investigar a poluiçã o de cursos de á gua,
eficiência de desinfecçã o de sistemas de tratamento de á gua, de efluentes industriais e domésticos, balneabilidade de praias,
rios e monitoramento sistemá tico para classificaçã o da qualidade da á gua de rios.

Definir um procedimento para a aná lise de coliformes totais e termotolerantes pela técnica de membrana filtrante.

PRINCÍPIO DO MÉTODO

FRASCO PARA COLETA

De vidro neutro ou plá stico autoclavável ató xico, com capacidade mínima de 125 mL, boca larga e tampa à prova de
vazamento.
MATERIAIS

Balança
Banho-Maria
Destilador de água ou aparelho para desionização
Autoclave
Estufa
Bomba de Vácuo
Frasco Kitassato
Frascos
Porta-Filtro de Vidro
Incubadora Bacteriológica
Refrigerador
Potenciômetro
Balões
Frasco para coleta de amostra
Provetas
Tubos de ensaio
Tubos de Durhan
Frasco para água de diluição
Pipetas
Placas de Petri
Alças de inoculação
Bandejas de plástico ou aço inoxidável
Bicos de Bunsen ou similar
De aço inoxidável ou galvanizado plastificado
Membranas filtrantes
Pinças
Lâmpada ultravioleta

MÉTODO

 Para todos os microrganismos pesquisados aplicou-se a técnica convencional dos tubos mú ltiplos a qual subdivide-se
no ensaio presuntivo, confirmativo e completo expressando-se os resultados em nú mero mais provável de colô nias por
100 mL (NMP).

1. Ensaio presuntivo: Consiste na inoculaçã o de volumes de 10.0; 1.0 e 0.1 mL de á gua a ser analisada numa série de
nove tubos. Os tubos que recebem inó culos de 10 mL têm meio de cultura com concentraçã o dupla a fim de compensar
a diluiçã o. Os volumes de 1 e 0,1 mL da amostra sã o inoculados em meio de concentraçã o simples. O ensaio visa ao
enriquecimento da amostra e um resultado positivo, dentro de 24-48h, é apenas sugestivo de á gua contaminada, pois
pode haver interferência de outros microrganismos devendo-se, portanto, dar seguimento a aná lise

2. Ensaio confirmativo: Todos os tubos positivos no ensaio presuntivo devem ser submetidos ao ensaio confirmativo o
qual consiste na inoculaçã o dos ensaios presuntivos positivos em meio de cultura seletivo para a bactéria ou grupo de
bactérias pesquisadas, reduzindo-se a possibilidade de ocorrência de resultados falso-positivos. Um resultado positivo
confirma a presença de bactérias indicadoras de contaminaçã o.

3. Ensaio completo: Este ensaio é caracterizado pela realizaçã o de provas adicionais, nã o sendo obrigató rio. Consiste na
utilizaçã o de provas bioquímicas adicionais para identificaçã o da espécie ou quando se suspeita da interferência de
microrganismos nos ensaios anteriores.

 Expressão dos resultados em número mais provável de bactérias por 100mL (NMP): 2 A combinaçã o de
resultados positivos e negativos no ensaio confirmativo permite a obtençã o de uma estimativa da densidade original
das bactérias (NMP) através da aplicaçã o de cá lculos de probabilidade (COSTA, 1980; STANDARD METHODS, 1998)
predeterminados na tabela de Hoskins. Os resultados sã o, entã o, expressos em nú mero mais provável de bactérias por
100mL.
PROCEDIMENTO

1. ESQUEMA

1. 5 (OU 10) tubos de ensaio com 10 ml cada de caldo LTS;

2. Pipetar 10 ml de amostra da á gua (Frasco de Coleta).
OBS: Ao final a soluçã o terá 20 (OU 10ML) ml (10 ml de LTS e 10 ml de amostra).
3. Apó s incubaçã o de 24 a 48h , observar em qual houve formaçã o de gá s;
4. Os que tiveram crescimento, separar e
 5. Adicionar 0,0,1ml (10um) para outro tubo de ensaio contendo 10 ml meio de cultura EC;
6. Incubar de 24 a 48h entre 44,5-45,5 graus.
7. Separar os meios em que houve turbidez;
8. Semear por esgotamento de alça em meio de cultura EC-MUG em uma placa de petri;
9. Observar a luminescência azul das colô nias em que houve crescimento bacteriano com auxílio de uma lâ mpada
ultravioleta.

2. PREPARO DE MEIO DE CULTIVO-, utilizando o Caldo Lactosado (OU EC- m-FC) como exemplo:

A. Calcular a quantidade de meio de cultura para fazer 50 ml (OU 100ML) de Caldo LTS, utilizando regra de três;
B. Destacar e identificar um papel, com lados de comprimento iguais, com o nome do Caldo LTS e a quantidade do
meio em gramas a ser utilizado, seguindo o ró tulo do fornecedor;
C. Dobrar suavemente o papel, de uma ponta a outra (ambos os lados);
D. Separar uma proveta com o volume 50 ml (OU 100ML)
E. Separar um balã o volumétrico de fundo chato (quanto mais larga a boca, melhor; evitar vidraria com o“pescoço”
longo) com o dobro de capacidade para o Volume Final: Caldo LTS e Á gua Desionizada, ou seja os 50 ml (OU 100
ML);
F. Utilizando o papel como suporte, pesar a quantidade precisa de Caldo LTS em uma balança de precisã o
(descontando o peso do papel), (a balança precisa estar em um ambiente protegido de ventilaçã o, ensolaçã o ou
calor excessivo);
G. Verta uma pequena quantia da á gua desionizada para o balã o volumétrico;
H. Para facilitar, forme um “funil” com as pontas do papel e despeje o Caldo LTS dentro do balã o;
I. Aos poucos, despeje o restante da á gua, ainda utilizando o papel como “funil”, sempre girando o balã o a fim de
desempregnar/limpar a superfície interna do balã o volumétrico e o papel (nã o descarte o papel);
J. Misturar delicadamente o balã o, evitando empregnaçã o do líquido, até a dissoluçã o do meio;
K. Apó s, preparar um rolo, de algodã o hidrofó bico, (evitar deixar partes doltas) suficientemente espesso para tampar
a boca do balã o;
L. Cobrir a boca do balã o volumétrico, sem deixar abas abertas, com o papel identificado e fita crepe (pouca fita para
facilitar a remoçã o);
M. Levar ao autoclave, observando as instruçã o do fornecedor para temperatura, tempo, pressã o, arrefecimento e
introduçã o de reagentes adicionais necessá ria para a esterilizaçã o/funacionalidade do meio.

3. ANÁLISE DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS- testagem quantitativa

A. Teste para Coliformes Fecais Totais

i. Identificar os tubos necessá rios (com tubos invertidos de Durham) com o nú mero de diluiçã o inicial da amostra 1:1
(10 ml de Caldo Lactosado para 10 ml da amostra) e numeraçã o: tubo 1, 2, 3 etc.
ii. Incubar a 36-37 graus por 24h;
iii. Apó s a incubaçã o avaliar a presença de gá s no tubo. Os que foramaram gá s deverã o ser separados para repique e os
que nã o foram observados a formaçã o de gá s deverã o ser incubado novamente por mais 24h, para confirmaçã o de
negatividade;
iv. OBS: preparar Caldo BVB para repicagem.

B. Teste de Confirmação para Coliformes Fecais Totais

i. Identificar os tubos de Durham com a mesma identificaçã o numérica que os tubos anteriores com Caldo Lactosado
com positividade para formaçã o de gá s e nú mero de diluiçã o;
ii. Repicar em tubo com Durham contendo 10 ml do Caldo BVB;
iii. Incubar por 24h em a 36-37 grau;
iv. Apó s observar quais tubos tiveram, formaçã o de gá s. Os que tiveram formaçã o sã o separados para repique e os
negativos incubados por mais 24h para confirmaçã o de negatividade.
v. OBS: Os dois Testes a seguir devem ser feito paralelamente, caso seja necessá rio a deiferenciaçã o para Escherichia
coli na amostra.
vi. OBS: Preparar Caldos EC-MUG para diferenciaçã o de E.coli e Caldo EC para a Confirmaçã o de Coliformes Fecais
Termotolerantes.
 C. Teste de Corfimação para Coliformes Fecais Termotolerantes

i. Identificar os tubos de Durham com a mesma identificaçã o numérica que os tubos anteriores com Caldo Lactosado
(ou EC?) com positividade para formaçã o de gá s e nú mero de diluiçã o;
ii. Fazer o repique dos tubos com positividade (formaçã o de gá s) do Caldo BVB em tubos contendo 10 ml de Caldo EC;
iii. Incubar por 24h em a 44,5-45,5 grau;
iv. Apó s observar quais tubos tiveram, formaçã o de gá s. Os que tiveram formaçã o sã o tubos positivos para presença de
Coliformes Fecais Termotolerâ ntes.

D. Teste de Confirmação de E. coli

i. Identificar os tubos de Durham com a mesma identificaçã o numérica que os tubos anteriores com Caldo Lactosado
(ou EC?) com positividade para formaçã o de gá s e nú mero de diluiçã o;
ii. Fazer o repique dos tubos com positividade (formaçã o de gá s) do Caldo BVB em tubos contendo 10 ml de Caldo EC-
MUG;
iii. Incubar por 24h em a 44,5-45,5 grau;
iv. Apó s incubaçã o, levar os tubos a uma sala escura e submetê-los à exposiçã o de luz ultravioleta. A presença de
luminosidade azul-flourescente revela positividade para Escherichia coli.

Observações adicionais

 A quantidade de tubos e diluiçã o utilizada para preparo da primeira etapa do teste presentivo [A)-i]
dependerá da “presuntividade” da qualidade de á gua amostral, respondendo a seguinte pergunta: A á gua
retirada como Amostra tem sugetividade de contaminaçã o, há indícios de grande interferência
antropoló gica?. Se houver muita cntaminaçã o, é necessá rio três ou mais séries de diluiçã o: 1:1 (10 tubos),
1:10 (10 tubos), 1:100 (10 tubos) etc;
 As diluiçõ es devem sempre ser feitas utilizando água peptonada;
 O Caldo utilizado em [A)-i], pode ser utilizado em dobro (ou seja, o dobro de meio de cultura para 10ml de
amostra), caso a amostra seja “presumida” como pouco contaminada;

 E. coli é a ú nica bactéria que possui a enzima β-D glucoronidase- presente em 95% das linhagens de E. coli-
requerida para a hidró lise do MUG.

INTERFERENTES

REAGENTES E PADRÕES

CÁLCULO/ FÓRMULA

O Nú mero Mais Provável (NMP) de coliformes é expresso como a densidade média de bactérias contidas em 100 mililitros
de amostra, ou NMP de coliformes fecais/100 ml (NMP CF/100 ml).

Como alternativa à utilizaçã o da fó rmula, pode—se observar os resultados de positividade dos tubos e comparar
com as tabelas de NMP e os procedimentos completos para aná lise de coliformes, disponíveis em:
http://paginapessoal.utfpr.edu.br/arcoelho/microbiologia-de-alimentos/roteiros-de-aulas-praticas/roteiros-
de-aulas-praticas/TabeladeHoskins.PDF ou Resoluçã o do CONAMA N° 20 - 18/06/1986. As quais contêm
combinaçõ es de possibilidade de positividade para 3 tubos de diluiçã o 1:1. Ou seja, diluiçõ es de amostras com
grande contaminaçã o deve-se pegar os resultados (positividade entre os tubos) e lançar na fó rmula:
XXXXXXXXXXX

LEITURA

A aná lise de coliformes termotolerantes foi realizada pela técnica de membrana filtrante, utilizando-se o á gar mFC (Difco), e
a diferenciaçã o para E. coli foi feita com o uso do meio ECMUG (Difco) conforme descrito no “Standard Methods” (APHA
2005b). Foram filtrados volumes variáveis, de acordo com grau de contaminaçã o da amostra, de forma que fossem obtidas
contagens de 20 a 60 colô nias por placa. A incubaçã o foi realizada a 44,5°± 0,2°C durante 24 horas. Apó s esse período, foi
realizada a contagem das colô nias típicas de coliformes termotolerantes, de coloraçã o azul. Para a diferenciaçã o da E. coli,
pelo menos 10 colô nias da placa utilizada para contagem foram transferidas para o meio EC-MUG, que foi incubado a 44,5°±
0,2°C durante 24 horas. Culturas que apresentaram fluorescência sob luz UV de comprimento de onda de 365nm foram
consideradas provenientes de colô nias positivas para E. coli. Simultaneamente, as colô nias submetidas à diferenciaçã o com
EC-MUG foram inoculadas em á gar eosina-azul de metileno para isolamento, e as colô nias típicas para coliforme nesse meio,
que eram provenientes de colô nias negativas no meio EC-MUG, foram submetidas à identificaçã o com uma galeria de testes
bioquímicos disponível comercialmente (API 20E, Biomérieux). As amostras coletadas durante o ano de 2005 também
foram analisadas pela técnica de membrana filtrante utilizando-se o á gar m-TEC modificado que contém o substrato
cromogênico 5-bromo-6- cloro-3-indolil ß-D-glicuronídeo para a enzima ß-D-glicuronidase, presente em 95% das linhagens
de E. coli. Apó s filtraçã o e transferência das membranas para esse meio, as placas foram incubadas a 44,5°± 0,2°C, durante
22 horas, apó s uma pré-incubaçã o de 2 horas a 35± 0,5°C. As colô nias de coloraçã o vermelho-escura (magenta) nesse meio
foram contadas como E. coli sem outras etapas de confirmaçã o (USEPA 2002).
TESTAGENS COMPLEMENTARES

1. Teste de oxidase

Este teste tem por finalidade evidenciar a presença da citocromo-oxidase, uma enzima da cadeia respirató ria de certas
bactérias. Esta enzima é necessá ria para a oxidaçã o do citrocromo c, segundo a seguinte reaçã o:
2 citocromo-c-reduzido + 2H+ + 1/2O2 citocromo-oxidase → 2 citocromo-c-oxidado + H2O
No teste de oxidase, o citocromo-c-oxidado, sofre reduçã o, ocorrendo a oxidaçã o da tetrametil-pfenilenodiamina, formando-
se uma substâ ncia de coloraçã o azul. As bactérias do grupo coliforme, por nã o possuírem a citocromo-c-oxidase,
apresentam resultado negativo neste teste.

REFERÊNCIAS

1- Disponível em: https://cetesb.sp.gov.br/wp-content/uploads/2018/01/Para-enviar-ao-PCSM_-NTC-

L5.202_5%C2%AAed-_dez.-2018.pdf
2- Disponível em: https://www.saaesorocaba.com.br/downloads/concurso2010/CMI%20003%20-%20An
%C3%A1lise%20de%20Coliformes.pdf.
3- Disponível em: NORMA TÉ CNICA totais - determinaçã o pela técnica de membrana filtrante: método de ensaio
4- https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4115599/mod_resource/content/0/Microbiologia
%20%C3%A1gua.pdf.

Determinaçã o de Coliformes
Totais

Os métodos de aná lises utilizados para a determinaçã o da presença de coliformes totais e fecais nas amostras de á gua
foram as Técnicas dos Tubos Mú ltiplos (CETESB, 2003; APHA et al., 2005) e Membrana Filtrante (APHA et al., 2005;
CETESB,2007). As aná lises foram realizadas no Laborató rio de Química Ambiental da CDAM/INPA. Neste relató rio sã o
apresentados os resultados referentes a filtraçã o utilizando funis de Bü chner contendo carvã o obtido a partir de
sementes de
Fig.:
açaí e tucumá , preparados no Laborató rio de Celulose e Papel-Carvã o Vegetal (CTIN/INPA). O carvã o cedido para este
estudo foi preparado nas granulaturas 10t e 35t a 500°C. As amostras de á gua foram coletadas em Manaus (igarapé
Tarumã -Açú , Praia Dourado Marinho) e em Sã o Gabriel da Cachoeira (orla do Rio Negro, igarapé da Cachoeirinha e
igarapé Mauixi). As coletas foram realizadas entre os meses de março e junho de 2012, pela manhã . A técnica dos tubos
mú ltiplos consiste em dois testes: Primeiro teste presuntivo e segundo confirmativo, que compreende os procedimentos I
e ll. O procedimento I (teste presuntivo) é utilizado para determinar a presença ou ausência de coliformes. O
procedimento II (teste confirmativo), para aná lise de coliforme fecal e total. No teste presuntivo utiliza-se 10ml de
Lactose-Bouillon, em tubos de ensaio e tubo de Durham invertido, autoclava-se a 1kgf/cm2 de pressã o, logo apó s este
processo, é tirada a pressã o até esfriar o material esterilizados. Em seguida identificam-se os tubos com as réplicas de
diluiçã o de 10-1 a 10-4, sendo 15 tubos para cada ponto, incubam-se os tubos em estufa à temperatura de 35,5°+ 0,5°C I
Congresso de Iniciaçã o Científica PIBIC/CNPq - PAIC/FAPEAM Manaus – 2012 por 24hs se houver a formaçã o de gá s no
tubo de Durhan e se estiver turva existe entã o a presença da bactéria do grupo coliforme na primeira aná lise, mas será
somente confirmado no teste II. No teste confirmativo (Coliformes totais): Utiliza-se 10ml de Brillangrum-Galle-Lactose-
Bouillon (Germany) ou Brilliant-Green Bile Lactose Broth em tubos de ensaio separados para coliforme total com 1ml da
amostra do presuntivo onde houve formaçã o de gá s e incubar-se por 24 a 48hs. Nã o apresentado a produçã o de gá s e a
soluçã o nã o se tornar turva o teste conclui-se negativo, para este grupo de coliforme. Para a confirmaçã o de coliforme
fecal, utiliza-se o meio caldo EC Broth, em tubos de ensaio e de Durham, onde se transfere 1ml da amostra do teste I onde
houve a detecçã o. Se houver formaçã o de gá s no tubo de Durham, confirma-se a existência do grupo coliforme fecal. O
meio de cultura é uma mistura de nutrientes necessá rios ao crescimento microbiano. A formulaçã o de um meio de cultura
deve levar em conta o tipo nutritivo ao qual o microrganismo pertence. O Nú mero Mais provável-NMP é calculado através
de uma tabela denominada Hoskins, com diversas combinaçõ es possíveis de resultados positivos versus concentraçã o de
amostra, em diferentes séries de inoculaçã o. Na técnica da membrana filtrante os materiais utilizados sã o: Filtros de
membrana de acetato de celulose de 0.45µ branco quadriculado estéril de 47mm, equipamento para a vá cuo (suporte,
funil, kitasato), bomba de vá cuo, placas de Petri (estéril), pinças, bico de Bunsen ou lamparina, pipetas graduadas de 5 e
10 ml (estéril), lâ mpada UV- ultravioleta. Os meios de cultura usados no nesta metodologia sã o: (M-Endo MF) líquido para
coliformes totais, (M-Fc MF) líquido para coliformes fecais.Todo o material deve ser esterilizado: autoclava-se a 1kgf/cm2
de pressã o, pipetas, funil, suporte, kitasato, frascos com á gua para diluiçã o, frasco para a coleta as pipetas devem ser
enroladas em papel alumínio ou comum e a tampa do frasco para a coleta coberta com papel alumínio para evitar
qualquer tipo de contaminaçã o. Identificam-se as placas de Petri para coliformes totais e fecais, e deixam-nas sob a
lâ mpada UV de 15 a 20 minutos. Remove-se o funil e transfere-se cuidadosamente com pinça flambada a membrana para
a placa de Petri de modo a evitar inclusã o de bolhas de ar, incubam-se as placas em posiçã o invertida por 24hs a 35°C
para coliforme fecal, dando-se o tempo; contam-se as colô nias típicas com o auxílio de um microscó pio ou lupa, com
iluminaçã o perpendicular ao plano da membrana. As colô nias típicas sã o: Vermelho escuro com brilho dourado
característico, colô nias coliformes totais, azuis colô nias coliformes fecais. A densidade de coliformes será dada em termos
de coliformes por 100mL da amostra , n° de coliformes/ 100mL= 100x n° de colô nias típicas/10Ml da amostra filtrada. O
sistema de filtragem com carvã o vegetal (sementes de açaí e tucumã ) foi desenvolvido pelo laborató rio de Celulose e
Papel/Carvã o Vegetal (CTIN/INPA) como alternativa para melhoria da qualidade de á gua. No laborató rio de química
ambiental (CDAM/INPA) foi realizada a aná lises da á gua que passou pelo carvã o nas granulaturas 10t e 35t, para analisar
a possível capacidade na reduçã o e eliminaçã o de coliformes totais e termotolerantes. Foram pesados 50g de carvã o de
granulatura 10t e 20g de carvã o de granulatura 35t. . O processo de filtragem ocorreu-se assim: Colocou-se o carvã o para
secar. Pesou-se o carvã o; Colocou-se em um funil de Buchmam; Repetir o processo quatro vezes; Filtrar 500 ml de á gua
destilada em um dos funis; Filtrou-se 250 mL da amostra em cada um dos 3 funis restantes.