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    Aula 05 - Testes Imunológicos I

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    IMUNOLOGIA CLÍNICA

    IMUNODIAGNÓSTICO EM
    REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO,
    AGLUTINAÇÃO E FLOCULAÇÃO

    Profª MSc. Débora Damasceno C. Fernandes


    Faculdade Cosmopolita

    [email protected]
    DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
    § Testes diagnós@cos de valor predi@vo afirmado, capaz de fornecer
    a resposta correta quanto ao estado de saúde e/ou doença de um
    paciente
    § Quatro respostas são
    possíveis
    § MAS QUAL A CORRETA?

    § Validação e u3lização
    da melhor técnica para
    cada 3po de pesquisa
    § METODOLOGIA
    PADRÃO-OURO
    TESTES DIRETOS x TESTES INDIRETOS
    TESTES QUALITATIVOS x TESTES QUANTITATIVOS
    TESTES SEMIQUANTITATIVOS
    TESTES DE DIAGNÓSTICO x TESTES DE TRIAGEM

    A PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI- A PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-HCV EM


    HCV EM UMA AMOSTRA DE PACIENTE BOLSAS DE SANGUE DE UM HEMOCENTRO
    TESTE PRECISA SER ESPECÍFICO TESTE PRECISA SER SENSÍVEL
    Especificidade: refere-se à reação antígeno- Sensibilidade: refere-se à quanAdades
    anticorpo capaz de identificar a exposição a necessárias de anAcorpos para a detecção do
    um único patógeno. anCgeno, e varia consideravelmente.
    ANTICORPOS NO IMUNODIAGNÓSTICO
    ▪ Atuam como moléculas reagentes para detecção, purificação e
    quantificação de antígenos
    ▪ Podem ser produzidos em
    laboratório e direcionados a
    praticamente qualquer antígeno
    de interesse
    ▪ Ex: anticorpos monoclonais
    ▪ Moléculas microscópicas que
    não são vistas diretamente,
    e sim indiretamente
    ▪ Métodos colorimétricos
    ▪ Formação de imunocomplexos grandes com aspecto de flocos
    REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
    ▪ Envolvem a reação de an>genos solúveis com an@corpos IgM ou IgG
    ▪ Formação de agregados grandes chamados de treliças
    ▪ Ocorrem em dois estágios

    01 02
    Formação rápida de Entrelaçamento dos pequenos complexos
    pequenos complexos formados no estágio um, formando de modo
    antígeno-antícorpo mais lento as treliças
    (ocorre em segundos) (pode ocorrer em minutos ou horas)

    AS REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO GERALMENTE OCORREM QUANDO


    PROPORÇÃO DO ANTÍGENO EM RELAÇÃO AO ANTICORPO (RAZÃO) É ÓTIMA
    CURVA DE PRECIPITAÇÃO

    A QUANTIDADE
    NENHUM MÁXIMA DE
    PRECIPITADO PRECIPITADO
    VISÍVEL SE SE FORMA NA
    FORMA ZONA E
    QUANDO UM EQUIVALÊNCIA,
    COMPONENTE ONDE A
    OU OUTRO SE PROPORÇÃO
    ENCONTRA EM ENTRE AG
    EXCESSO E AC É
    APROXIMADA
    REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
    ▪ Diferentes quan-dades de an/geno são adicionadas
    a uma quan-dade fixa de an-corpo, formando
    precipitados devido à interação das moléculas dos
    dois reagentes.
    ▪ A análise do precipitado pode ser u-lizada para criar
    uma curva de precipitação.
    ▪ O precipitado é recuperado e quan=ta=vamente
    avaliado quanto ao an=corpo, e o sobrenadante é
    testado para anAgenos ou an=corpos residuais

    NA ZONA DE EXCESSO DE ANTÍGENO, ALGUNS DOS COMPLEXOS


    FORMADOS SÃO MUITO PEQUENOS PARA PRECIPITAREM → DANOS A
    PEQUENOS VASOS SANGUÍNEOS, QUANDO SE FORMAM IN VIVO
    TESTE DO ANEL DE PRECIPITINA IMUNODIFUSÃO RADIAL

    ANTÍGENOS
    SOLÚVEIS

    ZONA DE
    EQUIVALÊNCIA:
    PRECIPITADO
    VISÍVEL
    BANDA DE
    PRECIPITAÇÃO

    ANTICORPOS

    Difusão de Ag e de Ac, um em direção ao Realizada em gel de ágar, em uma placa de Petri


    outro, em um tubo de ensaio. Quando eles ou lâmina de microscópio. Uma linha visível do
    aEngem proporções equivalentes, na zona precipitado forma-se entre os poços quando a
    de equivalência, forma-se uma linha visível razão óEma entre Ag e Ac é aEngida
    ou um anel de precipitado.
    IMUNOELETROFORESE (IMUNOBLOTTING / WESTERN BLOTTING
    ▪ Western blo+ng ou Imunoblo+ng
    ▪ Proteínas de interesse podem ser separadas por eletroforese e depois detectadas
    mediante sua reação com um an=corpo
    ▪ Os componentes são separados por eletroforese em gel, sendo então transferidos para uma
    folha que liga proteínas (blo$er), chamada de filtro ou membrana. Lá a proteína/anWgeno é
    inundada com um anEcorpo ligado à enzima (leitura visual, semelhante ao ELISA)
    REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
    “Reação entre um Ac e um Ag par2culado, resultando em uma
    aglomeração de par7culas visíveis.”

    ▪ Muito específicos, com boa


    sensibilidade, baixo custo e de fácil
    visualização/leitura
    ▪ Podem ser realizados em tubos de
    ensaio, em placas de microtitulação,
    ou com uma mistura de reagentes
    em lâminas de vidro
    ▪ Podem ser diretas ou
    indiretas/passivas
    AGLUTINAÇÃO DIRETA
    ▪ Ocorre quando Ac solúveis promovem a formação de agregados ao
    interagir com um determinado Ag.
    ▪ A agluAnação de hemácias é um processo denominado
    hemagluAnação, que é a base da ,pagem sanguínea de seres humanos
    ▪ Detectam anAcorpos contra quanAdades relaAvamente grandes de
    anFgenos celulares, como hemácias, bactérias e fungos
    ▪ Na realização em microplacas, a tipo O 9po B 9po A
    quantidade de Ag em cada poço é a
    mesma, porém a quantidade de soro
    contendo Ac é diluída, de modo que
    cada poço seguinte tenha a metade
    dos anticorpos do poço anterior.
    AGLUTINAÇÃO DIRETA: DETECTAM ANTICORPOS CONTRA QUANTIDADES RELATIVAMENTE
    GRANDES DE ANTÍGENOS CELULARES, COMO HEMÁCIAS, BACTÉRIAS OU FUNGOS.

    DILUIÇÕES SERIADAS DO SORO DO PACIENTE


    SÃO ANALISADAS, E A MAIOR DILUIÇÃO (MENOR
    CONCENTRAÇÃO) DE SORO NA QUAL A REAÇÃO
    ANTÍGENO-ANTICORPO É OBSERVADA É
    DEFINIDA COMO O TÍTULO DA AMOSTRA.
    AGLUTINAÇÃO INDIRETA (LÁTEX)
    ▪ Detecção de anticorpos* contra antígenos* adsorvidos em suportes
    ▪ Microesferas de látex
    ▪ Teste ASO (infecções
    bacterianas por S.
    pyogenes)
    ▪ Proteína C rea:va ▪ Muito sensíveis e de fácil
    ▪ Fator reumatoide visualização/leitura
    (doenças de fundo ▪ Podem ser diretas ou
    inflamatório e/ou
    indiretas
    autoimunes)
    REAÇÃO DE FLOCULAÇÃO: VDRL
    ▪ Teste antigênico não-treponêmico
    ▪ Antígenos derivados de tecido
    cardíaco de bovinos
    ▪ CARDIOLIPINA
    ▪ Em associação com colesterol e
    lecitina, a cardiolipina se
    transforma numa espécie de
    antígeno ativo que pode detectar
    e se ligar a anticorpos presentes
    no soro durante as etapas
    primária e secundária da
    infecção de sífilis
    REAÇÃO DE FLOCULAÇÃO: VDRL

    EM CASO DE REAÇÃO POSITIVA PARA FLOCULAÇÃO, É NECESSÁRIO INICIAR A ETAPA


    DE SEMI-QUANTIFICAÇÃO ATRAVÉS DE DILUIÇÕES SERIADAS. A ÚLTIMA DILUIÇÃO
    ONDE SE OBSERVA FLOCULAÇÃO ACONTECENDO, É O “TÍTULO” DA AMOSTRA
    VDRL QUALITATIVO
    DETERMINAÇÃO PRIMÁRIA DE RESULTADO POSITIVO OU NEGATIVO
    O RESULTADO DEU POSITIVO, E AGORA?
    VDRL SEMI-QUANTITATIVO E DILUIÇÕES SERIADAS
    O RESULTADO DEU POSITIVO, E AGORA?
    VDRL QUANTITATIVO E DILUIÇÕES SERIADAS

    IMUNOLOGIA- Aula prática: VDRL - YouTube

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